La metanfetamina agisce su sottopopolazioni di neuroni che regolano il comportamento sessuale nei ratti maschi (2010)

Neuroscienza. 2010 Mar 31; 166 (3): 771-84. doi: 10.1016 / j.neuroscience.2009.12.070. Epub 2010 Jan 4.

Frohmader KS, Wiskerke J, Wise RA, Lehman MN, Raffreddare LM.

Fonte

Dipartimento di Anatomia e Biologia Cellulare, Scuola di Medicina e Odontoiatria Schulich, Università dell'Ontario Occidentale, Londra, ON, Canada, N6A 5C1.

Astratto

La metamfetamina (Meth) è uno stimolante altamente additivo. L'abuso di Meth è comunemente associato alla pratica del comportamento a rischio sessuale e all'aumentata prevalenza di Virus dell'Immunodeficienza Umana e degli utenti di Meth riportano un aumento del desiderio sessuale, dell'eccitazione e del piacere sessuale. La base biologica per questo nesso farmaco-sesso è sconosciuta. L'attuale studio dimostra che la somministrazione di Meth nei ratti maschi attiva i neuroni nelle regioni del cervello del sistema mesolimbico che sono coinvolti nella regolazione del comportamento sessuale. Nello specifico, Meth e accoppiamento coattivano le cellule nel nucleo accumbens core e shell, amigdala basolaterale e corteccia cingolata anteriore. Questi risultati dimostrano che, contrariamente all'attuale convinzione, le droghe di abuso possono attivare le stesse cellule di un rinforzo naturale, cioè il comportamento sessuale, e a sua volta può influenzare la ricerca compulsiva di questa ricompensa naturale.

parole chiave: nucleo accumbens, amigdala basolaterale, corteccia prefrontale, abuso di sostanze, riproduzione, dipendenza

La motivazione e la ricompensa sono regolate dal sistema mesolimbico, una rete interconnessa delle aree del cervello comprendente il nucleo accumbens (NAc) dell'area tegmentale ventrale (NAc), l'amigdala basolaterale e la corteccia prefrontale mediale (mPFC) (Kelley, 2004, Kalivas e Volkow, 2005). Vi sono ampie prove che il sistema mesolimbico è attivato in risposta a entrambe le sostanze di abuso (Di Chiara e Imperato, 1988, Chang et al., 1997, Ranaldi et al., 1999) e ai comportamenti naturalmente gratificanti come il comportamento sessuale (Fiorino et al., 1997, Balfour et al., 2004). Il comportamento sessuale maschile, e in particolare l'eiaculazione, è altamente gratificante e rinforzante nei modelli animali (Pfaus et al., 2001). I roditori maschi sviluppano una preferenza di luogo condizionata (CPP) alla copulazione (Agmo e Berenfeld, 1990, Martinez e Paredes, 2001, Tenk, 2008), e svolgerà compiti operanti per ottenere l'accesso a una femmina sessualmente ricettiva (Everitt et al., 1987, Everitt e Stacey, 1987). Le droghe d'abuso sono anche gratificanti e rinforzanti, e gli animali impareranno ad auto-somministrarsi sostanze di abuso, inclusi gli oppiacei, la nicotina, l'alcol e gli psicostimolanti (Saggio, 1996, Pierce e Kumaresan, 2006, Feltenstein e See, 2008). Sebbene sia noto che sia le droghe d'abuso che i comportamenti sessuali attivano aree mesolimbiche del cervello, non è al momento chiaro se le droghe d'abuso influenzino gli stessi neuroni che mediano il comportamento sessuale.

Studi elettrofisiologici hanno dimostrato che cibo e cocaina attivano entrambi i neuroni nel NAc. Tuttavia, i due rinforzi non attivano le stesse celle all'interno del NAc (Carelli et al., 2000, Carelli e Wondolowski, 2003). Inoltre, l'auto-somministrazione di cibo e saccarosio non causa alterazioni a lungo termine delle proprietà elettrofisiologiche come indotto dalla cocaina (Chen et al., 2008). Al contrario, una raccolta di prove suggerisce che il comportamento sessuale maschile e le droghe d'abuso potrebbero effettivamente agire sugli stessi neuroni mesolimbici. Gli psicostimolanti e gli oppioidi alterano l'espressione del comportamento sessuale nei ratti maschi (Mitchell e Stewart, 1990, Fiorino e Phillips, 1999a, Fiorino e Phillips, 1999b). Dati recenti del nostro laboratorio hanno dimostrato che l'esperienza sessuale altera la reattività agli psicostimolanti come evidenziato da una sensibilizzata risposta locomotoria e sensibilizzata percezione della ricompensa alla d-amfetamina in animali sessualmente esperti (Pitchers et al., 2009). Una risposta simile è stata precedentemente osservata con ripetuta esposizione ad anfetamina o ad altre droghe d'abuso (Lett, 1989, Shippenberg e Heidbreder, 1995, Shippenberg et al., 1996, Vanderschuren e Kalivas, 2000). Insieme, questi risultati suggeriscono che il comportamento sessuale e le risposte alle droghe d'abuso sono mediati dagli stessi neuroni nel sistema mesolimbico. Quindi, il primo obiettivo del presente studio è quello di indagare l'attivazione neurale del sistema mesolimbico dal comportamento sessuale e dalla somministrazione del farmaco nello stesso animale. In particolare, abbiamo testato l'ipotesi che lo psicostimolante, la metanfetamina (Meth), agisca direttamente sui neuroni che normalmente mediano il comportamento sessuale.

La meth è una delle droghe illecite più abusate al mondo (NIDA, 2006, Ellkashef et al., 2008) perè stato spesso collegato a comportamenti sessuali alterati. È interessante notare che gli utenti di Meth riportano un aumento del desiderio sessuale e dell'eccitazione, nonché un maggiore piacere sessuale (Semple et al., 2002, Schilder et al., 2005). Inoltre, L'abuso di meth è comunemente associato a comportamenti sessualmente compulsivi (Rawson et al., 2002). Gli utenti spesso riferiscono di avere numerosi partner sessuali e hanno meno probabilità di utilizzare la protezione rispetto ad altri tossicodipendenti (Somlai et al., 2003, Springer et al., 2007). Sfortunatamente, gli studi che indicano che i Meth usano come un predittore del comportamento a rischio sessuale sono limitati in quanto si basano su auto-segnalazioni non confermate (Elifson et al., 2006). Pertanto, per comprendere questo complesso nesso farmaco-sesso è necessaria un'indagine sulla base cellulare dei cambiamenti indotti dalla Meth nel comportamento sessuale in un modello animale.

Alla luce delle prove sopra delineate che suggeriscono che le droghe d'abuso, e in particolare la Meth, possono agire su neuroni normalmente coinvolti nella mediazione del comportamento sessuale, l'obiettivo del presente studio era di indagare l'attivazione neurale mediante comportamento sessuale e somministrazione dello psicostimolante Meth. Questo studio ha implementato una tecnica neuroanatomica, utilizzando la visualizzazione immunoistochimica dei primi geni istantanei Fos e la mappa chinasi fosforilata (pERK) per rilevare rispettivamente l'attivazione neurale concomitante da comportamento sessuale e Meth. Fos è espresso solo all'interno del nucleo di cellule, con un massimo livello di espressione 30-90 minuti dopo l'attivazione del neurone. Ci sono ampie prove che l'attività sessuale induca l'espressione di Fos nel cervello (Pfaus e Heeb, 1997, Veening e Coolen, 1998), compreso il sistema mesocorticolimbico (Robertson et al., 1991, Balfour et al., 2004). Esistono anche prove che le droghe d'abuso inducono l'espressione di pERK nel sistema mesocorticolimbico (Valjent et al., 2000, Valjent et al., 2004, Valjent et al., 2005). In contrasto con l'espressione di Fos, la fosforilazione di ERK è un processo altamente dinamico e si verifica solo 5-20 minuti dopo l'attivazione neuronale. I distinti profili temporali di Fos e PERK li rendono una serie ideale di marcatori per la successiva attivazione neuronale da parte di due stimoli diversi.

PROCEDURE SPERIMENTALI

Soggetti

Ratti Sprague Dawley maschi adulti (210-225 g) ottenuti da Charles River Laboratories (Montreal, QC, Canada) sono stati ospitati due per gabbia in gabbie di plexiglas standard (gabbie di casa). La stanza degli animali è stata mantenuta in un ciclo di luce invertita 12 / 12 h (luci spente a 10.00 h). Cibo e acqua erano disponibili ad libitum. Tutti i test sono stati eseguiti durante la prima metà della fase oscura sotto illuminazione rossa fioca. Le femmine di stimolo utilizzate per il comportamento sessuale erano bilateralmente ovariectomizzate in anestesia profonda (13 mg / kg di ketamina e 87 mg / kg di xilazina) e hanno ricevuto un impianto sottocutaneo contenente 5% di estradiolo benzoato (EB) e 95% di colesterolo. La recettività sessuale è stata indotta dalla somministrazione sottocutanea (sc) di 500 μg progesterone in 0.1 h di 4 ml prima del test. Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per la cura degli animali presso l'Università dell'Ontario occidentale e sono conformi alle linee guida delineate dal Consiglio canadese per la cura degli animali.

Disegni sperimentali

Esperimenti 1 e 2: ratti maschi (n = 37) sono stati accoppiati con una femmina ricettiva a una eiaculazione (E) o per 30 min, che è mai venuto prima in gabbie di prova pulite (60 × 45 × 50 cm) durante cinque volte -settimanale sessioni di accoppiamento pre-test, per acquisire esperienza sessuale. Durante le ultime due sessioni, sono stati registrati tutti i parametri standard per le prestazioni sessuali, tra cui: latenza di montaggio (ML, tempo dall'introduzione della femmina fino alla prima montatura), latenza di intromissione (IL, tempo dall'introduzione della femmina fino alla prima montatura con penetrazione vaginale), latenza dell'eiaculazione (EL, tempo dalla prima intromissione all'eiaculazione), intervallo post eiaculazione (PEI, tempo dall'eiaculazione alla prima successiva intromissione), numero di supporti (M) e numero di intromissioni (IM) (Agmo, 1997). Tutti i maschi hanno ricevuto 1 ml / kg di iniezione giornaliera di 0.9% NaCl (soluzione fisiologica) 3 giorni consecutivi prima del giorno di test, per l'assuefazione alla manipolazione e alle iniezioni. Un giorno prima della giornata di test, tutti i maschi erano ospitati singolarmente. Nei maschi esperti, i Fos possono essere indotti da segnali contestuali condizionati associati all'esperienza sessuale precedente (Balfour et al, 2004). Pertanto, tutte le manipolazioni di accoppiamento e controllo durante i test finali sono state condotte nella gabbia di casa (evitare di stimoli condizionali predittivi) per prevenire l'attivazione indotta da stimoli condizionali nei maschi di controllo senza controllo. I maschi sono stati distribuiti in otto gruppi sperimentali che non differivano in nessuna misura delle prestazioni sessuali durante le ultime due sessioni di accoppiamento (dati non mostrati). Durante il test finale, ai maschi è stato permesso di accoppiarsi nella loro gabbia di casa fino a quando non hanno mostrato un'eiaculazione (sesso) o non hanno ricevuto una partner femminile (nessun sesso). Tutti i maschi accoppiati sono stati perfusi con 60 minuti dopo l'inizio dell'accoppiamento per consentire l'analisi dell'espressione Fos indotta da accoppiamento. I maschi hanno ricevuto un'iniezione di 4 mg / kg Meth o 1 ml / kg di soluzione salina (sc) (n = 4 ciascuno), 10 (esperimento 1) o 15 (esperimento 2) min prima della perfusione, per l'analisi della fosforilazione indotta da farmaci di MAP chinasi. Il dosaggio e il tempo prima della perfusione erano basati su rapporti precedenti (Choe et al., 2002, Choe e Wang, 2002, Chen e Chen, 2004, Mizoguchi et al., 2004, Ishikawa et al., 2006). I gruppi di controllo includevano maschi che non si accoppiavano, ma ricevevano Meth 10 (n = 7) o 15 (n = 5) min prima del sacrificio, o iniezioni saline 10 (n = 5) o 15 (n = 4) min prima del sacrificio . Dopo il sacrificio, i cervelli sono stati processati per immunoistochimica.

Esperimento 3: poiché è stata utilizzata una dose elevata di Meth nell'esperimento 1 e 2, è stato eseguito un esperimento neuroanatomico aggiuntivo per indagare se il comportamento sessuale e una dose inferiore di Meth inducono pattern dose dipendenti di attivazione neurale sovrapposta. Questo studio è stato condotto in modo identico agli esperimenti 1 e 2. Tuttavia, nel test finale, i gruppi accoppiati e non accoppiati (n = 6 ciascuno) hanno ricevuto 1 mg / kg Meth (sc) 15 min prima del sacrificio.

Esperimento 4: per verificare se l'attivazione neurale causata dal sesso e Meth è specifica per Meth, questo esperimento ha studiato se modelli simili di attivazione neurale sovrapposta potevano essere visti con la d-amfetamina (Amph) dello psicostimolante. Questo esperimento è stato condotto nello stesso modo degli esperimenti 1 e 2. Tuttavia, nel test finale, ai maschi è stato somministrato Amph (5 mg / kg) o soluzione salina (1 mg / kg) (sc) 15 min prima del sacrificio (n = 5 ciascuno). Controllare i maschi senza accoppiamento ricevuti salini o Amph 15 minuti prima del sacrificio. Viene fornita una panoramica dei gruppi sperimentali utilizzati negli esperimenti 1-4 Tabella 1.

Tabella 1      

Panoramica dei gruppi sperimentali inclusi negli esperimenti 1-4.

Preparazione del tessuto

Gli animali sono stati anestetizzati con pentobarbital (270 mg / kg; ip) e perfusi transcardialmente con 5 ml di soluzione salina seguita da 500 ml 4% paraformaldeide in tampone fosfato 0.1 M (PB). I cervelli sono stati rimossi e post-fissati per 1 h a temperatura ambiente nello stesso fissativo, quindi immersi in 20% saccarosio e 0.01% sodio azide in 0.1 M PB e conservati a 4 ° C. Sezioni coronali (35 μm) sono state tagliate su un microtomo congelatore (H400R, Micron, Germania), raccolte in quattro serie parallele in soluzione crioprotettiva (30% saccarosio e 30% etilenglicole in 0.1 M PB) e conservate a 20 ° C fino a ulteriore in lavorazione.

L'immunoistochimica

Tutte le incubazioni sono state eseguite a temperatura ambiente con agitazione delicata. Le sezioni flottanti libere sono state lavate estesamente con 0.1 M soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) tra le incubazioni. Le sezioni sono state incubate in 1% H2O2 per 10 min, quindi bloccato in soluzione di incubazione (PBS contenente 0.1% di albumina di siero bovino e 0.4% di Triton X-100) per 1 h.

pERK / Fos

Il tessuto è stato incubato durante la notte con un anticorpo policlonale di coniglio contro p42 e p44 mappe chinasi ERK1 ed ERK2 (pERK; 1: esperimento 400 1 lotto 19; 1: 4.000 esperimento 2 e 3 lotto 21; Cell segnalazione Cat # 9101;), seguito da un Incubazioni 1 h con IgG anti-coniglio asino biotinilato (1: 500, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) e complesso di perossidasi di avidina-rafano (ABC Elite; 1: 1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA). Quindi, il tessuto è stato incubato per 10 min con tyramide biotinilato (BT; 1: 250 in PBS + 0.003% H2O2; Tyramid Signal Amplification Kit, NEN Life Sciences, Boston, MA) e per 30 min con strepavidina coniugata Alexa 488 (1: 100, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA). Successivamente, il tessuto è stato incubato durante la notte con un anticorpo policlonale di coniglio contro c-Fos (1: 500; SC-52; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), seguito da un'incubazione min 30 con Alexa 555 di capra anti-coniglio (1: 200; Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA). Dopo la colorazione, le sezioni sono state lavate accuratamente in 0.1 M PB, montate su vetrini con gelatina 0.3% in ddH20 e ricoperto con un mezzo di montaggio acquoso (Gelvatol) contenente agente anti-sbiadimento 1,4-diazabiciclo (2,2) ottano (DABCO; 50 mg / ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). I controlli immunoistochimici includevano l'omissione di uno o entrambi gli anticorpi primari, con conseguente assenza di etichettatura nella lunghezza d'onda appropriata.

Analisi dei dati

Comportamento sessuale

Per tutti e quattro gli esperimenti, i parametri standard per le prestazioni sessuali sono stati registrati come descritto sopra e analizzati utilizzando l'analisi della varianza (ANOVA). L'analisi dei dati sul comportamento sessuale durante il giorno del test finale non ha rivelato differenze significative tra i gruppi in nessuno dei parametri della performance sessuale.

Conteggio delle cellule PERK / Fos

Cellule singole e doppie per Fos e pERK sono state contate nei livelli caudali delle subregioni core e shell NAc, amigdala basolaterale (BLA), amigdala mediale posterodorsale (MEApd), amigdala centrale (CeA), nucleo preottico mediale (MPN), posteromediale e nucleo del letto posterolaterale dello stria terminale (BNSTpm e BNSTpl), e l'area cingolata anteriore (ACA), prelimbica (PL) e le subregioni di infralimbico (IL) del mPFC. Le immagini sono state acquisite utilizzando una camera CCD raffreddata (Microfire, Optronics) collegata a un microscopio Leica (DM500B, Leica Microsystems, Wetzlar, Germania) e il software Neurolucida (MicroBrightfield Inc) con impostazioni fisse della fotocamera per tutti i soggetti (utilizzando gli obiettivi 10x). Utilizzando il software neurolucida, le aree di analisi sono state definite sulla base di punti di riferimento (Swanson, 1998) unico per ogni regione del cervello (vedi Figure 1 ). Le aree standard di analisi sono state utilizzate in tutte le aree eccetto core e shell di NAc. Nelle ultime aree, l'espressione pERK e Fos non era omogenea e appariva in pattern simili a patch. Pertanto, l'intero nucleo e il guscio erano delineati sulla base di punti di riferimento (ventricolo laterale, commisure anteriori e isole di Calleja). Le aree di analisi non differivano tra i gruppi sperimentali e erano 1.3 mm2 nel core e nella shell di NAc. Le aree standard di analisi per le restanti aree erano: 1.6 mm2 nel BLA, 2.5 e 2.25 mm2 rispettivamente in MEApd e CeA, 1.0 mm2 nel MPN, 1.25 mm2 nelle sottoregioni BNST e mPFC e 3.15 mm2 nel VTA. Due sezioni sono state contate bilateralmente per ogni regione del cervello per animale, e sono stati calcolati il ​​numero di cellule singole e doppie etichettate per pERK e Fos e le percentuali di cellule pERK che hanno espresso il marcatore Fos. Per gli esperimenti 1, 2 e 4, le medie di gruppo sono state confrontate usando ANOVA bidimensionale (fattori: accoppiamento e farmaco) e LSD di Fisher per post hoc confronti a un livello significativo di 0.05. Per l'esperimento 3, le medie di gruppo sono state confrontate usando t-test non appaiati a un livello significativo di 0.05.

Figure 1       

Disegni schematici e immagini che illustrano le aree di analisi del cervello. Le aree di analisi indicate erano basate su punti di riferimento unici per ciascuna regione del cervello, non differivano tra i gruppi sperimentali e erano 1.25 mm2 in sottoregioni di mPFC (a), 1.3 mm2 nel ...

Immagini

Immagini digitali per Figure 3 sono stati catturati utilizzando una camera CCD (DFC 340FX, Leica) collegata a un microscopio Leica (DM500B) e sono stati importati nel software Adobe Photoshop 9.0 (Adobe Systems, San Jose, CA). Le immagini non sono state alterate in alcun modo tranne che per la regolazione della luminosità.

Figure 3       

Immagini rappresentative delle sezioni NAc immunocolorate per Fos (rosso; a, d, g, j) e pERK (verde; b, e, h, k) di animali di ciascun gruppo sperimentale: No Sex + Sal (a, b, c) , Sesso + Sal (d, e, f), No Sesso + Meth (g, h, i) e Sesso + Meth (j, k, l). I pannelli giusti sono ...

RISULTATI

Attivazione neurale del sistema limbico per comportamento sessuale e somministrazione di meth

Esperimento 1: analisi di cellule singole e doppie marcate per Fos indotto da accoppiamento e pERK indotto da Meth nei maschi che hanno ricevuto Meth 10 minuti prima del sacrificio hanno rivelato Fos indotti nell'MNN, BNSTpm, NAc core e shell, BLA, VTA, e tutte le sottoregioni di mPFC, coerenti con studi precedenti che dimostrano l'espressione di Fos indotta da accoppiamento in queste aree (Baum e Everitt, 1992, Pfaus e Heeb, 1997, Veening e Coolen, 1998, Hull et al., 1999). La somministrazione di Meth 10 minuti prima del sacrificio indotto da pERK nel core e shell NAc, BLA, MeApd, CeA, BNSTpl e regioni di mPFC, coerenti con i pattern di attivazione indotti da altri psicostimolanti (Valjent et al., 2000, Valjent et al., 2004, Valjent et al., 2005).

Inoltre, sono stati osservati tre modelli di co-espressione dell'attivazione neurale da comportamento sessuale e Meth: in primo luogo, sono state identificate aree del cervello in cui sesso e farmaci attivavano popolazioni neurali non sovrapposte (Tabella 2). In particolare, in CeA, MEApd, BNSTpl e mPFC, aumenti significativi sia del pERK indotto da farmaci (F (1,16) = 7.39-48.8; p = 0.015- <0.001) che del Fos indotto dal sesso (F (1,16, 16.53) = 158.83–0.001; p <1,16) sono stati osservati. Tuttavia, in queste regioni non ci sono stati aumenti significativi nei neuroni con doppia etichetta nei maschi accoppiati trattati con Meth. L'unica eccezione è stata la MEApd, in cui è stato riscontrato un effetto di accoppiamento sul numero di cellule con doppia etichetta (F (9.991) = 0.006; p = XNUMX). Tuttavia, non c'è stato alcun effetto complessivo del trattamento farmacologico e la doppia etichettatura nei gruppi trattati con Meth non era significativamente più alta rispetto ai gruppi trattati con soluzione salina, quindi non è stata causata dal farmaco (Tabella 2). In secondo luogo, sono state identificate aree del cervello in cui l'attivazione neurale è stata solo indotta dall'accoppiamento (Tabella 3). Nello specifico, MPN, BNSTpm e VTA sono stati attivati ​​solo dall'accoppiamento e contenevano aumenti significativi nei Fos indotti dall'accoppiamento (F (1,16) = 14.99-248.99; p ≤ 0.001), ma nessun pERK indotto da Meth.

Tabella 2      

Panoramica delle espressioni Fos indotte da accoppiamento e PERK indotte da Meth nelle aree cerebrali in cui sesso e farmaci attivano popolazioni neurali non sovrapposte.
Tabella 3      

Panoramica delle espressioni Fos indotte dall'induzione e PERK indotte da Meth nelle aree del cervello in cui l'attivazione neurale è stata indotta solo dall'accoppiamento.

Infine, sono state trovate aree cerebrali in cui il sesso e le droghe hanno attivato la sovrapposizione di popolazioni di neuroni (Figure 2 ed and3) .3). Nel nucleo e nel guscio NAc, BLA e ACA, c'erano effetti complessivi dell'accoppiamento (F (1,16) = 7.87-48.43; p = 0.013- <0.001) e del trattamento farmacologico (F (1,16) = 6.39– 52.68; p = 0.022- <0.001), nonché un'interazione tra questi due fattori (F (1,16) = 5.082-47.27; p = 0.04- <0.001; nessuna interazione significativa in ACA) sul numero di cellule che esprimono entrambi Fos indotto dall'accoppiamento e pERK indotto da Meth. L'analisi post hoc ha rivelato che il numero di neuroni con doppia etichetta era significativamente più alto nei maschi accoppiati con Meth iniettato rispetto ai maschi trattati con Meth non accoppiati (p = 0.027- <0.001) o con soluzione salina accoppiata (p = 0.001- <0.001) (Figure 2 ed and3) .3). Quando i dati sono stati espressi come percentuali di neuroni attivati ​​dalla droga, 39.2 ± 5.3% nel core NAc, 39.2 ± 5.8% nel guscio NAc, 40.9 ± 6.3% nel BLA e 50.0 ± 5.3% dei neuroni ACA sono stati attivati ​​da sia accoppiamento che Meth.

Figure 2       

Fositi indotti dal sesso ed espressione di pERK indotta da Meth nei neuroni NAc, BLA e ACA 10 min dopo la somministrazione di 4 mg / kg Meth. Numeri medi ± sem di cellule Fos (a, d, g, j), pERK (b, e, h, k) e duali (c, f, i, l) nel nucleo di NAc (a, ...

Un'osservazione inaspettata è stata che il comportamento sessuale ha colpito il pERK indotto da Meth. Sebbene Meth abbia indotto significativamente i livelli di pERK in entrambi i gruppi iniettati con Meth iniettati, in NAc, BLA e ACA, l'etichettatura di pERK era significativamente inferiore nei maschi accoppiati con Meth-iniettato rispetto ai maschi Meth-iniettati non accoppiati (Figura 2b, e, h, k; p = 0.017- <0.001). Questa scoperta può ulteriormente supportare l'ipotesi che il sesso e le droghe agiscano sugli stessi neuroni, ma potrebbe anche essere indicativo di alterazioni indotte dall'accoppiamento nell'assorbimento o nel metabolismo di farmaci che a loro volta causano alterazioni delle risposte neurali a Meth. Per indagare se il comportamento sessuale causa un diverso pattern temporale di attivazione indotta da farmaci, sezioni di NAc, BLA e ACA sono state colorate per i maschi sacrificati in un momento successivo (15 min) dopo la somministrazione del farmaco (esperimento 2).

Esperimento 2: l'analisi di cellule singole e doppie ha confermato i risultati sopra descritti che il comportamento sessuale e la successiva esposizione a Meth 15 minuti prima del sacrificio hanno portato ad aumenti significativi di immunosommercio Fos e pERK nel nucleo e nel guscio NAc, BLA e ACA. Inoltre, in queste aree sono state trovate di nuovo significative co-espressioni di Fos indotti da accoppiamento e pERK indotto da Meth (Figure 4 ; effetto di accoppiamento: F (1,12) = 15.93–76.62; p = 0.002- <0.001; effetto del farmaco: F (1,12) = 14.11–54.41; p = 0.003- <0.001). Il numero di neuroni con doppia etichetta nei maschi accoppiati con Meth iniettato era significativamente più alto rispetto ai maschi non accoppiati trattati con Meth (p <0.001) o accoppiati trattati con soluzione salina (p <0.001). Quando i dati erano espressi come percentuali di neuroni attivati ​​da farmaci, 47.2 ± 5.4% (nucleo NAc), 42.7 ± 7.6% (involucro NAc), 36.7 ± 3.7% (BLA) e 59.5 ± 5.1% (ACA) dei neuroni attivati per accoppiamento sono stati attivati ​​anche da Meth. Inoltre, il pERK indotto da farmaci non differiva tra animali accoppiati e non accoppiati (Figura 4b, e, h, k), in tutte le aree ad eccezione dell'ACA (p <0.001). Questi dati indicano che il comportamento sessuale provoca effettivamente un'alterazione del modello temporale di induzione del pERK da parte di Meth.

Figure 4       

Fositi indotti dal sesso ed espressione di pERK indotta da Meth nei neuroni NAc, BLA e ACA 15 min dopo la somministrazione di 4 mg / kg Meth. Numeri medi ± sem di cellule Fos (a, d, g, j), pERK (b, e, h, k) e duali (c, f, i, l) nel nucleo di NAc (a, ...

Attivazione neurale a seguito di comportamento sessuale e 1 mg / kg Meth

Finora i risultati hanno rivelato che il comportamento sessuale e 4 mg / kg Meth hanno attivato popolazioni sovrapposte di neuroni nel nucleo e nel guscio NAc, BLA e ACA. To indagare l'influenza del dosaggio del farmaco su questa sovrapposizione nell'attivazione, i modelli di attivazione neurale sono stati anche studiati utilizzando una dose inferiore di Meth. Il nucleo e il guscio di NAc, BLA e ACA sono stati analizzati per l'attivazione indotta dal sesso e dal Meth. In effetti, il comportamento sessuale e la successiva esposizione a Meth hanno portato a significativi aumenti dell'immunomarcatura Fos e pERK nelle subregioni core e shell NAc, BLA e neuroni nella regione ACA dell'mPFC (Figure 5 ). È interessante notare che la dose inferiore di Meth ha prodotto un numero simile di neuroni marcati con pERK come indotto da 4 mg / kg Meth nelle quattro regioni cerebrali analizzate. Ancora più importante, il nucleo e la shell di NAc, BLA e ACA hanno mostrato aumenti significativi nel numero di cellule con doppia etichetta (Figura 5c, f, i, l) rispetto ai maschi non accoppiati a cui è stata somministrata Meth (p = 0.003- <0.001). Quando i dati erano espressi come percentuali di neuroni attivati ​​da farmaci, il 21.1 ± 0.9% e il 20.4 ± 1.8% nel nucleo e nel guscio NAc rispettivamente, il 41.9 ± 3.9% nel BLA e il 49.8 ± 0.8% dei neuroni ACA sono stati attivati ​​dal sesso e Meth.

Figure 5       

Fositi indotti dal sesso ed espressione di pERK indotta da Meth nei neuroni NAc, BLA e ACA 15 min dopo la somministrazione di 1 mg / kg Meth. Numeri medi ± sem di cellule Fos (a, d, g, j), pERK (b, e, h, k) e duali (c, f, i, l) nel nucleo di NAc (a, ...

Attivazione neurale dopo comportamento sessuale e somministrazione di d-Amfetamina

Per verificare se i suddetti risultati fossero specifici per Meth, è stato condotto un ulteriore esperimento per studiare l'attivazione neurale di accoppiamento e di Amph. L'analisi di cellule singole e doppie marcate per pERK e Fos ha mostrato che il comportamento sessuale e la successiva esposizione ad Amph hanno portato ad un significativo aumento di immunosommercio Fos e pERK nel core NAc e shell e BLA (Figure 6 ; effetto di accoppiamento: F (1,15) = 7.38-69.71; p = 0.016- <0.001; effetto del farmaco: F (1,15) = 4.70–46.01; p = 0.047- <0.001). Inoltre, il numero di neuroni a doppia etichetta era significativamente più alto nei maschi trattati con Amph accoppiati rispetto ai maschi trattati con Amph non accoppiati (p = 0.009- <0.001) o trattati con soluzione salina accoppiata (p = 0.015- <0.001) (Figura 6c, f, i). Quando i dati sono stati espressi come percentuali di neuroni attivati ​​dalla droga, 25.7 ± 2.8% e 18.0 ± 3.2% rispettivamente nel core e nello shell NAc e 31.4 ± 2.0% dei neuroni BLA sono stati attivati ​​sia da accoppiamento che da Amph. La regione ACA dell'mPFC mostrava livelli significativi di Fos indotti dall'accoppiamento (Figura 6j; F (1,15) = 168.51; p <0.001). Tuttavia, a differenza di Meth, Amph non ha determinato aumenti significativi dei livelli di pERK indotti da farmaci nell'ACA (Figura 6k) o numeri di neuroni a doppia etichetta nell'ACA (Figura 6l) rispetto ai maschi con iniezione salina accoppiata e non trattata.

Figure 6       

Espressione pERK indotta da Fos e indotta da sesso nei neuroni NAc, BLA e ACA 15 min dopo la somministrazione di 5 mg / kg Amph. Numeri medi ± sem di cellule Fos (a, d, g, j), pERK (b, e, h, k) e duali (c, f, i, l) nel nucleo di NAc (a, ...

DISCUSSIONE

L'attuale studio dimostra a livello cellulare una sovrapposizione tra l'attivazione neurale da parte del comportamento sessuale del rinforzo naturale e il Meth psicostimolante. Pertanto, questi dati mostrano che non solo i farmaci agiscono sulle stesse regioni del cervello che regolano la ricompensa naturale, ma in realtà i farmaci attivano le stesse cellule coinvolte nella regolazione della ricompensa naturale. Nello specifico, è stato dimostrato che il comportamento sessuale e la meth hanno coattivato una popolazione di neuroni nella regione NAc e shell, BLA e ACA della mPFC, identificando potenziali siti in cui Meth può influenzare il comportamento sessuale.

L'attuale scoperta che il comportamento sessuale e la somministrazione di Meth attivano popolazioni sovrapposte di neuroni nel NAc, BLA e ACA è in contrasto con i risultati di altri studi che dimostrano che diverse popolazioni di neuroni NAc codificano la droga e la ricompensa naturale.

In particolare, studi elettrofisiologici che hanno confrontato l'attivazione neurale durante l'auto-somministrazione di cocaina per via endovenosa (cibo e acqua) hanno indicato che l'auto-somministrazione di cocaina attivava una popolazione differenziale di neuroni non sovrapponibile che generalmente non rispondeva durante la risposta operante all'acqua e rinforzo alimentare (92%). Solo il 8% dei neuroni accumbal ha mostrato l'attivazione sia della cocaina che della ricompensa naturale (Carelli et al., 2000).

Al contrario, una maggioranza (65%) di cellule nel NAc ha mostrato attivazione da diversi premi naturali (cibo e acqua), anche se un rinforzo era più appetibile (saccarosio) (Roop et al., 2002).

Diversi fattori potrebbero aver contribuito alla discrepanza con i risultati attuali. Innanzitutto, sono stati utilizzati approcci tecnici diversi per indagare sull'attività neurale. L'attuale studio ha utilizzato un metodo neuroanatomico per il rilevamento dell'attivazione neurale simultanea da parte di due diversi stimoli utilizzando la doppia immunocitochimica a fluorescenza per Fos e pERK, consentendo l'analisi dell'attivazione di una singola cellula su ampie aree cerebrali. Al contrario, gli studi di Carelli e collaboratori hanno utilizzato registrazioni elettrofisiologiche limitate al NAc di animali che si comportano per stabilire se l'auto-somministrazione di droghe d'abuso attivasse gli stessi circuiti neurali usati dalle ricompense naturali.

In secondo luogo, l'attuale studio ha studiato una diversa ricompensa naturale, ad esempio comportamento sessuale rispetto a studi precedenti, che utilizzavano cibo e acqua in ratti soggetti a restrizioni (Carelli, 2000). Il cibo e l'acqua potrebbero avere un minore valore gratificante rispetto all'accoppiamento. Il comportamento sessuale è altamente gratificante e i ratti formano facilmente CPP per copulare (Agmo e Berenfeld, 1990, Martinez e Paredes, 2001, Tenk, 2008). Anche se i ratti con dieta ristretta formano CPP per l'acqua (Agmo et al., 1993, Perks e Clifton, 1997) e cibo (Perks e Clifton, 1997), dI topi senza restrizioni preferibilmente consumano e formano CPP per alimenti più appetibili (Jarosz et al., 2006, Jarosz et al., 2007).

In terzo luogo, i nostri studi includevano diversi farmaci contro l'abuso rispetto agli studi precedenti, utilizzando metanfetamina e anfetamina invece della cocaina. I risultati attuali dimostrano che specificamente Meth e, in misura minore, anfetamina, hanno provocato l'attivazione di neuroni attivati ​​anche dal comportamento sessuale. Anche l'esperienza farmacologica ha avuto un ruolo nelle nostre scoperte. Gli studi attuali hanno utilizzato animali che sono stati sessualmente vissuti, ma drogati ingenui. Al contrario, gli studi elettrofisiologici di Carelli e collaboratori hanno utilizzato animali "ben addestrati" che hanno ricevuto ripetute esposizioni alla cocaina.

Quindi, è possibile che l'attivazione dei neuroni attivata dal Meth dai comportamenti sessuali sia alterata nei ratti con esperienza di droghe. Tuttavia, studi preliminari del nostro laboratorio suggeriscono che l'esperienza farmacologica è improbabile che sia un fattore importante come comportamento sessuale e trattamento Meth nei maschi trattati cronicamente con Meth co-attivato percentuali simili di neuroni attivati ​​dalla droga come riportato nello studio corrente (20.3 ± 2.5% nel core NAc e 27.8 ± 1.3% nella shell NAc, Frohmader e Coolen, osservazioni non pubblicate).

Infine, l'attuale studio ha studiato l'azione "diretta" dei farmaci che utilizzano la somministrazione passiva. Pertanto, l'analisi attuale non rivela informazioni riguardanti i circuiti neurali coinvolti nella ricerca di farmaci o segnali associati alla ricompensa del farmaco, ma piuttosto rivela l'attività neurale causata dall'azione farmacologica del farmaco. Nei precedenti studi elettrofisiologici, l'attività neurale di NAc che si verifica entro secondi di risposte rinforzate non è il risultato dell'azione farmacologica della cocaina, ma è fortemente dipendente dai fattori associativi all'interno del paradigma di auto-somministrazione (Carelli, 2000, Carelli, 2002). Nello specifico, l'attività neurale di NAc è influenzata da presentazioni indipendenti dalla risposta di stimoli associati alla somministrazione di cocaina per via endovenosa e da contingenze strumentali (cioè pressioni a leva) insite in questo paradigma comportamentale (Carelli, 2000, Carelli e Ijames, 2001, Carelli, 2002, Carelli e Wightman, 2004). In sintesi, le nostre scoperte di co-attivazione mediante la ricompensa naturale e farmaceutica possono essere specifiche per l'attivazione da comportamento sessuale e Meth e Amph passivamente amministrati.

Meth e sesso hanno attivato la sovrapposizione di popolazioni di neuroni nel nucleo e nel guscio di NAc in modo dose-dipendente. I neuroni co-attivati ​​nel NAc possono mediare i potenziali effetti di Meth sulla motivazione e le proprietà gratificanti del comportamento sessuale, in quanto le lesioni del NAc interrompono il comportamento sessuale (Liu et al., 1998, Kippin et al., 2004). Inoltre, questi neuroni sono potenzialmente un locus per gli effetti del farmaco dose-dipendente sull'accoppiamento, dal momento che la dose inferiore di Meth (1 mg / kg) ha ridotto il numero di cellule con doppia etichetta di 50% rispetto alla dose più alta di Meth (4 mg / kg). Sebbene questo studio non identifichi il fenotipo chimico dei neuroni co-attivati, studi precedenti hanno dimostrato che l'espressione di pERK e Fos indotta da farmaci nel NAc dipende dai recettori della dopamina (DA) e del glutammato (Valjent et al., 2000, Ferguson et al., 2003, Valjent et al., 2005, Sun et al., 2008). Sebbene non sia chiaro se l'attivazione neurale indotta dall'accoppiamento nel NAc dipenda da questi recettori, ciò è stato dimostrato su altre regioni del cervello, in particolare nell'area preottica mediale (Lumley e Scafo, 1999, Dominguez et al., 2007). Thus, Meth può agire sui neuroni attivati ​​anche durante il comportamento sessuale attraverso l'attivazione dei recettori della dopamina e del glutammato. Il ruolo del glutammato NAc nel comportamento sessuale non è al momento chiaro, ma è ben noto che la DA svolge un ruolo fondamentale nella motivazione del comportamento sessuale (Hull et al., 2002, Hull et al., 2004, Pfaus, 2009). Gli studi di microdialisi hanno riportato aumenti dell'efflusso di NAc durante le fasi appetitive e di consumo del comportamento sessuale maschile (Fiorino e Phillips, 1999a, Lorrain et al., 1999) e l'afflusso di DA mesolimbico è stato correlato alla facilitazione dell'iniziazione e del mantenimento del comportamento sessuale dei ratti (Pfaus e Everitt, 1995). Inoltre, gli studi di manipolazione del DA mostrano che gli antagonisti del DA nel NAc inibiscono il comportamento sessuale, mentre gli agonisti facilitano l'iniziazione del comportamento sessualer (Everitt et al., 1989, Pfaus e Phillips, 1989). Quindi, Meth può influenzare la motivazione per il comportamento sessuale attraverso l'attivazione dei recettori DA.

In contrasto con il NAc, il numero di cellule con doppia etichetta nel BLA e ACA è rimasto relativamente invariato indipendentemente dalla dose di Meth. Il BLA è fondamentale per l'apprendimento associativo discreto ed è fortemente coinvolto nel rinforzo condizionato e nella valutazione della ricompensa durante la risposta strumentale (Everitt et al., 1999, Cardinal et al., 2002, Vedi, 2002). I ratti lesionati BLA mostrano una pressione ridotta della leva per stimoli condizionati in coppia con il cibo (Everitt et al., 1989) o rinforzo sessuale (Everitt et al., 1989, Everitt, 1990). Al contrario, questa manipolazione non influenza la fase consumatrice della nutrizione e del comportamento sessuale (Cardinal et al., 2002). Il BLA svolge anche un ruolo chiave nella memoria degli stimoli condizionati associati agli stimoli della droga (Grace e Rosenkranz, 2002, Laviolette e Grace, 2006). Lesioni o inattivazioni farmacologiche del BLA bloccano l'acquisizione (Whitelaw et al., 1996) ed espressione (Grimm and See, 2000) reintroduzione della cocaina condizionata, senza influenzare il processo di somministrazione del farmaco. Inoltre, L'anfusione infusa direttamente nel BLA provoca un reintegrazione di un farmaco potenziato in presenza dei segnali condizionati (Vedi et al., 2003). Pertanto, è possibile che la trasmissione DA potenziata dallo psicostimolante nel BLA produca una salienza emotiva e una ricerca potenziate (Ledford et al., 2003) di ricompensa sessuale, contribuendo così al potenziamento della pulsione sessuale e al desiderio riportato da coloro che abusano di Meth (Semple et al., 2002, Verde e Halkitis, 2006).

Nell'ACA, l'attivazione neurale dei neuroni attivati ​​dal sesso era indipendente dal dosaggio e specifica per Meth, poiché non era stata osservata con Amph. Sebbene Meth e Amph abbiano proprietà strutturali e farmacologiche simili, Meth è uno psicostimolante più potente di Amph con effetti di lunga durata (NIDA, 2006). Studi di Goodwin et al. ha mostrato che Meth genera un più grande efflusso di DA e inibisce la clearance di DA localmente più efficacemente nel NAc di ratto rispetto ad Amph. Queste caratteristiche potrebbero contribuire alle proprietà di dipendenza di Meth rispetto ad Amph (Goodwin et al., 2009) e forse le differenze di attivazione neurale osservate tra i due farmaci. Tuttavia, non è chiaro se i diversi modelli di risultati siano dovuti a differenze di efficacia tra le droghe o problemi di potenza correlati alle dosi impiegate e sono necessarie ulteriori indagini.

La co-attivazione da parte di Meth e il sesso non sono stati osservati in altre sottoregioni di mPFC (IL e PL). Nel ratto, l'ACA è stato ampiamente studiato usando compiti appetitivi, supportando un ruolo nelle associazioni stimolo-rinforzo (Everitt et al., 1999, Vedi, 2002, Cardinal et al., 2003). Vi sono ampie prove che l'mPFC è coinvolto nel desiderio di droga e ricaduta nei comportamenti di ricerca di droghe e assunzione di droga sia negli uomini che nei ratti (Grant et al., 1996, Childress et al., 1999, Capriles et al., 2003, McLaughlin e See, 2003, Shaham et al., 2003, Kalivas e Volkow, 2005). ioIn linea con questo, è stato proposto che la disfunzione di mPFC causata da ripetute esposizioni a droghe d'abuso possa essere responsabile della riduzione del controllo degli impulsi e dell'aumento del comportamento diretto dalla droga, come osservato in molti tossicodipendenti (Jentsch e Taylor, 1999). Dati recenti del nostro laboratorio hanno dimostrato che le lesioni mPFC risultano in continua ricerca di comportamento sessuale quando questo era associato a uno stimolo avversivo (Davis et al., 2003). Anche se questo studio non ha investigato l'ACA, supporta l'ipotesi che l'mPFC (e l'ACA in particolare) media gli effetti di Meth su una perdita di controllo inibitorio sul comportamento sessuale come riportato da abusatori di Meth (Salo et al., 2007).

In conclusione, insieme questi studi costituiscono un primo passo critico verso una migliore comprensione di come le droghe d'abuso agiscono su percorsi neurali che normalmente mediano i premi naturali. Inoltre, questi risultati dimostrano che, contrariamente all'attuale convinzione che le droghe di abuso non attivano le stesse cellule nel sistema mesolimbico come ricompensa naturale, Meth, e in misura minore Amph, attivano le stesse cellule del comportamento sessuale. A loro volta, queste popolazioni neurali co-attivate possono influenzare la ricerca della ricompensa naturale a seguito dell'esposizione al farmaco. Infine, i risultati di questo studio possono contribuire in modo significativo alla nostra comprensione della base della dipendenza in generale. Il confronto delle somiglianze e delle differenze, così come le alterazioni nell'attivazione neurale del sistema mesolimbico provocate dal comportamento sessuale rispetto a droghe d'abuso possono portare a una migliore comprensione dell'abuso di sostanze e delle alterazioni associate nella ricompensa naturale.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni dal National Institutes of Health R01 DA014591 e Canadian Institutes of Health Research RN 014705 a LMC.

ABBREVIAZIONI

  • ABC
  • avidin-biotina-perossidasi di rafano complesso
  • ACA
  • area cingolata anteriore
  • Amph
  • d-amfetamina
  • BLA
  • amigdala basolaterale
  • BNSTpl
  • nucleo del letto posterolaterale degli stria terminali
  • BNSTpm
  • nucleo del letto posteromediale degli stria terminali
  • BT
  • tyramide biotinilato
  • CeA
  • amigdala centale
  • CPP
  • preferenza del luogo condizionata
  • E
  • eiaculazione
  • EL
  • eiaculazione latente
  • IF
  • area infralimbica
  • IL
  • latenza delle intromissioni
  • IM
  • intromissione
  • M
  • Mount
  • Chinasi MAP
  • proteina chinasi attivata dal mitogeno
  • MEApd
  • amigdala mediale posterodorsale
  • Meth
  • metanfetamine
  • ML
  • montare la latenza
  • mPFC
  • corteccia prefrontale mediale
  • MPN
  • nucleo preottico mediale
  • NAc
  • nucleo Accumbens
  • PB
  • tampone fosfato
  • PBS
  • tampone fosfato salino
  • PEI
  • intervallo post eiaculatorio
  • vantaggio
  • Chinasi MAP fosforilata
  • PL
  • area prelimbic
  • VTA
  • area tegmentale ventrale

Le note

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