DeltaFosB regola indirettamente l'attività del promotore Cck (2010)

Cervello. 2010 può 6; 1329: 10-20.

Pubblicato online 2010 March 11. doi: 10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,¹ Megan Wald,¹ Madison Paddock,¹ Elizabeth Hoffman,¹ Rachel Arey,² Scott Edwards,² Sade Spencer,² Eric J. Nestler,³ ed Colleen A. McClung^{2, *}

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Astratto

Alcuni degli importanti cambiamenti biochimici, strutturali e comportamentali indotti dall'esposizione cronica a droghe d'abuso sembrano essere mediati dal fattore di trascrizione altamente stabile ΔFosB. Il lavoro precedente ha dimostrato che la sovraespressione di ÀFosB nei topi per 2 settimane porta ad un aumento nell'espressione di numerosi geni nello striato, la maggior parte dei quali viene successivamente downregolata dopo 8 settimane di espressione di ÀFosB. È interessante notare che un gran numero di questi geni è stato anche regolato in modo eccessivo nei topi che sovraesprimono il fattore di trascrizione CREB. Non è chiaro da questo studio, tuttavia, se ΔFosB a breve termine regola questi geni tramite CREB. Qui troviamo che 2 settimane di sovraespressione di ÀFosB aumenta l'espressione di CREB nello striato, un effetto che si dissipa di 8 settimane. L'induzione precoce è associata ad un aumento del legame del CREB con alcuni promotori del gene bersaglio in questa regione del cervello. Sorprendentemente, un gene che era un sospetto bersaglio CREB basato su precedenti rapporti, colecistochinina (Cck), non era controllato da CREB nello striato. Per indagare ulteriormente sulla regolamentazione di CCK dopo la sovraespressione di ΔFosB, abbiamo confermato che la sovraespressione a breve termine di ΔFosB aumenta entrambi CCK attività del promotore ed espressione genica. Aumenta anche l'attività di legame in un putativo sito di legame del CREB (CRE) nel CCK promotore. Tuttavia, mentre il sito CRE è necessario per la normale espressione basale di CCK, non è richiesto per l'induzione ΔFosB di CCK. Presi insieme, questi risultati suggeriscono che mentre l'induzione a breve termine di ΔFosB aumenta l'espressione e l'attività di CREB in alcuni promotori di geni, questo non è l'unico meccanismo attraverso il quale i geni sono sovraregolati in queste condizioni.

parole chiave: nucleo accumbens, trascrizione, dipendenza

INTRODUZIONE

L'esposizione cronica a droghe d'abuso provoca cambiamenti biochimici e strutturali in diverse regioni del cervello. Si ritiene che questi cambiamenti implichino alterazioni nei profili di espressione genica nel sistema mesolimbico. Questo sistema è composto da neuroni dopaminergici che si sviluppano dall'area tegmentale ventrale (VTA) nel mesencefalo a neuroni spinosi medi nel nucleo accumbens (NAc) (striato ventrale) nonché in una serie di altre regioni del cervello. Alterazioni nell'attività di due fattori di trascrizione, proteina di legame dell'elemento di risposta del cAMP (CREB) e ΔFosB (una famiglia di proteine Fos), sono state proposte per mediare molti dei cambiamenti biochimici, strutturali e comportamentali osservati con esposizione cronica a droghe d'abuso ( recensito da Nestler, 2005).

CREB è un fattore di trascrizione onnipresente espresso appartenente alla famiglia CREB / ATF. Gli omodimeri CREB si legano alle variazioni di una sequenza CRE (consenso: TGACGTCA) che si trovano nei promotori di molti geni. La fosforilazione del CREB (prevalentemente in serina 133, sebbene altri siti siano stati identificati) può essere stimolata da diverse cascate di segnalazione, comprese quelle a valle dei recettori della dopamina (Cole et al., 1995). In seguito alla fosforilazione della serina 133, CREB recluta la proteina legante CREB (CBP) del co-attivatore o le proteine correlate che portano ad un aumento dell'espressione genica (rivisto da Johannessen et al., 2004). L'esposizione cronica a droghe oppiacee o psicostimolanti induce aumenti transitori nell'attività CREB nel nucleo accumbens (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), un adattamento pensato per diminuire le proprietà gratificanti di questi farmaci e per contribuire allo stato emotivo negativo del ritiro della droga (Nestler, 2005).

Lsi ritiene che gli adattamenti duraturi e onerosi per droghe d'abuso siano mediati in parte da ΔFosB, una variante di splicing altamente stabile di FosB (Nestler et al., 1999; McClung et al., 2004; Nestler, 2008). I familiari di Fos si dimmerizzano con membri della famiglia Jun per formare un complesso 1 (AP-1) della proteina attivatore. I complessi di trascrizione AP-1 si legano alle variazioni dell'elemento di risposta AP-1 (consenso: TGACTCA) per regolare la trascrizione (rivisto da Chinenov e Kerppola, 2001). Mentre l'esposizione acuta a droghe d'abuso porta all'induzione di breve durata (ore) dei membri della famiglia Fos (così come all'aumentata attività del CREB), l'esposizione ripetuta al farmaco porta all'accumulo del ΔFosB altamente stabile (Hope et al., 1994; Perrotti et al., 2008), la cui espressione persiste per settimane.

Topi bi transgenici che sovraesprimono indifferentemente sia ΔFosB che CREB nello striato adulto mostrano molti dei fenotipi biochimici e comportamentali osservati negli animali esposti ripetutamente a psicostimolanti o altre droghe di abuso. UNLa nalisi dei cambiamenti di espressione genica in questi animali transgenici ha identificato numerosi geni sovraregolati dalla sovraespressione a breve termine (2 settimane) di ΔFosB, cambiamenti associati a una concomitante riduzione della ricompensa del farmaco. I cambiamenti nell'espressione genica e nella risposta comportamentale con ΔFosB a breve termine erano notevolmente simili a quelli osservati negli animali con sovraesprimono CREB per 2 o 8 settimane (McClung e Nestler, 2003). In forte contrasto, la sovraespressione a lungo termine (8 settimane) di ΔFosB ha diminuito l'espressione di molti di questi stessi geni e ha portato ad un aumento della ricompensa del farmaco (Kelz et al., 1999; McClung e Nestler, 2003).

Un gene identificato in questi studi è colecistochinina (CCK), un neuropeptide prodotto in diverse regioni del cervello, incluso lo striato (Hokfelt et al., 1980). CCK può modulare la trasmissione dopaminergica (Vaccarino, 1992), è coinvolto nella ricompensa e nel rinforzo della droga (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002), ed è indotta nello striato da cocaina cronica (Ding e Mocchetti, 1992). Inoltre il CCK il promotore ha dimostrato di essere reattivo a entrambi i complessi CREB e AP-1 (Haun e Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Poiché molti dei geni (incluso CCK) che mostrava un aumento dell'espressione dopo CREB e un'espressione a breve termine di ΔFosB erano noti o sospetti geni bersaglio di CREB (McClung e Nestler, 2003), volevamo determinare se l'espressione ΔFosB a breve termine porta alla regolazione di questi geni (con particolare attenzione) CCK) attraverso la regolazione del CREB o attraverso meccanismi più complessi di regolazione genica.

RISULTATI

La sovraespressione di ÀFosB aumenta transitoriamente i livelli di CREB

Abbiamo usato il western blotting per indagare se la sovraespressione di ΔFosB aumenta i livelli di proteina CREB nello striato dei topi. Per questo studio, abbiamo utilizzato topi bi-transgenici (linea 11A) che trasportano sia un transgene NSE-tTA sia un transgene TetOp-ΔFosB. In assenza di doxiciclina, questi topi mostrano un forte aumento dell'espressione ΔFosB nei neuroni positivi al dynorfone nello striato (Kelz et al., 1999). Questo metodo di sovraesprimono ΔFosB è stato ampiamente documentato e consente una sovraespressione specifica della regione, che è in parallelo con l'induzione ΔFosB osservata negli animali esposti a cocaina cronica (Hope et al., 1994; Kelz et al., 1999). Abbiamo trovato che nei topi 11A che sovraesprimono ΔFosB, i livelli di proteina CREB erano significativamente sovraregolati dopo 2 settimane di espressione e questi livelli tornavano al basale dopo 8 settimane di espressione (Figura 1A, n = 8). Per determinare se i cambiamenti nei livelli di CREB con sovraespressione di ΔFosB a breve termine potessero essere replicati in un altro sistema, abbiamo sovraespresso transitoriamente ΔFosB nelle cellule PC12 e abbiamo scoperto che i livelli di CREB sono aumentati in modo significativo (p <0.05) rispetto ai controlli (Figura 1B, n = 4). Questi risultati dimostrano che l'espressione ΔFosB a breve termine aumenta i livelli di proteina CREB.

I livelli CREB aumentano con la sovraespressione di ΔFosB. Analisi Western blot dei lisati da (A) mouse striato da 11A topi dox per 2 o 8 settimane o (B) Cellule PC12 che sovraesprimono ΔFosB. Dati in A sono mostrati come variazione percentuale in off dox rispetto ...

Sia ΔFosB che CREB si legano ai promotori di specifici geni target nello striato dopo sovraespressione a breve termine ΔFosB

Abbiamo utilizzato analisi ChIP (immunoprecipitazione della cromatina) del tessuto striatale per determinare se il legame ΔFosB o CREB si è verificato in alcuni promotori del gene bersaglio e se questo legame è stato aumentato in seguito a sovraespressione ΔFosB a breve termine. Abbiamo analizzato il legame al BDNF ed CCK promotori, dal momento che entrambi i geni sono altamente sovraregolati a seguito di sovraespressione a breve termine di ΔFosB, sovraespressione di CREB o trattamento cronico di cocaina (McClung e Nestler, 2003). Abbiamo anche analizzato il binding al CDK5 promotore, poiché è un obiettivo diretto noto di ΔFosB (Chen et al., 2000; Bibb et al., 2001; Kumar et al., 2005). Alla fine, abbiamo misurato il legame al prodynorphin promotore, dal momento che studi precedenti hanno scoperto che può essere vincolato sia da ΔFosB che da CREB in condizioni diverse (Andersson et al., 2001; Zachariou et al., 2006).

L'analisi del ChIP è stata eseguita su topi 11A che sovraesprimono ΔFosB per 2 settimane usando anticorpi che riconoscono CREB o ΔFosB. In condizioni normali, abbiamo trovato che ΔFosB si lega al CDK5 ed prodynorphin promotori, mentre non vi è alcun legame rilevabile al BDNF or CCK promotori (Tabella 1). Inoltre, la sovraespressione di ΔFosB ha aumentato il legame di ΔFosB al CDK5 promotore, ma non al prodynorphin promotore. Successivamente abbiamo misurato il legame del CREB con questi promotori e abbiamo scoperto che CREB si lega al CDK5, BDNF ed prodynorphin promotori, ma non al CCK promotore, nello striato normale, e che la sovraespressione di ÀFosB per le settimane 2 aumenta il legame del CREB al BDNF ed prodynorphin promotori, ma non il CDK5 promotore. Presi insieme, questi risultati mostrano che ΔFosB e CREB possono entrambi legarsi a determinati geni promotori come prodynorphin ed CDK5tuttavia, il binding di CREB è specifico per altri promotori come BDNF. Inoltre, la sovraespressione di ΔFosB porta ad aumenti del legame ÀFosB a determinati promotori, come ci si aspetterebbe, ma anche al legame del CREB a promotori specifici, in accordo con l'induzione CREB ΔFosB-mediata osservata in questo momento.

Legame di proteine regolative putative a vari promotori nei topi con sovraesprimono ΔFosB per due settimane.

Il lavoro precedente ha dimostrato che i cambiamenti nell'espressione genica indotta da sovraespressione a lungo termine di ΔFosB sono associati a modificazioni della cromatina, in particolare, acetilazione dell'istone H3, a specifici promotori di geni (Kumar et al., 2005). Per determinare se questo potrebbe spiegare cambiamenti nell'espressione genica sulla sovraespressione di ΔFosB a breve termine, abbiamo misurato il legame dell'istone acetilato H3 (una modifica dell'istone associata alla cromatina trascrizionale attiva) o un istone metilato H3 (Lys9, una modifica istonica associata a trascrizione cromatina inattiva). Abbiamo trovato che sovraespressione di ΔFosB per 2 settimane non ha portato a cambiamenti nel legame di H3 acetilato a nessuno dei promotori di geni studiati (Tabella 1). Abbiamo trovato una significativa diminuzione del legame dell'istone metilato H3 al prodynorphin promotore, ma non vincolante al CCK promotore e nessun cambiamento nel legame al CDK5 ed BDNF promotori, suggerendo che questo non è un meccanismo generale mediante il quale ΔFosB, a breve termine, regola l'espressione genica. Siamo rimasti sorpresi e interessati al fatto che non abbiamo riscontrato differenze nei nostri test ChIP che potrebbero spiegare l'aumento di CCK Espressione di mRNA nei topi 11A dopo 2 settimane di espressione ÀFosB e ha deciso di indagare ulteriormente su questo meccanismo.

Aumenti a breve termine di A.FosB CCK espressione in più sistemi

Caratterizzazione di microarray di topi 11A bi transgenici che sovraesprimono ΔFosB nello striato hanno rilevato che CCK i livelli di espressione aumentano dopo 2 settimane di sovraespressione e poi diminuiscono gradualmente con periodi più lunghi di espressione ΔFosB (Figura 2A, n = 3). Abbiamo convalidato questo effetto per CCK utilizzando la PCR in tempo reale su un gruppo separato di animali nelle settimane 2 e 8 e i risultati trovati nei due punti temporali sono simili all'analisi di microarray (dati non mostrati).

Sovraespressione a breve termine di ΔFosB aumenta CCK espressione genica. (A) CCK Espressione di mRNA nello striato dopo sovraespressione di ΔFosB in topi 11A per 1, 2, 4 o 8 settimane. L'analisi microarray è stata eseguita su campioni striatali e CCK livelli ...

Per indagare ulteriormente sulla capacità di ΔFosB di regolare CCK espressione, abbiamo usato cellule PC12 transiunte transientemente con a CCK-luciferasi reporter plasmide e un plasmide di espressione ÀFosB o una quantità uguale di pCDNA. Entrambi i due (n = 5-9) e tre (n = 11-13) giorni di sovraespressione ΔFosB hanno determinato un aumento significativo CCK-luciferasi espressione. Inoltre, tre giorni di sovraespressione ΔFosB hanno comportato un aumento significativo CCK-induzione della leuciferasi rispetto a due giorni di sovraespressione (Figura 2B). Sovraespressione di ΔFosB non induce espressione di un costrutto luciferasi senza promotore (dati non mostrati). In nessun caso le condizioni di trattamento sono state ridotte CCK-attività della leuciferasi apparente. Questi risultati mostrano che l'espressione ΔFosB a breve termine aumenta l'attività di CCK promotore e lascia senza risposta il meccanismo mediante il quale sopprime l'iperespressione a lungo termine di ΔFosB CCK espressione.

La sovraespressione di ΔFosB aumenta il legame in un sito di legame del CREB putativo nel CCK promotore

Le nostre analisi lo hanno trovato CCK l'espressione è aumentata in seguito all'espressione a breve termine ΔFosB, tuttavia, i nostri test ChIP hanno rilevato che né CREB né ΔFosB si legano al CCK promotore. Per determinare se ci sono cambiamenti nel legame alle proteine al CCK promotore successivo alla sovraespressione di ΔFosB, abbiamo utilizzato il test di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) con una sonda contenente il putativo sito simile a CRE presente all'interno del CCK promotore. Usando estratti nucleari da striati di topi 11A che sovraesprimono ΔFosB per 2 settimane, abbiamo riscontrato un aumento del legame con il sito CRE putativo nel CCK promotore (Figura 3 A, C, n = 4). È interessante notare che i topi 11A con sovraesprimono ΔFosB per le settimane 8, che mostrano una diminuzione CCK espressione, ha anche mostrato un aumento del legame in questo sito (Figura 3B, C, n = 4). Come confronto, abbiamo esaminato il legame con un sito CRE di consenso nei topi che sovraesprimono ΔFosB per 2 settimane e abbiamo trovato un robusto legame del CRE negli estratti striatali, ma nessun aumento nel legame dopo l'induzione del ΔFosB (Figura 3F, n = 4). Pertanto, nonostante un aumento dei livelli di CREB totali osservato in questo momento da ΔFosB, questi risultati sono in linea con i nostri test ChIP che trovano che un aumento del legame del CREB ai promotori dopo la sovraespressione di ΔFosB è specifico solo per determinati geni e non è un fenomeno globale . Per determinare se CREB è associato a CCK promotore nella nostra analisi EMSA, abbiamo eseguito saggi supershift con un anticorpo specifico per CREB. In accordo con i nostri test ChIP, non abbiamo trovato alcun legame tra CREB e a CCK sonda contenente il putativo sito CRE nei saggi EMSA, mentre CREB ha significativamente legato e supershift un sito CRE di consenso (Figura 3D, E, n = 4). L'attività di legame del DNA al CCK il promotore non è stato influenzato da un anticorpo contro ΔFosB (dati non mostrati), in condizioni mostrate in diversi studi precedenti per bloccare il legame ÀFosB ai siti AP-1 in buona fede (Hope et al., 1994a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi et al., 1998). Abbiamo anche eseguito test ChIP su striati di animali 11A dopo 8 settimane di espressione ΔFosB e ancora non abbiamo trovato alcun legame di CREB o ΔFosB al CCK promotore (dati non mostrati). Quindi, l'espressione ΔFosB porta ad un aumento del legame proteico al CCK promotore dopo entrambe le settimane di espressione 2 e 8; tuttavia, l'identità di questi fattori rimane sconosciuta.

Legame proteico al CCK promotore. (A, B) Test di spostamento della mobilità elettroforetica utilizzando il CCK Sito simile a CRE con tessuto striato proveniente da animali che sovraesprimono ΔFosB per 2 settimane (A) o 8 settimane (B). In (A), competizione con eccesso di concorrente non etichettato ...

Il putativo sito CRE nel CCK il promotore non è responsabile per l'aumento dell'attività del promotore

Dal momento che abbiamo trovato un aumento nel legame alle proteine usando un frammento di CCK promotore, che contiene il putativo sito CRE, seguendo la sovraespressione di ΔFosB, volevamo determinare se questo sito è necessario per aumentare CCK espressione successiva alla sovraespressione di ΔFosB. Per testare questa possibilità, abbiamo trasfettato cellule PC12 con a CCK-luciferasi plasmide contenente il suo sito simile a CRE intatto o uno contenente una mutazione nel sito che abolirebbe qualsiasi interazione con CREB. È interessante notare che la mutazione del sito simile a CRE è diminuita basale CCK attività promotrice di 32% (Figura 4A, n = 9), ma non ha influenzato il CCK induzione del promotore mediante sovraespressione di ΔFosB (Figura 4B, n = 11-13). Questo suggerisce che, sebbene il CCK il promotore richiede un sito simile a CRE intatto per l'attività basale completa, l'aumentata attività del promotore indotta dalla sovraespressione di ΔFosB non richiede la sequenza simile a CRE.

I CCK-come il sito CRE non è necessario per CCK induzione di ΔFosB. (A) CCKL'attività della leuciferasi è stata misurata con 2 giorni dopo la trasfezione con la normale CCK-luciferasi o uno in cui il sito simile a CRE è stato mutato. * p <0.05 (B) CCK-luciferase ...

cFos si lega al CCK promotore

Studi precedenti lo hanno trovato cFos L'mRNA aumenta con l'espressione ΔFosB a breve termine, tuttavia, dopo un'espressione prolungata di ΔFosB, la capacità del trattamento della cocaina di indurre cFos nello striato è ridotta (McClung e Nestler, 2003; Renthal et al., 2008). Pertanto, potrebbe essere possibile che cFos contribuisca all'incremento di CCK espressione che segue un'espressione ΔFosB a breve termine. Abbiamo eseguito test ChIP con un anticorpo specifico per cFos e misurato cFos binding al CCK promotore con e senza espressione ΔFosB a breve termine. Mentre abbiamo scoperto che cFos si lega a CCK promotore, questa associazione non è aumentata in modo significativo in seguito alla sovraespressione di ÀFosB (Figure 5 , n = 5). Questo suggerisce che poiché cFos lega il CCK promotore, può contribuire al regolamento generale di CCK espressione, ma probabilmente non è coinvolto nel regolamento del CCK promotore di ΔFosB.

cFos si lega al CCK promotore. Saggi di immunoprecipitazione della cromatina sono stati eseguiti con un anticorpo specifico per cFos utilizzando tessuto striatale da topi con sovraesprimono ΔFosB sia su dox, sia dopo 2 settimane di rimozione dox. L'analisi della PCR in tempo reale era ...

DISCUSSIONE

Questo studio conferma e amplia le scoperte precedenti dimostrando che ΔFosB regola l'espressione genica nello striato e scopriamo che lo fa attraverso molteplici meccanismi dopo l'espressione a breve termine. Mostriamo che, dopo 2 settimane di sovraespressione, il ΔFosB si lega direttamente ai promotori di determinati geni che portano a cambiamenti nell'espressione (es. CDK5). Inoltre, aumenta i livelli di proteina CREB, un effetto osservato nelle cellule in coltura e nello striato, portando ad un aumento del legame del CREB ad altri promotori di geni (es. dinorfina ed BDNF). In uno studio precedente, abbiamo scoperto che la sovraespressione a breve termine di ΔFosB nello striato porta a molti degli stessi cambiamenti di espressione genica che si riscontrano quando il CREB è sovraespresso e porta a risposte comportamentali simili nelle misure di preferenza per la cocaina (McClung e Nestler, 2003). Pertanto, la scoperta che ΔFosB conduce a un'induzione di CREB, così come il legame di CREB a determinati promotori di geni, aiuta a spiegare perché così tanti cambiamenti di espressione genica sono stati condivisi da questi due fattori di trascrizione.

L'induzione di CREB di ΔFosB è interessante, poiché è stato dimostrato che le droghe d'abuso inducono cambiamenti nei livelli di CREB fosforilati 133 della serina (Mattson et al., 2005) e aumentare la trascrizione CRE-mediata (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), senza alterare i livelli generali di CREB. È possibile che i cambiamenti nei livelli CREB possano essere transitori e, quindi, facilmente trascurati in altri studi. Nelle nostre mani, abbiamo osservato aumenti indotti dalla cocaina nell'RNA CREB in particolari esperimenti, tuttavia questo effetto è molto variabile (osservazione non pubblicata). Poiché sia i topi transgenici 11A che le cellule PC-12 mostrano l'induzione del CREB dopo sovraespressione a breve termine di ΔFosB, questo suggerisce che CREB sia effettivamente indotto da ΔFosB (o target di ΔFosB), fornendo ancora un altro meccanismo per spiegare i cambiamenti indotti dal farmaco nel gene espressione.

Sorprendentemente, abbiamo scoperto che né CREB né ΔFosB si legano al CCK promotore anche se CCK l'espressione è chiaramente sovraregolata seguendo l'espressione ΔFosB a breve termine. Cck è un neuropeptide abbondante espresso sia in VTA che in NAc (Hokfelt et al., 1980) ed è probabilmente coinvolto nelle risposte comportamentali alle droghe d'abuso (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002). In saggi di coltura cellulare, il CCK il promotore è stato ampiamente caratterizzato e ha dimostrato di essere sensibile ai membri della famiglia CREB e AP-1 (rivisto da Hansen, 2001). Haun e Dixon (1990) ha dimostrato che i complessi AP-1 possono legarsi a CCK Sito simile a CRE in vitro, e fu successivamente mostrato, usando cellule di neuroblastoma SK-N-MC, che la mutazione del sito simile a CRE ridusse la reattività del promotore a cFos / cJun sovraespressi (Rourke et al., 1999). Anzi, troviamo anche aumentato CCK attività del promotore (Figure 2 ) e vincolante in corrispondenza dell'elemento CRE-like (Figure 3 ) sulla sovraespressione di ΔFosB, un altro membro della famiglia AP-1, ma non troviamo alcun legame diretto di ΔFosB al CCK promotore in vivo or in vitro, anche dopo la sua sovraespressione.

Molto lavoro ha dimostrato un ruolo per CREB nel regolamento di CCK attività del promotore. Il CCK Il sito simile a CRE è conservato tra i vertebrati (Hansen, 2001) e, in alcuni saggi di coltura cellulare, sia i complessi CREB che AP-1 si legano a questo sito e sono necessari per CCK attività del promotore (Haun e Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Inoltre, diversi attivatori noti di CCK espressione (compresi bFGF, PACAP, peptones e depolarizzazione) hanno dimostrato di agire tramite CREB (Hansen, et al., 1999; Deavall, et al, 2000; Bernard, et al., 2001; Gevrey, et al., 2002; Hansen, et al., 2004). Nostro CCKdati del gene reporter della -liferasi hanno un ruolo essenziale per il sito simile a CRE nella regolazione di CCK attività del promotore, poiché la mutazione di questo sito riduce il basale CCK attività del promotore e CCKL'espressione della -luciferasi indotta da VP16-CREB, una forma costitutivamente attiva di CREB, viene persa quando questo sito viene mutato (osservazione non pubblicata). Quindi, siamo rimasti sorpresi nello scoprire che CREB non sembra legarsi a CCK promotore negli estratti striatali o al basale o in caso di sovraespressione a breve termine di ΔFosB quando i livelli di CREB sono aumentati. Questo sostiene che i livelli di CREB di per sé non sono l'unico fattore nel determinare la quantità di legame in questo sito, e questo è supportato dal lavoro di altri (Cha-Molstad, et al., 2004). Poiché i promotori di altri geni bersaglio CREB precedentemente identificati, come BDNF ed prodynorphin, ha impegnato CREB, siamo fiduciosi nel constatare che CREB non è vincolante per il CCK promotore in estratti nucleari striatali. Inoltre, l'induzione di CCKL'attività della leuciferasi di ΔFosB non dipendeva dal sito intatto di tipo CRE, suggerendo che ΔFosB non regola CCK espressione regolando il legame diretto di CREB con il CCK promotore.

La nostra incapacità di rilevare CREB interagendo con il CCK il promotore è supportato da Renthal et al. (2009), che ha utilizzato un approccio ChIP-chip per esaminare i cambiamenti globali nel CREB fosforilato (pCREB) e il legame ΔFosB nello striato dopo l'esposizione cronica alla cocaina. In questi esperimenti, i complessi di DNA-proteina sono stati immunoprecipitati con anticorpi ΔFosB o pCREB e il DNA precipitato, dopo l'etichettatura, è stato ibridato con un microarray promotore. Mentre molti geni target CREB precedentemente caratterizzati sono stati identificati con questo approccio (es. BDNF, prodynorphin), CCK non è stato identificato. Inoltre, è stato dimostrato che il legame di CREB con un sito di consenso di CRE varia notevolmente tra le linee cellulari coltivate (Cha-Molstad, et al., 2004). Tutti gli studi precedenti che hanno trovato interazioni CREB con il CCK il promotore è stato condotto in coltura cellulare (non il cervello da cui sono derivati i nostri campioni di EMSA e ChIP) e ha utilizzato saggi di gel shift per studiare le interazioni tra proteine e DNA. Mentre un EMSA può valutare il potenziale di un fattore di legarsi a una sequenza di DNA, i test ChIP forniscono un nuovo sguardo a queste interazioni in vivo. Inoltre, molti dei dati che dimostrano l'induzione di CCK attività del promotore o legame del CREB al CCK promotore sono stati ottenuti da cellule che erano state stimolate da fattori come i peptoni (Bernard et al., 2001), depolarizzazione (Hansen, et al., 2004), o una varietà di attivatori di cascate di segnali intracellulari tra cui cAMP e ERK (Hansen et al., 1999). Nei nostri esperimenti, l'unico "stimolo" utilizzato era la sovraespressione di ΔFosB, che è sufficiente per indurre CCK espressione. Presi insieme, questo suggerisce che la capacità di CREB di legarsi a (e potenzialmente regolare) il CCK il promotore dipende molto dal tipo di cellula e dall'attivazione di particolari percorsi di segnalazione. Inoltre, il CCK L'elemento promotore di tipo CRE (almeno nelle cellule PC12 non indotte e nello striato di topo) non è un bersaglio diretto di CREB o di ΔFosB. È interessante notare che il regolamento di FosB L'espressione di CREB è specifica anche per il tipo di cellula e il tipo di stimolazione. Uno studio di Andersson et al. trovato che l'iniezione di oligonucleotidi antisenso di CREB nello striato di topo inibiva parzialmente l'induzione di FosB seguendo la somministrazione di cocaina (Andersson et al., 2001). Tuttavia, hanno anche scoperto che l'abilità di L-Dopa di indurre FosB l'espressione nello striato lesionato da 6-OHDA non è stata influenzata dalla presenza di oligonucleotidi antisenso del CREB.

Dal momento che CREB e ΔFosB sembrano regolare indirettamente il CCK promotore e cambiamenti nella struttura della cromatina sono stati documentati in risposta a una varietà di stimoli che inducono ΔFosB (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2008), abbiamo ipotizzato che ΔFosB potesse modulare indirettamente l'attività del promotore alterando la struttura della cromatina. Tuttavia, nei topi con sovraesprimono ΔFosB per le settimane 2, non vi era alcun cambiamento nell'acetilazione dell'istone H3 al CCK promotore (Tabella 1). Questo è supportato dai dati del chip ChIP di Renthal et al. (2009), che non ha riportato alcun cambiamento nel legame H3 acetilato al CCK promotore in topi esposti a cocaina cronica. Dal momento che il CCK il promotore è attivo nello striato, non è stato previsto o osservato alcun legame istintivo H3 dell'istone metilato repressivo. È interessante notare che non abbiamo visto alcun cambiamento dovuto alla sovraespressione di ΔFosB nel legame H3 acetilato al BDNF promotore (che ha mostrato un aumento del legame con CREB) o al CDK5 ed prodynorphin promotori (che mostravano un aumento del legame ΔFosB). Dal momento che ci sono una miriade di modifiche degli istoni associate a cambiamenti nell'attività del promotore (rivisto da Rando e Chang, 2009), ci sono probabilmente altre modificazioni della cromatina che si associano all'induzione di questi geni. Qualsiasi singola modifica della cromatina, sebbene spesso predittiva del livello di attività del promotore, potrebbe non cambiare durante l'attivazione di un particolare gene. Nel lavoro futuro, sarebbe interessante guardare ad altri potenziali cambiamenti nella struttura della cromatina intorno al CCK promotore dopo sovraespressione di ΔFosB. È interessante notare che la cocaina cronica (probabilmente via Induzione ΔFosB) ha dimostrato di indurre l'espressione di sirtuin 1 e 2, deacetilasi istoniche di classe III che sembrano alterare la fisiologia neuronale, la segnalazione ERK e le risposte comportamentali alla cocaina (Renthal et al., 2009). L'induzione di una deacetilasi istonica avrebbe la capacità di regolare simultaneamente l'espressione di un gran numero di geni via cambiamenti globali nella struttura della cromatina.

Un possibile candidato coinvolto in CCK la regolazione successiva alla sovraespressione di ΔFosB era il membro della famiglia AP-1 cFos. L'espressione di cFos è regolata da CREB (Sheng et al., 1990; Impey et al., 2004), e la sovraespressione cFos (concordante con sovraespressione del suo partner di legame cJun) aumenta CCK attività del promotore (Rourke et al., 1999). Pertanto, l'aumento dei livelli di CREB a causa della sovraespressione a breve termine di ΔFosB potrebbe aumentare i livelli di cFos e comportare un aumento del legame al CCK Sito simile a CRE. CFO L'mRNA è indotto nei topi dopo due settimane di sovraespressione ΔFosB (McClung e Nestler, 2003) e diminuita nei topi esposti a cocaina cronica o a sovraespressione a lungo termine ΔFosB (Renthal et al., 2008). Qui troviamo che cFos si lega direttamente al CCK promotore nel tessuto striatale, tuttavia, la sovraespressione di ÀFosB non aumenta significativamente il legame. Questo suggerisce che mentre cFos potrebbe essere coinvolto nella regolazione CCK espressione in generale, un cambiamento nel legame di cFos da solo non è verosimilmente il meccanismo con cui regola il ΔFosB CCK espressione. È possibile, tuttavia, che ΔFosB possa indurre cambiamenti sia post-traduzionali in cFos (es. Fosforilazione alterata) sia indurre l'espressione di un partner legante (come cJun) o di una proteina co-attivatrice. Tuttavia, poiché il sito intatto di tipo CRE (che in precedenza è stato indicato come sito di rilegatura per complessi AP-1, vedere Haun e Dixon, 1990) non è richiesto per l'aumento CCK l'attività del promotore vista con la sovraespressione di ΔFosB (valutata nei nostri esperimenti sul gene reporter), è ovvio che anche altri fattori transattivi sono regolati da ΔFosB.

I CCK il frammento del promotore utilizzato nei nostri esperimenti sul gene reporter della luciferasi contiene un sito di legame Sp1 conservato e una E-box (revisionata da Hansen, 2002). In particolare, è stato dimostrato che le sequenze E-box legano numerosi fattori di trascrizione (rivisti da Forrest e McNamara, 2004). Usando cellule PC12, abbiamo visto che la mutazione della E-box diminuisce CCK attività del promotore, ma non altera la risposta del promotore a ΔFosB (dati non mostrati). È interessante notare che a CCK-ligiferasi reporter contenente mutazioni nel sito CRE e E-box non ha attività basale rilevabile e non risponde alla sovraespressione ΔFosB (osservazione non pubblicata). Un altro potenziale mediatore dell'azione ΔFosB su CCK promotore sono gli ATF, alcune forme di cui è noto essere indotte nello striato dall'esposizione cronica allo psicostimolante (Green et al., 2008). Tuttavia, non abbiamo trovato prove per l'induzione del ΔFosB di questi ATF (dati non mostrati) e non ci si aspetterebbe che gli ATF si leghino al sito mutato di tipo CRE sul CCK promotore.

Un avvertimento di questo studio è che stiamo usando un sistema bi-transgenico per sovraesprimere ΔFosB e quindi si deve essere prudenti nel disegnare paralleli tra questo paradigma e la somministrazione di cocaina cronica. Tuttavia, i topi transgenici 11A offrono l'opportunità unica di osservare gli effetti specifici di ΔFosB nello striato, poiché l'iperespressione è limitata a questa regione del cervello (Chen et al., 1998), mentre la somministrazione di cocaina induce cambiamenti in un'ampia varietà di altre regioni del cervello che possono quindi influenzare indirettamente il corpo striato. Inoltre, diversi studi hanno documentato fenotipi comportamentali e molecolari simili nei topi 11A rispetto agli animali non transgenici trattati con cocaina cronica (Kelz et al., 1999; McClung e Nestler, 2003; Renthal et al., 2009). Inoltre, Bibb et al. (2001) riportato livelli simili di striato Cdk5 Induzione di mRNA e proteine in questo stesso ceppo 11A se paragonato a littermates trattati con cocaina, non transgenici, e cambiamenti simili nei target CDK5, p35 e DARPP-32.

In conclusione, troviamo che l'espressione di ΔFosB a breve termine porta all'induzione di geni nello striato attraverso meccanismi multipli. Questi includono il legame diretto del promotore, l'induzione della proteina CREB e l'attività, la modificazione della cromatina, oltre a percorsi ancora da determinare.

PROCEDURE SPERIMENTALI

Animali

Gli animali 11A bi transgenici maschili (NSE-tTA x TetOP-ΔFosB) sono stati utilizzati in questo studio e sono caratterizzati da Kelz et al., 1999. Per sovraesprimere ΔFosB, i topi sono stati rimossi dalla doxiciclina tra 3 e 6 settimane di età, mentre i topi di controllo sono stati mantenuti su doxiciclina. Tutti i mouse sono stati raggruppati e mantenuti su un 12: 12 luce / ciclo scuro, luci accese a 7 am e luci spente a 7 pm, con ad lib accesso al cibo e all'acqua. Tutti gli esperimenti sui topi erano conformi ai protocolli approvati dal comitato per la cura degli animali e l'uso del Centro medico del Southwestern dell'Università del Texas a Dallas.

Reporter ed espressione plasmidi

The wildtype (WT) CCK il reporter del promotore-luciferasi è stato preparato inserendo un frammento PCR approssimativamente 200 bp nel vettore pGL3-luc (Promega). Questo frammento è stato ottenuto da DNA genomico di topo (primer: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' a monte, e 5 'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' a valle) e inizialmente inserito nel vettore pGEM-T Easy (Promega, #A1360). Il frammento del promotore è stato quindi clonato nei siti degli enzimi di restrizione Kpn1 / Xho1 di pGL3-luc.

Per creare la mutazione del punto CRE nel CCK promotore, un primer mutageno diretto contro un sito simile a CRE precedentemente segnalato (primer sensoriale: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', primer antisenso: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3' . Questo converte il sito simile a CRE segnalato (ACTGCGTCAGC) in ACTGAGCTCC. Tutti i plasmidi reporter sono stati confermati dal sequenziamento del DNA. Il plasmide di espressione ΔFosB contiene una sequenza ΔFosB a lunghezza intera inserita nel sito di clonazione multipla di pCDNA 3.1 ed è stata descritta in precedenza (Ulery e Nestler, 2007).

Colture cellulari e trasfusioni di DNA

Le cellule di feocromocitoma di ratto (PC12) sono state mantenute nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco F-12, integrato con siero di cavallo al 10%, siero bovino fetale al 5% e penicillina / streptomicina all'1% a 37 ° C e 5% di CO₂. Le cellule sono state trasfettate mediante elettroporazione utilizzando un elettroporatore BTX 360 (350 V, 0 ohm e 850 μF) in 800 μL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco in cuvette con gap da 4 mm con 10 μg del reporter e 5 μg del costrutto di espressione. Il plasmide vettore vuoto (pCDNA) è stato utilizzato per normalizzare le quantità totali di DNA. Dopo la trasfezione, le cellule sono state coltivate su piastre rivestite di collagene da 35 mm per le quantità di tempo indicate.

Saggi di Luciferasi

Due o tre giorni dopo la trasfezione, le cellule sono state lavate 3 volte in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, lisate (utilizzando glicilglicina 25 mM, MgSO 15 mM₄, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), raccolti e eliminati tramite centrifugazione. 30 μL di lisato è stato combinato con 140 μL tampone di saggio di luciferasi (25 mM glicilglicina, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM potassio fosfato, 1 mM coenzima A, pH 7.8). L'attività di luminescenza è stata misurata utilizzando un lettore di fluorescenza per micropiastre FLx-800 dopo un'iniezione automatica di 40 μL 1 mM luciferina per pozzetto. L'attività della luciferasi è stata normalizzata al contenuto totale di proteine come determinato da un saggio della proteina BioRad.

Test di spostamento della mobilità elettroforetica

Estratti nucleari da sezioni bilaterali di striato da topi 11A bi-transgenici (che hanno mantenuto o meno la doxiciclina per 2 o 8 settimane) (McClung e Nestler, 2003) sono stati preparati secondo Huang and Walters (1996). ³²Le sonde oligonucleotidiche a doppio filamento P sono state preparate utilizzando il protocollo del sistema Promega Gel Shift Assay (#E3300) e le sonde sono state purificate utilizzando le colonne Roche Quick Spin. Le sequenze di consenso CRE e AP-1 provenivano da Promega (#E328A e E320B, rispettivamente) e CCK Le sequenze CRE erano (senso Cck-CRE: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE antisense: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Le reazioni vincolanti e l'elettroforesi sono state eseguite utilizzando le modifiche della procedura del sistema Promega Gel Shift Assay (#E3300). Il CPM 50,000 della sonda marcata è stato combinato con 10 μg estratto nucleare striato. Il DNA o gli anticorpi della concorrenza fredda sono stati aggiunti prima dell'introduzione delle sonde radio-marcate. Per gli esperimenti supershift, è stato utilizzato 2 μg di anticorpo CREB (Upstate Biotechnology # 06-083). Le reazioni sono state elettroforate su gel 4% di poliacrilammide, essiccate e esposte su pellicola (usando schermi intensificatori per 1 ore a giorni 2).

immunoblotting

Per le cellule PC12, piastre da 35 mm di cellule trasfettate sono state lavate in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco ghiacciata e i lisati sono stati preparati in tampone di lisi RIPA ghiacciato (Tris 50 mM pH 7.4, NaCl 5 mM, EDTA 5 mM, desossicolato 1%, 1 % Triton X-100, 0.1% sodio dodecil solfato) contenente inibitori della proteasi. Dopo la sonicazione, la cancellazione e il test delle proteine Bradford, i lisati sono stati completamente denaturati e 50 μg di ciascun campione sono stati sottoposti a elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS al 10%. Le proteine sono state trasferite alla membrana PVDF, bloccate per 1 ora nel 3% di latte in polvere non grasso in soluzione salina tamponata con Tris contenente lo 0.1% di Tween-20 (latte TBS-T) e sondate durante la notte a 4 ° C con anticorpi primari (CREB- Upstate Biotechnology # 06-083, usato a 1: 1,000; GAPDH- Sigma # G8795, usato a 1: 80,000) diluito in latte TBS-T. Dopo più lavaggi in TBS-T, i blot sono stati sondati per un'ora a temperatura ambiente utilizzando anticorpi secondari coniugati con fosfatasi alcalina (Sigma) diluiti 1: 5,000 in latte TBS-T. Dopo più lavaggi in soluzione salina tamponata con Tris, la reazione del colore è stata eseguita secondo le istruzioni del BioRad (# 170-6432). Le membrane sono state asciugate durante la notte, scansionate su uno scanner piano e la densitometria è stata eseguita utilizzando ImageJ (vedi sotto).

Per gli estratti striatali, le analisi Western blot sono state eseguite come precedentemente pubblicato (Hope et al., 1994). Il tessuto è stato rimosso da topi decapitati, posti sul ghiaccio e sezionati su una matrice cerebrale con uno spessore di 1 mm. I punzoni di tessuto sono stati quindi prelevati e congelati a -80 ° C fino al momento dell'uso. Il tessuto è stato sonicato su ghiaccio in un tampone modificato a base di detergente contenente sia fosfatasi che inibitori della proteasi (Roche, Sigma). Dopo la sonicazione, i campioni sono stati denaturati in acqua bollente e centrifugati a 15,000xg per 15 minuti; il surnatante è stato successivamente raccolto ed elaborato; le quantità di concentrazione di proteine sono state poi quantificate usando un saggio Bradford (Bio-Rad). I campioni sono stati fatti su un gel 10% di acrilammide / bisacrilammide, trasferito su una membrana di PVDF, bloccato nel latte 5% e incubato con anticorpi primari (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Le macchie sono state successivamente visualizzate utilizzando un sistema di chemiluminescenza (Pierce). Tutti i campioni sono stati normalizzati a GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Le curve standard sono state eseguite per garantire che siamo nell'intervallo lineare del test.

Analisi di densitometria

Per gli immunoblots PC12, l'analisi densitometrica è stata eseguita utilizzando ImageJ con calibrazione rodbard. Il segnale di fondo medio è stato sottratto da ciascuna misurazione e il rapporto tra il segnale CREB e GAPDH è stato calcolato per ciascun campione. Per gli immunoblots striatali e l'analisi EMSA, Scion Image 1.62c è stato utilizzato con sottrazione di fondo.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)

I test del ChIP sono stati eseguiti secondo i metodi di Tsankova et al. (2004) ed Kumar et al. (2005). In breve, i campioni striatali bilaterali di topi 11A mantenuti con o senza doxiciclina sono stati reticolati con formaldeide all'1% e la reticolazione è stata estinta con glicina (concentrazione finale di 0.125 M). Questi campioni provenivano da intere fette di cervello prelevate a livello del nucleo accumbens con la corteccia rimossa. La cromatina è stata tagliata a frammenti di circa 0.2-1 kb tramite sonicazione, eliminata con perline di proteina G (Thermo Scientific # 22852) e campioni di input congelati a -80 ° C. Per ciascuna precipitazione sono stati utilizzati tra 60 e 100 μg di cromatina. Sono stati usati 5-10 μg di ciascun anticorpo primario (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, acetilato H3: Upstate Biotechnology # 06-599, metilato H3 (LYS9): Cell Signaling Technology, cFos: Santa Cruz Biotechnology # SC-7202x). I complessi anticorpo-cromatina sono stati immunoprecipitati con proteina G plus perline secondo le istruzioni del produttore (Thermo Scientific # 22852). Dopo la reticolazione inversa dei campioni in ingresso e precipitati, ogni campione è stato sottoposto a PCR quantitativa (qPCR). L'uso di tutti questi anticorpi per ChIP è stato ampiamente convalidato (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2009).

I livelli di legame proteico a ciascun promotore di interesse genetico sono stati determinati misurando la quantità di DNA associato da qPCR (Prisma 7700 Applied Biosystems (ABI), Foster City, CA). Il DNA in ingresso o totale (nonimmunoprecipitato) e il DNA immunoprecipitato sono stati amplificati in triplicato in presenza di SYBR Green (Applied Biosystems, CA). I valori Ct di ciascun campione sono stati ottenuti utilizzando il software 1.1 del rilevatore di sequenza. La quantificazione relativa del DNA del modello è stata eseguita utilizzando il metodo ΔΔCt (Tsankova et al., 2004). Primer utilizzati: promotore BDNF 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA Promotore CDK5: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck promotore: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Promotore di Prodynorphin: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

analisi statistica

Tutti i dati sono presentati come medie ± errore standard della media. La differenza statistica è stata determinata dal test t a due code di Student (p <0.05). Quando sono stati effettuati confronti multipli, i valori di p sono stati aggiustati utilizzando la correzione Bonferroni.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare Will Renthal e Arvind Kumar per discussioni utili. Vorremmo anche ringraziare il NIDA per aver finanziato questi esperimenti.

Le note

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Termini di classificazione:

Sezione: #1 Biologia cellulare e molecolare dei sistemi nervosi

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