L'induzione DeltaFosB nella corteccia orbitofrontale potenzia la sensibilizzazione locomotoria nonostante l'attenuazione della disfunzione cognitiva causata dalla cocaina. (2009)

2. metodi

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in stretta conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso di animali presso la sede di UT Southwestern.

2.5. Quantificazione dell'mRNA

I ratti hanno ricevuto iniezioni intra-OFC di AAV-GFP o AAV-ΔFosB, seguiti da 21 due volte al giorno iniezioni di soluzione salina o cocaina, esattamente come descritto per gli esperimenti comportamentali. Gli animali sono stati usati 24 h dopo l'ultima iniezione di soluzione salina o cocaina. I ratti sono stati uccisi dalla decapitazione. I cervelli sono stati estratti rapidamente e sono stati ottenuti punzoni di spessore 1 dello spessore di 12 bilaterali 80 e immediatamente congelati e conservati a -XNUMX ° C fino all'isolamento dell'RNA. Punzoni dall'OFC sono stati anche rimossi per l'analisi mediante DNA microarray che ha confermato il trasferimento genico virale-mediato successo in questa regione (vedi (Winstanley et al., 2007) per risultati più dettagliati). L'RNA è stato estratto dai campioni NAc utilizzando il reagente RNA Stat-60 (Teltest, Houston, TX) in base alle istruzioni del produttore. Il DNA contaminante è stato rimosso con il trattamento con DNasi (DNA-Free, catalogo # 1906, Ambion, Austin TX). L'RNA purificato è stato retrotrascritto in cDNA (Superscript First Strand Synthesis, Catalog # 12371-019; Invitrogen). Le trascrizioni per geni di interesse sono state quantificate utilizzando qPCR in tempo reale (SYBR Green, Applied Biosystems, Foster City, CA) su un termociclatore a pozzetto Mx5000p 96 di Stratagene (La Jolla, CA). Tutti i primer erano sintetizzati su misura da Operon (Huntsville, AL; Tabella 1 per sequenze) e convalidato per linearità e specificità prima degli esperimenti. Tutti i dati della PCR sono stati normalizzati a livelli di gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), che non è stato alterato dal trattamento con cocaina, secondo la seguente formula: ΔC_t =C_t(gene di interesse) - C_t (GAPDH). Livelli di espressione aggiustati per entrambi i ratti AAV-ΔFosB e AAV-GFP che hanno ricevuto cocaina e i ratti AAV-ΔFosB che hanno ricevuto soluzione salina cronica, sono stati quindi calcolati rispetto ai controlli (gruppo AAV-GFP somministrato con soluzione salina cronica) come segue: ΔΔC_t = ΔC_t - ΔC_t (gruppo di controllo). In linea con la pratica raccomandata sul campo (Livak e Schmittgen, 2001), i livelli di espressione relativi ai controlli sono stati quindi calcolati utilizzando la seguente espressione: 2^-ΔΔCt.

  

Tabella 1

Sequenza di primer utilizzati per quantificare i livelli di cDNA tramite PCR in tempo reale.

3. Αποτελέσματα

Experiment 1

La somministrazione cronica di cocaina produce sensibilizzazione agli effetti iperlocomotori della cocaina acuta che viene imitata da ΔFosB

Come prevedibile, è stata osservata una sensibilizzazione locomotoria robusta negli animali di controllo dopo esposizione cronica alla cocaina, con animali trattati cronicamente con cocaina che mostrava iperattività aumentata in risposta alla sfida acuta di cocaina (Fig. 1A, trattamento cronico: F_1,34 = 4.325, p<0.045). Animali che esprimono eccessivamente ΔJunD, un mutante dominante negativo di JunD che agisce come un antagonista di ΔFosB (Zachariou et al., 2006), nell'OFC erano indistinguibili dagli animali di controllo (Fig. 1C, GFP vs ΔJunD, gruppo: F_{1, 56} = 1.509, NS). Tuttavia, gli animali sovraesprimenti ΔFosB nell'OFC che avevano ricevuto ripetute iniezioni saline apparivano "pre-sensibilizzati": mostravano una maggiore risposta locomotoria alla cocaina acuta che era indistinguibile dalla risposta sensibilizzata delle loro controparti trattate con cocaina cronica (Fig. 1B, GFP vs chirurgia ΔFosB × trattamento cronico: F_{1, 56} = 3.926, p<0.052; Solo ΔFosB: trattamento cronico: F_1,22 = 0.664, NS). Gli animali ΔFosB erano leggermente iperattivi entro il primo 15 min di essere posizionati nelle scatole del locomotore (GFP vs ΔFosB, chirurgia: F_1,56 = 4.229, p <0.04), ma i livelli di attività locomotoria erano paragonabili ai controlli nei 15 minuti precedenti la somministrazione di cocaina (intervento chirurgico: F_{1, 56} = 0.138, NS).

  

Fig. 1

Sensibilizzazione locomotoria alla cocaina. La cocaina acuta ha prodotto un aumento maggiore dell'attività locomotoria negli animali di controllo trattati cronicamente con cocaina versus salina (pannello A). Negli animali sovraespressivi ΔFosB (pannello B), quelli dati ripetuti salini (Di Più …)

Considerando che, quando somministrato cocaina durante il 5CSRT, gli stessi animali mostravano una capacità relativamente avanzata di trattenere le risposte motorie premature, questa iperattività appare specifica per la locomozione ambulatoria, ovvero il tipo di movimento che è tipicamente registrato negli studi di sensibilizzazione locomotoria. Sebbene l'attività potenziata in risposta ai farmaci stimolanti possa riflettere un profilo ansiogenico, la sovraespressione intra-OFC di ΔFosB non aumenta l'ansia misurata utilizzando il test a labirinto più elevato o a campo aperto (dati non mostrati). Gli animali erano anche bene abituati alle iniezioni di IP e le iniezioni saline non alteravano le loro prestazioni cognitive (Winstanley et al., 2007), quindi questo effetto motore non può essere attribuito a una risposta generale a un'iniezione IP. In sintesi, questi risultati indicano che l'induzione di ΔFosB nell' OFC è sufficiente (ma non necessaria) per il locomotore sensibilizzato che risponde alla cocaina, anche se il ΔFosB nella stessa regione causa tolleranza agli effetti della cocaina sulla motivazione e l'impulsività (Winstanley et al., 2007).

3.1. ΔFosB / FosB

I livelli di mRNA di FosB nel NAc non sono stati alterati da alcun trattamento farmacologico cronico (Fig. 2A, droga: F_1,14 = 1.179, ns) o espressione di ΔFosB nell'OFC (chirurgia: F_{1, 14} = 0.235, ns). Tuttavia, i livelli di ΔFosB erano significativamente più alti negli animali trattati cronicamente con cocaina in accordo con precedenti rapporti (Chen et al., 1997); Fig. 2B, droga: F_1,14 = 7.140, p<0.022). È interessante notare che la quantità di ΔFosB mRNA nel NAc degli animali trattati con soluzione salina era inferiore in quelli in cui questo fattore di trascrizione era stato sovraespresso nell'OFC (farmaco: F_1,14 = 9.362, p<0.011). Tuttavia, l'assenza di un'interazione farmaco × intervento chirurgico indica che il trattamento con cocaina cronica stava avendo lo stesso effetto in entrambi i gruppi trattati con AAV-GFP e AAV-ΔFosB, aumentando proporzionalmente i livelli di ΔFosB in misura simile (farmaco × intervento chirurgico: F_{1, 14} = 0.302, ns).

  

Fig. 2

Cambiamenti nell'mRNA all'interno del NAc degli animali che sovra-esprimono GFP o ΔFosB nell'OF e trattati cronicamente con salina o cocaina. I dati indicano cambiamenti di piegatura lineare nell'espressione come proporzione di valori di controllo. I dati mostrati sono (Di Più …)

4. Discussione

Qui mostriamo che sovraespressione di ΔFosB nei ratti sensibilizzati OFC alle azioni stimolanti locomotore della cocaina, imitando le azioni della somministrazione cronica di cocaina. Abbiamo precedentemente dimostrato che le prestazioni di questi stessi animali sui paradigmi 5CSRT e di attualizzazione del ritardo sono meno influenzate dalla cocaina acuta e che un simile effetto simile alla tolleranza si osserva dopo ripetute esposizioni di cocaina. Pertanto, la sensibilizzazione e la tolleranza alle diverse azioni della cocaina possono essere osservate negli stessi animali, con entrambi gli adattamenti mediati attraverso la stessa molecola, ΔFosB, che agisce nella stessa regione del cervello. Il fatto che entrambi i fenomeni possano essere simultaneamente indotti mimando una delle azioni della cocaina in un singolo locus frontocorticale sottolinea l'importanza delle regioni corticali nelle sequele dell'assunzione cronica di droghe. Inoltre, questi dati suggeriscono che la tolleranza e la sensibilizzazione riflettono due aspetti apparentemente contrastanti, ma intimamente connessi, della risposta alle droghe che danno assuefazione.

Dato che l'aumentata espressione di ÀFosB nel NAc è coinvolta in modo critico nello sviluppo della sensibilizzazione locomotoria, un'ipotesi plausibile sarebbe stata che l'ΔFosB sovraespressivo nell'OFC pre sensibilizzasse gli animali alla cocaina aumentando i livelli di ΔFosB nel NAc. Tuttavia, è stato trovato il risultato inverso: i livelli di ΔFosB nel NAc erano significativamente più bassi negli animali sovraesprimenti ΔFosB nell'OF. Le conseguenze comportamentali di questa diminuzione di NAc ΔFosB sono difficili da interpretare, poiché l'inibizione delle azioni di ΔFosB attraverso la sovraespressione di ΔJunD in questa regione riduce molti degli effetti della cocaina nei topi (Peakman et al., 2003). Esistono alcuni parallelismi tra queste osservazioni e quelle fatte in riferimento al sistema della dopamina. Per esempio, la parziale deplezione della dopamina nel NAc può portare all'iperattività, come può l'applicazione diretta di agonisti della dopamina in questa regione (Bachtell et al., 2005; Costall et al., 1984; Parkinson et al., 2002; Winstanley et al., 2005b). Allo stesso modo, il fatto che l'aumento dei livelli corticali di ΔFosB possa ridurre l'espressione sottocorticale assomiglia alla constatazione consolidata che un aumento della trasmissione dopaminergica prefrontale è spesso accompagnato da una diminuzione reciproca dei livelli di dopamina striatale (Deutch et al., 1990; Mitchell e Gratton, 1992). Come un tale meccanismo di feedback possa funzionare per le molecole di segnalazione intracellulare non è al momento chiaro, ma può riflettere cambiamenti nell'attività generale di alcune reti neuronali causate da un cambiamento nella trascrizione genica. Ad esempio, l'aumento di ΔFosB nell'OFC determina una sovraregolazione dell'attività inibitoria locale, come evidenziato da un aumento dei livelli del GABA_A recettore, recettore mGluR5 e sostanza P, come rilevato dall'analisi di microarray (Winstanley et al., 2007). Questo cambiamento dell'attività OFC potrebbe quindi influenzare l'attività in altre aree del cervello, che a sua volta potrebbe portare a un cambiamento locale nell'espressione di ΔFosB. Se i livelli di ΔFosB riflettono i cambiamenti relativi nell'attività della dopamina è un problema che merita ulteriori indagini.

Tutti gli animali hanno mostrato un aumento significativo dei livelli di mRNA di ÀFosB nel NAc dopo trattamento con cocaina cronica, in linea con precedenti segnalazioni di aumento dei livelli di proteine ​​(Chen et al., 1997; Hope et al., 1992; Nye et al., 1995). Tuttavia, un recente rapporto ha rilevato che i livelli di mRNA ΔFosB non erano più significativamente aumentati di 24 h dopo trattamento con anfetamine cronica, sebbene siano stati osservati aumenti significativi di 3 h dopo l'iniezione finale (Alibhai et al., 2007). Questa discrepanza può essere dovuta alla differenza nel farmaco psicostimolante usato (cocaina vs anfetamina), ma data la ridotta emivita della cocaina, sarebbe ragionevole aspettarsi che i suoi effetti sull'espressione genica si normalizzassero più rapidamente di quelli dell'amfetamina, piuttosto che viceversa. Un motivo più plausibile per questi diversi risultati è che gli animali nello studio corrente sono stati iniettati con una dose moderata di farmaco due volte al giorno per 21 giorni rispetto a una singola iniezione ad alte dosi per i giorni 7 (Alibhai et al., 2007). Il regime più esteso di trattamento avrebbe potuto portare ai cambiamenti più pronunciati qui osservati.

Sebbene i cambiamenti nell'espressione genica osservati all'interno della NAc in seguito alla cocaina cronica siano in generale d'accordo con i risultati precedentemente riportati, l'entità degli effetti è minore nello studio corrente. Una ragione potenziale per questo è che gli animali sono stati sacrificati solo 24 h dopo l'ultima iniezione di cocaina, mentre la maggior parte degli studi ha utilizzato tessuto ottenuto due settimane dall'ultima esposizione al farmaco. Gli studi che esplorano il corso del tempo della sensibilizzazione locomotoria indicano che cambiamenti più pronunciati nel comportamento e nell'espressione genica / proteica sono osservati in questo momento successivo. Anche se segnaliamo un leggero aumento di mRNA per la dopamina D₂ recettore nel NAc, il consenso generale è che i livelli di espressione del D₂ o D₁ i recettori non sono permanentemente alterati in seguito allo sviluppo della sensibilizzazione locomotoria, sebbene entrambi aumentino e diminuiscano in D₂ numero di recettori sono stati riportati poco dopo la fine del regime di sensibilizzazione (vediPierce e Kalivas, 1997) per la discussione). La nostra osservazione che GluR1 e GluR2 mRNA sono rimasti invariati dopo il trattamento cronico di cocaina in questo primo momento è anche in accordo con un precedente rapporto (Fitzgerald et al., 1996), sebbene sia stato rilevato un aumento dell'mRNA di GluR1 in momenti successivi alla cessazione del trattamento con psicostimolanti cronici (Churchill et al., 1999).

Tuttavia, abbiamo osservato un piccolo aumento di mRNA di PSD95 nel NAc di animali trattati cronicamente con cocaina. PSD95 è una molecola di ponteggio ed è una delle principali proteine ​​nella densità postsinaptica delle sinapsi eccitatorie. Ancoraggi diversi recettori del glutammato e proteine ​​di segnalazione associate alla sinapsi, e un aumento nell'espressione di PSD95 è pensato per riflettere l'aumento dell'attività sinaptica e l'aumento di inserimento e stabilizzazione dei recettori del glutammato alle sinapsi (van Zundert et al., 2004). Un ruolo per PSD95 nello sviluppo della sensibilizzazione locomotoria è stato suggerito in precedenza (Yao et al., 2004).

Aumenti nell'arco di espressione sono stati anche collegati ad aumenti dell'attività sinaptica. Tuttavia, mentre è stato osservato un aumento dell'espressione dell'arco nel NAc, 50 min dopo l'iniezione con anfetamine (Klebaur et al., 2002), i nostri dati indicano che la somministrazione cronica di cocaina non regola in modo permanente l'arco nel NAc, anche se sono stati osservati aumenti nell'arco di 24 h dopo somministrazione cronica di farmaci antidepressivi (Larsen et al., 2007) e anfetamine (Ujike et al., 2002). Un aumento della fosforilazione del CREB si osserva anche nel NAc dopo somministrazione acuta di cocaina e anfetamine (Kano et al., 1995; Konradi et al., 1994; Self et al., 1998), ma forse non sorprende che non sia stato osservato alcun aumento di mRNA di CREB in seguito alla somministrazione cronica di cocaina. Segnalare attraverso il percorso CREB è pensato per essere più importante nelle fasi iniziali dell'assunzione di farmaci, con fattori di trascrizione come il ΔFosB che viene a dominare man mano che la dipendenza progredisce (McClung e Nestler, 2003). Sebbene CREB sia stato implicato negli effetti gratificanti della cocaina (Carlezon et al., 1998non sono stati riportati casi in cui l'aumento dell'espressione di CREB influenzi la sensibilizzazione locomotoria, sebbene aumenti mediati da virus nell'antagonista negativo dominante dominante di CREB, l'inducibile proteina repressiva precoce o ICER, aumenti l'iperattività causata da un'iniezione acuta di anfetamina (Green et al., 2006).

In sintesi, sebbene la maggior parte dei cambiamenti indotti da farmaci osservati siano concordanti con le previsioni della letteratura, non abbiamo trovato alcun cambiamento nell'espressione genica all'interno del NAc che potrebbe spiegare la risposta locomotoria sensibilizzata alla cocaina osservata negli animali naïve ai farmaci trattati con AAV-ΔFosB intra-OFC. Ciò solleva la possibilità che l'aumento di ΔFosB nell'OFC possa non influenzare la sensibilizzazione motoria attraverso il NAc, sebbene molti altri geni, non studiati qui, potrebbero essere coinvolti. Prove considerevoli suggeriscono che la modulazione della corteccia prefrontale mediale (mPFC) può modificare l'attività striatale e quindi contribuire alla sensibilizzazione comportamentale agli psicostimolanti (Steketee, 2003; Steketee e Walsh, 2005), anche se meno si sa sul ruolo di più regioni prefrontali ventrale come l'OFC. Il NAc riceve alcune proiezioni dall'OFC (Berendse et al., 1992). Tuttavia, uno studio più recente e dettagliato ha identificato pochissime proiezioni dirette di OFC-NAc: l'etichettatura sparsa della parte più laterale del guscio di NAc è stata osservata in seguito a iniezioni di tracciante anterogrado nelle aree laterale e ventrolaterale dell'OFC, e l'OFC più ventrale regione invia proiezioni minime al nucleo di NAc (Schilman et al., 2008). Il caudato-putamen centrale riceve innervazione molto più densa. Alla luce di questa evidenza anatomica, la maggior parte del tessuto NAc analizzato nelle nostre reazioni di PCR non sarebbe stata innervata direttamente dall' OFC, diminuendo le probabilità che qualsiasi cambiamento nell'espressione genica venisse rilevato con successo.

L'OFC progetta pesantemente verso regioni che sono strettamente connesse con il NAc, come l'mPFC, l'amigdala basolaterale (BLA), il putamen caudato e il nucleo subtalamico (STN). Se le modifiche all'OFC possano modulare indirettamente il funzionamento del NAc attraverso la sua influenza in queste aree è una questione aperta. È stato dimostrato che l'attività nel BLA è alterata dopo le lesioni OFC e che ciò contribuisce in modo significativo al deficit nell'apprendimento inverso causato dal danno OFC (Stalnaker et al., 2007), ma qualsiasi effetto in aree come il NAc deve ancora essere segnalato. Potrebbe essere più produttivo focalizzare l'attenzione su altre aree più fortemente collegate all'OFC e che sono anche fortemente implicate nel controllo motorio. L'STN è un obiettivo particolarmente promettente, in quanto non solo le lesioni di STN e OFC producono effetti simili sull'impulsività e sull'apprendimento pavloviano (Baunez e Robbins, 1997; Chudasama et al., 2003; Uslaner e Robinson, 2006; Winstanley et al., 2005a), ma la sensibilizzazione locomotoria indotta da psicostimolante è associata ad un aumento dell'espressione c-Fos in questa regione (Uslaner et al., 2003). Sperimentazioni future progettate per sondare come i cambiamenti indotti dal farmaco nell'espressione genica all'interno dell'OFC influenzano il funzionamento delle aree a valle come l'STN sono garantite. L'OFC invia anche una proiezione secondaria all'area tegmentale ventrale (Geisler et al., 2007), una regione nota per essere criticamente coinvolta nello sviluppo della sensibilizzazione locomotoria. È possibile che la sovraespressione di ΔFosB nell'OFC possa quindi influenzare la sensibilizzazione locomotoria attraverso questo percorso.

L'esatta natura della relazione tra i cambiamenti indotti dalla droga nella funzione cognitiva e la sensibilizzazione locomotoria non è al momento chiara, e finora ci siamo concentrati sull'OFC. Alla luce di questi risultati, è possibile che cambiamenti nell'espressione genica associati allo sviluppo della sensibilizzazione locomotoria in altre regioni cerebrali possano avere un impatto sulla risposta cognitiva alla cocaina. Gli esperimenti che esplorano l'interazione tra aree corticali e sottocorticali in seguito alla somministrazione di droghe che danno assuefazione possono gettare nuova luce su come lo stato dipendente viene generato e mantenuto, e sui ruoli interattivi interpretati dalla sensibilizzazione e dalla tolleranza in questo processo.

Riferimenti