COMMENTI: prova che il deltafosb lascia tracce dopo molto tempo dal recupero dalla dipendenza. Specificamente la dipendenza provoca cambiamenti epigenetici, che provocano un'induzione molto più rapida del deltafosb quando si verifica una recidiva. Questo spiega come il ricadere, anche dopo anni, possa rapidamente degenerare in uno stato di dipendenza totale.
J Neurosci. Manoscritto d'autore; disponibile in PMC 2013 gennaio 25.
Astratto
ΔFosB, a FosB prodotto genico, è indotto nel nucleo accumbens (NAc) e nel caudato putamen (CPu) mediante esposizione ripetuta a droghe d'abuso come la cocaina. Questa induzione contribuisce a modelli aberranti di espressione genica e anomalie comportamentali osservate con esposizione ripetuta al farmaco.
Qui, abbiamo valutato se una storia remota di esposizione al farmaco nei ratti potrebbe alterare l'inducibilità del FosB gene suscitato dalla successiva esposizione alla cocaina. Mostriamo che la precedente somministrazione cronica di cocaina, seguita da un prolungato ritiro, aumenta l'inducibilità di FosB in NAc come evidenziato da una maggiore induzione acuta dell'mRNA di ΔFosB e un più rapido accumulo di proteina ΔFosB dopo ripetuta re-esposizione di cocaina. Non così innescato FosB l'induzione è stata osservata in CPu, infatti, la successiva induzione acuta di ΔFosB mRNA è stata soppressa in CPu.
Questi modelli anormali di FosB espressione sono associate a modificazioni della cromatina al FosB promotore del gene. La precedente somministrazione cronica di cocaina induce un prolungato aumento del legame con RNA polimerasi II (Pol II) al FosB promotore solo in NAc, suggerendo che Pol II "stalling" primes FosB per l'induzione in questa regione dopo la riesposizione alla cocaina. Una sfida alla cocaina innesca quindi il rilascio di Pol II dal promotore del gene, consentendo una maggiore rapidità FosB trascrizione. Una sfida alla cocaina diminuisce anche le modifiche repressive dell'istone al FosB promotore in NAc, ma aumenta tali segni repressivi e diminuisce i segni attivanti in CPu.
Questi risultati forniscono nuove informazioni sulla dinamica della cromatina al FosB promotore e rivela un nuovo meccanismo per innescato FosB induzione in NAc dopo riesposizione alla cocaina.
Introduzione
La tossicodipendenza è caratterizzata dalla ricerca e dall'assunzione compulsive di farmaci nonostante gravi conseguenze negative (Kalivas et al., 2005; Hyman et al., 2006). L'esposizione cronica al farmaco causa cambiamenti persistenti nell'espressione genica nello striato ventrale (o nucleo accumbens; NAc) e nello striato dorsale (o putamen caudato; CPu), strutture striatali implicate nella ricompensa e nella dipendenza dalla droga (Freeman et al., 2001; Robinson e Kolb, 2004; Shaham e Hope, 2005; Labirinto e Nestler, 2011). ΔFosB, una proteina troncata e stabile codificata dal gene immediato-precoce, FosB, è un fattore di trascrizione ben caratterizzato indotto in NAc e CPu dall'esposizione cronica a praticamente tutte le droghe d'abuso, dove media le risposte comportamentali sensibilizzate alla somministrazione ripetuta del farmaco (Nestler, 2008). Tuttavia, se la precedente esposizione cronica a un farmaco di abuso altera la successiva induzione di ΔFosB rimane sconosciuta.
Abbiamo ipotizzato recentemente che le modificazioni della cromatina in risposta all'esposizione cronica al farmaco potrebbero alterare l'inducibilità di specifici geni nelle regioni del cervello bersaglio (Robison e Nestler, 2011). Prove crescenti hanno dimostrato che le droghe di abuso dopo somministrazione cronica alterano la struttura e l'accessibilità trascrizionale della cromatina attraverso numerosi tipi di modifiche, tra cui fosforilazione, acetilazione e metilazione delle code dell'istone. Il lavoro più recente nei sistemi di coltura cellulare si è concentrato sul reclutamento di RNA polimerasi II (Pol II) sul promotore di geni "inducibili" prima della loro espressione, con Pol II legato persistentemente a regioni del promotore prossimale e intorno al sito di inizio della trascrizione (TSS ) in uno stato "bloccato" (Core e Lis, 2008; Nechaev e Adelman, 2008). Si pensa che l'attivazione del Pol II in stallo sia responsabile della sua fuga dal promotore e dalle regioni TSS e dalla sua trascrizione di questi geni "innescati" (Zeitlinger et al., 2007; Saha et al., 2011; Bataille et al., 2012).
Qui, mostriamo che la precedente esposizione cronica alla cocaina, seguita da un prolungato periodo di sospensione, altera l'inducibilità del FosB gene alla successiva somministrazione di cocaina, con NAc innescato per induzione mentre CPu non lo è. Quindi identifichiamo distinte firme cromatiniche al FosB promotore del gene in NAc e CPu che sono associati con una tale aberrante inducibilità del FosB gene, compreso il reclutamento di Pol II in stallo presso il FosB promotore prossimale in NAc solo come cambiamenti in diverse modificazioni istoniche attivanti o repressive in entrambe le regioni del cervello. Questi risultati forniscono nuove informazioni sulla dinamica della cromatina al FosB promotore del gene e indicare per la prima volta un meccanismo mediante il quale lo stallo dei numeri primi di Pol II FosB per una maggiore attivazione in NAc dopo la riesposizione alla cocaina.
Materiali e Metodi
Animali
I ratti maschi Sprague Dawley (250-275 g, Charles River Laboratories), utilizzati in tutti gli esperimenti, erano alloggiati in una stanza climatizzata su un ciclo 12 hr luce / buio (luci accese a 7 AM) con accesso al cibo e acqua ad libitum. Tutti gli animali sono stati iniettati due volte al giorno per dieci giorni con cocaina (15 mg / kg, ip) o soluzione salina (ip) nelle loro gabbie di casa. Esperimenti su animali sono stati approvati dalla Commissione per l'assistenza e l'uso di animali (IACUC) presso il Monte Sinai.
Misure del locomotore
Gli animali sono stati abituati nella camera locomotoria il primo giorno per 1 hr, e quindi monitorati per l'attività locomotoria dopo un'iniezione salina utilizzando il Photobeam Activity System (San Diego Instruments). Dopo l'assunzione di 1 hr nelle camere locomotorie ogni giorno, la cocaina (15 mg / kg, ip) è stata somministrata giornalmente per i giorni 2 e gli animali sono stati nuovamente monitorati per l'attività locomotoria per 1 hr.
L'immunoistochimica
Gli animali sono stati perfusi 24 ora dopo la loro ultima esposizione al farmaco. L'immunoreattività ΔFosB / FosB è stata rilevata come descritto (Perrotti et al., 2004). Il western blotting ha confermato che tutta l'immunoreattività ΔFosB / FosB osservava 24 h o più a lungo dopo iniezioni di cocaina riflesse ΔFosB, con FosB non rilevabile (non mostrato).
Isolamento dell'RNA, trascrizione inversa e PCR
Punzoni bilaterali 12-calibro di NAc e dorso-dorsale / CPU dorsomediale sono stati ottenuti come descritto (Perrotti et al., 2004), congelato su ghiaccio secco e lavorato secondo i protocolli pubblicati (Covington et al., 2011). ΔFosB e FosB mRNA è stato misurato utilizzando PCR quantitativa (qPCR) con primer ΔFosB e FosB specifici per isoforma (Alibhai et al., 2007). I livelli di ÀFosB e FosB dell'mRNA sono stati normalizzati ai livelli di mRNA di GAPDH, che non sono stati influenzati dall'esposizione alla cocaina (non mostrata).
Macchia occidentale
Punzoni NAc e CPu sono stati raccolti come sopra e trattati per Western blotting come descritto (Covington et al., 2011), utilizzando anticorpi contro ERK44 / 42 [chinasi regolata dal segnale extracellulare-44 / 42] e phosphoERK44 / 42 (pERK), AKT [proto-oncogene virale del timoma] e p-AKT, SRF (fattore di risposta sierica) e pSRF, CREB [proteina di legame dell'elemento di risposta del cAMP] e pCREB. La quantità di proteina assorbita su ciascuna corsia è stata normalizzata a livelli di actina o tubulina, che non sono stati influenzati dall'esposizione alla cocaina.
Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)
I punzoni NAc e CPu appena dissezionati sono stati preparati per ChIP come descritto (Maze et al., 2010). Ogni condizione sperimentale è stata analizzata in triplice copia da gruppi indipendenti di animali. Per ogni campione di ChIP, i punzoni bilaterali NAc e CPu sono stati raggruppati da cinque ratti (punzoni 10). Gli anticorpi utilizzati per specifiche modifiche dell'istone sono uguali a quelli pubblicati (Maze et al., 2010); anticorpi a Pol II fosforilati a Ser5 della sua regione di ripetizione del dominio del terminale carbossilico (CTD) (Pol II-pSer5) sono stati ottenuti da abCam 5131. Sono stati progettati quattro set di primer ChIP FosB (Lazo et al., 1992; Mandelzys et al., 1997): 1F: GTACAGCGGAGGTCTGAAGG, 1R: GAGTGGGATGAGATGCGAGT; 2F: CATCCCACTCGGCCATAG, 2R: CCACCGAAGACAGGTACTGAG; 3F: GCTGCCTTTAGCCAATCAAC, 3R: CCAGGTCCAAAGAAAGTCCTC; 4F: GGGTGTTTGTGTGTGAGTGG, 4R: AGAGGAGGCTGGACAGAACC. I livelli delle modificazioni della cromatina sono confrontati con quelli per il DNA in ingresso come descritto (Maze et al., 2010).
analisi statistica
Tutti i valori riportati sono media ± sem I dati per l'attività locomotoria e il conteggio delle cellule sono stati analizzati mediante ANOVA a due vie con trattamento e iniezione come fattori. Gli esperimenti qPCR sono stati analizzati per punto temporale da ANOVA unidirezionali con il trattamento come fattore. Quando sono stati osservati effetti principali significativi (p <0.05), sono stati condotti test post-hoc Bonferroni per il confronto con animali trattati con soluzione salina naïve al farmaco (^ in cifre) e animali trattati con cocaina naïve al farmaco (* in figure). Per i dati Western blotting e ChIP sono stati utilizzati test t di Student a due code non accoppiati, con correzioni per confronti multipli.
Risultati
Maggiore Induzione di Fosb in ratti non trattati con cocaina in NAc, ma non in CPu
Per esaminare l'influenza di un precedente corso cronico di cocaina, seguito da un prolungato periodo di sospensione, sull'inducibilità del FosB gene in risposta a una successiva sfida alla cocaina, i ratti che sono stati precedentemente iniettati ip due volte al giorno con soluzione salina o cocaina (15 mg / kg) per 10 giorni hanno ricevuto dosi di prova del farmaco dopo 28 giorni di sospensione (Fig 1A). Per prima cosa abbiamo misurato le risposte locomotorie in un gruppo di animali per confermare l'induzione della sensibilizzazione locomotoria con una precedente esposizione alla cocaina, una conseguenza attesa della somministrazione del farmaco. Ratti con esperienza di cocaina e topi hanno mostrato un'equivalente attività locomotoria al basale, con una sfida alla cocaina verso animali naïf alla droga che aumentavano la loro locomozione (Fig 1B. Ripetute misure ANOVA a due vie, trattamento: F1,66 = 30.42, p <0.0001; sfida alla cocaina: F2,66= 58.39, p <0.0001; trattamento x sfida alla cocaina: F2,66= 8.56, p = 0.0005, post-test Bonferroni ^p <0.001). Questa provocazione con la cocaina ha indotto un'attività locomotoria significativamente maggiore, cioè sensibilizzazione, nei ratti con esperienza di cocaina (Bonferroni post-test * p <0.001).
Per valutare gli effetti di questo regime di pretrattamento della cocaina sull'espressione di ÀFosB in NAc e CPu, abbiamo misurato la proteina ÀFosB con metodi immunoistochimici 24 hr dopo che gli animali naïve alla cocaina e alla cocaina sono stati trattati con 0, 1, 3, o 6 daily challenge di cocaina iniezioni (15 mg / kg; vedi Fig 1A). Come precedentemente stabilito (Nye et al., 1995), Le iniezioni di cocaina 3 sono state sufficienti per indurre in modo significativo la proteina ΔFosB in NAc e CPu di animali naïve al farmaco e il suo accumulo è rimasto significativo dopo 6 giorni di iniezioni di cocaina (Fig 1C. Misure ripetute ANOVA a due vie, nucleo NAc, trattamento: F1,28= 23.5, p <0.0001; sfida alla cocaina: F3,28= 49.16, p <0.0001; trattamento x sfida alla cocaina: F3,28= 6.83, p = 0.0014; Shell NAc, trattamento: F1,28= 18.69, p <0.0001; sfida alla cocaina: F3,28= 31.52, p <0.0001; trattamento x sfida alla cocaina: F3,28= 3.21, p <0.05; CPu, trattamento: F1,28= 9.47, p <0.001; sfida alla cocaina: F3,28= 19.74, p <0.0001; trattamento x sfida alla cocaina: F3,28= 0.94, p> 0.05. In NAc core, shell e CPu, Bonferroni post-test ^p <0.05). Negli animali con esperienza di cocaina, non c'era evidenza di induzione persistente di ΔFosB in NAc o CPu dopo 28 giorni di sospensione, in linea con i rapporti precedenti secondo cui il segnale ΔFosB si dissipa completamente entro questo punto temporale (Nye et al., 1995), la ragione per cui questo punto temporale è stato utilizzato in questo studio. Sorprendentemente, tuttavia, i ratti con esperienza di cocaina che hanno ricevuto iniezioni di cocaina 3 o 6 hanno mostrato un'induzione della proteina ΔFosB significativamente maggiore in NAc, un effetto evidente sia nelle sottoregioni core che in quelle shell (Fig 1C. Bonferroni post-test * p <0.05). Al contrario, non è stata osservata tale maggiore induzione della proteina ΔFosB in CPu; invece, un'induzione equivalente di ΔFosB è stata osservata in questa regione dopo 3 o 6 giorni di iniezioni di cocaina challenge in ratti naïve ed esperti alla cocaina (Fig 1C).
Per ottenere informazioni sulle alterazioni trascrizionali che si verificano in NAc e CPu in risposta a una sfida di cocaina, abbiamo studiato il decorso temporale (45, 90 e 180 min) dell'inducibilità delle trascrizioni di ΔFosB e FosB sull'RNA su una singola cocaina o iniezione salina somministrata a ratti naïve alla cocaina e inesperti dopo 28 giorni di ritiro (vedi Fig 1A). Rispetto a una sfida salina, una sfida alla cocaina ha indotto un rapido aumento dei livelli di ÀFosB e FosB di mRNA in tutti e tre i punti temporali sia in NAc che in CPu di animali naïve alla cocaina (Fig 1D. Misure ripetute ANOVA unidirezionale per punto temporale; Bonferroni post-test ^p <0.05). In NAc, abbiamo osservato una maggiore induzione dell'mRNA di ΔFosB e FosB negli animali con esperienza di cocaina rispetto agli animali naïve alla cocaina dopo il challenge con cocaina, l'effetto essendo significativo a 90 minuti mentre, al contrario, l'inducibilità dell'mRNA di ΔFosB e FosB in CPu era significativamente diminuito negli animali con esperienza di cocaina (Fig 1D. Bonferroni post-test %p = 0.08, * p <0.05).
Caratterizzazione di vie di segnalazione a monte in NAc e CPu di ratti con esperienza di cocaina
Una possibile spiegazione per l'alterata inducibilità del FosB gene in NAc e CPu dopo un precedente corso cronico di cocaina è che una remota storia di esposizione alla cocaina potrebbe indurre cambiamenti duraturi nelle vie di segnalazione che sono a monte di FosB induzione genica tale che una sfida alla cocaina induce quindi il gene a un grado aberrante. Per studiare questa ipotesi, abbiamo analizzato i due fattori di trascrizione, SRF e CREB, che sono stati recentemente dimostrati necessari per l'induzione della cocaina di ΔFosB in queste regioni del cervello (Vialou et al., 2012) insieme a protein chinasi a monte, ERK e AKT, implicate anche nell'azione della cocaina (Valjent et al., 2000; Lu et al., 2006; Boudreau et al., 2009). Non siamo riusciti a rilevare eventuali cambiamenti nei livelli totali o fosforilati di queste varie proteine che potrebbero spiegare l'alterata inducibilità dei FosB osservato, incluso nessun cambiamento in SRF, CREB o AKT (Fig 2B, C). La mancanza di cambiamento in pSRF e pCREB in NAc in risposta a una sfida alla cocaina è coerente con un recente rapporto, che ha trovato entrambi indotti in modo significativo solo dalla cocaina cronica (Vialou et al., 2012).
In NAc e CPu di animali naïve ai farmaci, 20 min dopo l'esposizione iniziale al farmaco (Fig 2A), una singola cocaina ha diminuito i livelli di pERK42 / 44 (Fig 2B, C. Test t di Student a due code: * p <0.05). Ci sono precedenti segnalazioni di aumento dei livelli di pERK in queste regioni dopo somministrazione acuta di cocaina (Valjent et al., 2000). Questo è difficile da confrontare con altri documenti che esaminano la fosforilazione di ERK in NAc durante il ritiro da ripetute iniezioni di cocaina (Boudreau et al., 2007; Shen et al., 2009), come nel nostro studio il pERK è stato quantificato dopo 28 giorni di prelievo e dopo una cocaina o una soluzione salina. Rispetto agli animali naïf alle droghe che hanno sperimentato la cocaina per la prima volta, la ri-esposizione alla cocaina in ratti con cocaina, dopo 28 giorni di astinenza, ha causato un aumento significativo dei livelli di pERK42 / 44 in CPu (Fig 2B, C. Test t per studenti a due code: * p <0.05).
Il panorama della cromatina al Promotore del gene Fosb in NAc e CPu di ratti con esperienza di cocaina
Abbiamo poi esaminato se i cambiamenti in FosB l'inducibilità genetica è associata ad alterazioni nella sua struttura cromatinica. ChIP è stato eseguito su NAc e CPu usando anticorpi diretti contro tre forme ben caratterizzate di modificazioni istoniche: trimetilazione di Lys4 dell'istone H3 (H3K4me3) associato all'attivazione genica, e H3K27me3 e H3K9me2 associati alla repressione genica. Abbiamo analizzato i ratti naïve alla cocaina ed esperti dopo 28 giorni di sospensione o senza o con una iniezione di cocaina di sfida, con animali esaminati 1 più tardi (Fig 3A). In NAc, non abbiamo trovato cambiamenti significativi nel legame di nessuna di queste tre modifiche dell'istone al FosB promotore del gene in assenza di una sfida alla cocaina, sebbene ci fosse una tendenza a ridurre i livelli di H3K9me2 (Fig 3B-D. Test t di Student a due code. #p = 0.2 rispetto ai rispettivi controlli di Naïve per i farmaci). Questo effetto è diventato significativo dopo una sfida alla cocaina ed era specifico per la regione del promotore prossimale del gene (Fig 3C. * p <0.05). Sebbene i livelli di H3K9me2 siano molto bassi in alcuni geni, il FosB il promotore del gene mostra livelli apprezzabili di questo marchio in NAc in condizioni di controllo (Maze et al., 2010, dati non mostrati). Al contrario, in CPu, abbiamo rilevato riduzioni piccole ma significative nel binding H3K4me3 e aumenti nel binding H3K27me3, al FosB promotore in assenza di una sfida alla cocaina, effetti persi dopo la sfida (Fig 3D. * p <0.05).
Abbiamo poi studiato Pol II legandosi al FosB gene, basato su recenti scoperte nella coltura cellulare che lo stallo di Pol II a TSSs, che è caratterizzato dalla sua fosforilazione a Ser 5 nella sua regione di ripetizione CTD, è associato all'innesco di geni (vedi Introduzione). Abbiamo quindi analizzato il binding di Pol II-pSer5 con FosB in quattro regioni distinte del gene (Fig 3B). Questa analisi ha rivelato un significativo arricchimento di Pol II-pSer5 al FosB gene nella sua regione del promotore prossimale e attorno al suo TSS in NAc di animali con esperienza nella cocaina, dopo un prolungato ritiro, in assenza di una sfida alla cocaina rispetto ai controlli (Fig 3E. * p <0.05). Questo arricchimento non era evidente in due regioni del corpo genico di FosB, coerente con lo stallo di Pol II descritto in sistemi sperimentali più semplici. È interessante notare che, dopo una sfida alla cocaina, il legame Pol II-pSer5 mostrava ancora segni di arricchimento, sebbene non più significativo, FosB regione del promotore prossimale (Fig 3E. %p = 0.1), ma è tornato ai livelli di controllo sul TSS. I risultati in CPu erano più variabili, senza un chiaro schema di legame Pol II-pSer5 osservato.
Discussione
Il presente studio fornisce nuove informazioni sulla regolamentazione sostenuta di FosB settimane dopo la cessazione dell'esposizione ripetuta alla cocaina. Mostriamo che la precedente somministrazione cronica di cocaina rende il FosB gene più inducibile in NAc, con conseguente più rapido accumulo di ΔFosB al momento della riesposizione al farmaco. Data la preponderanza di prove che l'induzione di ΔFosB in NAc media le risposte comportamentali sensibilizzate alla cocaina (Nestler, 2008Le nostre scoperte rivelano un nuovo meccanismo per il ripristino più rapido di tali risposte sensibilizzate dopo un prolungato ritiro.
Dimostriamo che l'induzione potenziata di ΔFosB in NAc è associata a cambiamenti della cromatina al FosB gene che ci si aspetta che lo inneschi per una maggiore induzione. Quindi, mostriamo un aumento del legame di Pol II con il promotore prossimale e le regioni TSS del gene che sono presenti dopo 4 settimane di astinenza dalla precedente somministrazione cronica di cocaina. Tale arricchimento di Pol II al TSS si perde rapidamente a causa della sfida della cocaina e FosB induzione, coerente con un modello in coltura cellulare che ha bloccato Pol II è rilasciato da TSSs su attivazione genica (vedi Introduzione). Una sfida alla cocaina induce anche una rapida diminuzione del legame di H3K9me2 - un segno di repressione genetica - alla FosB promotore. Al contrario, non abbiamo rilevato alcuna induzione duratura di diversi fattori di trascrizione, o delle loro chinasi a monte, che sono noti per mediare FosB induzione da cocaina. Questi risultati supportano la nostra ipotesi che l'induzione potenziata di ΔFosB in NAc è mediata tramite priming epigenetico del FosB gene e non tramite upregulation di eventi upstream.
Risultati molto diversi sono stati ottenuti per CPu. Non ci sono prove per lo stallo di Pol II a FosB in ratti esperti di cocaina prima di una sfida di cocaina, anche se c'erano piccole ma significative modificazioni dell'istone compatibili con la repressione genica: aumento del legame di H3K27me3 e riduzione del legame di H3K4me3. Non c'era anche alcun cambiamento nei fattori di trascrizione upstream o nelle chinasi coerenti con ridotto FosB induzione. Questi risultati suggeriscono che dopo la somministrazione cronica di cocaina, le modificazioni epigenetiche servono a smorzare FosB inducibilità genica in CPu, in contrasto con il priming visto in NAc. Tuttavia, mentre questi effetti reprimono l'induzione del mRNA di ΔFosB dopo la riesposizione alla cocaina, non vi è perdita nell'accumulo di proteina ΔFosB. Il meccanismo alla base di questo paradosso richiede ora ulteriori indagini.
Più in generale, i nostri risultati supportano un modello in cui le alterazioni del panorama della cromatina a specifici geni in risposta alla somministrazione cronica di cocaina servono a innescare o smorzare quei geni per la successiva induzione alla ri-esposizione al farmaco. Tali cambiamenti della cromatina, che possono essere visti come "cicatrici epigenetiche", andrebbero persi nelle analisi dei livelli di geni dell'mRNA allo steady state. In questo modo, la caratterizzazione dell'epigenoma della dipendenza promette di rivelare nuove informazioni sulla patogenesi molecolare del disturbo, che può essere sfruttata per lo sviluppo di nuovi trattamenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni dal National Institute on Drug Abuse.
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