PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Astratto
Le alterazioni indotte dalla cocaina nell'espressione genica causano cambiamenti nella morfologia e nel comportamento neuronale che possono essere alla base della dipendenza da cocaina. Abbiamo identificato un ruolo essenziale per la dimetilazione dell'istone 3 lisina 9 (H3K9) e della lisina dimetiltransferasi G9a nella plasticità strutturale e comportamentale indotta dalla cocaina. La somministrazione ripetuta di cocaina ha ridotto i livelli globali di dimetilazione di H3K9 nel nucleo accumbens. Tla sua riduzione della metilazione dell'istone fu mediata attraverso la repressione di G9a in questa regione del cervello, che era regolata dal fattore di trascrizione indotto dalla cocaina ΔFosB. Utilizzando mutagenesi condizionale e trasferimento genico mediato da virus, abbiamo scoperto che la downregulation di G9a aumentava la plasticità della colonna vertebrale dendritica dei neuroni accumbens del nucleo e una maggiore preferenza per la cocaina, stabilendo così un ruolo cruciale per la metilazione dell'istone nelle azioni a lungo termine della cocaina.
Introduzione
L'esposizione ripetuta alla cocaina è caratterizzata da cambiamenti persistenti nell'espressione genica e alterata morfologia neuronale all'interno del nucleo accumbens (NAc), una componente chiave del circuito di ricompensa del cervello (1-2). Il rimodellamento della cromatina è importante nei cambiamenti trascrizionali aberranti in questa regione del cervello che può essere alla base degli aspetti della dipendenza da cocaina (3-9). La regolazione della cocaina della struttura della cromatina nel NAc risulta, in parte, da modifiche dirette della cocaina indotte dalla macchina enzimatica della cromatina, portando a cambiamenti nell'acetilazione dell'istone e nella fosforilazione (4, 7-9); tuttavia, i ruoli per gli enzimi che controllano la metilazione dell'istone non sono ancora stati studiati.
Una recente analisi del promotore su tutto il genoma utilizzando immunoprecipitazione della cromatina accoppiata a microarrays (ChIP-Chip) ha identificato modelli alterati di istone repressiva H3 lisina 9 (H3K9) e 27 (H3K27) metilazione a specifici promotori di geni in NAc dopo trattamento ripetuto di cocaina (6). Abbiamo quindi profilato numerosi lisina metiltransferasi (KMT) e demetilasi (KDM) che sono noti per controllare la metilazione di H3K9 o H3K27 (Fig. 1A). Solo due enzimi, G9a e GLP, hanno mostrato la regolazione trascrizionale persistente 24 ore dopo la somministrazione ripetuta di cocaina, quando l'espressione di entrambi i geni era significativamente sottoregolata. Poiché G9a e GLP catalizzano specificamente la dimetilazione di H3K9 (H3K9me2), la loro downregulation da parte della cocaina è coerente con i livelli globali ridotti di H3K9me2 eucromatico osservati in questo momento (Fig. 1B). Al contrario, i livelli globali di metilazione eterocromatica di H3K27 sono rimasti inalterati grazie all'esposizione ripetuta alla cocaina (Fig. S1 nel supporto del materiale online). A causa dei suoi alti livelli di attività catalitica entrambi in vitro ed in vivo (10), abbiamo deciso di approfondire il significato funzionale della repressione di G9a in seguito all'esposizione ripetuta alla cocaina nel NAc. I livelli della proteina G9a, come i livelli del suo mRNA, erano significativamente ridotti di 24 ore dopo somministrazione ripetuta di cocaina (Fig. S2). Sebbene l'espressione di mRNA di G9a fosse ridotta del 35% nel NAc, l'analisi immunoistochimica ha rivelato una riduzione del 15% più modesta nei livelli di proteina G9a, in accordo con il calo osservato di 21% di H3K9me2 dopo somministrazione ripetuta di cocaina (Fig. 1B). L'espressione di mRNA di G9a era anche sottoregolata in questa regione del cervello da 20% dopo ripetuta autoamministrazione di cocaina (Fig. S3).
Per identificare se i cambiamenti di H3K9me2 eucromatici sono correlati alle alterazioni dell'intero genoma nell'espressione genica nel NAc, abbiamo impiegato analisi di microarray per esaminare i profili di espressione genica indotti da una dose di cocaina negli animali con o senza una precedente esposizione a cocaina precedente (vedere supplemento elenchi di geni in Tabelle S1-S3). Gli animali che avevano ricevuto la cocaina ripetuta mostravano una drammatica aumentata espressione genica 1 ora dopo una sfida alla cocaina rispetto agli animali trattati acutamente (Fig. 1C). Questo aumento dell'espressione genica si è verificato ancora in risposta a una cocaina provocata dopo la settimana di astinenza da 1 da cocaina ripetuta. Coerentemente con i precedenti rapporti, una piccola percentuale di geni (~ 10%) mostra risposte trascrizionali desensibilizzate dopo ripetute somministrazioni di cocaina (Fig. 1C; vedere Tabella S1) (5). Per indagare direttamente il ruolo della downregulation G9a nell'espressione genica potenziata osservata dopo ripetuta cocaina, i topi hanno ricevuto iniezioni intra-NAc di vettori di virus Herpes simplex (HSV) che esprimono GFP o G9a e sono stati trattati con cocaina salina o ripetuta per determinare se la sovraespressione di G9a è stato sufficiente a bloccare l'aumento ripetuto indotto dalla cocaina dell'espressione genica. Da un insieme di geni 12 selezionati in modo casuale che mostrano livelli di espressione più elevati a seguito di cocaina ripetuta, abbiamo osservato che G9a ha ridotto significativamente l'espressione potenziata di 50% di questi geni (Tabella S4).
Per identificare gli eventi trascrizionali a monte che mediano la ripetuta repressione indotta da cocaina dell'espressione di G9a, abbiamo studiato un possibile ruolo di ΔFosB, un prodotto di giunzione altamente stabile del gene precoce immediato FosB. ΔFosB si accumula nel NAc dopo ripetuta esposizione alla cocaina, dove è stato associato ad un aumento della ricompensa di cocaina (11). ΔFosB può agire sia come attivatore trascrizionale che come repressore a seconda del gene bersaglio coinvolto (3, 5, 6, 12). Utilizzando NSE bitransgenicotTA × tetOP-ΔFosB topi, in cui l'espressione di ΔFosB può essere indotta selettivamente nel NAc e nello striato dorsale di animali adulti (13), abbiamo esaminato l'impatto dell'espressione ΔFosB sulla regolazione della cocaina di H3K9me2 e KMTs nel NAc. La sovraespressione di ÀFosB è stata sufficiente a ridurre i livelli di entrambi H3K9me2 (Fig. 1D) e G9a espressione (Fig. 1E), imitando così gli effetti della ripetuta cocaina. Al contrario, ΔFosB non ha ridotto l'espressione di GLP in questa regione del cervello e non ha avuto alcun effetto su SUV39H1 e EZH2, i principali enzimi trimethylating per H3K9 e H3K27, rispettivamente (Fig. S4). Per confermare questi dati utilizzando un sistema di sovraespressione ΔFosB indipendente, i topi adulti wildtype hanno ricevuto iniezioni bilaterali intra-NAc di vettori di virus Adeno-associati (AAV) che esprimono GFP o ΔFosB. L'iperespressione virale mediata di ΔFosB ha ridotto i livelli di espressione di G9a in questa regione del cervello (Fig. 1E).
Tale regolazione pronunciata e specifica di G9a ci ha spinto a indagare se l'alterazione dell'espressione di G9a specificamente nei neuroni di NAc regola le risposte comportamentali alla cocaina. I topi Wildtype hanno ricevuto iniezioni intra-NAc di vettori HSV che esprimono GFP o G9a e sono stati quindi analizzati utilizzando un paradigma di preferenza place condizionale privo di cocaina, che fornisce una misura indiretta della ricompensa del farmaco. La sovraespressione virale di G9a nei neuroni NAc è stata confermata dopo test comportamentali (Fig. 2A). La sovraespressione di G9a ha diminuito in modo significativo la preferenza per la cocaina rispetto agli animali che sovraesprimono GFP (Fig. 2B) e aumentati i livelli di H3K9me2 nel NAc (Fig. 2C). Sovraespressione di un mutante cataliticamente morto di G9a (G9aH1093K) (14) non ha influito sulla preferenza della cocaina (Fig. 2B) e non ha avuto alcun effetto sui livelli di H3K9me2 in questa regione del cervello (Fig. 2C).
Per studiare ulteriormente il ruolo di G9a negli effetti comportamentali della cocaina, e più specificamente per imitare la repressione ripetuta da cocaina dell'espressione di G9a nel NAc, G9a adultofl / fl topi (14) ha ricevuto iniezioni intra-NAc di vettori AAV che esprimevano Cre ricombinasi o GFP come controllo. AAV-Cre knockdown di G9a nel NAc, che è stato confermato immunoistochimicamente (Fig. S5), ha aumentato significativamente gli effetti della cocaina negli esperimenti di condizionamento del luogo e ha ridotto i livelli di H3K9me2 nel NAc (Fig. 2D, E). Un inibitore farmacologico disponibile in commercio di G9a e GLP, BIX01294 (15-16), è stato utilizzato per accertare se l'inibizione enzimatica influenzi analogamente le risposte comportamentali alla cocaina. Infatti, l'inibizione farmacologica di G9a e GLP ha aumentato significativamente la preferenza per la cocaina e diminuito H3K9me2 nel NAc (Fig. 2F, G).
La somministrazione ripetuta di cocaina aumenta la densità delle spine dendritiche sui neuroni medi spinosi NAc (17), un processo associato a cambiamenti funzionali alle sinapsi glutamatergiche eccitatorie su questi neuroni (18-19) e sensibilizzate risposte comportamentali al farmaco (17, 20). Abbiamo quindi ipotizzato che la downregulation dell'attività di G9a nel NAc da parte di cocaina ripetuta potrebbe mediare la capacità della cocaina di regolare la densità della colonna vertebrale dendritica dei neuroni di NAc. Usando l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) con un anticorpo anti-G9a, abbiamo identificato diversi putativi target genici di G9a nel NAc, ognuno dei quali è stato precedentemente implicato nella plasticità dendritica indotta da cocaina (Fig. 3A) (20-26). Abbiamo trovato che la somministrazione ripetuta di cocaina diminuiva significativamente il legame con G9a, così come i livelli di H3K9me2, a questi promotori di geni (Fig. 3B). Al contrario, la somministrazione acuta di cocaina ha rapidamente assunto G9a in alcuni di questi stessi geni promotori, in linea con l'aumentata espressione di G9a osservata nell'ANC di 1 dopo una dose acuta di cocaina (Fig. S6). Sebbene il legame di G9a a specifici promotori del gene sia correlato con i cambiamenti nella sua espressione, non è chiaro se tali eventi siano mediati da livelli globali alterati di G9a nel NAc e / o da differenze nel reclutamento di G9a dopo acuta vs. ripetuta somministrazione di cocaina.
Sulla base della regolazione di G9a di numerosi geni correlati alla plasticità nel NAc, abbiamo esaminato direttamente se il mantenimento dell'espressione di G9a in questa regione del cervello dopo ripetuti trattamenti di cocaina fosse sufficiente a bloccare la formazione di spine dendritiche indotta da cocaina. Utilizzando un protocollo di trattamento della cocaina precedentemente dimostrato di promuovere l'induzione della colonna vertebrale dendritica nel NAc (20), abbiamo esaminato la densità della colonna vertebrale negli animali iniettati con HSV-GFP o HSV-G9a. In accordo con i risultati precedenti, abbiamo osservato un aumento significativo della densità della colonna vertebrale dendritica nel NAc dopo il trattamento con cocaina, un effetto che è stato completamente bloccato dalla sovraespressione di G9a (Fig. 3C). La sovraespressione di G9a da sola non era sufficiente a ridurre la densità della colonna vertebrale dendritica di NAc in assenza di cocaina. Per completare questi dati, G9afl / fl i topi hanno ricevuto iniezioni intra-NAc di HSV-Cre e la densità della colonna vertebrale è stata quantificata e confrontata con gli animali che hanno ricevuto HSV-GFP in assenza di cocaina. Atterramento dell'espressione di G9a ha aumentato significativamente la densità della colonna vertebrale sui neuroni medi spinosi NAc (Fig. 3C).
Data la prova che la downregulation di G9a nel NAc dopo cocaina ripetuta è mediata da ΔFosB, abbiamo poi esaminato se questo fattore di trascrizione è parimenti coinvolto nella regolazione delle spine dendritiche di NAc. Sebbene ΔFosB non sia stato precedentemente collegato causalmente a tale plasticità dendritica, molti dei suoi bersagli, incluse le subunità Cdk5 e NFκB, sono stati così coinvolti (20-23), e l'espressione persistente di ΔFosB nei neuroni di NAc si correla con l'aumento della densità della colonna vertebrale dendritica dopo ripetuti trattamenti con cocaina (27). Innanzitutto, abbiamo trovato che l'induzione di ΔFosB nei topi bitransgenici in assenza di cocaina, che riduceva l'espressione di G9a e H3K9me2 (Fig. 1D, E), diminuito legame G9a a numerosi geni correlati alla plasticità, molti dei quali hanno anche dimostrato di essere bersagli diretti di ΔFosB stesso (Fig. 3D) (3, 6). Abbiamo poi dimostrato che la sovraespressione virale di ΔFosB nel NAc ha aumentato significativamente la densità della colonna vertebrale dendritica in condizioni basali, simile a quello osservato dopo la somministrazione ripetuta di cocaina (Fig. 3E). Al contrario, la sovraespressione nel NAc di ΔJunD, una proteina mutante dominante negativa che antagonizza l'attività trascrizionale di ΔFosB, ha bloccato la capacità della cocaina ripetuta di aumentare la formazione di spine dendritiche nel NAc (Fig. 3C).
La nostra osservazione che ΔFosB regola l'espressione di G9a nel NAc e che ΔFosB e G9a regolano alcuni degli stessi geni target, ci ha portato ad esaminare altre interazioni tra ΔFosB e G9a. Dopo cocaina acuta, quando i livelli di G9a sono stati aumentati, il legame di G9a al FosB gene è stato aumentato, mentre dopo la cocaina ripetuta, quando l'espressione di G9a è stata soppressa, G9a si lega al FosB gene è diminuito (Fig. 3A). Non è stata osservata tale diminuzione del legame con G9a dopo cocaina ripetuta c-fos, dove il legame con G9a è aumentato da cocaina ripetuta (Fig. S7). Questo è coerente con il fatto che, a differenza di FosB, c-fos è represso, non indotto, dall'esposizione psicostimolante cronica (5). La sovraespressione ΔFosB nei topi bitransgenici è stata sufficiente per ridurre significativamente il legame di G9a con FosB gene (Fig. 3D). Inoltre, la sovraespressione di G9a è stata sufficiente a ridurre l'aumentata espressione di ÀFosB in seguito alla somministrazione ripetuta di cocaina (Tabella S4). Questi dati suggeriscono un ciclo autoregolatorio in base al quale G9a inizialmente limita l'induzione di ΔFosB mediante somministrazione acuta di cocaina. Tuttavia, poiché il ΔFosB si accumula con l'esposizione ripetuta al farmaco, reprime G9a e potenzia quindi la propria ulteriore induzione.
In conclusione, abbiamo dimostrato che la metilazione dell'istone della lisina nel NAc è criticamente coinvolta nella regolazione dell'espressione genica neuronale in risposta alla cocaina. La repressione di G9a e H3K9me2 dopo ripetute somministrazioni di cocaina favorisce la cocaina, in parte, attraverso l'attivazione trascrizionale di numerosi geni noti per regolare forme aberranti di plasticità dendritica. Acquisire una migliore comprensione dei geni regolati attraverso tali meccanismi migliorerà la nostra conoscenza delle complesse basi biologiche della tossicodipendenza e potrebbe aiutare nello sviluppo di terapie più efficaci per i disturbi da dipendenza.
Materiali e Metodi
Animali e trattamenti
Salvo diversa indicazione, i topi erano alloggiati da quattro a cinque per gabbia in una colonia con un ciclo 12 ore / buio (luci accese da 7: 00 AM a 7: 00 PM) a temperatura costante (23 ° C) con ad libitum accesso all'acqua e al cibo. Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dalla IACUC presso l'UT Southwestern Medical Center e la Mount Sinai School of Medicine.
Per gli esperimenti di cocaina [immunoistochimica, western blotting, PCR quantitativa (qPCR), analisi di microarray e immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)], sono stati usati topi C8BL / 10J maschi di 57- a 6-settimana-vecchio. Gli animali hanno ricevuto iniezioni giornaliere di "salina" (7 trattamenti salino, ip), cocaina "acuta" (6 trattamenti salino + un trattamento 20 mg / kg cocaina-HCl, ip) o cocaina "ripetuta" (trattamenti 7 20 mg / kg cocaina-HCl, ip). I topi sono stati sacrificati all'ora 1 o 24 ore dopo il trattamento finale. Per gli studi di microarray, gli animali sono stati trattati quotidianamente sia con "salina" (15 trattamenti salino, ip), cocaina "acuta" (14 trattamenti salino + 1 trattamento 20 mg / kg cocaina-HCl, ip), cocaina "ripetuta + acuta" ( Trattamenti 7 salina + 8 trattamenti 20 mg / kg cocaina-HCl, ip) o "prelievo ripetuto + cocaina acuta" (trattamenti 7 20 mg / kg cocaina-HCl + 7 trattamenti salina + 1 challenge treatment 20 mg / kg cocaina-HCl, ip) e sono stati sacrificati 1 ora dopo il trattamento finale. In esperimenti comportamentali, i topi sono stati singolarmente ospitati dopo l'intervento chirurgico e sono stati trattati con 10 mg / kg di cocaina-HCl, ip come descritto di seguito. Per l'analisi della colonna vertebrale dendritica e la convalida di microarray in seguito a infezione da HSV-GFP e HSV-G9a-GFP, i topi sono stati trattati con "salina" (5 trattamenti salino, ip) o "ripetuta cocaina" (trattamenti 5 20 mg / kg cocaina-HCl, ip ) nel corso dei giorni 3, poiché in precedenza questo protocollo di iniezione ha dimostrato di aumentare la densità della colonna vertebrale sui neuroni del nucleus accumbens (NAc) entro il lasso di tempo dell'espressione del transgene del virus dell'herpes simplex (HSV) (Rif aggiuntivo S1). I topi utilizzati per l'analisi della colonna vertebrale dendritica sono stati sacrificati 4 ore dopo l'ultimo trattamento.
Per indurre la cancellazione locale della trascrizione di G9a limitata ai neuroni NAc, abbiamo usato topi mutanti omozigoti per un allele G9a floxed, che sono stati descritti in dettaglio altrove (S2). Ricombinazione Cre-indotta produce esone 22 a 25 splicing out-of-frame che porta al decadimento mediato da sciocchezze del trascritto mutato. Abbiamo usato topi floxed G9a che erano completamente retrocopati a topi C57BL / 6J. I topi sono stati iniettati sterotassicamente nel NAc con vettori di virus Adeno-associato (AAV) (sierotipo 2) che esprimono GFP o Cre-GFP tra l'età di 7 e 10 settimane. L'analisi immunoistochimica è stata utilizzata per verificare l'efficienza della ricombinazione Cre-mediata (cfr Figura supplementare S5). Abbiamo usato animali sottoposti a iniezione AAV 21 giorni dopo l'intervento chirurgico perché la ricombinazione in topi G9a floxed era stabile e massima a questo punto temporale, in linea con i report pubblicati (S3-S4). Gli esperimenti di sovraespressione di G9a e ΔJunD sono stati condotti in modo simile usando vettori di virus HSV che esprimevano GFP, tipo selvatico G9a-GFP, G9aH1093K-GFP cataliticamente morto o ΔJunD-GFP (vedere S2 per i dettagli relativi allo sviluppo dei costrutti G9a). Topi con sovraesprimono di HSV sono stati usati 3 giorni dopo l'intervento chirurgico poiché la sovraespressione era massima in questo momento, osservata tramite immunoistochimica. A causa della natura transitoria dell'espressione dell'HSV e della natura considerevolmente più stabile dell'espressione AAV, i vettori HSV sono stati utilizzati in esperimenti che richiedevano un'espressione transgenica rapida ea breve termine, mentre i vettori AAV sono stati utilizzati in esperimenti che richiedevano periodi prolungati di espressione del transgene. Entrambi i vettori hanno dimostrato, in ampi studi precedenti, di infettare solo i corpi cellulari neuronali all'interno dell'area del cervello iniettato, senza alcuna infezione di neuroni afferenti o efferenti.
Per gli esperimenti comportamentali che utilizzano l'inibitore farmacologico G9a / GLP, BIX01294 (25 ng / μl), i topi sono stati impiantati sterotassicamente con due minipompe sottocutanee, nonché con cannule di guida bilaterali, nel NAc. Le minipompe sono state attivate 12 ore prima dell'impianto iniziando la somministrazione continua (0.25 μl / ora) di entrambi i veicoli (5 idrossipropil beta-ciclodestrina) o farmaco per i giorni 14, durante i quali sono state eseguite valutazioni comportamentali.
Per esperimenti di sovraespressione ΔFosB [western blotting, qPCR e ChIP], NSE bitransgenico maschile-tTA × tetOP-ΔFosB sono stati usati topi (10 settimane), per cui in assenza della doxiciclina derivata dalla tetraciclina (8 settimane fuori doxiciclina), gli animali mostravano una forte espressione costitutiva striatale striata di ΔFosB (S5). La sovraespressione di ÀFosB in questi topi è stata confermata tramite qPCR. Per confermare i risultati usando NSE-tTA × tetOP-ΔFosB topi, wildtype 8-settimane-vecchi C57BL / 6J topi maschi sono stati iniettati intra-NAc sterotassicamente con vettori AAV che esprimono GFP o ΔFosB-GFP. I vettori AAV sono stati utilizzati, in questo caso, per garantire l'espressione massima di ÀFosB alle 8 settimane dopo l'intervento chirurgico, consentendo un confronto diretto tra i topi sovraespressivi ΔFosB con infezione virale e bitransgenici. La sovraespressione virale è stata confermata usando qPCR a 8 settimane dopo l'intervento chirurgico (i punzoni NAc di 15 sono stati sezionati sotto il sito di iniezione). I topi con sovraesprimono AAV-GFP e AAV-ÀFosB-GFP che non sono stati utilizzati per qPCR sono stati trattati con soluzione salina (14 trattamenti salino, ip) o cocaina ripetuta (trattamenti 14 30 mg / kg cocaina-HCl, ip) a partire da 6 settimane post- chirurgia. 4 giorni dopo il trattamento finale, i cervelli sono stati fissati con 4% paraformaldeide, sezionati su un vibratomo e utilizzati per l'analisi della colonna vertebrale dendritica.
Analisi Western blot
I punzoni NAc di gauge 14 sono stati prelevati da sezioni coronali 1 mm ottenute utilizzando una matrice cerebrale di topo in acciaio inossidabile e sono stati sonicati nel tampone di lisi 1 M HEPES (1% SDS) contenente inibitori di proteasi e fosfatasi. 10-I campioni di 30 μg di proteine totali sono stati sottoposti a elettroforesi su gel 18% SDS. Le proteine sono state trasferite in membrane PVDF e incubate con anti-H3K9me2 (monoclonale di topo, 1: 500), anti-β-tubulina (monoclonale di topo, 1: 60,000), istone anti-totale H3 (coniglio policlonale, 1: 5,000), anti-GFP (utilizzato per la verifica di uguale espressione virale nel tessuto perforato) (coniglio policlonale, 1: 1000), anti-H3K27me3 (coniglio policlonale, 1: 500) o anticorpi anti-actina (monoclonale di topo, 1: 60,000) durante la notte a 4 ° C (tutte le membrane sono state bloccate nel latte 5% o 5% di albumina di siero bovino). Le membrane sono state quindi incubate con anticorpi secondari marcati con perossidasi (1: 15,000-1: 60,000 a seconda dell'anticorpo primario utilizzato) e le bande sono state visualizzate utilizzando il substrato SuperSignal West Dura. Le bande sono state quantificate con il software NIH Image J e le bande H3K9me2 sono state normalizzate a actina o β-tubulina e all'istone totale H3 da controllare per un carico uguale. La cocaina ripetuta non ha avuto effetti sui livelli di actina (Fig. S8) o l'istone totale 3 (Fig. S1) nel NAc. Inoltre, l'infezione da HSV-G9a-GFP e HSV-G9aH1093K-GFP non ha avuto alcun effetto sui livelli totali di β-tubulina nel NAc (Fig. S8).
L'immunoistochimica
I topi sono stati sedati con una dose letale di idrato di cloralio e perfusi con 4% paraformaldeide prima di essere analizzati mediante immunoistochimica singola o doppia come precedentemente descritto (S6). In breve, i cervelli post-fissi sono stati incubati a temperatura ambiente per una notte in saccarosio 30% prima di essere sezionati a 35 μm (i cervelli utilizzati per l'analisi della colonna vertebrale dendritica sono stati sezionati su un vibratoma in sezioni 100 μm in assenza di saccarosio 30%). Le sezioni NAc libere galleggianti sono state lavate con 1X PBS, bloccate (siero normale di asino 3%, 0.1% tritonX, 1X PBS) e successivamente incubate con anti-GFP (policlonali di pollo, 1: 8000) e / o anti-G9a (coniglio policlonale , 1: 500) anticorpi in soluzione bloccante. Le sezioni analizzate per le spine dendritiche sono state incubate con un anticorpo policlonale anti-GFP di coniglio in 1: 200. Dopo incubazione durante la notte, le sezioni NAc sono state risciacquate con 3 volte per 10 minuti con 1X PBS, seguite da incubazione con Cy2 e / o anticorpi secondari accoppiati fluorescenti Cy3 in 1X Soluzione di blocco PBS per 2 ore. Le sezioni utilizzate per gli studi di morfologia sono state incubate nell'anticorpo secondario durante la notte a temperatura ambiente. La co-colorazione nucleare è stata ottenuta incubando sezioni in 1X PBS contenente DAPI (1: 50,000) per i minuti 10. Le sezioni sono state nuovamente lavate, seguite dalla disidratazione con etanolo e il montaggio con DPX. Tutte le sezioni sono state riprese utilizzando la microscopia confocale.
Isolamento dell'RNA e qPCR
Punzoni NAc bilaterali calibro 14 sono stati omogeneizzati in Trizol e processati secondo le istruzioni del produttore. L'RNA è stato purificato con le colonne RNAesy Micro e la spettroscopia ha confermato che le razioni di RNA 260/280 e 260/230 erano> 1.8. L'RNA è stato quindi trascritto al contrario utilizzando un kit Bio-Rad iScript. Il cDNA è stato quantificato mediante qPCR utilizzando SYBR Green. Ogni reazione è stata eseguita in duplicato o triplicato e analizzata seguendo il metodo ΔΔCt come descritto in precedenza utilizzando la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) come controllo di normalizzazione (S7). Vedere Tabella supplementare S5 per le sequenze di primer mRNA.
Analisi del DNA microarray
Quattro gruppi (replicanti biologici indipendenti 3 per gruppo) sono stati utilizzati per lo studio di microarray, per un totale di microarray 12. 1 ora dopo l'ultima iniezione di cocaina, gli animali sono stati rapidamente decapitati e il cervello è stato rimosso e posto sul ghiaccio. Le dissezioni di NAc sono state prese utilizzando un punzone ad ago calibro 15 e sono state rapidamente congelate su ghiaccio secco fino all'estrazione dell'RNA. Punzoni bilaterali sono stati raggruppati da quattro animali per ogni replica, per un totale di topi 12 per gruppo. Isolamento dell'RNA, elaborazione di microarray e analisi dei dati sono stati eseguiti come precedentemente descritto (S8). In breve, l'RNA è stato isolato e purificato come descritto sopra e ne è stata controllata la qualità utilizzando il Bioanalyzer di Agilent. La trascrizione inversa, l'amplificazione, l'etichettatura e l'ibridazione agli array Illumina MouseWG-6 v2.0 sono state eseguite utilizzando procedure standard dal nucleo microarray di UT Southwestern. I dati grezzi sono stati sottratti dallo sfondo e normalizzati quantile utilizzando il software Beadstudio. I dati normalizzati sono stati analizzati utilizzando il software GeneSpring e gli elenchi genetici sono stati generati utilizzando criteri di significatività di un cutoff di variazione di 1.3 volte accoppiato con un valore di p-cutoff non rigoroso di p <0.05.
Manteniamo un elevato grado di fiducia in questi dati per diversi motivi. Innanzitutto, tutti gli animali sono stati manipolati, trattati e uccisi allo stesso tempo, alle stesse condizioni. Allo stesso tempo, tutte le elaborazioni RNA e array sono state eseguite contemporaneamente. In secondo luogo, abbiamo eseguito array triplicati e raggruppato più animali per campione di array, riducendo così al minimo le differenze dovute alla variabilità individuale e all'aumento del potere statistico (S9). In terzo luogo, i criteri di analisi dei dati utilizzati per il nostro studio sono raccomandati dal progetto MicroArray Quality Control, in quanto questi criteri sono stati convalidati per fornire un alto grado di riproducibilità intersita e riproducibilità inter- e intraplatforma (S10-S11).
Costruzione di vettori virali
A causa dei vincoli delle dimensioni di inserimento del vettore virale, le sequenze codificanti per G9a (G9a) o G9a cataliticamente morto (G9aH1093K) sono state subclonate nel plasmide bicistronico p1005 + HSV che esprime GFP sotto il controllo del promotore del citomegalovirus umano immediato precoce (CMV) (il G9a) la dimensione di inserimento era ~ 3.96 kb, che supera la dimensione massima di inserimento per i vettori AAV-2). Il promotore IE4 / 5 guida l'espressione G9a. I frammenti sono stati subclonati nel plasmide bicistronico p1005 + HSV tramite blunt end ligations con Klenow trattato con PmeI ed EcoRI digerito G9a (da pcDNA3.1) e CIP trattato con p1005 + dopo digestione con EcoRI. Per la produzione di HSV-ΔJunD-GFP, la sequenza codificante di ΔJunD fiancheggiata da siti di restrizione EcoRI è stata generata mediante PCR utilizzando primer oligonucleotidi contenenti il sito EcoRI. Il prodotto PCR è stato quindi legato al sito EcoRI del vettore p1005 +. L'espressione locale di Cre ricombinasi nei neuroni NAc è stata ottenuta mediante consegna genica mediata da virus utilizzando un vettore AAV come descritto (S12). GFP o una fusione N-terminale di GFP in Cre è stata subclonata in un vettore ricombinante AAV-2 contenente un promotore di CMV con una sequenza di accettore donatore di splicing e un segnale di poliadenilazione. Tutti gli inserimenti di vettore sono stati confermati dal sequenziamento del diasossi. I vettori virali sono stati prodotti utilizzando un metodo di trasfezione tripla, senza ausilio, come precedentemente descritto (S13). Il virus purificato è stato conservato a -80 ° C. La qualità virale è stata valutata mediante il titolo infettivo valutato nelle cellule HEK293. I virus AAV-ΔFosB-GFP sono stati preparati in modo simile. Per HSV-Cre, l'espressione Cre è stata guidata da un promotore IRES, in contrapposizione al promotore IE4 / 5, al fine di ridurre al minimo l'espressione di Cre e prevenire la tossicità neuronale (vedere S14 per la costruzione virale). In tutti i casi, la sovraespressione virale è stata convalidata, entrambi in vitro ed in vivo, tramite qPCR, e i virus sono stati confermati immunoistochimicamente per mostrare l'espressione limitata a NAc dopo l'intervento chirurgico.
Chirurgia stereotassica
Sotto anestesia con ketamina (100 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg), i topi sono stati posizionati in uno strumento stereotassico di piccoli animali e la superficie craniale è stata esposta. Sono stati usati trentatré aghi siringa di gauge per infondere bilateralmente 0.5 μl di virus nel NAc con angolo 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) a una velocità di 0.1 μl / min. Agli animali che ricevevano iniezioni di HSV è stato permesso di recuperare per 2 giorni dopo l'intervento, mentre i topi utilizzati per test comportamentali trattati con vettori AAV sono stati autorizzati a recuperare per 20 giorni prima di essere sottoposti a condizionamento del luogo. Questi tempi sono coerenti con i periodi di massima espressione transgenica mediata da virus per i due vettori. Per le infusioni di BIX01294, ognuna delle due mini-pompe era posizionata per via sottocutanea sul retro del mouse. I posizionamenti delle cannule sono stati ottenuti perforando due piccoli fori cranici sopra il NAc e con la consegna della cannula da bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). I topi sono stati autorizzati a riprendersi dalla chirurgia per 4 a 5 giorni prima di iniziare la procedura di condizionamento del luogo alla cocaina come descritto di seguito.
Preferenza di luogo condizionata
La procedura di condizionamento del luogo è stata condotta come descritto in precedenza, con le seguenti modifiche (S7). In breve, 3 giorni dopo le infusioni intra-NAc di HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP o HSV-GFP, i topi sono stati inseriti nelle camere di condizionamento, che consistono in tre ambienti distinti. I topi che hanno mostrato una preferenza significativa per una delle due camere di condizionamento sono stati esclusi dallo studio (<10% di tutti gli animali). I gruppi di condizionamento sono stati quindi bilanciati per adattarsi a qualsiasi bias della camera che potrebbe ancora esistere. Nei giorni successivi, gli animali sono stati iniettati con soluzione salina e confinati in una camera nel pomeriggio per 30 minuti, quindi iniettati con cocaina (10 mg / kg, ip) e confinati per 30 minuti nell'altra camera la sera per 2 giorni (due soluzione salina e due abbinamenti di cocaina). Il giorno del test, i topi sono stati rimessi nell'apparecchio senza trattamento per 20 minuti e testati per valutare quale lato preferissero. Le risposte locomotorie alla cocaina sono state valutate tramite interruzioni del raggio nelle camere accoppiate con cocaina per garantire l'efficacia del trattamento farmacologico. Per gli esperimenti AAV e BIX01294 CPP, è stato utilizzato un protocollo leggermente modificato. Gli animali sono stati nuovamente iniettati con soluzione salina o cocaina (10 mg / kg, ip) e confinati in camere specifiche per sessioni di 30 minuti, ma sono stati invece condizionati solo una volta al giorno per 4 giorni, seguito dal test il giorno 5 (gli animali sono stati condizionati la sera si sono alternati trattamenti di condizionamento). Per tutti i gruppi, la locomozione al basale in risposta alla soluzione salina è stata valutata per garantire che la locomozione non fosse influenzata dal trattamento virale o inibitore.
Autosomministrazione di cocaina per via endovenosa
Sono stati ottenuti ratti Long-Evans maschi adolescenti, che pesavano 230-250 g all'inizio dell'esperimento. Sono stati alloggiati in un ambiente a temperatura e umidità su un ciclo 12 ora / buio invertito (luci spente a 9: 00 am) con ad libitum accesso al cibo e all'acqua. I ratti sono stati autorizzati ad acclimatarsi nel loro nuovo ambiente e sono stati gestiti quotidianamente per la settimana 1 prima dell'inizio dell'esperimento. Tutte le procedure sono state condotte in conformità con la Guida dell'Istituto nazionale della salute per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono state approvate dal Comitato per l'assistenza e l'uso degli animali del Monte Sinai. L'attrezzatura per l'auto-somministrazione era dotata di raggi infrarossi per misurare il comportamento locomotore. L'autosomministrazione è stata effettuata come precedentemente descritto (S15-S16) con cateteri impiantati nella vena giugulare destra sotto anestesia con isoflurano (2.4-2.7%). I cateteri sono stati lavati con 0.1 ml di una soluzione salina contenente 10 U di eparina e ampicillina (50 mg / kg). Dopo una settimana di recupero dall'intervento, è iniziato il training di auto somministrazione durante la fase oscura del ciclo luce / buio. Agli animali era consentito un accesso giornaliero di 3 ore alla cocaina (0.75 mg / kg / infusione) con un programma di rinforzo a rapporto fisso 1 (FR1), in cui 1 pressa a leva attiva risultava in una singola infusione di farmaco. I ratti hanno stabilizzato la loro assunzione di cocaina dopo 6 giorni (variazione <15% nel tasso di risposta per 3 giorni consecutivi, con almeno il 75% che ha risposto sulla leva rinforzata). 24 ore dopo l'ultima sessione di auto-somministrazione, i ratti sono stati rapidamente decapitati, i cervelli sono stati rapidamente rimossi ed elaborati per l'isolamento dell'RNA e la qPCR.
Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)
Punzoni di NAc freschi sono stati reticolati con formaldeide e preparati per ChIP come precedentemente descritto (S17-S18) con piccole modifiche. In breve, 4 14-gauge punzoni NAc per animale (animali 5 raggruppati per campione) sono stati raccolti, reticolati con 1% formaldeide e temprati con 2 M glicina prima del congelamento a -80 ° C. 1 giorno prima della sonicazione del campione, pecora anti-coniglio / topo (a seconda dell'anticorpo di precipitazione) Le sfere magnetiche di IgG sono state preparate incubando perline magnetiche appropriate con anti-G9a (ChIP di coniglio policlonale) o anti-H3K9me2 (topo monoclonale di ChIP) anticorpi durante la notte a 4 ° C sotto rotazione costante in soluzione di blocco. La sonicazione del tessuto e il taglio della cromatina sono stati effettuati come precedentemente descritto (S17). Dopo la sonicazione, le stesse concentrazioni di cromatina sono state trasferite in nuove provette e ~ 5% dei prodotti finali sono stati salvati per fungere da controlli di "input". Dopo accurato lavaggio e risospensione delle miscele di granuli / anticorpi coniugati, volumi uguali di miscele di anticorpi / granuli (~ 7.5 μg anticorpo / campione) sono stati aggiunti a ciascun campione di cromatina e incubati per ~ 16 ore a rotazione costante a 4 ° C. I campioni sono stati ulteriormente lavati e reticolato in modo incrociato a 65 ° C per una notte prima della purificazione del DNA utilizzando un kit di purificazione PCR. Dopo la purificazione del DNA, i campioni sono stati sottoposti a qPCR e sono stati normalizzati ai rispettivi controlli di "input" come precedentemente descritto (S17). Sono state eseguite anche immunoprecipitazioni di IgG murine normali utilizzando un anticorpo policlonale anti-IgG murino per controllare l'appropriato arricchimento dell'amplificazione del segnale. Adenina fosforibosiltransferasi (APRT) è stata utilizzata come controllo negativo per esperimenti di sovraespressione di cocaina e ΔFosB. Vedere Tabella supplementare S5 per le sequenze di primer del promotore.
Analisi della colonna vertebrale dendritica
Per studiare il ruolo di G9a nella regolazione della morfologia neuronale in vivo, abbiamo usato metodi precedentemente descritti con le seguenti modifiche (S1). Tre giorni dopo l'iniezione di HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (tutti i virus sono stati utilizzati nei topi C57Bl / 6J wild type), o HSV-Cre-GFP (utilizzato in G9afl / fl topi), quando l'espressione virale era massima, i topi sono stati perfusi, i cervelli sono stati sottoposti a crioprotezione e successivamente sezionati su 100 μm su un vibratomo. Le sezioni sono state quindi immunocolorate usando un anticorpo contro GFP come descritto sopra (vedere Immunohistochemistry). Per valutare gli effetti della sovraespressione di G9a e del knockout sui numeri della colonna vertebrale, così come l'effetto della sovraespressione di ΔJunD, abbiamo misurato il numero di spine su approssimativamente 1-2 neuriti per neurone pari almeno a 299 μm di dendriti secondari da terreno NAc che esprime GFP neuroni spinosi (MSN). Dato che gli MSN sono morfologicamente distinti dalle altre popolazioni neuronali nel NAc, così come i precedenti rapporti indicano che l'HSV infetta principalmente i neuroni DARPP-32 che esprimono in questa regione del cervello (S19), siamo fiduciosi che gli MSN sono stati valutati esclusivamente in questi studi. Per ciascun animale, abbiamo esaminato i ~ neuroni 6-8 negli animali 3-4 per gruppo (gruppi 7), dopo i quali è stato ottenuto un valore medio per ciascun animale per l'analisi statistica. Esperimenti progettati per esaminare gli effetti della sovraespressione di ÀFosB sulla densità della colonna vertebrale NAc sono stati effettuati in modo simile a quello descritto sopra, con l'eccezione che i vettori AAV sono stati utilizzati per esprimere GFP o ΔFosB-GFP per lunghi periodi di tempo (8 settimane). Tutte le immagini HSV sono state catturate utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo di immersione in olio 100X (le immagini AAV sono state catturate con un obiettivo di immersione in olio 63X). Le immagini sono state acquisite con il pinhole impostato sull'unità arbitraria 1 e una dimensione del frame 1024 × 1024. La lunghezza dendritica è stata misurata usando il software NIH Image J ei numeri della colonna vertebrale sono stati contati alla cieca dallo sperimentatore principale, poiché le diapositive sono state codificate prima della scansione sperimentale. È stato calcolato il numero medio di spine per 10 μm di dendrite.
analisi statistica
Gli ANOVA a una o due vie sono stati eseguiti per determinare l'importanza per la preferenza del luogo condizionata e l'analisi della colonna vertebrale dendritica con più di due gruppi. I test t di Student sono stati utilizzati per altri confronti tra cui qPCR, western blotting, analisi dendritica della colonna vertebrale confrontando HSV-GFP con HSV-Cre in G9afl / fl topi, analisi di microarray (vedi sopra) ed esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina. I test t di studente pianificati sono stati utilizzati a seguito dell'analisi ANOVA a due vie della densità della colonna vertebrale dendritica dopo sovraespressione di ΔFosB con la conferma degli effetti principali significativi del trattamento farmacologico e del virus. Tutti i valori inclusi nelle legende delle figure rappresentano la media ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Analisi statistiche dettagliate per Figg. 1-3 nel testo principale sono dati in: Dettagliate figure leggende tra cui statistiche.
Le note
Certifico che nessuno dei materiali inclusi nel manoscritto è intitolato Ruolo essenziale dell'istone metiltransferasi G9a nella plasticità indotta dalla cocaina sono stati precedentemente pubblicati o sono in esame altrove, anche su Internet.
Tutto il lavoro che coinvolge l'uso di animali è stato condotto in conformità con le linee guida istituzionali e IACUC presso l'Università del Texas Southwestern Medical Center e la Mount Sinai School of Medicine.
Riferimenti e note
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