PLoS One. 2011; 6(9): e24992.
Albino J. Oliveira-Maia,1,*¤a¤b Craig D. Roberts,1 D. David Walker,2 Brooke Luo,1 Cynthia Kuhn,2 Sidney A. Simon,1,3,5 e Miguel AL Nicolelis1,3,4,5,6
Astratto
Il consumo di zuccheri ad alto contenuto calorico induce risposte comportamentali appetitive e rilascio di dopamina nello striato ventrale, anche in assenza di meccanismi di trasduzione del gusto dolce. Tuttavia, non è chiaro se tali effetti post-ingegneristici correlati alla ricompensa riflettano eventi pre- o post-assorbimento. A supporto dell'importanza del rilevamento del glucosio post-assorbimento, abbiamo riscontrato che, in test comportamentali su ratti, soluzioni di glucosio ad alta concentrazione somministrate nella vena giugulare erano sufficienti a condizionare un bias di interazione. Inoltre, una soluzione di glucosio a bassa concentrazione ha condizionato risposte comportamentali robuste quando somministrata nella vena epatica-portale, ma non in quella giugulare. Infine, la somministrazione enterica di glucosio a una concentrazione sufficiente a indurre un condizionamento comportamentale ha prodotto un profilo glicemico simile a quello osservato dopo la somministrazione della soluzione di glucosio a bassa concentrazione nella vena epatica-portale, ma non nella vena giugulare. Infine, utilizzando la voltammetria ciclica a scansione rapida, abbiamo scoperto che, in accordo con i risultati comportamentali, una soluzione di glucosio a bassa concentrazione ha causato un aumento degli eventi di rilascio spontaneo di dopamina nella membrana del nucleo accumbens quando somministrata nella vena porta epatica, ma non in quella giugulare. Questi risultati dimostrano che gli effetti post-assorbimento del glucosio sono sufficienti per le risposte comportamentali post-ingestive e le risposte dopaminergiche correlate alla ricompensa che derivano dal consumo di zucchero. Inoltre, i livelli di glicemia nel sistema venoso porta epatica contribuiscono in modo più significativo a questo effetto rispetto alla glicemia sistemica, suggerendo il coinvolgimento di un sensore viscerale intra-addominale per il glucosio.
Introduzione
Le conseguenze positive post-intestinali del consumo di cibo sono un fattore determinante del comportamento alimentare [1]Infatti, abbiamo recentemente scoperto che in un paradigma comportamentale a due bottiglie, anche in animali in cui sono assenti percorsi funzionali di trasduzione del gusto dolce, il consumo orale di saccarosio (un saccaride contenente calorie), ma non di sucralosio (un dolcificante artificiale non calorico), era sufficiente per il condizionamento di robuste preferenze collaterali. [2]Inoltre, quando questi animali ingerivano saccarosio, si riscontrava un aumento del rilascio di dopamina e dell'attivazione neuronale nel nucleo accumbens (NAcc). Una stimolazione post-ingerente del sistema dopaminergico è stata suggerita anche da uno studio di imaging funzionale umano, in cui sucralosio e saccarosio venivano presentati a concentrazioni corrispondenti all'intensità del gusto, e solo quest'ultimo attivava le aree dopaminergiche del mesencefalo. [3]La rilevanza dell'attivazione dopaminergica per l'apprendimento post-ingestivo è stata confermata in esperimenti condotti sui ratti, in cui l'antagonismo del recettore della dopamina nel NAcc ha inibito lo sviluppo di associazioni tra sapori non calorici e glucosio iniettato direttamente nel duodeno. [4].
Per quanto riguarda i meccanismi che portano agli effetti comportamentali correlati alla ricompensa della stimolazione post-intestinale da parte di zuccheri come il saccarosio, i dati disponibili non sono del tutto coerenti. Uno studio ha indicato che è necessaria la stimolazione diretta della mucosa intestinale. [5], mentre altri hanno dimostrato l'importanza degli effetti post-assorbimento iniettando i nutrienti per via endovenosa [6], [7]Più recentemente è stato anche suggerito che, indipendentemente dal gusto, l'utilizzo del glucosio nei tessuti è necessario affinché il consumo di glucosio causi il rilascio di dopamina nello striato. [8]In ogni caso, le vie di segnalazione post-ingestiva che portano al condizionamento comportamentale e al rilascio di dopamina restano controverse.
In questo studio, eravamo interessati a chiarire il ruolo dei meccanismi pre- e post-assorbitivi negli effetti correlati alla ricompensa di uno zucchero calorico, indipendentemente dal suo sapore. A tal fine, abbiamo utilizzato ratti per testare le risposte comportamentali e dopaminergiche alla somministrazione endovenosa di glucosio nella vena giugulare (JV) e nella vena porta epatica (HPV). Inizialmente, abbiamo verificato se diverse concentrazioni di glucosio (5%, 22.5% e 50%), somministrate nella JV, fossero sufficienti a condizionare un bias laterale in un test di preferenza a due bottiglie. In questo esperimento, la saccarina è stata utilizzata come controllo per la potenziale stimolazione intravascolare del gusto. In un altro esperimento, dati gli effetti glicemici dei diversi stimoli glicemici somministrati nella JV, gli effetti del glucosio al 5% somministrato nell'HPV sono stati testati con lo stesso paradigma comportamentale. In quell'esperimento, il mannitolo è stato utilizzato come controllo per gli effetti osmotici. Successivamente, gli effetti glicemici dei diversi stimoli glicemici utilizzati in questi esperimenti sono stati misurati simultaneamente nel sangue della coda e di quello dell'HPV, per valutare la rilevanza dei cambiamenti in ciascuna di queste sedi per gli effetti comportamentali osservati in precedenza. Infine, utilizzando la voltammetria ciclica, è stata misurata la frequenza transitoria della dopamina nel NAcc e sono stati testati gli effetti dell'infusione di una soluzione di glucosio al 5% in HPV e JV.
Risultati
Per chiarire la partecipazione dei meccanismi mucosali (intestinali) rispetto a quelli post-assorbitivi nel condizionamento indipendente dal gusto mediante effetti post-ingegneristici nei ratti, abbiamo condotto esperimenti per testare l'inversione del bias laterale in un paradigma comportamentale a due bottiglie [2]In breve, gli animali sono stati testati per il bias laterale in un test con due bottiglie di acqua contro acqua, in condizioni di acqua e lieve restrizione alimentare. Per condizionare l'inversione del bias laterale, gli animali sono stati quindi esposti a un protocollo di condizionamento di 4 giorni con libero accesso all'acqua somministrata quotidianamente su lati alternati del box comportamentale. Nei 2 giorni in cui gli animali sono stati esposti al lato opposto al bias originale, sono stati somministrati 3 mL di soluzione di glucosio contemporaneamente al consumo di acqua e in base al comportamento di leccamento (3 µL/leccata per le prime 1000 leccate d'acqua). Nei restanti 2 giorni, quando gli animali sono stati esposti al lato del bias originale, è stato somministrato il veicolo alle stesse condizioni. In alcuni animali, precedentemente impiantati con cateteri vascolari, gli stimoli di condizionamento (glucosio o veicolo) sono stati infusi per via endovenosa, mentre in altri sono stati somministrati per via orale attraverso una cannula indipendente nel tubo di aspirazione utilizzato per la somministrazione dell'acqua (vedere Metodi). Nell'ultimo giorno di test, l'inversione della polarizzazione laterale è stata testata in tutti gli animali utilizzando un test di due bottiglie d'acqua contro acqua (vedere Metodi e Tabella 1 per dettagli).
Due gruppi di animali sono stati condizionati utilizzando il 5% (n
=6) o 15% (n=5) soluzioni di glucosio somministrate per via orale. Nel complesso, gli animali di questi gruppi hanno mostrato livelli di consumo più elevati durante le sessioni di condizionamento con il veicolo rispetto alle sessioni di glucosio, un effetto che potrebbe essere dovuto agli effetti sazianti della somministrazione di glucosio o all'uso di elevati livelli di privazione idrica (Figura S1A). L'inversione del bias laterale è stata testata confrontando la preferenza per il lato opposto al bias originale di ciascun animale nelle sessioni di due bottiglie prima e dopo il condizionamento. Abbiamo riscontrato effetti significativi per lo stimolo di condizionamento (5% vs. 15%, F=9.3, p=0.014) e sessione di test (pre vs. post-condizionamento, F=7.9, p=0.021) e un'interazione quasi significativa tra i due fattori (F=4.2, p=0.071; ANOVA bidirezionale a misure ripetute). Tuttavia, aumenti significativi nella preferenza pre- vs. post-condizionamento per il lato associato alla somministrazione di glucosio sono stati riscontrati solo negli animali condizionati con glucosio al 15% (0.11±0.06 vs. 0.8±0.2, t=3.3, p<0.05), ma non quelli condizionati con glucosio al 5% (0.07±0.04 vs. 0.18±0.15, t=0.6, p>0.05; test t di Bonferroni post-hoc; Fig. 1A).
Utilizzando lo stesso protocollo comportamentale, abbiamo testato gli effetti delle infusioni JV di basso (5%, n=10), intermedio (22.5%, n=7) e alto (50%, n=11) soluzioni di glucosio. Saccarina sodica (NaSacc; 3.16%, precedentemente dimostrata essere la concentrazione ottimale per la stimolazione intravascolare del gusto dolce [9]) è stato utilizzato come controllo per la potenziale stimolazione intravascolare del gusto (n=5). Analogamente a quanto riscontrato negli animali condizionati per via orale, nel complesso questi ratti presentavano livelli di consumo più elevati durante le sessioni di condizionamento con il veicolo rispetto alle sessioni con glucosio o saccarina (Figura S1B). Per quanto riguarda l'inversione del bias laterale, abbiamo trovato effetti significativi per lo stimolo di condizionamento (glucosio basso vs. intermedio vs. alto vs. NaSacc, F=7.8, p<0.001), sessione di test (pre vs. post-condizionamento, F=45.3, p<0.001) e l'interazione tra questi fattori (F=15.8, p<0.001; ANOVA bidirezionale a misure ripetute). L'inversione del bias laterale è stata riscontrata negli animali condizionati con infusioni JV del 22.5% (0.18±0.05 vs. 0.63±0.10, t=4.7, p<0.001) e 50% glucosio (0.13±0.05 vs. 0.82±0.07, t=9.1, p<0.001), ma non quelli condizionati con glucosio al 5% (0.14±0.05 vs. 0.12±0.05, t=0.3, p>0.05) o NaSacc (0.19±0.09 vs. 0.3±0.19, t=1, p>0.05; test t di Bonferroni post-hoc; Fig. 1B). In sintesi, mentre le due soluzioni di glucosio a concentrazione più elevata hanno determinato un'inversione della polarizzazione laterale, non è stato riscontrato alcun effetto per NaSacc, eliminando così il gusto intravascolare come indizio di questi cambiamenti comportamentali.
Per comprendere meglio l'impatto glicemico dei diversi stimoli del glucosio, a gruppi separati di animali è stato concesso libero accesso all'acqua in sessioni comportamentali di 10 minuti, mentre 3 mL di ciascuna delle soluzioni di glucosio utilizzate per il condizionamento venivano somministrati simultaneamente al consumo di acqua e in base alla leccata (3 µL/leccata per le prime 1000 leccate d'acqua; 5% orale, n=3; 15% orale, n=4; 5% JV, n=6; 22.5% JV, n=4; 50% JV, n=6). La glicemia è stata misurata dal sangue della coda prima (baseline) e a diversi punti temporali dopo la somministrazione di glucosio (0'-40'). Ad eccezione del glucosio orale al 5%, tutti gli stimoli hanno causato un aumento significativo della glicemia periferica (Fig. 2A, Vedere Tabella S1 Per i dati). Questo effetto è stato verificato anche per il glucosio al 5% JV, che non ha condizionato l'inversione del bias laterale, dimostrando che l'aumento della glicemia periferica è insufficiente a indurre cambiamenti del bias laterale. Per chiarire ulteriormente il profilo glicemico di ciascun stimolo, sono state analizzate sia le misure assolute (mg/dL) che quelle relative (% basale) della glicemia in termini di glicemia media e picco. Negli animali in cui il glucosio è stato somministrato per via orale, non sono state riscontrate differenze per il picco di glicemia relativa (% basale) dopo l'esposizione al glucosio al 5% e al 15% (rispettivamente 117±8 vs. 131±9, t=1.1, p=0.33, t-test non accoppiato; Fig. 2B). Quando la glicemia dopo il 15% di glucosio orale, che era efficace nel condizionare l'inversione del bias laterale, è stata confrontata con quella risultante dalla somministrazione di glucosio da parte di una vena giugulare (JV), è stato riscontrato un effetto principale significativo (F=37.7, p<0.0001, ANOVA unidirezionale). I confronti a coppie hanno rivelato differenze relative al JV 22.5% (428±34, t=5.8, p<0.001) e glucosio al 50% (536±48, t=8.6, p<0.001), ma non rispetto al glucosio al 5% (170±10, t=0.8, p>0.05; test t di Bonferroni post-hoc; Fig. 2C). Risultati simili sono stati riscontrati per la glicemia assoluta di picco e media (Fig. S2A, B, D ed E) e la glicemia relativa media (Fig. S3A e B).
I nostri risultati suggeriscono che, sebbene il glucosio endovenoso fosse sufficiente a condizionare l'inversione del bias laterale in un test con due bottiglie d'acqua contro acqua, ciò era possibile solo quando venivano indotti livelli di glicemia molto più elevati di quelli derivanti dalla somministrazione di glucosio orale. Abbiamo quindi ipotizzato che l'iperglicemia sistemica derivante dalla somministrazione di glucosio per via endovenosa fosse necessaria per azionare un sensore periferico che si attiva in seguito alla somministrazione di glucosio gastrointestinale. TIl sistema HPV ha una posizione ottimale per un tale sensore, poiché trasporta la maggior parte del sangue ricco di nutrienti dal sistema gastrointestinale, prima che venga rilasciato nella circolazione sistemicaPer testare questa ipotesi, è stato eseguito lo stesso protocollo di condizionamento con glucosio al 5% somministrato attraverso cateteri HPV (n=10), piuttosto che per via orale o tramite la vena giugulare. Come controllo osmotico, un altro monosaccaride (dal sapore dolce) (5% mannitolo) [10]) è stato applicato come stimolo condizionante in un gruppo alternativo di animali (n=5 Figura S1C). In questo esperimento non sono state riscontrate differenze nel consumo durante le sessioni di condizionamento con veicolo rispetto a quelle con glucosio o mannitolo. Anzi, gli animali condizionati con glucosio presentavano livelli di consumo complessivamente più elevati rispetto a quelli condizionati con mannitolo (Figura S1C). Quando si considerano gli effetti comportamentali in altre sessioni di condizionamento (Fig. S1A e S1B) questo suggerisce che, in queste condizioni, il mannitolo abbia prodotto un effetto avversivo contestuale generalizzato alle sessioni con il veicolo. Per quanto riguarda l'inversione del bias laterale, sono stati riscontrati effetti significativi per lo stimolo condizionante (glucosio vs. mannitolo, F=10.2, p=0.007), sessione di test (pre vs. post-condizionamento, F=5.2, p=0.04) e l'interazione tra questi fattori (F=9.5, p=0.009; ANOVA a due vie a misure ripetute). Inoltre, a supporto della nostra ipotesi, è stato riscontrato un aumento significativo nella preferenza pre- vs. post-condizionamento per il lato associato al glucosio (0.17±0.05 vs. 0.69±0.12, t=4.7, p<0.001), ma non l'infusione di mannitolo durante il condizionamento (0.14±0.04 vs. 0.06±0.06, t=0.5, p>0.05; test t di Bonferroni post-hoc, Fig. 3A). Pertanto, il glucosio al 5% è stato efficace nel condizionare l'inversione del bias laterale quando somministrato nell'HPV (Fig. 3A), ma non la JV (Fig. 1B). Questa variazione negli effetti comportamentali del glucosio al 5% non è risultata da differenze nella glicemia sistemica a seconda del sito di somministrazione, poiché la glicemia ematica di picco (% basale) dopo la somministrazione di HPV (171±13) e JV (Fig. 1D) non erano significativamente diversi (t=0.07, p=0.9, t-test non accoppiato; Fig. 3B; vedere tabella S1 per i dati). Non sono state riscontrate differenze nemmeno per la glicemia assoluta di picco e media (Fig. S2C e F) e la glicemia relativa media (Figura S3D).
Nel complesso, questi risultati indicano fortemente che un aumento della glicemia da HPV, piuttosto che la glicemia sistemica, è uno stimolo critico che determina un'inversione del bias laterale indipendente dal gusto. Per testare ulteriormente questa ipotesi, gruppi separati di animali anestetizzati sono stati iniettati con il veicolo o con le diverse soluzioni di glucosio utilizzate per il condizionamento, tramite cateteri inseriti nel duodeno (acqua, n=5; 5% glucosio, n=4; 15% glucosio, n=6), JV (soluzione salina, n=5; 5% glucosio, n=6; 22.5% glucosio, n=4; 50% glucosio, n=4) o HPV (soluzione salina, n=4; 5% glucosio, n=7). La glicemia è stata misurata sia nel sangue della coda che in quello dell'HPV all'inizio (baseline) e alla fine (0') della perfusione di stimolo, e ogni 10 minuti successivi (10'-50'). I dati grezzi sono stati analizzati separatamente per le iniezioni di veicolo e glucosio e per la glicemia nel sangue della coda e dell'HPV (Fig. 4, Vedere Tabella S2 per i dati). Come spiegato per la glicemia negli animali svegli, sono stati quindi confrontati i valori di picco e di media della glicemia (vedere i dati in Tabelle S3 e S4). Per la glicemia relativa di picco (% del basale), è stata riscontrata un'interazione significativa tra lo stimolo (JV vs. HPV vs. glucosio duodenale al 5% vs. glucosio duodenale al 15% vs. glucosio JV al 22.5% vs. glucosio JV al 50% vs. veicolo) e il sito di prelievo del sangue (coda vs. HPV; F=11.4, p<0.001), consentendo analisi separate della glicemia della coda e dell'HPV (vedere Tabella S4 per i dettagli). In entrambi i casi, la glicemia dopo JV 5% di glucosio, considerata come uno stimolo di controllo che non ha condizionato l'inversione del bias laterale (vedere Fig. 1B), è stato confrontato con quello osservato dopo gli stimoli rimanenti. Fo misurazioni del sangue della coda, solo JV 22.5% e 50% glucosio e veicolo, ma non HPV 5% e duodenale 5% e 15% glucosio, differivano significativamente da JV 5% glucosio (Fig. 4C). Per le misurazioni del sangue dell'HPV, tuttavia, il glucosio duodenale al 5%, l'unico altro stimolo del glucosio che non ha condizionato l'inversione del bias laterale (vedere Fig. 1A), era anche l'unico stimolo che non differiva significativamente dal glucosio JV al 5% (Fig. 4D). Pertanto, in accordo con i nostri risultati precedenti, l'HPV, ma non la glicemia sistemica, misurata nei ratti anestetizzati, riflette accuratamente l'inversione del bias laterale osservata dopo il condizionamento negli animali svegli. Questa somiglianza tra gli effetti comportamentali e la risposta glicemica di picco dell'HPV non è stata riscontrata per la glicemia media (Tabella S4), suggerendo che gli effetti comportamentali rilevanti della somministrazione di glucosio derivino da alti livelli episodici di glicemia piuttosto che dagli effetti di variazioni glicemiche prolungate. Risultati simili sono stati riscontrati confrontando i livelli assoluti di glicemia (mg/dL). (Tabella S3).
Studi precedenti hanno dimostrato che il rilascio di dopamina può essere evocato nel nucleo accumbens, in risposta alla somministrazione gastrointestinale di zuccheri, indipendentemente dal loro sapore. [2], [4], [11]. Eravamo quindi interessati a capire se il rilascio di dopamina in quest'area sarebbe stato influenzato in modo diverso dalla somministrazione di glucosio al 5% tramite JV rispetto a HPV. FLa voltammetria ciclica a scansione asta è stata utilizzata per identificare eventi di rilascio spontaneo di dopamina o "transitori" [12], [13], [14], [15] nel guscio del nucleo accumbens dei ratti anestetizzati (n=12) (vedere metodi). Dopo aver ottenuto registrazioni basali per 6-8 minuti, i ratti sono stati infusi nella vena JV con glucosio al 5% o nell'HPV con glucosio al 5% o veicolo. La frequenza dei transitori basali (3.4±0.7 transienti/min), la durata (520±68 msec) e l'ampiezza (30±3 nM) erano simili a quanto descritto negli animali svegli. [12], [14], [15] (Vedi Fichi. 5A e B per registrazioni rappresentative). Inoltre, una volta misurati i cambiamenti indotti dal glucosio, è stata somministrata cocaina (15 mg/kg) a tutti gli animali per mostrare gli effetti dell'inibizione della ricaptazione della dopamina in queste condizioni. Abbiamo scoperto che la cocaina aumentava la frequenza e la durata dei transitori, senza influenzarne l'ampiezza (Fig. S5).
Per quanto riguarda i cambiamenti nella frequenza transitoria dopo la somministrazione di glucosio, l'ANOVA bidirezionale a misure ripetute ha rivelato un effetto principale significativo per il tempo (linea di base vs. 1–5 min vs. 6–10 min vs. 11–15 min vs. 16–20 min; F=2.7, p=0.044) ma non per il gruppo di trattamento (glucosio JV vs. glucosio HPV vs. soluzione salina HPV; F=1.6, p=0.26) e una significativa interazione tra fattori (F=2.4, p=0.036 Fig. 5C). Data la significativa interazione tra i fattori, ulteriori confronti per l'effetto del tempo sono stati eseguiti separatamente per ciascun gruppo di trattamento. Per i gruppi HPV trattati con soluzione salina e JV con glucosio, l'effetto del tempo non è stato significativo (F=0.5, p=0.75 e F=0.61, p=0.66 rispettivamente) e il confronto a ciascun periodo di tempo rispetto al rispettivo basale non è risultato significativo (rispettivamente t<1.1 e t<1.5, p>0.05 per tutti). Tuttavia, per il gruppo HPV glucosio, è stato riscontrato un effetto significativo del tempo (F=3.9, p=0.031; ANOVA unidirezionale a misure ripetute) e, rispetto al basale, la frequenza transitoria era più alta per i primi 5 minuti dopo l'inizio dell'infusione (t=3, p<0.05) ma non nei periodi di tempo rimanenti (t<1.7, p>0.05 per tutti; test t di Bonferroni post-hoc; vedere Tabella S5 per i dettagli). Non sono stati riscontrati effetti per il tempo, il gruppo di trattamento o la loro interazione rispetto alla durata o all'ampiezza transitoria (Fig. S4). In questi animali, la glicemia nel sangue della coda è stata determinata anche prima e 20 minuti dopo l'inizio delle infusioni di JV o HPV, mostrando, come previsto, che le differenze osservate nella frequenza transitoria dopo l'infusione di glucosio non sono dovute a differenze nella glicemia sistemica (Fig. 5D). Pertanto, in base ai dati presentati sul comportamento e sulla glicemia, a una concentrazione inferiore (5%), il glucosio ha aumentato significativamente la frequenza transitoria della dopamina quando infuso nell'HPV, ma non nella JV.
Discussione
In questo studio dimostriamo che i meccanismi post-assorbimento partecipano agli effetti comportamentali e dopaminergici del glucosio correlati alla ricompensa, indipendentemente dagli aspetti edonisticamente positivi del suo sapore. Abbiamo inizialmente scoperto che, nei ratti, soluzioni di glucosio ad alta concentrazione somministrate nella vena giugulare erano sufficienti a condizionare un bias laterale (Fig. 1B). Tuttavia, ciò è stato possibile solo a concentrazioni di glucosio che hanno determinato una glicemia molto più elevata di quella risultante dal consumo orale di glucosio, a concentrazioni che erano anche sufficienti a condizionare i bias collaterali (Fig. 2). Per chiarire questa incoerenza, sono stati condotti ulteriori esperimenti per confrontare gli effetti del glucosio somministrato nel JV e nell'HPV, poiché quest'ultimo è il primo sito di accumulo del glucosio dopo l'assorbimento nell'intestino [16]A questo proposito, abbiamo scoperto che, a una concentrazione inferiore, le soluzioni di glucosio hanno condizionato robusti bias laterali quando somministrate nell'HPV, ma non nel JV (Fig. 3A). A supporto di questa scoperta, la somministrazione enterica di glucosio a una concentrazione sufficiente a suscitare il condizionamento comportamentale (Fig. 1A) ha determinato un profilo glicemico simile a quello osservato dopo la somministrazione della soluzione di glucosio a bassa concentrazione nell'HPV, ma non nel JV (Fig. 4). Infine, la somministrazione di una soluzione di glucosio a bassa concentrazione nell'HPV, ma non nella JV, ha causato un aumento della frequenza di transienti di dopamina nel guscio del nucleo accumbens, come misurato dalla voltammetria ciclica a scansione rapida (Fig. 5). Nel complesso, questi risultati supportano il fatto che gli effetti post-assorbimento del glucosio sono sufficienti per le risposte comportamentali post-ingestive e le risposte dopaminergiche correlate alla ricompensa risultanti dal consumo di zucchero, e i livelli di glicemia nel sistema HPV contribuiscono in modo più significativo a questo effetto rispetto alla glicemia sistemica.
La partecipazione differenziale dei fattori orali e post-ingegneristici nel controllo del comportamento alimentare è stata ben caratterizzata [1]I controlli post-intestinali dell'assunzione di cibo sono stati per lo più riconosciuti come influenze inibitorie (ad esempio, sazietà), ma meno ricerche sono state dedicate agli effetti positivi post-intestinali dell'assunzione di cibo. [17]Mentre diversi autori iniziali hanno dimostrato che l'iniezione intragastrica di nutrienti può servire come un adeguato rinforzo comportamentale [18], [19], questo risultato è stato controverso e attribuito a perdite nel sistema di cannulazione gastrica [1], [20]In effetti, la maggior parte degli autori ha sviluppato lavori che dimostrano che i nutrienti iniettati direttamente nello stomaco condizioneranno la preferenza per un sapore associato. [20], [21], [22], [23], [24], [25], e solo recentemente abbiamo scoperto che, nei topi senza trasduzione funzionale del gusto dolce nelle cellule recettrici del gusto, il consumo orale di saccarosio era sufficiente per il condizionamento di preferenze collaterali robuste, indipendentemente da qualsiasi segnale orale [2]Qui, la procedura comportamentale sviluppata in precedenza nei topi [2] è stato adattato per l'uso nel ratto e abbiamo dimostrato che potrebbe essere utilizzato per misurare il condizionamento comportamentale derivante dal consumo enterico di glucosio (Fig. 1A).
Sebbene la letteratura sui controlli positivi post-intestinali dell’assunzione di cibo abbia ormai quasi 60 anni, i segnali periferici alla base di questi effetti, in particolare quelli del glucosio, rimangono controversi. [5]Esperimenti con la somministrazione parenterale di soluzioni di glucosio nei ratti o nei conigli, per testarne gli effetti come segnale per un condizionamento post-ingestivo positivo, hanno avuto risultati positivi [7], [26], [27], [28], [29] e risultati negativi [30], [31], [32]. Qui abbiamo dimostrato un effetto dose-risposta nella capacità del glucosio di condizionare il comportamento, quando somministrato nella JV (Fig. 1B). Questi risultati forniscono una spiegazione ragionevole per le precedenti discrepanze con la somministrazione di glucosio JV, poiché erano stati ottenuti risultati positivi con concentrazioni più elevate di glucosio (30%) [7] rispetto a quelli utilizzati negli esperimenti con risultati negativi (10%) [31], [32].
Nei ratti, l'HPV è stato precedentemente proposto come un sito importante per il rilevamento di segnali post-assorbitivi che supportano il condizionamento appetitivo post-ingestivo [6]In uno studio successivo condotto su ratti privati di cibo, non si è riscontrato che le iniezioni di glucosio dell'HPV condizionassero le preferenze di sapore, portando alla proposta che la stimolazione intestinale da parte dei nutrienti sia necessaria affinché le infusioni di HPV condizionino il comportamento. [5]Qui scopriamo che, anche nei ratti privati di cibo, l'infusione di glucosio HPV è stata sufficiente a condizionare un bias laterale (Fig. 3A). Rispetto agli esperimenti negativi sopra menzionati [5]Questi risultati non possono essere spiegati dall'uso di concentrazioni di glucosio più elevate (5% qui utilizzato contro il 10%), ma possono essere una conseguenza delle differenze nella velocità di infusione (non meno di 0.3 mL/min qui contro 0.083 mL/min). Inoltre, in accordo con i risultati precedenti [6], l'infusione della stessa concentrazione di glucosio nella JV non ha avuto tali effetti (Fig. 1B). Pertanto, sebbene i nostri dati non possano escludere l'importanza della stimolazione dei nutrienti intestinali per il condizionamento appetitivo post-ingestivo, mostrano chiaramente che non è necessaria e che i fattori post-assorbimento, che agiscono perifericamente nel sistema HPV, sono sufficienti per tali effetti comportamentali.
È importante notare che il glucosio e altri nutrienti presenti nell'intestino verranno assorbiti, con conseguente aumento maggiore dei livelli di nutrienti nel sangue nell'HPV rispetto alla circolazione sistemica. [16]Questo effetto sarà presumibilmente additivo a quello dell'iniezione di nutrienti nell'HPV, presentando una spiegazione ragionevole per l'associazione precedentemente notata tra la presenza di nutrienti nell'intestino e la capacità delle infusioni di HPV di condizionare il comportamento. [5], [6]Pertanto, quando si confrontano gli effetti comportamentali delle infusioni di nutrienti enterici, JV e/o HPV, è importante misurare direttamente i livelli di nutrienti nel sangue derivanti da queste infusioni. Tuttavia, solo pochi degli studi che hanno indagato gli effetti condizionanti positivi della somministrazione endovenosa di glucosio hanno incluso misurazioni della glicemia sistemica, con risultati contrastanti. [27], [31], [33], e nessuno includeva queste misurazioni nel sangue dell'HPV. Qui mostriamo, sia nei ratti svegli che in quelli anestetizzati, che le misurazioni della glicemia nel sangue della coda non spiegavano completamente i differenti effetti comportamentali delle infusioni di glucosio enterico, JV e HPV (Figg. 2, ,3B,3B, 4A, 4C, S2 e S3; Tabelle S1, S2, S3 e S4). Tuttavia, quando le misurazioni sono state eseguite nel sangue dell'HPV di animali anestetizzati, si è scoperto che il picco di glicemia era un buon correlato della capacità delle soluzioni di glucosio di condizionare i bias collaterali (Fig. 4B e 4D; Tabelle S2, S3 e S4). Questo non era vero per la glicemia media, riflettendo il fatto che l'iniezione endovenosa di glucosio non ha prodotto un profilo glicemico completamente fisiologico, e suggerendo anche che gli effetti comportamentali osservati della somministrazione di glucosio dipendevano maggiormente dai livelli più elevati di glicemia che da aumenti glicemici sostenuti. In ogni caso, questi risultati supportano ulteriormente l'importanza del carico di glucosio post-assorbimento nell'HPV per il condizionamento appetitivo post-ingestivo, dimostrando, soprattutto, che ciò è vero anche quando i nutrienti vengono somministrati nell'intestino, piuttosto che direttamente nella vena giugulare o nell'HPV.
Sono stati condotti anche esperimenti per studiare gli effetti negativi (cioè sazianti) dei nutrienti iniettati nell'HPV in diverse specie. Come descritto per il condizionamento positivo, sono stati osservati risultati incoerenti (vedi [6], [34] per le recensioni). La ragione di queste differenze è stata variamente attribuita allo stato nutrizionale dell'animale, al protocollo per l'infusione dell'HPV e ai diversi paradigmi di test [34]In effetti, la maggior parte di questi fattori avrà presumibilmente un impatto sul livello di nutrienti nell'HPV, il che suggerisce che questo fattore potrebbe essere alla base degli effetti sazianti delle infusioni di nutrienti per via endovenosa, come descritto qui per il condizionamento comportamentale positivo.
Negli esperimenti comportamentali con infusioni di glucosio nel JV o nell'HPV, sono state utilizzate anche soluzioni di controllo per distinguere gli effetti dovuti al carattere nutrizionale del glucosio da quelli che potrebbero derivare dalla stimolazione del gusto o da variazioni dell'osmolalità. Per gli esperimenti con infusione nel JV, è stata utilizzata una soluzione di saccarina sodica, a una concentrazione che si era precedentemente dimostrata ottimale per la stimolazione intravascolare del gusto dolce. [9]Per le infusioni di HPV è stato utilizzato il mannitolo poiché, a concentrazioni uguali al glucosio, questo monosaccaride dal sapore dolce provoca cambiamenti simili nell'osmolalità plasmatica, ma ha effetti metabolici minimi. [10]Contrariamente al glucosio, sia la saccarina che il mannitolo non hanno condizionato i cambiamenti di polarizzazione laterale dopo l'infusione rispettivamente nella JV o nell'HPV, eliminando il gusto e l'osmolalità plasmatica come meccanismo alla base di quegli effetti comportamentali (Fig. 1B e e3A).3A). Questi importanti controlli hanno supportato i nostri precedenti risultati sul condizionamento comportamentale indipendente dal gusto con saccarosio nei topi [2], e anche i primi resoconti di condizionamento strumentale e di preferenza di luogo risultante dalla somministrazione intragastrica e endovenosa di nutrienti, in assenza di segnali orosensoriali o olfattivi [18], [19], [26], [27].
Il ruolo della dopamina nella mediazione delle caratteristiche appetitive del cibo è stato ampiamente dimostrato in precedenza [35]L'aumento dei livelli di dopamina nel nucleo accumbens (NAcc) si verifica in seguito al consumo di zuccheri contenenti calorie come il saccarosio [36], [37], e sia il gusto dolce che la stimolazione post-intestinale hanno dimostrato di essere sufficienti per questo effetto [2], [38], [39]Tuttavia, i meccanismi post-intestinali che portano al rilascio di dopamina nel NAcc dopo il consumo di zuccheri rimangono poco chiari. A sostegno dell'importanza della stimolazione pre-assorbitiva, è stato dimostrato che l'ormone intestinale grelina stimola il rilascio di dopamina nel mesoaccumbens. [40]Sono state presentate anche prove di controlli post-assorbimento del rilascio di dopamina striatale, ma i risultati riportati sono in qualche modo equivoci. [8], [41], [42]È importante notare che gli effetti della glicemia sull'omeostasi della dopamina striatale sono stati attribuiti ai neuroni glucosio-dipendenti nel cervello. [41], in particolare poiché è stato riscontrato un aumento dei livelli di dopamina nello striato dorsale quando il glucosio viene infuso direttamente nella substantia nigra [43]In questo studio, utilizzando la voltammetria ciclica, abbiamo scoperto che il 5% di glucosio infuso nell'HPV, ma non nella JV, ha determinato un aumento degli eventi transitori della dopamina (Fig. 5A–C), provocando in entrambi i casi un aumento simile e fisiologicamente rilevante della glicemia periferica (Fig. 3B, 4A, 4C e e5D).5D). Questa scoperta conferma che i segnali di glucosio post-assorbimento sono sufficienti a indurre il rilascio di dopamina nel NAcc, dimostrando inoltre, a nostra conoscenza per la prima volta, che questi effetti post-assorbimento dipendono dall'aumento della glicemia nell'HPV, piuttosto che dalla rilevazione diretta nel cervello o da meccanismi alternativi, come il gusto intravascolare. Gli effetti dopaminergici differenziali del glucosio al 5% somministrato nella vena giugulare (JV) e nell'HPV sono particolarmente rilevanti dato che sono paralleli agli effetti differenziali di questi trattamenti sul comportamento (Fig. 1B e e3A)3A) e glicemia da HPV (Fig. 4B e 4D), suggerendo che quest'ultimo potrebbe essere il fattore esplicativo sottostante sia agli effetti comportamentali che a quelli neurochimici della somministrazione di glucosio.
Sebbene siano stati segnalati transitori spontanei di dopamina nei ratti svegli [44], [45], notiamo che, a nostra conoscenza, questo è il primo rapporto sui ratti anestetizzati (Figura 5A e 5B). Tuttavia, abbiamo scoperto che tutte e tre le caratteristiche utilizzate per descrivere i transitori (frequenza, durata e ampiezza) sono abbastanza simili a quelle riportate nei ratti svegli [14], [15], [44], [46], [47]Inoltre, anche nei ratti anestetizzati, la frequenza transitoria era sensibile sia all'infusione di glucosio nell'HPV (Fig. 5C) e alla somministrazione intraperitoneale di cocaina (Figura S5A). Precedenti esperimenti che utilizzavano la voltammetria ciclica avevano descritto le risposte dopaminergiche del NAcc al saccarosio intraorale [47] o saccarina [39] infusione. Rispetto a questi precedenti studi voltammetrici, riportiamo aumenti sostenuti della frequenza transitoria nell'arco di minuti dopo l'infusione endovenosa di glucosio, piuttosto che le risposte nell'arco di pochi secondi che si verificano dopo la presentazione dello stimolo orale. [46], [48]Analogamente a quanto precedentemente descritto per la nomifensina [15] e cocaina [45] somministrazione, abbiamo anche scoperto che l'iniezione di 15 mg/kg di cocaina ha causato un aumento della frequenza transitoria della dopamina nel NAcc (Figura S5A) e durata (Figura S5B). Tuttavia, non abbiamo trovato effetti per l'ampiezza transitoria (Figura S5C). Pertanto, gli effetti degli psicostimolanti sono simili nei ratti svegli e anestetizzati. Studiare gli effetti sui transitori nei roditori anestetizzati potrebbe essere più appropriato in contesti in cui l'ambiente e il condizionamento rappresentano fattori confondenti indesiderati.
Il NAcc, dove abbiamo misurato i transienti di dopamina, non è una struttura omogenea. Esistono due suddivisioni principali, il nucleo e l'involucro del NAcc, per i quali sono state segnalate differenze funzionali nell'elaborazione della ricompensa e nella cinetica del rilascio di dopamina. [49], [50]I dati voltametrici qui riportati sono stati misurati con elettrodi impiantati nella sottoregione del guscio. Infatti, gli effetti che abbiamo osservato dopo l'iniezione di cocaina (Figura S5A) sono in accordo con risultati precedenti, che mostrano che la cocaina aumenta la frequenza transitoria in questa sottoregione, ma non nel nucleo del NAcc [51]È stato proposto che la trasmissione della dopamina all'interno del guscio NAcc partecipi all'elaborazione della ricompensa primaria in risposta a entrambi gli psicostimolanti [49], [51] e stimoli ingestivi orali [39], mentre si ritiene che il rilascio di dopamina nel nucleo NAcc abbia un ruolo più specifico nella risposta ai segnali di previsione della ricompensa nel contesto delle associazioni apprese [39], [49]Ora dimostriamo che l'infusione di glucosio da HPV provoca un aumento della frequenza transitoria della dopamina nel guscio del NAcc, un effetto che, come suggerito dagli effetti dell'antagonismo del recettore della dopamina nella stessa area, potrebbe essere rilevante per l'apprendimento della preferenza del sapore indotto dalle conseguenze post-orali dei carboidrati. [4]In ogni caso, sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare la partecipazione del nucleo del NAcc nelle risposte post-assorbimento degli zuccheri.
Precedenti ricerche avevano suggerito che i meccanismi di rilevamento e trasduzione del dolce che si trovano sulle cellule gustative sulla lingua sono presenti anche nell'intestino e sono un regolatore post-ingestivo critico dell'appetito per gli zuccheri. [52]Tuttavia, noi e altri abbiamo dimostrato che i dolcificanti non nutritivi, che attivano anche questi meccanismi [52], non condizionare il lato [2] o sapore [53] preferenze. Inoltre, sebbene i meccanismi di rilevamento e trasduzione del gusto siano difettosi, entrambi i Trpm5 KO [2] e T1R3 KO [53] I topi svilupperanno preferenze condizionate dagli zuccheri nutrizionali. I risultati qui descritti supportano l'ipotesi che un fattore post-assorbimento, dipendente dalle variazioni glicemiche nell'HPV, piuttosto che sistemicamente, contribuisca agli effetti comportamentali positivi e agli effetti dopaminergici sul NAcc derivanti dal consumo di zuccheri. Sebbene questi risultati siano contrari a un ruolo importante del meccanismo pre-assorbimento, tale meccanismo non può essere escluso e, di fatto, vi sono prove che fattori mucosali e post-assorbimento potrebbero cooperare nel condizionamento post-ingestivo. [5]In ogni caso, la natura dei fattori post-assorbimento dell'HPV glucosio-dipendenti è ancora da determinare. Una possibilità è il coinvolgimento dell'insulina, soprattutto perché è stato dimostrato che questo ormone è rilevante per la risposta dopaminergica all'iperglicemia. [41]Un altro meccanismo di intervento candidato è l'assorbimento netto del glucosio epatico, poiché dipende dai livelli di insulina [54] e aumenta quando il glucosio viene somministrato nell'HPV, rispetto all'infusione periferica [55]È stata inoltre dimostrata una relazione tra lo stato energetico del fegato, misurato in termini di concentrazione di ATP negli epatociti, e l'assunzione di cibo. [56]In definitiva, questi fattori potrebbero anche spiegare le recenti scoperte, che dimostrano che l'utilizzo del glucosio è necessario per il condizionamento comportamentale e gli effetti dopaminergici del consumo di glucosio. [8]Anche il meccanismo di trasmissione dei segnali dal fegato al cervello non è chiaro. Un'ipotesi è la trasmissione neurale, probabilmente tramite neuroni afferenti vagali sensibili al glucosio. [57]Tuttavia, non è stato dimostrato che la lesione degli afferenti neurali vagali e non vagali addominali blocchi le preferenze di sapore condizionate dalla somministrazione enterale di polimeri di glucosio. [58], [59], [60]Un'altra alternativa, che è stata meno esplorata [61], è che i fattori umorali, possibilmente prodotti dal fegato e/o dal pancreas, vengono rilasciati nel flusso sanguigno e agiscono direttamente nel cervello per modulare l'assunzione di cibo [62].
In sintesi, questi risultati supportano l'affermazione che gli effetti post-assorbimento del glucosio sono sufficienti a indurre risposte comportamentali appetitive al consumo di zucchero e che i livelli di glicemia nel sistema HPV contribuiscono in modo più significativo a questo effetto rispetto alla glicemia sistemica. Inoltre, questi effetti si verificano indipendentemente dal gusto, dalla stimolazione mucosale post-ingerente e dall'osmolalità plasmatica. Inoltre, questa è la prima dimostrazione che la somministrazione di glucosio da HPV è sufficiente a indurre transienti dopaminergici striatali, un effetto che potrebbe essere alla base degli effetti comportamentali positivi di questo trattamento. Dati i notevoli effetti comportamentali del bypass gastrointestinale per la riduzione del peso corporeo [63], [64], con potenziali effetti sui livelli di nutrienti dell'HPV, riteniamo che i meccanismi qui descritti potrebbero svolgere un ruolo nell'eziologia e nel trattamento dell'obesità umana, meritando quindi ulteriori e più approfondite ricerche sia su modelli animali che umani.
Materiali e Metodi
Dichiarazione etica
Tutte le procedure sono state eseguite nel rigoroso rispetto dei protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Duke University (numero di protocollo A329-07-12).
Soggetti
Centoquarantaquattro ratti maschi Long-Evans e 12 ratti maschi Sprague-Dawley sono stati ottenuti dai Charles Rivers Laboratories (Raleigh, NC) e alloggiati individualmente in gabbie di plexiglas. Tutti gli animali sono stati mantenuti con un ciclo luce/buio di 12 ore e gli esperimenti sono stati condotti nella fase di luce del ciclo. Al momento di ciascun esperimento, gli animali avevano un'età compresa tra 3 e 6 mesi e non avevano mai sperimentato gli stimoli utilizzati. Esperimenti preliminari hanno dimostrato che, nelle condizioni necessarie per condurre esperimenti con iniezioni endovenose, si potevano ottenere tassi di leccamento stabili solo quando l'accesso orale all'acqua era limitato alle sessioni comportamentali. Pertanto, erano disponibili cibo per roditori Purina e acqua. ad libitum, fatta eccezione per la durata dei test comportamentali, durante i quali gli animali sono stati privati di cibo durante la notte e hanno avuto accesso all'acqua solo durante il test comportamentale. Negli esperimenti condotti su animali anestetizzati, è stata loro vietata l'assunzione di cibo e acqua circa 24 ore prima dell'esperimento. Negli animali il cui peso corporeo è sceso al di sotto dell'85% del valore basale, la restrizione di cibo e acqua è stata interrotta e gli animali sono stati esclusi dall'esperimento.
stimoli
Tutte le soluzioni infuse (d-glucosio – 5%, 15%, 22.5% e 50%; d-mannitolo – 5%; saccarina sodica – 3.16%) sono state preparate quotidianamente in acqua deionizzata o NaCl allo 0.9% e mantenute a temperatura ambiente. Sono state utilizzate anche acqua deionizzata e soluzione di NaCl allo 0.9%, designate come "veicolo". L'acqua deionizzata è stata somministrata anche per via orale, così come, in un'altra serie di esperimenti, soluzioni di glucosio al 5% e al 15% preparate in acqua deionizzata. D-glucosio, d-mannitolo, saccarina sodica, acqua deionizzata e NaCl sono indicati nell'articolo rispettivamente come glucosio, mannitolo, saccarina, acqua e soluzione salina. Tutti i prodotti chimici sono stati ottenuti da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) ed erano di grado reagente.
Cateterizzazione della vena porta giugulare ed epatica (HPV)
Cateteri in poliuretano (Strategic Applications, Inc., Libertyville, IL) sono stati impiantati nella vena giugulare destra in 75 ratti e nella vena porta epatica in 35 ratti. Alcuni animali sono stati cateterizzati fuori sede (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA), mentre altri sono stati cateterizzati internamente utilizzando la stessa procedura. In breve, gli animali sono stati anestetizzati con alotano al 5%, seguito da iniezione intraperitoneale o intramuscolare di xilazina (5-20 mg/kg) e ketamina (75-100 mg/kg). Dosi supplementari sono state somministrate ogniqualvolta necessario. Per il cateterismo giugulare, è stata eseguita una piccola incisione per esporre la vena giugulare destra. L'estremità craniale della vena è stata legata e una legatura lassa è stata posizionata caudalmente per isolare una sezione di 5 mm del vaso. Per il cateterismo portale, è stata praticata un'incisione addominale mediana, il cieco è stato estratto e la vena mesenterica è stata identificata. Analogamente, l'estremità distale della vena è stata legata e una legatura lasca è stata posizionata prossimalmente per isolare una sezione del vaso. In entrambi i casi, un catetere è stato inserito in un'incisione praticata tra le legature e fissato in posizione legando la legatura lasca attorno al vaso cateterizzato. È stata quindi praticata una piccola incisione nella regione scapolare e il catetere è stato tunnellizzato sottocutaneamente ed esteriorizzato attraverso questa incisione. È stata testata la pervietà e il catetere è stato riempito con una "soluzione bloccante" (500 UI/mL di eparina in glucosio al 50%) e sigillato con un tappo. È stata praticata una tasca cutanea sottocutanea cranialmente e la lunghezza eccedente del catetere è stata inserita nella tasca. Infine, il sito di incisione del vaso e l'incisione cutanea nella regione scapolare sono stati chiusi con clip. Gli animali sono stati lasciati riposare per 3-5 giorni dopo l'intervento chirurgico prima di iniziare ulteriori procedure sperimentali. Prima di queste procedure, la soluzione di bloccaggio del catetere è stata sostituita con eparina 50 UI/ml in soluzione di NaCl allo 0.9%, utilizzata anche per mantenere la pervietà negli esperimenti comportamentali condotti nell'arco di diversi giorni.
Impostazione comportamentale
Tutti i test comportamentali sono stati condotti in box comportamentali Med Associates (Med Associates Inc., St. Albans, VT), ciascuno racchiuso in una camera ventilata e insonorizzata, come descritto in precedenza [65]In breve, le camere erano dotate di due alloggiamenti per tubi aspiratori in una delle pareti. L'accesso ai tubi aspiratori poteva essere bloccato da porte controllate da computer e gli alloggiamenti per i tubi aspiratori erano dotati di liscimetri a fascio utilizzati per il rilevamento del leccamento (Med Associates Inc., St. Albans, VT). Ogni tubo aspiratore conteneva due cannule in acciaio inossidabile da 20 gauge collegate a colonne cromatografiche da 50 ml (Kontes Flex-Columns; Fisher Scientific, Hampton, NH) contenenti le soluzioni di stimolo. I contenitori delle soluzioni erano alloggiati all'esterno delle camere insonorizzate e mantenuti in posizione elevata per favorire il flusso del liquido per gravità. Solenoidi controllati da computer (Parker Hannifin Corporation, Fairfield, NJ) regolavano il flusso del fluido in modo tale che, entro 10 ms dal rilevamento di un leccamento, una delle valvole si aprisse e erogasse circa 3 µL di fluido. È stata utilizzata una pompa a siringa (Med Associates Inc., St. Albans, VT) per consentire l'iniezione intravascolare di soluzioni durante le attività comportamentali. La pompa è stata attivata 10 ms dopo il rilevamento di una leccata, determinando l'iniezione di circa 3 µL della soluzione contenuta nella siringa collegata alla pompa. Pertanto, la velocità di infusione è stata adattata alla velocità di leccata (circa 7 Hz) e il volume di liquido ingerito è risultato approssimativamente uguale alla quantità infusa.
Condizionamento agli effetti post-ingegneristici
Protocollo generale
Per verificare se i ratti sviluppano distorsioni laterali condizionate dal glucosio in un paradigma a due bottiglie, 72 animali sono stati esposti a un protocollo di condizionamento simile a quello che abbiamo usato in precedenza nei topi [2]Per ogni animale, la distorsione laterale è stata determinata in un Durata 10 minuti test con acqua erogata su entrambi i lati della scatola comportamentale (test con due bottiglie d'acqua contro test con acqua). Una volta stabilita una chiara polarizzazione laterale, gli animali sono stati esposti per 4 giorni a Durata 30 minuti sessioni di libero accesso all'acqua presentate quotidianamente su lati alternati del box (sessioni di addestramento a scelta forzata con una sola bottiglia). Il primo e il terzo giorno, l'acqua è stata presentata sul lato opposto a quello iniziale e 3 mL di uno stimolo di condizionamento sono stati somministrati simultaneamente all'acqua per le prime 1000 leccate (ovvero, 1000 × 3 µL).=3 mL). Il secondo e il quarto giorno, l'acqua è stata presentata con il bias laterale iniziale e 3 mL di veicolo (soluzione salina o acqua, vedere sotto per i dettagli) sono stati somministrati simultaneamente all'acqua per le prime 1000 leccate. In genere, le prime 1000 leccate si sono verificate in un massimo di 8 minuti. Dopo l'addestramento, è stata testata l'inversione del bias laterale in Durata 10 minuti Test con due bottiglie d'acqua vs. test con acqua. In questi esperimenti, 8 animali non hanno completato il protocollo di condizionamento a causa di malattia o eccessiva perdita di peso e in altri 5 si è verificato un errore nel protocollo di condizionamento. I dati di questi 13 animali sono stati esclusi dall'analisi.
Stimoli di condizionamento
In 11 animali il condizionamento è stato effettuato con veicolo (acqua) e soluzioni di glucosio (6 ratti con il 5% e 5 ratti con il 15%), somministrate per via orale durante la leccata per l'acqua. In 33 animali il condizionamento è stato effettuato con infusioni di veicolo (acqua o soluzione salina - non sono state riscontrate differenze in base al sottotipo di veicolo, dati non mostrati) e saccarina (5 ratti) o soluzioni di glucosio (10 ratti con il 5%, 7 ratti con il 22.5% e 11 ratti con il 50%) somministrate tramite vena giugulare cateteri. In 15 animali il condizionamento è stato eseguito con infusioni di mannitolo al 5% (5 ratti) o glucosio al 5% (10 ratti) somministrate attraverso vena porta Cateteri. Negli animali in cui il condizionamento è stato eseguito utilizzando cateteri venosi, prima delle sessioni di test e di condizionamento, l'animale è stato anestetizzato con isoflurano al 5% e il catetere è stato collegato a una siringa posizionata sulla pompa di infusione.
Misurazioni della glicemia
Animali svegli
Inizialmente, i ratti sono stati addestrati a bere in sessioni giornaliere di 10 minuti con libero accesso all'acqua. Una volta ottenuti livelli di consumo stabili, è stata condotta una sessione di test in cui, per le prime 1000 leccate d'acqua, uno stimolo specifico (∼3 mL) è stato somministrato per via orale o infuso, contemporaneamente alla leccatura. In 7 animali, soluzioni di glucosio (3 ratti con il 5% e 4 ratti con il 15%) sono state somministrate per via orale. In 20 animali, le soluzioni di glucosio sono state somministrate attraverso cateteri nella vena giugulare (6 ratti con il 5%, 4 ratti con il 22.5% e 6 ratti con il 50%) o cateteri nella vena porta (4 ratti con il 5%). Il giorno del test, è stato raccolto il sangue della coda per la determinazione della glicemia sia prima che immediatamente dopo l'esposizione alla camera di prova (rispettivamente basale e 0'), e anche a intervalli di 10 minuti dopo il ritorno dell'animale nella sua gabbia di origine (10', 20', 30', 40'). La glicemia è stata misurata utilizzando un glucometro portatile (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA; livello massimo di rilevamento di 500 mg/dL).
Animali anestetizzati
I ratti naïve sono stati anestetizzati utilizzando alotano al 5% seguito da iniezione intramuscolare di 50 mg/kg di pentobarbital, che ha dimostrato di essere una delle strategie anestetiche con piccoli effetti sulla glicemia [66]Dosi supplementari sono state somministrate ogniqualvolta necessario. È stata praticata un'incisione addominale mediana. In 15 ratti, che non avevano subito alcun intervento chirurgico precedente, la parete dello stomaco è stata perforata ed è stato inserito un catetere in polietilene in modo che la sua estremità si trovasse nel duodeno, a circa 2 cm dal piloro. Ai restanti 30 ratti erano stati precedentemente impiantati cateteri giugulari o venosi portali. I livelli di glucosio nel sangue della coda sono stati misurati a intervalli di 5-10 minuti. Una volta stabilizzata la glicemia nel sangue della coda, è stata registrata una misurazione della glicemia basale (0') sia per il sangue della coda che per quello della vena porta. Per la raccolta del sangue portale, la vena porta epatica è stata identificata vicino all'ilo epatico ed è stato utilizzato un ago da 31 gauge per raccogliere da 0.05 a 0.1 mL di sangue. 3 mL di uno stimolo specifico sono stati quindi iniettati in modo continuo per 8 minuti utilizzando una pompa a siringa (Med Associates Inc., St. Albans, VT), per emulare le condizioni durante le sessioni di addestramento comportamentale. Degli animali con cateteri duodenali, 5 ratti sono stati iniettati con veicolo (acqua), 4 con glucosio al 5% e 6 con glucosio al 15%. Negli 11 ratti con cateteri portali, il veicolo (soluzione salina; n=4) o è stato somministrato glucosio al 5% (n=7). I restanti 19 ratti avevano cateteri nella vena giugulare e hanno ricevuto un veicolo (soluzione salina; n=5) o soluzioni di glucosio (5%, n=6; 22.5%, n=4; 50%, n=4). Il sangue della coda e il sangue della vena porta sono stati successivamente raccolti a intervalli di 10 minuti per un massimo di 1 ora, a partire da 10 minuti dopo l'inizio delle infusioni (10', 20', 30', 40', 50' e 60'). La glicemia nel sangue della coda e della vena porta è stata misurata come descritto sopra.
Voltammetria ciclica a scansione rapida
Elettrodi
I microelettrodi in fibra di carbonio sono stati preparati da fibre di carbonio T-7 da 300 µm di diametro (Amoco, Greenville, SC) come precedentemente descritto [67]Quando necessario, è stata aggiunta resina epossidica all'interfaccia vetro/fibra per migliorare la tenuta. Circa 50-100 µm di fibra sono stati lasciati esposti oltre la tenuta vetro/carbone. Tutti gli elettrodi sono stati immersi in 2-propanolo con carbone attivo Norit-A per almeno 10 minuti prima dell'uso. Dopo l'abbassamento alla profondità iniziale nel nucleo accumbens, gli elettrodi sono stati condizionati ciclicamente per 15 minuti a 60 Hz con una forma d'onda triangolare (da -0.4 V a 1.3 V rispetto a Ag/AgCl a 400 V/sec) e successivamente per altri 15 minuti alla frequenza utilizzata per la raccolta dati, 10 Hz. [68]Sono stati utilizzati fili d'argento clorurati come elettrodi di riferimento e tutti i potenziali sono stati riportati rispetto ad Ag/AgCl.
Elettrochimica
Per la voltammetria ciclica a scansione rapida (FSCV) abbiamo utilizzato uno strumento elettrochimico UEI (University of North Carolina Department of Chemistry Electronics Facility, Chapel Hill, NC). Per la generazione di forme d'onda, la raccolta dati, il filtraggio digitale e la rilevazione e l'analisi dei transienti di dopamina sono stati utilizzati i moduli di National Instruments (PCI-6052 e PCI-6711E) e il software TH-1 (ESA, Chelmsford, MA). Per rilevare la dopamina extracellulare, è stata applicata una forma d'onda triangolare (da -0.4 V a 1.3 V vs Ag/AgCl a 400 V/sec) al microelettrodo in fibra di carbonio a 10 Hz. Le variazioni della dopamina extracellulare sono state determinate monitorando la corrente su una finestra di 100 mV al picco del potenziale di ossidazione della dopamina (circa 0.65 V). Correnti di dopamina in vivo sono stati convertiti in concentrazioni di dopamina calibrando gli elettrodi dopo l'uso sperimentale con due soluzioni standard di dopamina in un sistema di iniezione a flusso. La composizione del tampone utilizzato per la post-calibrazione era (in mM): 126 NaCl, 2.5 KCl, 2.4 CaCl.2, 1.2 MgCl2, 2.0 Na2SO4, 1.2 NaH2PO4, 15 TRIS HCl, pH=7.4
Metodi in vivo
Dodici ratti sono stati lasciati riprendersi dall'impianto del catetere per almeno 3 giorni interi prima della privazione notturna di cibo e acqua. La mattina successiva alla privazione, i ratti sono stati anestetizzati con uretano (1.5 g/kg ip) e posizionati in un apparecchio stereotassico (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). La temperatura corporea è stata mantenuta a 37 °C con un Deltaphase Isothermal Pad (Braintree Scientific, Braintree, MA). Il cuoio capelluto e la fascia sottostante sono stati resecati e sono stati praticati dei fori per gli elettrodi di lavoro, di stimolazione e di riferimento. Le coordinate stereotassiche sono espresse in mm anteroposteriori (AP) e mediolaterali (ML) dal bregma, e dorsoventrali (DV) dalla dura madre. Un elettrodo di stimolazione bipolare (Plastics One Inc., Roanoke, VA) è stato posizionato nell'area tegmentale ventrale (VTA): -5.2 AP, +1.0 ML, da -7.5 a -9.0 DV. Un microelettrodo in fibra di carbonio è stato posizionato nella membrana ipsilaterale del nucleo accumbens (+1.7 AP, 0.8 ML, da -6.4 a -7.4 DV). Un filo di riferimento Ag/AgCl è stato posizionato nella corteccia controlaterale. Sono state registrate le concentrazioni extracellulari di dopamina risultanti da 24 treni di stimolazione a 60 Hz (bifasici, 2 ms per fase e 130 µA) della VTA. Le posizioni degli elettrodi di stimolazione e di lavoro sono state ottimizzate per individuare siti che supportassero il rilascio di dopamina stimolato elettricamente e i transitori spontanei di dopamina. I modelli di dopamina per la successiva identificazione transitoria sono stati ricavati da voltammogrammi ciclici ottenuti dal rilascio stimolato. Tutti i siti selezionati per l'analisi transitoria supportavano il rilascio stimolato di dopamina con un rapporto segnale/rumore di 30 o superiore. La glicemia nella coda è stata determinata, come descritto sopra, e i dati basali sono stati registrati per 6-10 minuti senza ulteriore stimolazione. Immediatamente dopo la raccolta dei dati basali finali, è stata accesa la pompa di infusione. Il glucosio (5% in soluzione salina) è stato infuso (3 mL/5 min) nella vena porta epatica o giugulare. Per il gruppo di controllo, la soluzione salina è stata infusa nella vena porta. Sono stati registrati file di un minuto ininterrottamente per 20 minuti, dopodiché è stata determinata nuovamente la glicemia nella coda ed è stato verificato il mantenimento del rilascio stimolato. La misurazione della glicemia non è stata possibile in 2 animali a causa di un malfunzionamento del glucometro. Per determinare se il sito di rilascio della dopamina registrato rispondesse all'inibizione dell'uptake della dopamina, è stata somministrata un'iniezione intraperitoneale di 15 mg/kg di cocaina un'ora dopo l'infusione. I dati sono stati registrati per 25 minuti dopo la somministrazione di cocaina e il rilascio stimolato è stato ricontrollato. In 4 animali, la frequenza transitoria era degradata o risultava instabile al momento della somministrazione di cocaina.
Analisi dei dati
I risultati delle analisi dei dati sono stati espressi come media ± errore standard della media e "n" rappresenta il numero di ratti. Le analisi sono state eseguite con GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, California) o il software NCSS 2000 (NCSS, Kaysville, UT) e hanno utilizzato ANOVA a due o unidirezionali (con test post-hoc di Bonferroni) e t-test a due o un campione. La correzione sequenziale di Bonferroni per confronti multipli è stata eseguita con il metodo di Holm. [69] ogni volta che venivano utilizzati più t-test indipendenti nello stesso set di dati.
Misure di preferenza comportamentale
I test di preferenza a due bottiglie sono stati analizzati calcolando i rapporti di preferenza come
dove n(.) indica il numero totale di leccate rilevate su un particolare sipper durante una sessione. I test di significatività si sono basati su t-test a campione singolo contro 0.5, che è il valore di riferimento che indica l'indifferenza rispetto a entrambi i sipper.
Misure della glicemia nel sangue
La glicemia basale è stata definita per ciascun sito di prelievo ematico in ciascun animale mediante una singola misurazione eseguita immediatamente prima dell'inizio dell'assunzione o della somministrazione dello stimolo. I livelli di glucosio nel sangue sono stati analizzati come valori assoluti (mg/dL) o come variazione percentuale rispetto al basale. È stata calcolata la glicemia media dopo l'assunzione o la somministrazione dello stimolo ed è stato inoltre identificato il valore glicemico più alto in questo periodo (picco glicemico).
Transitori di dopamina
I transienti spontanei di dopamina sono stati identificati utilizzando una procedura pubblicata che ha determinato la corrispondenza dei picchi di dopamina presunti a un voltammogramma modello noto per essere dopamina [70]Un voltammogramma ciclico della dopamina, derivante dal rilascio di dopamina stimolato elettricamente, è servito da modello. I voltammogrammi ciclici di base sono stati sottratti da quelli di ogni singolo punto utilizzando un algoritmo nel software TH-1. Per ciascun file di dati, questa analisi ha incluso quattro passaggi utilizzando durate di base comprese tra 0.5 e 1.5 secondi, iniziate 0.5, 1.0, 1.5 o 2.5 secondi prima del punto dati testato. I criteri per l'accertamento dei transienti di dopamina sono stati tratti da metodi pubblicati e includevano due punti consecutivi (risoluzione di 0.1 secondi) che presentavano un'elevata corrispondenza con il modello (r≥0.86). [14], [15], [70], [71]Un programma Matlab progettato appositamente ha tabulato il numero di transienti e le loro durate (in numeri di punti di 0.1 sec) e ampiezze combinando i risultati di tutti i passaggi. Un transiente è risultato da almeno due punti consecutivi identificati come dopamina. Le ampiezze sono state determinate come il picco di corrente dopaminergica del transiente meno la linea di base vicino all'inizio del picco del transiente e convertite in concentrazione di dopamina a seguito del in vitro post-calibrazione [14]Il numero di punti transitori consecutivi (0.1 sec) è stato utilizzato come durata transitoria [14].
informazioni di supporto
Figura S1
Consumo di acqua durante le sessioni di condizionamento. Il consumo complessivo di acqua durante le sessioni di condizionamento è stato confrontato utilizzando l'ANOVA bidirezionale a misure ripetute. A. Gli animali condizionati con stimoli orali leccavano di più durante la somministrazione del veicolo rispetto a quella del glucosio (F=8.3, p=0.02), ma non sono stati riscontrati effetti per lo stimolo condizionante (5% vs. 15% glucosio, F=0.2, p=0.65) o l'interazione tra questi fattori (F=0.05, p=0.82). Questo effetto della riduzione del leccamento durante la disponibilità di glucosio era tuttavia minore, poiché non abbiamo trovato differenze nei confronti a coppie tra il consumo in sessioni di glucosio rispetto a quelle di veicolo per animali condizionati con entrambi i valori del 5% (4933±117 vs. 5460±141, t=2.3, p>0.05) e glucosio al 15% (5136±259 vs. 5585±502, t=1.8, p>0.05; test t di Bonferroni post-hoc). B. Similmente ai risultati ottenuti durante il condizionamento orale, gli animali condizionati con stimoli somministrati nella vena giugulare si leccavano di più durante la somministrazione del veicolo rispetto a quella del glucosio o della saccarina (F=4.5, p=0.04), ma non sono stati riscontrati effetti per lo stimolo condizionante (5% glucosio vs. 22.5% glucosio vs. 50% glucosio vs. 3.16% saccarina, F=1.5, p=0.23) o l'interazione tra questi fattori (F=1.4, p=0.27). Ancora una volta, non sono state riscontrate differenze nei confronti a coppie tra il consumo di glucosio o saccarina rispetto alle sessioni di veicolo per gli animali condizionati con glucosio al 5% (6614±356 vs. 6466±334, t=0.3, p>0.05), 22.5% glucosio (5092±650 vs. 6157±245, t=1.7,p>0.05), 50% glucosio (4824±592 vs. 6062±763, t=2.5,p>0.05) e 3.16% saccarina (4826±802 vs. 5250±512, t=0.6, p>0.05; test t di Bonferroni post-hoc). C. Negli animali con cateteri epatici-portali (HPV), si è riscontrato un leccamento maggiore in quelli trattati con glucosio rispetto al gruppo trattato con mannitolo (F=259, p<0.0001), ma nessun effetto per la somministrazione di veicolo rispetto a glucosio o mannitolo (F=0.7, p=0.41) o l'interazione tra questi fattori (F=0.1, p=0.73). Inoltre, non abbiamo trovato differenze nei confronti a coppie tra il consumo in sessioni di glucosio rispetto a quelle di veicolo per animali condizionati con glucosio al 5% (7314±148 vs. 7758±139, t=0.4, p>0.05) e mannitolo al 5% (3887±183 vs. 4244±574, t=0.8, p>0.05; test t di Bonferroni post-hoc).
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Figura S2
Misurazioni della glicemia media e massima (mg/dL) nella coda di animali svegli. A. Negli animali condizionati per via orale, non sono state riscontrate differenze nella glicemia media dopo il 5% e il 15% di glucosio (rispettivamente 84±7.4 vs. 94±3, t=1.4, p=0.23, t-test non accoppiato). B. La glicemia media dopo somministrazione orale di glucosio al 15%, efficace nel condizionare l'inversione del bias laterale, è stata confrontata anche con quella risultante dalla somministrazione di glucosio tramite vena giugulare (JV). È stato riscontrato un effetto complessivo significativo (F=27.6, p<0.0001, ANOVA unidirezionale) e confronti a coppie relativi al glucosio orale al 15% hanno rivelato differenze per JV 22.5% (220±19.2, t=3.6, p<0.001) e glucosio al 50% (315±33.6, t=7, p<0.001), ma non rispetto al glucosio al 5% (84±1.8, t=0.3, p>0.05; test t di Bonferroni post-hoc). C. La glicemia media dopo la somministrazione di HPV (93±5.9) e JV di glucosio al 5% non era significativamente diversa (t=1.7, p=0.13, t-test non accoppiato). D–F. Risultati simili sono stati riscontrati confrontando la glicemia di picco, piuttosto che quella media. Non sono state riscontrate differenze tra il 5% e il 15% di glucosio (rispettivamente 97±2.5 vs. 102±4.3, t=0.87, p=0.42, t-test non accoppiato; D). Nei confronti tra glucosio orale al 15% e somministrazione di glucosio tramite vena giugulare (JV), è stato riscontrato un effetto complessivo significativo (F=34.4, p<0.0001, ANOVA unidirezionale) e i confronti a coppie hanno rivelato differenze relative a JV 22.5% (319±26.3, t=4.9, p<0.001) e glucosio al 50% (424±42.1, t=8, p<0.001), ma non rispetto al glucosio al 5% (110±6.5, t=0.2, p>0.05; t-test di Bonferroni post-hoc; E). Infine, il picco glicemico dopo la somministrazione di HPV (93±5.9) e JV di glucosio al 5% non era significativamente diverso (t=2, p=0.08, t-test non accoppiato, F).
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Figura S3
Misurazioni medie della glicemia nella coda (% del valore basale) negli animali svegli. I dati della glicemia mostrati sopra (Fig. S2), è stato analizzato anche dopo la normalizzazione rispetto al basale (% basale; vedere anche Fig. 2B, 2C e e3B3B per valori di picco) A. Negli animali condizionati per via orale, non sono state riscontrate differenze nella glicemia media dopo il 5% e il 15% di glucosio (100±4.2 vs. 121±7.3, t=2.3, p=0.07, t-test non accoppiato). B. La glicemia media dopo somministrazione orale di glucosio al 15%, efficace nel condizionare l'inversione del bias laterale, è stata confrontata anche con quella risultante dalla somministrazione di glucosio tramite vena giugulare (JV). È stato riscontrato un effetto complessivo significativo (F=20.8, p<0.0001, ANOVA unidirezionale) e confronti a coppie relativi al glucosio orale al 15% hanno rivelato differenze per JV 22.5% (296±29.4, t=3.6, p<0.01) e glucosio al 50% (402±46.2, t=6.3, p<0.001), ma non rispetto al glucosio al 5% (130±6.4, t=0.2, p>0.05; test t di Bonferroni post-hoc). C. La glicemia media dopo la somministrazione di HPV (121±6.6) e JV di glucosio al 5% non era significativamente diversa (t=1, p=0.33, t-test non accoppiato).
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Figura S4
Durata e ampiezza della risposta transitoria della dopamina nel nucleo accumbens di ratti anestetizzati, dopo somministrazione di glucosio o veicolo nella vena epatica-portale o giugulare. La voltammetria ciclica a scansione rapida è stata utilizzata per identificare eventi di rilascio spontaneo di dopamina (transitori) nel guscio del nucleo accumbens di ratti anestetizzati. Le misurazioni sono state condotte per un periodo basale e anche durante e dopo l'infusione di glucosio al 5% nella vena giugulare (n=4) o HPV (n=4), o veicolo in quest'ultimo (n=4). È stato dimostrato che l'infusione di glucosio nell'HPV, ma non nel JV, provoca un aumento della frequenza transitoria della dopamina, se confrontata con l'effetto dell'infusione del veicolo nell'HPV (vedere Fig. 5). A. Qui mostriamo la durata transitoria (msec.) prima dell'infusione (baseline) e in intervalli di 5 minuti dopo l'inizio dell'infusione, per il veicolo HPV (baseline, 464±204; 5 minuti, 371±117; 10 minuti, 316±29; 15 minuti, 350±74; 20 minuti, 402±82; quadrati blu), glucosio HPV (baseline, 548±79; 5 minuti, 437±48; 10 minuti, 416±34; 15 minuti, 434±61; 20 minuti, 474±61; quadrati rossi) e glucosio JV (baseline, 534±120; 5 minuti, 507±142; 10 minuti, 464±41; 15 minuti, 396±108; 20 minuti, 493±97; quadrati neri). L'ANOVA bidirezionale ha rivelato l'assenza di effetti significativi per il trattamento (F=1.6, p=0.21), tempo (F=0.9, p=0.49) e l'interazione tra questi fattori (F=0.08, p=1). B. Per l'ampiezza transitoria (nM) i valori per il veicolo HPV (baseline, 35.9±7.4; 5 minuti, 32.8±7.1; 10 minuti, 29.7±7; 15 minuti, 26.5±5.3; 20 minuti, 24.4±3.3), glucosio HPV (baseline, 29.3±7.7; 5 minuti, 26.6±4.4; 10 minuti, 30.2±4.8; 15 minuti, 26.5±3.7; 20 minuti, 23.1±3.4) e glucosio JV (baseline, 26.3±1.2; 5 minuti, 21.7±1.8; 10 minuti, 24.9±1.8; 15 minuti, 25.9±1.2; 20 minuti, 25.8±3.4) sono stati confrontati anche utilizzando l'ANOVA bidirezionale e non sono stati trovati effetti per il trattamento (F=1.4, p=0.25), tempo (F=0.7, p=0.58) e l'interazione tra questi fattori (F=0.4, p=0.91).
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Figura S5
Frequenza, durata e ampiezza transitorie della dopamina nel nucleo accumbens dei ratti anestetizzati dopo somministrazione sistemica di cocaina. Per determinare se il sito di rilascio della dopamina selezionato rispondesse all'inibizione dell'uptake della dopamina, una volta misurati gli effetti della somministrazione di glucosio sui transienti dopaminergici del nucleo accumbens, sono stati somministrati 15 mg/kg di cocaina tramite iniezione intraperitoneale. In 4 animali, la frequenza dei transienti era degradata o risultava instabile. I dati relativi ai restanti 8 ratti sono presentati insieme, indipendentemente dal gruppo di trattamento. È stata utilizzata un'ANOVA a un fattore per misure ripetute per indagare possibili variazioni nella frequenza, durata e ampiezza dei transienti in intervalli di tempo di 5 minuti dopo l'iniezione ip, rispetto al periodo basale immediatamente precedente l'iniezione di cocaina. A. La cocaina ha avuto un effetto complessivo di aumento della frequenza transitoria (F=3.8, p=0.007) con un effetto significativo rispetto al basale (2.2±0.7 transienti/min) a 20 minuti (7±2.1, t=3.3, p<0.05), ma non i restanti punti temporali (5 minuti, 2.2±0.7, t=0.004; 10 minuti, 4.5±1.3, t=1.5; 15 minuti, 5.9±1.8, t=2.5; 25 minuti, 5.9±1.6, t=2.5; p>0.05 per tutti; test t di Bonferroni post-hoc). B. Per una durata transitoria, la cocaina ha avuto anche un effetto complessivo significativo (F=4, p=0.006), con ulteriori effetti significativi rispetto al basale (423±32 msec) a 10 minuti (711±122, t=3.4, p<0.01), 15 minuti (736±126, t=3.7, p<0.01), 20 minuti (700±65, t=3.3, p<0.05) e 25 minuti, 705±76, t=3.4, p<0.01), ma non a 5 minuti (600±84, t=2.1; p>0.05; test t di Bonferroni post-hoc). C. Gli effetti della cocaina sull'ampiezza transitoria non sono stati significativi, sia complessivamente (F=1.3, p=0.31) e quando ogni punto temporale è stato confrontato con il basale (21.2±2.4 nM; 5 minuti, 23.7±1.9, t=1.1; 10 minuti, 25.5±3.8, t=1.9; 15 minuti, 26.5±3.2, t=2.3; 20 minuti, 23.9±1.8, t=1.2; 25 minuti, 23.6±2, t=1.1; p>0.05 per tutti; test t di Bonferroni post-hoc).
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Tabella S1
Misurazioni della glicemia (mg/dL) nel sangue della coda di animali svegli. Ai ratti è stato permesso di bere acqua con la somministrazione simultanea di una delle soluzioni di glucosio utilizzate per il condizionamento (5% o 15% per via orale, 5%, 22.5% o 50% nel JV o 5% nel HPV). La glicemia è stata misurata dal sangue della coda all'inizio (baseline) e alla fine (0') della sessione comportamentale di 10 minuti, e ogni 10 minuti successivi (10'-40'). La glicemia (mg/dL) è stata confrontata utilizzando un'ANOVA a due vie a misure ripetute, rivelando effetti complessivi significativi per lo stimolo (JV vs. HPV vs. glucosio orale al 5% vs. glucosio orale al 15% vs. glucosio JV al 22.5% vs. glucosio JV al 50%; F=25.4, p<0.0001), tempo (baseline vs. 0′ vs. 10′ vs. 20′ vs. 30′ vs. 40′; F=42.24, p<0.0001) e l'interazione tra questi fattori (F=12.5, p<0.0001). Ulteriori confronti sono stati effettuati a ciascun punto temporale tra la glicemia dopo somministrazione di glucosio al 5% con JV, considerata come stimolo di controllo che non condizionava l'inversione del bias laterale, e la glicemia misurata dopo ciascuno dei restanti stimoli con glucosio (vedere i dettagli in questa tabella). Data la significativa interazione, i dati sono stati analizzati separatamente per ogni stimolo, mostrando un effetto significativo per il tempo in tutti i casi (JV 5% glucosio, F=14.48, p<0.0001; JV 22.5% glucosio, F=19.98, p<0.0001; JV 50% glucosio, F=28.04, p<0.0001; glucosio orale al 15%, F=3.212, p=0.036; HPV 5% glucosio, F=26.7, p<0.0001) ad eccezione del glucosio orale al 5% (F=2.68, p=0.087; ANOVA a un fattore a misure ripetute). Infine, la glicemia a ciascun punto temporale è stata confrontata con la rispettiva misurazione basale (vedere i dettagli in questa tabella). I confronti significativi sono evidenziati in grassetto. (basilea - basale).
(DOC)
Tabella S2
Misurazioni della glicemia (mg/dL) in animali anestetizzati. I ratti sono stati anestetizzati e poi iniettati con il veicolo o una delle diverse soluzioni di glucosio utilizzate per il condizionamento attraverso il duodeno (acqua, n=5; 5% glucosio, n=4; 15% glucosio, n=6), JV (soluzione salina, n=5; 5% glucosio, n=6; 22.5% glucosio, n=4; 50% glucosio, n=4) o HPV (soluzione salina, n=4; 5% glucosio, n=7) cateteri. La glicemia è stata misurata sia nel sangue della coda che in quello dell'HPV all'inizio (baseline) e alla fine (0') della perfusione di stimolo, e successivamente ogni 10 minuti (10'-50'). Inizialmente, i dati sono stati analizzati separatamente per le iniezioni di veicolo e glucosio e per la glicemia nel sangue della coda e dell'HPV. A. Per le misurazioni della glicemia nel sangue della coda dopo le iniezioni del veicolo, è stato riscontrato un effetto complessivo significativo per il tempo (linea di base vs. 0′ vs. 10′ vs. 20′ vs. 30′ vs. 40′ vs. 50′; F=2.6, p=0.02) ma non per il sito di iniezione (JV vs. duodenale vs. HPV; F=0.3, p=0.78) o l'interazione tra questi fattori (F=1.1, p=0.4; ANOVA bidirezionale a misure ripetute). Sono stati eseguiti ulteriori confronti a ogni punto temporale tra la glicemia dopo soluzione salina JV e quella osservata dopo acqua duodenale o soluzione salina HPV (vedere i dettagli in questa tabella). B. Con le misurazioni della glicemia nel sangue dell'HPV dopo le iniezioni del veicolo, non sono stati riscontrati effetti complessivi significativi per il tempo (F=1, p=0.41), sito di iniezione (F=1.3, p=0.31) né l'interazione tra questi fattori (F=1.9, p=0.05; ANOVA bidirezionale a misure ripetute). Anche in questo caso, sono stati eseguiti confronti a ogni punto temporale tra la glicemia dopo soluzione salina JV e quella osservata dopo altre vie di somministrazione del veicolo (vedere i dettagli in questa tabella). C. Rispetto alle misurazioni della glicemia nel sangue della coda dopo le iniezioni di glucosio, è stato riscontrato un effetto complessivo significativo per il tempo (F=129.3, p<0.0001), stimolo (JV vs. HPV vs. glucosio orale al 5% vs. glucosio orale al 15% vs. JV 22.5% glucosio vs. JV 50% glucosio; F=45.5, p<0.0001) e l'interazione tra questi fattori (F=30.7, p<0.0001; ANOVA bidirezionale a misure ripetute). Sono stati eseguiti ulteriori confronti a ogni punto temporale tra la glicemia dopo glucosio al 5% JV, considerato come stimolo di controllo che non condizionava l'inversione del bias laterale, e quella osservata dopo i restanti stimoli di glucosio (vedere i dettagli in questa tabella). D. In termini di misurazioni della glicemia nel sangue dell'HPV dopo iniezioni di glucosio, è stato riscontrato un effetto complessivo significativo per il tempo (F=132, p<0.0001), stimolo (F=15.5, p<0.0001) e l'interazione tra questi fattori (F=27.5, p<0.0001; ANOVA a due vie a misure ripetute). Anche in questo caso, sono stati effettuati ulteriori confronti a ogni punto temporale tra le misurazioni della glicemia dopo la somministrazione di glucosio al 5% in JV e quelle osservate dopo i restanti stimoli glicemici (vedere i dettagli in questa tabella). I confronti significativi sono evidenziati in grassetto. (basale – basale; gg – duodenale; sal. – soluzione salina; ac. – acqua).
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Tabella S3
Glicemia media e massima (mg/dL) negli animali anestetizzati. Misurazioni della glicemia nel sangue della coda e dell'HPV nei ratti anestetizzati (vedere Tabella S2) sono stati analizzati anche in base ai valori medi e di picco dopo somministrazione di glucosio o veicolo (ovvero, 0'-50'). Poiché, come descritto in precedenza, non sono state riscontrate differenze complessive nella glicemia in base alle diverse vie di somministrazione del veicolo, i dati relativi al veicolo sono stati inclusi come un'unica categoria. Gli stimoli glicemici che in precedenza non si erano dimostrati efficaci nel condizionare l'inversione del bias laterale sono evidenziati in grassetto. A. La glicemia media è stata confrontata utilizzando l'ANOVA bidirezionale a misure ripetute, rivelando effetti complessivi significativi per lo stimolo (JV vs. HPV vs. glucosio duodenale al 5% vs. glucosio duodenale al 15% vs. glucosio JV al 22.5% vs. glucosio JV al 50% vs. veicolo; F=47.56, p<0.0001), territorio del sangue (coda vs. HPV; F=13.44, p=0.0007) e l'interazione tra questi fattori (F=25.2, p<0.0001). Sono state riscontrate differenze significative anche tra la glicemia della coda e quella dell'HPV per diversi stimoli individuali (vedere i dettagli in questa tabella). Data la significativa interazione tra i fattori, la glicemia della coda e quella dell'HPV sono state analizzate separatamente e, in entrambi i casi, sono state riscontrate differenze complessivamente significative (rispettivamente: F=66.26, p<0.0001; F=31.84, p<0.0001; ANOVA a un fattore). Sono stati inoltre eseguiti ulteriori confronti a coppie separatamente per il sangue della coda e del virus HPV tra le misurazioni della glicemia dopo la somministrazione di glucosio al 5% nel JV, considerata come stimolo di controllo che non condizionava l'inversione del bias laterale, e quelle osservate dopo i restanti stimoli di glucosio. Per le misurazioni del sangue della coda, tali differenze sono state riscontrate per il JV con glucosio al 22.5% e al 50% e veicolo, mentre per le misurazioni del sangue del virus HPV sono state riscontrate differenze per il duodeno con glucosio al 15% e il JV con glucosio al 22.5% e al 50% (vedere i dettagli in questa tabella). B. Il picco glicemico è stato confrontato utilizzando le stesse metodologie. Abbiamo riscontrato effetti complessivi significativi per lo stimolo (F=160.1, p<0.0001), territorio del sangue (F=32.22, p<0.0001) e l'interazione tra questi fattori (F=10.46, p<0.0001; ANOVA a due vie a misure ripetute), e anche differenze significative tra la glicemia della coda e quella dell'HPV per diversi stimoli (vedi tabella). Anche in questo caso, sono state riscontrate differenze complessivamente significative sia per la glicemia della coda che per quella dell'HPV (rispettivamente: F=154.8, p<0.0001; F=93.98, p<0.0001; ANOVA a un fattore). Per le misurazioni del sangue della coda, glucosio duodenale al 5%, glucosio JV al 22.5% e al 50% e veicolo differivano significativamente da glucosio JV al 5%, mentre per le misurazioni del sangue dell'HPV, sono state riscontrate differenze per veicolo, glucosio HPV al 5%, glucosio duodenale al 15% e glucosio JV al 22.5% e al 50%. In quest'ultimo caso, glucosio duodenale al 5%, l'unico altro stimolo di glucosio che non ha condizionato l'inversione del bias laterale negli animali svegli, è stato l'unico stimolo testato che non differiva significativamente da glucosio JV al 5% (vedere i dettagli in questa tabella). I confronti significativi sono evidenziati in grassetto. (gg. – duodenale).
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Tabella S4
Glicemia media e massima (% basale) negli animali anestetizzati. La glicemia media e di picco della coda e la glicemia del sangue dell'HPV sono state inoltre confrontate utilizzando valori normalizzati alle misure basali (% del basale; vedere Tabelle S2 e S3). Ancora una volta, gli stimoli del glucosio che in precedenza non si erano dimostrati efficaci nel condizionare l'inversione della polarizzazione laterale sono evidenziati con testo in grassetto. A. Per la glicemia relativa media abbiamo riscontrato effetti complessivi significativi per lo stimolo (F=61.8, p<0.0001), territorio del sangue (F=10.98, p=0.002) e l'interazione tra questi fattori (F=21.45, p<0.0001; ANOVA a due vie a misure ripetute), e sono state riscontrate differenze significative tra la glicemia della coda e quella dell'HPV per diversi stimoli specifici (vedere i dettagli in questa tabella). Data la significativa interazione tra i fattori, la glicemia della coda e quella dell'HPV sono state analizzate separatamente e sono stati riscontrati effetti complessivamente significativi per entrambi i campioni di sangue della coda (F=78.37, p<0.0001) e misurazioni del sangue dell'HPV (F=39.95, p<0.0001; ANOVA a un fattore per misure ripetute). Come fatto in precedenza, sono stati eseguiti ulteriori confronti a coppie tra le misurazioni della glicemia dopo somministrazione di glucosio al 5% nel JV, considerato come stimolo di controllo che non condizionava l'inversione del bias laterale, e quelle osservate dopo i restanti stimoli di glucosio. Per il sangue della coda, il 22.5% e il 50% di glucosio nel JV erano significativamente diversi, mentre per il sangue dell'HPV, sono state riscontrate differenze per il 5% di glucosio nel HPV, il 5% e il 15% di glucosio nel duodeno e il 22.5% e il 50% nel JV (vedi tabella). B. Per la glicemia relativa di picco, sono stati riscontrati effetti principali significativi per lo stimolo (F=112.2, p<0.001), territorio del sangue (F=29.6, p<0.001) e l'interazione tra questi fattori (F=11.4, p<0.001; ANOVA a due vie a misure ripetute), e anche per diversi stimoli specifici tra la glicemia della coda e quella dell'HPV (vedere i dettagli in questa tabella). Data la significativa interazione tra i fattori, la glicemia della coda e quella dell'HPV sono state analizzate separatamente e, in entrambi i casi, sono state riscontrate differenze significative (rispettivamente: F=85.92, p<0.001 e F=92.8, p<0.001; ANOVA unidirezionale a misure ripetute). Inoltre, per le misurazioni del sangue della coda, solo il JV al 22.5% e al 50% di glucosio e il veicolo differivano significativamente dal JV al 5% di glucosio, mentre per le misurazioni del sangue dell'HPV sono state riscontrate differenze per tutti gli stimoli, ad eccezione del glucosio duodenale al 5%, l'unico altro stimolo con glucosio che non ha comportato un'inversione del bias laterale (vedere i dettagli in questa tabella). I confronti significativi sono evidenziati in grassetto. (dd. – duodenale).
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Tabella S5
Frequenza transitoria della dopamina nel nucleo accumbens di ratti anestetizzati, dopo somministrazione di glucosio o veicolo nella vena epatica-portale o giugulare. La voltammetria ciclica a scansione rapida è stata utilizzata per identificare eventi di rilascio spontaneo di dopamina, o "transitori", nel guscio del nucleo accumbens di ratti anestetizzati. Le misurazioni sono state condotte per un periodo basale, e anche durante e dopo l'infusione di glucosio al 5% nella vena giugulare (n=4) o HPV (n=4), o veicolo in quest'ultimo (n=4). È stato dimostrato che l'infusione di glucosio nell'HPV, ma non nella JV, provoca un aumento della frequenza transitoria della dopamina, se confrontata con l'effetto dell'infusione del veicolo nell'HPV e anche con i rispettivi valori basali (vedere anche Fig. 5). I confronti significativi sono evidenziati in grassetto. (sal. – soluzione salina).
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Ringraziamenti
Ringraziamo Teresa Maia, Jim Meloy e Gary Lehew per il supporto tecnico, e Susan Halkiotis per la revisione del manoscritto.
Le note
Interessi conflittuali: Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione.
finanziamento: Questo lavoro è stato finanziato con il Grant Number R01DC001065 a Sidney Simon del National Institute on Deafness and Other Communication Disorders (NIDCD). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del NIDCD o dei National Institutes of Health.
Referenze