Dopamina wzmacnia poszukiwania nagrody poprzez promowanie wzbudzanego przez cue wzbudzenia w jądrze półleżącym (2014)

Wprowadzenie

Występowanie dopaminy z brzusznego obszaru nakrywkowego (VTA) do NAc jest zasadniczym elementem obwodu nerwowego, który promuje zachowanie związane z nagrodą (Nicola, 2007). Jeśli eksperymentalnie zmniejszy się funkcję dopaminy NAc, zwierzęta będą miały mniejszy wpływ na uzyskanie nagrody (Salamone i Correa, 2012) i często nie reagują na sygnały przewidujące nagrody (Di Ciano i wsp., 2001; Yun i wsp., 2004; Nicola, 2007, 2010; Saunders i Robinson, 2012). Deficyty te wynikają z upośledzenia określonego składnika wynagradzania za zwłokę: opóźnienie w inicjowaniu zachowań podejścia jest zwiększone, podczas gdy szybkość podejścia, umiejętność znalezienia celu i wykonywania niezbędnych zachowań operantowych wymaganych do zdobycia nagrody, oraz zdolność do konsumować nagrodę nie są dotknięte (Nicola, 2010). Dopamina musi promować podejście, wpływając na aktywność neuronów NAc, ale natura tego wpływu pozostaje niejasna. Duże proporcje neuronów NAc są pobudzane lub hamowane przez sygnały przewidujące nagrody (Nicola i wsp., 2004a; Roitman i wsp., 2005; Ambroggi i wsp., 2008, 2011; McGinty i wsp., 2013), a wzbudzenia rozpoczynają się przed początkiem zachowania zorientowanego podejścia i przewidują opóźnienie w rozpoczęciu lokomocji (McGinty i wsp., 2013). Zatem ta aktywność ma cechy wymagane od sygnału zależnego od dopaminy, który promuje podejrzane podejście, ale czy to robi, jest nieznane.

Neurony w dwóch strukturach, które wysyłają glutamatergiczne związki aferentne do NAc, BLA i przyśrodkowe przyśrodkowe PFC (Brog i in., 1993), są podekscytowani przewidywaniem nagród (Schoenbaum i wsp., 1998; Ambroggi i wsp., 2008) oraz odwracalna dezaktywacja którejkolwiek z tych struktur (Ambroggi i wsp., 2008; Ishikawa i in., 2008) lub VTA (Yun i wsp., 2004) zmniejsza wielkość wzbudzanych przez cue wzbudzeń w NAc. Obserwacje te sugerują, że wzbudzane przez NAC sygnały wzbudzane są napędzane przez wejścia glutaminergiczne, ale bez dopaminy NAc nawet te silne sygnały pobudzające są niewystarczające do napędzania wywoływanych przez cue wzrostów zapłonu. Wniosek ten jest jednak wątły. Wiele neuronów NAc jest hamowanych przez sygnały (Nicola i wsp., 2004a; Ambroggi i wsp., 2011) i nie wiadomo, czy pobudzenia lub zahamowania są ważniejsze dla aktywacji zachowania podejścia. Dodatkowo, dezaktywacja VTA może zmniejszyć dyskryminacyjne bodźce (DS) - wywołane pobudzenia przez kilka mechanizmów niezależnych od dopaminy: zmniejszone kodowanie pamięci w BLA i PFC, które otrzymują projekcje z VTA (Swanson, 1982); zmniejszono wypalanie neuronów GABAergicznych VTA, które projektują do NAc (Van Bockstaele i Pickel, 1995); lub zmniejszone uwalnianie glutaminianu z neuronów dopaminergicznych (Stuber i in., 2010). Wreszcie, ponieważ dezaktywacja VTA zmniejsza nie tylko wywołane przez DS NAC, ale także zachowanie podejścia wywołanego przez DS (Yun i wsp., 2004), Wzbudzenie DS może być wtórne, a nie warunkiem koniecznym dla ruchu ukierunkowanego na cel.

Aby bezpośrednio przetestować rolę dopaminy w NAc w wypalaniu wywołanym cue, opracowaliśmy nową sondę do stosowania u zachowujących się gryzoni: kolistą matrycę elektrodową otaczającą centralną kaniulę iniekcyjną, która umożliwia jednoczesne rejestrowanie jednostkowej aktywności strzelania i infuzji antagonistów receptora dopaminy do przestrzeni pozakomórkowej otaczającej zarejestrowane neurony (du Hoffmann i in., 2011). Takie rozwiązanie pozwala nam ustalić powiązania między aktywacją receptora dopaminowego, odpaleniem neuronowym NAc i zachowaniem polegającym na poszukiwaniu nagrody: jeśli blokada receptorów dopaminowych NAc hamuje zarówno sygnały wywoływane przez cue, jak i inicjację podejścia, dostarczy to mocnych dowodów na to, że odpowiedź neuronalna zależy od endogenna dopamina i że sygnał ten jest wymagany do zachowania podejścia.

Materiały i Metody

Zwierząt.

Piętnastu samców szczurów Long-Evan (275 – 300 g po przybyciu) uzyskano z Charles River i pojedynczo trzymano. Tydzień po ich przybyciu szczury trzymano przez kilka minut dziennie, aby 3 d przyznał je eksperymentatorowi. Po przyzwyczajeniu szczury umieszczano na ograniczonej diecie 13 g karmy dla szczurów dziennie. Ad libitum po zabiegu zapewniono pożywienie 7 d, po czym zwierzęta ponownie umieszczono na ograniczonej diecie. Procedury na zwierzętach były zgodne z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee przy Albert Einstein College of Medicine.

Komory operacyjne.

Wszystkie eksperymenty behawioralne i trening behawioralny odbywały się w wykonanych na zamówienie komorach z pleksiglasu (kwadrat 40 cm, wysokość 60 cm). Znajdowały się one wewnątrz metalowych szafek, które służyły jako klatki Faradaya; szafki zostały wyłożone pianką akustyczną, a biały szum był odtwarzany w sposób ciągły przez dedykowany głośnik, aby zminimalizować słyszalność hałasu zewnętrznego wewnątrz komory. Komory operacyjne były wyposażone w pojemnik nagrody na jednej ścianie z chowanymi dźwigniami po obu stronach. Do pomiaru czasu wejścia i wyjścia pojemnika wykorzystano fotokomórkę z przodu pojemnika. Czasowa rozdzielczość systemu kontroli behawioralnej (Med Associates) wynosiła 1 ms.

Zadanie DS.

Zwierzęta były szkolone w zadaniu DS zgodnie z procedurami podobnymi do tych stosowanych wcześniej (Nicola i wsp., 2004a,b; Ambroggi i wsp., 2008, 2011; Nicola, 2010; McGinty i wsp., 2013). Dwa sygnały były przedstawiane pojedynczo, albo DS przewidujący nagrodę, albo bodziec neutralny (NS). Sygnały dźwiękowe składały się z tonu syreny (który zmieniał się z częstotliwością od 4 do 8 kHz przez 400 ms) i przerywanego tonu (dźwięk 6 kHz włączony przez 40 ms, wyłączony przez 50 ms); przypisanie określonego tonu do DS lub NS było randomizowane wśród szczurów. Przedziały międzypróbowe (ITI) wybrano losowo ze skróconego rozkładu wykładniczego ze średnią 30 si maksymalnie 150 sekund. NS był zawsze prezentowany przez 10 s; naciśnięcia dźwigni podczas NS były rejestrowane, ale nie miały zaprogramowanych konsekwencji. Dźwignie „aktywna” i „nieaktywna” były losowo przypisywane do lewej i prawej dźwigni dla każdego szczura na początku treningu i nie zmieniały się później. Odpowiedź dźwigni na aktywnej dźwigni podczas DS zakończyła wskazówkę, a pierwsze kolejne wejście do pojemnika spowodowało dostarczenie 10% nagrody sacharozy do dołka znajdującego się w pojemniku. Prezentacje DS, podczas których zwierzę nie odpowiadało, były przerywane po 10 sekundach. Odpowiedzi podczas ITI (między prezentacjami cue) i odpowiedzi na nieaktywnej dźwigni zostały zarejestrowane, ale nie doprowadziły do ​​dostarczenia nagrody. Zwierzęta trenowano w zakresie zadania DS, dopóki nie odpowiedziały na> 80% DS i <20% NS w 2-godzinnych sesjach treningowych.

Macierze mikroelektrod kaniulowane.

Po wstępnym szkoleniu szczurom implantowano kaniulowane mikromacierze składające się z ośmiu elektrod mikrowirówkowych wolframowych otaczających centralną kaniulę prowadzącą mikroiniekcji. Zostały one skonstruowane i zamontowane w specjalnie zaprojektowanych mikrodyskach, jak opisano wcześniej (du Hoffmann i in., 2011). Całkowity obrót śruby napędowej w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara przesunął elektrody i kaniulę jako jednostkę 300 μm (bez obracania sond), umożliwiając nam rejestrację z kilku unikalnych populacji neuronów w tym samym zwierzęciu.

Aby wszczepić macierze kaniulowane, szczury przygotowano do operacji i umieszczono w aparacie stereotaktycznym, jak opisano wcześniej (du Hoffmann i in., 2011; McGinty i wsp., 2013). Znieczulenie indukowano i utrzymywano za pomocą izofluranu (0.5-3%). Zwierzęta otrzymywały antybiotyk (Baytril) bezpośrednio przed operacją i 24 h po zabiegu. Macierze kaniulowane wszczepiono obustronnie do grzbietowego rdzenia NAc (1.4 mm przedni i 1.5 mm boczny od bregma, a 6.5 mm przedni od czaszki). Elektrody i mikrodyski przymocowano do czaszki za pomocą śrub kostnych i akrylu dentystycznego, a kaniule drutowe wprowadzono do kaniuli prowadzącej tak, że końce obturatorów były wyrównane z końcami kaniul prowadzących. Po zabiegu skóra głowy była leczona preparatem Neo-Predef, aby zapobiec infekcji, a zwierzętom pozwolono na 1 tydzień powrotu do zdrowia przed przystąpieniem do eksperymentów. W przypadku znieczulenia pooperacyjnego zwierzętom podawano 10 mg / kg niesteroidowego leku przeciwzapalnego ketoprofen.

Leki.

SCH23390 i raclopridde zostały zakupione od Sigma. W dniach testowych leki przygotowywano na świeżo przez rozpuszczenie ich w sterylnym roztworze soli fizjologicznej 0.9%. Leki podawano w dawkach 1.1 μg SCH233390 w soli fizjologicznej 0.55 μl na stronę i 6.4 μg raclopridu w soli fizjologicznej 0.8 μl na stronę. SCH233390 i raclopridde podawano we wlewie odpowiednio przez 12 i 17.5 min. W eksperymentach pilotażowych odkryliśmy, że obustronne wlewy raclopriddu trwające 12 min miały znaczący, ale przejściowy wpływ na stosunek odpowiedzi DS. Zatem, aby przedłużyć efekt, zwiększyliśmy czas trwania infuzji raclopridu tak, że profil czasowy jego działania farmakologicznego był podobny do profilu SCH23390. Tylko jedna dwustronna lub jednostronna iniekcja została wykonana na sesję nagraniową (jedna sesja dziennie). Wszystkie zwierzęta otrzymały co najmniej jeden obustronny zastrzyk jednego antagonisty i jedno (lub kilka) jednostronne zastrzyki antagonisty. Podczas niektórych jednostronnych eksperymentów antagonistycznych równocześnie podawaliśmy sól fizjologiczną jako kontrolę pojazdu przeciwległą do półkuli, która otrzymała antagonistę.

Procedura mikrowstrzykiwania i nagrywania.

Aparatura do jednoczesnego mikrowstrzykiwania i nagrywania została opisana wcześniej (du Hoffmann i in., 2011). Kabel rejestrujący wychodzący ze stopnia czołowego zakończony był 24-kanałowym komutatorem elektrycznym z centralnym otworem (Moog), który przekazywał sygnały do ​​elektrofizjologicznego układu rejestrującego. Dwie strzykawki zostały zamontowane w jednej pompie strzykawkowej umieszczonej na zewnątrz komory; przewody płynu ze strzykawek prowadziły do ​​dwukanałowego połączenia obrotowego (Instech Laboratories) zamontowanego nad komutatorem. Linie płynu schodziły z krętlika przez otwór komutatora, biegły wzdłuż kabla rejestrującego i kończyły się na dwóch mikroiniektorach o rozmiarze 33.

Przed sesją nagraniową mikroiniektory napełniono ponownie roztworem leku, a następnie wprowadzono do kaniuli prowadzącej zwierzęcia. Końcówki mikroinieżera wystawały 0.5 mm poza kaniulę prowadzącą, tak że końcówka mikroinieżera znajdowała się poniżej końcówek elektrod i ∼670 μm od środka każdej elektrody. Przed wypełnieniem lekiem przewody płynu i mikroiniektory zostały wypełnione olejem mineralnym, a poziom granicy faz olej-woda oznaczono w celu ułatwienia post hoc potwierdzenie, że lek został wstrzyknięty. W końcu etap głowy połączono ze zwierzęciem, a linie płynów były mocno przymocowane do kabla rejestrującego, aby utrzymać mikrowtryskiwacze na miejscu na czas trwania eksperymentu. Zwierzętom przygotowanym w ten sposób pozwolono wykonać zadanie DS dla okresu podstawowego co najmniej 45 min, podczas którego rejestrowano aktywność neuronową; następnie pompa strzykawkowa została włączona zdalnie, aby wprowadzić leki do mózgu. Iniekcja nie wymagała manipulowania zwierzęciem ani otwierania drzwi komory, a sesja behawioralna trwała nieprzerwanie przez linię bazową, infuzję i okresy po infuzji.

Sygnały napięcia neuronowego rejestrowano za pomocą wzmacniacza czołowego (wzmocnienie jedności), wzmacniano czasy 10,000 i digitalizowano przy użyciu komercyjnego sprzętu i oprogramowania (Plexon). Nagrywaliśmy z neuronów 379 w sesjach nagrywania / wstrzykiwania 38 u szczurów 15. Spośród sesji 38 7 odrzucono z powodu złego zachowania podczas okresu wyjściowego wstrzykiwania wstępnego lub z powodu braku możliwości niezawodnego wyizolowania neuronów. Tak więc nasza analiza neuronowa koncentrowała się na sesjach rejestrowania / wstrzykiwania 31, w których rejestrowaliśmy dobrze wyizolowane neurony 322 u szczurów 12. Po każdej sesji nagrywania / wstrzykiwania mikrodysk przenoszący układy elektrod był zaawansowany ∼150 μm (pół obrotu śruby mikrodysku), aby przesuwać elektrody brzusznie, aby rejestrować z nowej populacji neuronów. Jeśli zaobserwowano kilka (lub nie) neuronów, macierz była przesuwana co drugi dzień, aż do wykrycia neuronów.

Analiza.

Dane podzielono na okresy przed wstrzyknięciem, po wstrzyknięciu i odzysku, które zdefiniowano odpowiednio jako 45 min przed wlewem antagonistów, 40 min rozpoczynający się od końca wstrzyknięcia i ostatnie 33 min (2000 s) każda sesja (w sumie trwała 2 – 3 h). Okres po wstrzyknięciu odpowiada czasowi, w którym leki mają największy wpływ na zachowanie po wstrzyknięciu obustronnym (Rys. 1C).

 

Rysunek 1.

Wpływ antagonistów receptora dopaminy na zachowanie podejścia DS-cued. A, Schemat zadania DS. B, Mediana (kropka) i środkowe kwartyle (linie pionowe) DS (pomarańczowy) i NS (niebieski) współczynniki odpowiedzi w okresie wstępnego wstrzyknięcia dla wszystkich sesji behawioralnych ...

Izolację pojedynczych jednostek przeprowadzono w trybie off-line za pomocą Offline Sorter (Plexon), stosując analizę głównych składników. W kolejnych analizach uwzględniono tylko jednostki o dobrze zdefiniowanych przebiegach (> 100 μV), które wyraźnie różniły się od poziomu hałasu (<20–50 μV). Aby upewnić się, że pojedyncze jednostki są dobrze odizolowane od siebie i od szumu tła, zastosowano rozkłady interwałów międzypodpikowych i korelogramy krzyżowe (oprogramowanie Neural Explorer; Nex-Tech). Znaczniki czasu zweryfikowanych wartości szczytowych analizowano za pomocą niestandardowych procedur w środowisku oprogramowania R. Histogramy czasu perystymulacyjnego zbudowane wokół DS i NS, w przedziałach czasowych 50 ms, zostały użyte do oceny ilościowej i wykrycia wzbudzeń wywołanych cue w Ryciny 2A, , 3,3, , 4,4, , 55A, , 66A, , 77A, , 88A, I 1010A-C. Aby ustalić, czy neuron wykazywał znaczące wzbudzenie wywołane przez DS, obliczono funkcję rozkładu prawdopodobieństwa Poissona dla okresu linii bazowej 10 przed każdą kolejką. Neuron uznano za wzbudzony przez DS, jeśli wykazywał średnie zliczenia szczytowe powyżej górnego przedziału ufności 99% rozkładu linii strzelania w jednym lub większej liczbie przedziałów 50 ms między 50 i 200 ms po początku cue. W przypadku neuronów ze znacznymi wzbudzeniami wzbudzanymi przez DS w okresie linii bazowej wstrzykiwania wstępnego, średnia szybkość wypalania w czasie przedziałów 50 ms zablokowana dla DS i początku NS została uzyskana dla każdego okresu w każdej sesji, a średnia i mediana (Ryc. 2C – E, , 55A, , 66A, , 77A, , 88A, , 1010B,C) porównano szybkości wystrzeliwania neuronów. Ponieważ neurony z statystycznie wykrywalnym wzbudzeniem NS były prawie zawsze wzbudzane przez DS [nie pokazane, ale wcześniej zgłaszane (Ambroggi i wsp., 2011)], przeanalizowaliśmy odpowiedzi NS dla wszystkich neuronów ze znaczącą odpowiedzią DS. O ile nie wskazano inaczej, wszystkie porównania statystyczne wykorzystywały testy sumy rang Wilcoxona wewnątrz neuronu.

 

Rysunek 2.

Wzbudzone przez DS wzbudzenia przewidują późniejsze zachowanie poszukujące nagrody i kodują bliskość dźwigni. A, Średnie histogramy czasu przed iniekcją peri-event wyrównane do początku DS (ślad pomarańczowy) lub NS (ślad niebieski) dla neuronów 145 ze znaczącym pobudzeniem ...

 

Rysunek 3.

Przykładowe neurony pokazują, że antagoniści D1 i D2 zmniejszają wzbudzenie wywołane przez DS. Rastry i odpowiadające im histogramy pokazują wystrzelenie czterech różnych neuronów wzbudzonych DS wyrównanych do początku DS. Dane pochodzą z ostatnich prób 40 bezpośrednio poprzedzających start ...

 

Rysunek 4.

Skutki obustronnego wstrzyknięcia antagonisty dopaminy na wzbudzone przez cue wzbudzenie przewidują efekty behawioralne na zasadzie próba-próba. A, C, Analiza próba po próbie neuronalnego kodowania opóźnienia szczura w dotarciu do dźwigni dla tych samych neuronów pokazanych ...

 

Rysunek 5.

Aktywacja receptora D1 jest wymagana do wzbudzenia wywołanego przez DS. A, Histogramy czasu zdarzenia około wyrównane do początku DS dla neuronów ze znacznym wzbudzeniem wywołanym przez DS w okresie wstrzykiwania wstępnego. Ślady i chmury wskazują średnią prędkość wypalania ± SEM ...

 

Rysunek 6.

Aktywacja receptora D2 jest niezbędna do wzbudzenia wywołanego przez DS. A, Histogramy czasu zdarzenia około wyrównane do początku DS dla neuronów ze znacznym wzbudzeniem wywołanym przez DS w okresie przed wstrzyknięciem raclopridu. Pobudzenia wywołane przez DS zostały zredukowane przez obustronne ...

 

Rysunek 7.

Aktywacja receptora D1 nie jest wymagana do wzbudzania wywołanego przez NS. A, Histogramy czasu zdarzenia około wyrównane do NS dla neuronów ze znacznym wzbudzeniem wywołanym przez DS w okresie wstrzykiwania wstępnego. Te populacje całkowicie pokrywają się, a więc te same neurony ...

 

Rysunek 8.

Aktywacja receptora D2 jest niezbędna do wzbudzenia wywołanego przez NS. A, Histogramy czasu zdarzenia około wyrównane do NS dla neuronów ze znacznym wzbudzeniem wywołanym przez DS w okresie wstrzykiwania wstępnego. Pobudzenie NS zmniejszyło się w warunkach obustronnych i ipsilateralnych ...

 

Rysunek 10.

Wlew soli fizjologicznej nie wpływa na pobudzenie wywołane przez DS lub NS i ani aktywacja receptora D1, ani D2 nie jest wymagana do utrzymania częstości wypalania linii podstawowej. A, Pojedynczy wzbudzony DS neuron zarejestrowany podczas infuzji soli fizjologicznej. Konwencje są identyczne z tymi ...

W razie zamówieenia projektu Rysunek 4, określiliśmy, czy wpływ dwustronnego wstrzyknięcia antagonisty na opóźnienie dotarcia do dźwigni był skorelowany z wpływem antagonistów na wielkość pobudzenia wywołanego DS na podstawie próby po próbie. Najpierw obliczyliśmy średnią szybkość wyzwalania od 100 do 400 ms po wystąpieniu DS w każdej próbie dla wszystkich zarejestrowanych neuronów, które wykazywały znaczące pobudzenie DS przed obustronną infuzją antagonistów. Następnie dla każdego neuronu obliczyliśmy współczynnik korelacji rang Spearmana, porównując próbę po próbie wielkość wzbudzenia wywołanego DS i opóźnienie szczura, aby osiągnąć dźwignię w odpowiednich próbach. Te korelacje zostały przedstawione na histogramach w formacie Rysunek 4B,D. Wszystkie badania DS zostały uwzględnione w tej analizie; jeśli zwierzę nie nacisnęło dźwigni, do tej próby przypisano opóźnienie 10 s (maksymalna długość prezentacji cue). Obliczyliśmy te współczynniki korelacji dla okresu wstrzykiwania wstępnego, jak zdefiniowano powyżej; wydłużyliśmy okres po wstrzyknięciu przez 1000, aby uzyskać szersze próbkowanie latencji w badaniach, w których zwierzęta odpowiedziały po wlewie obustronnym. Aby ocenić istotność poszczególnych korelacji, zastosowaliśmy dwustronny asymptotyczny t-zbliżenie, ponieważ jest dokładne p nie można obliczyć wartości, gdy w danych rang występują więzy. Następnie wykorzystaliśmy sparowane testy Wilcoxona, aby porównać mediany rozkładu współczynników korelacji przed i po infuzji antagonisty.

Ponieważ neurony NAc mają niskie szybkości wypalania linii bazowej z niższymi granicami przedziału ufności bardzo często obejmującymi zero, inhibicje są znacznie trudniejsze do wykrycia i oszacowania niż pobudzenia. Tak więc, oprócz procedury opisanej powyżej, która została wykorzystana do wykrywania wzbudzenia, wykorzystaliśmy również analizę charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC), bardziej czułą metodę, w celu ilościowego określenia prawdopodobieństwa, że ​​szybkość strzelania w kolejnych przedziałach czasu ms 50 po początku cue różnił się od szybkości zapłonu w wyjściowej linii bazowej 10. Ta analiza została przeprowadzona oddzielnie dla okresów wstrzykiwania wstępnego i po wstrzyknięciu. Dla każdego pojemnika obliczyliśmy obszar pod krzywą ROC (AUC); Wartości AUC 0.5 wskazują na brak różnic w stosunku do wypalania prekursorowego, podczas gdy wartości bliższe 0 lub 1 wskazują na większe prawdopodobieństwo, że neuron jest odpowiednio hamowany lub wzbudzany. Aby przedstawić w sposób bezstronny modalną aktywność neuronalną w całej populacji zarejestrowanych neuronów, szybkości wypalania i wartości AUC obliczono dla pojemników 50 ms; aby wygładzić dane, pojemniki zostały rozwinięte przez 10 ms dla kolejnych obliczeń AUC. Wygładzone wartości AUC zostały następnie wykreślone jako mapy ciepła z rozdzielczością 10 ms (z każdą wartością reprezentującą AUC w następnym 50 ms) w Ryciny 5B, , 66B, , 77B, , 88B, I 1010D,E.

Następnie określiliśmy ilościowo, czy wartości AUC, obliczone w nienakładających się przedziałach 50 ms, odzwierciedlały znaczącą różnicę w wypalaniu. Dla każdego pojemnika najpierw wygenerowaliśmy 10,000 0.05 wartości AUC z ładowaniem początkowym z losowych tasowań wstępnej podstawowej częstotliwości wyzwalania i szybkości wyzwalania w odpowiednim pojemniku po ratunkowym. Następnie określiliśmy dwustronne prawdopodobieństwo, że rzeczywista wartość AUC została pobrana z rozkładu wartości inicjowanych; jeśli prawdopodobieństwo wynosiło <XNUMX, uznaliśmy, że wypalanie w zasobniku różni się znacząco od wartości wyjściowej sprzed korekty. Na koniec policzyliśmy liczbę neuronów z szybkością odpalania w każdym przedziale, która była znacznie większa lub mniejsza niż wstępne odpalanie linii bazowej, i wykreśliliśmy te wartości jako ułamki całej populacji (Ryc. 5C, , 66C, , 77C, , 88C, , 99B,D, , 1010F,G).

 

Rysunek 9.

Na aktywność neuronalną dopasowaną do wejścia do naczynia nagrody nie wpływa wstrzyknięcie antagonisty D1 lub D2 po stronie ipsilateralnej lub przeciwnej. A, C, Wartości AUC ROC są obliczane i wyświetlane zgodnie z opisem w Rysunek 5B, z wyjątkiem przedziałów czasu, które są dłuższe (200 ms) i wyrównane ...

Aby porównać proporcje neuronów wzbudzonych lub zahamowanych w okresach wstrzykiwania wstępnego i po wstrzyknięciu, zastosowano metodę redukcji danych. Najpierw obliczyliśmy ułamek przedziałów 50 ms między 0 i 1 po początkowym sygnale, w którym każdy neuron wykazywał znaczne pobudzenie lub zahamowanie. Następnie porównaliśmy te frakcje w okresach wstrzykiwania wstępnego i po wstrzyknięciu za pomocą sparowanego testu Wilcoxona. Neurony, które nie wykazywały znaczącej modulacji w żadnym pojemniku zarówno w okresach wstrzyknięcia wstępnego, jak i po wstrzyknięciu, zostały wyłączone z tej analizy i nie zostały uwzględnione na wykresach przedstawiających medianę frakcji znaczących pojemników (wykresy kropek i wąsów po prawej stronie każdej części w Ryc. 5C, , 66C, , 77C, , 88C, , 1010F,G). Procedura ta wyeliminowała wpływ dużej populacji neuronów bez różnicy w aktywności między oknem po DS i linią bazową przed DS; ta populacja jest mało interesująca, ale przyczynia się do dużej liczby wartości zerowych, które wpływają na medianę znaczących koszy w kierunku 0 i zaciemniają zarówno spadek, jak i wzrost frakcji znaczących pojemników po infuzji.

Podobne analizy przeprowadzono dla odpalenia związanego ze spożyciem, które nastąpiło po wejściu do pojemnika na nagrodę. Zwierzęta pozostawały w zbiorniku przez> 5 s; dlatego aby uchwycić te stosunkowo długie przedziały czasowe, pokazujemy wyniki przy użyciu bins 200 ms (Rys. 9). Okno czasowe do porównywania proporcji neuronów wzbudzonych w okresach wstrzykiwania wstępnego i wstrzyknięcia następowało z 0 do 1.5 s, podczas gdy z 0 do 5 s dla zahamowań; krótsze okno analizy zostało użyte do wzbudzania, ponieważ były one bardziej przejściowe. Analizy ROC przeprowadzono na klastrze obliczeniowym o wysokiej wydajności Albert Einstein College of Medicine przy użyciu pakietu pROC dla R.

Aby porównać „wypalanie” prędkości wystrzeliwania występujące poza zdarzeniami zadaniowymi, porównaliśmy średnią szybkość wypalania w pojemnikach 10 przed każdym wstrzyknięciem DS i po wstrzyknięciu antagonistów. Ta procedura jest funkcjonalnie równoważna losowemu próbkowaniu częstotliwości wypalania linii bazowej, ponieważ DS są prezentowane z niemal równym prawdopodobieństwem w dowolnym momencie podczas sesji behawioralnej. Neurony sklasyfikowano jako wykazujące znaczące wzbudzenie wywołane przez DS (przed infuzją leku) lub nie, a następnie porównano w tych grupach wyjściowe szybkości wypalania w okresach wstrzyknięcia wstępnego i po wstrzyknięciu za pomocą sparowanego testu Wilcoxona (Rys. 10H,I). Wykonaliśmy również dopasowanie liniowe dla neuronów wzbudzonych DS i porównaliśmy nachylenie tej linii z linią jedności (nachylenie 1).

Jeśli przeprowadzono wiele porównań podzbiorów danych pochodzących z tego samego tematu (Ryc. 2C – E, , 55A,C, , 66A,C, , 77A,C, , 88A,C, , 99B,D, , 1010B,C,F,G), p wartości zostały skorygowane przez Bonferroniego; tj p wartość została pomnożona przez liczbę dokonanych porównań. Poprawione p wartości uznano za znaczące, jeśli p <0.05. Wszystkie poprawki zostały wykonane współczynnikiem 3 z wyjątkiem Rysunek 2C – E, w którym czynnikiem był 2.

Śledzenie wideo.

W podzbiorze eksperymentów pozycję szczura mierzono za pomocą kamery podwieszonej (30 klatek / s) i skomputeryzowanego systemu śledzenia (Cineplex; Plexon). System śledził x i y pozycje dwóch różnokolorowych diod LED przymocowanych do głowicy nagrywającej. Jak wcześniej opisano (McGinty i wsp., 2013) obliczyliśmy centroid, który opisuje punkt środkowy między pozycjami diod LED dla każdej klatki wideo. Brakujące punkty danych do 10 kolejnych ramek uzupełniono za pomocą interpolacji liniowej; w rzadkich przypadkach, w których brakowało> 10 ramek, dane odrzucano. Dla każdej klatki wideo obliczyliśmy SD odległości między położeniem środka ciężkości w tej klatce i w oknie czasowym ± 200 ms. Te pomiary SD tworzą indeks lokomotoryczny (LI) dla tej klatki wideo. Przekształcone logarytmicznie wartości LI były rozłożone dwumodalnie, z dolnym pikiem reprezentującym epoki małego lub zerowego ruchu i górnym pikiem reprezentującym lokomocję (Drai i in., 2000). Następnie dopasowujemy dwie funkcje Gaussa do rozkładu LI i określiliśmy próg ruchu jako punkt, w którym te funkcje nakładały się najmniej.

Ruchy zdefiniowano jako co najmniej osiem kolejnych ramek z LI powyżej progu lokomotorycznego. Aby określić czas rozpoczęcia ruchu, ograniczyliśmy analizę do prób DS, w których zwierzę było nadal na początku cue, a następnie obliczono opóźnienie między początkiem cue a pierwszą ramką, w której LI przekroczył próg ruchu (Ryc. 1D-F, , 22B,D). Jeśli w próbie nie zmierzono żadnego dostrzegalnego ruchu, opóźnienie w tej próbie definiowano jako> 10 s (długość prezentacji sygnału, Rys. 1D). Podobne wyniki uzyskano, gdy takie próby zostały pominięte w analizie (dane nie pokazane). Rozkłady latencji DS-cued były następnie łączone pomiędzy szczurami i mediany porównywano z testem Wilcoxona. Aby określić czas oczekiwania na maksymalną prędkość i średnią prędkość ruchów kierowanych za pomocą dźwigni DS, wykorzystaliśmy wszystkie próby, które zakończyły się naciśnięciem dźwigni, nawet jeśli szczur poruszał się z DS na początku (Rys. 1E,F).

Histologia.

Zwierzęta głęboko znieczulono Euthasolem i perfundowano dosercowo solą fizjologiczną i 4% formaliną. Prąd stały (15 μA) przepuszczono przez każdą z elektrod w macierzach dla ∼30 s, aby wygenerować uszkodzenia. Mózgi usunięto i przechowywano w formalinie, aż zostały przetworzone. Przed krojeniem kriostatem mózgi poddano krioprotekcji przez zanurzenie w 30% sacharozy przez kilka dni. Skrawki (50 μm) wybarwiano pod kątem substancji Nissl w celu uwidocznienia kaniuli i śladów elektrod i uszkodzeń (Rys. 11).

 

Rysunek 11.

Histologiczna rekonstrukcja miejsc wstrzyknięcia antagonisty. Figura przedstawia dwa przekroje wieńcowe mózgu szczura, które obejmują większość przedniego i tylnego zasięgu NAc (0.8 mm – 2.8 mm przedni od bregma). Czarne kropki oznaczają ...

Efekt

Przedstawiliśmy szczurom dwa bodźce słuchowe o zmiennych interwałach uśredniające 30 s: DS przewidujący nagrodę i NS (Rys. 1A; Nicola i wsp., 2004a,b; Ambroggi i wsp., 2008, 2011; McGinty i wsp., 2013). Prasa dźwigniowa podczas DS kończyła sygnał i kropelka sacharozy była dostarczana po wejściu do pojemnika nagrody; jeśli zwierzęta nie odpowiedziały w 10 s, wskazówka została zakończona bez dostarczenia nagrody i rozpoczął się interwał między próbami. Odpowiedzi podczas tego okresu i podczas NS nie miały zaprogramowanych konsekwencji. NS zawsze były 10. Wyszkolone zwierzęta, które odpowiedziały na większość DS, ale niewiele NS (Rys. 1B), wszczepiono macierze kaniulowane skierowane na rdzeń NAc. Podczas eksperymentów zwierzęta najpierw wykonały zadanie dla okresu wstępnego wstrzykiwania 45 min, podczas którego rejestrowano aktywność neuronową NAc. Następnie antagonistę receptora D1 SCH23390 lub antagonistę receptora D2 / 3 raclopridde wlewano dwustronnie lub jednostronnie do NAc; zwierzęta pozostawały w komorze z przypadkowymi zdarzeniami w trakcie infuzji i przez co najmniej 75 min.

Zgodnie z wcześniejszymi badaniami (Yun i wsp., 2004; Nicola, 2010), obustronne wlewy któregokolwiek z antagonistów do rdzenia NAc znacząco zmniejszyły proporcję DS, na które zwierzę odpowiedziało (Rys. 1C, ciemnoszare ślady) i zwiększyły opóźnienie inicjowania ruchu, mierzone przez śledzenie wideo w podzbiorze sesji (Rys. 1D, szare przerywane ślady). W przeciwieństwie do tego, jednostronne wlewy tych samych dawek nie miały wpływu na stosunek odpowiedzi DS (Rys. 1C, jasnoszare ślady), opóźnienie rozpoczęcia ruchu po rozpoczęciu DS (Rys. 1D, przerywane światło pomarańczowe ślady) i opóźnienie, aby osiągnąć dźwignię lub prędkość ruchu podczas zbliżania się dźwigni (Rys. 1E,F). Te dane behawioralne pokazują, że dopamina NAc na pojedynczej półkuli jest wystarczająca do utrzymania zachowania, chociaż blokada receptorów D1 lub D2 / 3 na obu półkulach poważnie upośledza reakcję. Ta dysocjacja zapewnia krytyczną przewagę eksperymentalną, ponieważ pozwala nam przetestować wpływ antagonistów dopaminy na aktywność neuronową, gdy zachowanie jest zaburzone (zastrzyk obustronny) i kiedy nie jest (wstrzyknięcie jednostronne), wykluczając tym samym potencjalne ryzyko, że jakiekolwiek zaobserwowane zmiany w aktywności neuronalnej po infuzji antagonisty są wtórne do zmian w zachowaniu.

Nagrywaliśmy z neuronów 322 NAc w sesjach 31 do nagrywania / wstrzykiwania u szczurów 12. Około 45% zarejestrowanych neuronów było znacząco podekscytowanych przez prezentację DS. Te podniecenia wykazywały właściwości podobne do wcześniejszych (Yun i wsp., 2004; Nicola i wsp., 2004a; Ambroggi i wsp., 2011; McGinty i wsp., 2013; Morrison i Nicola, 2014): były większe niż te wywołane przez NSs (Rys. 2A); zaczęły się od krótkiego opóźnienia po pojawieniu się cue (N120 ms) i wystąpiły przed rozpoczęciem ruchu kierowanego dźwignią (Rys. 2B); a ich wielkość była skorelowana z prawdopodobieństwem reakcji behawioralnej, opóźnieniem inicjacji ruchu i bliskością dźwigni (McGinty i wsp., 2013; Rys. 2C – E).

Obustronna infuzja antagonisty D1or D2 / D3 spowodowała gwałtowne zmniejszenie wielkości wzbudzenia wywołanego przez DS. Jak pokazano na dwóch przykładowych neuronach (Rys. 3A,C), efekt ten był najbardziej wyraźny w minutach bezpośrednio po wlewie, co odpowiada maksymalnemu zmniejszeniu zachowań wywołanych przez cue wywołanych przez zastrzyki (Rys. 3A,C, niebieskie rastry i histogramy). Gdy efekt behawioralny powróci do normalnego stanu, odpowiedź na ostrzał również się poprawiła (Rys. 3A,C, czarne rastry i histogramy). Ten wzorzec wyników był spójny w neuronach wzbudzonych sygnalizacją (Ryc. 5A, , 66A, Dwustronne histogramy i wykresy wąsów). Na poparcie hipotezy, że te wzbudzenia wyznaczają siłę ruchu zbliżania się dźwigni, wielkość wzbudzenia wywołanego wskazówką w okresie przed wstrzyknięciem przewidywała opóźnienie zwierzęcia w dotarciu do dźwigni (Rys. 4A,C, lewo). Po obustronnym wstrzyknięciu antagonisty D1 lub D2 te opóźnienia zostały znacznie przesunięte do wyższych wartości, często tak wysokich, że nie było żadnej odpowiedzi w prezentacji cue 10 (Rys. 4A,C, lewy i prawy rozkład opóźnień). Uderzające jest to, że mimo że wypalanie przywoływane było zmniejszane przez antagonistów, nadal przewidywało ono siłę reakcji behawioralnej podczas okresów po wstrzyknięciu i regeneracji (Rys. 4A,C, właściwe wykresy rastrowe). Ta obserwacja wskazuje, że działanie behawioralne i neuronalne leku było skorelowane na zasadzie próbnej: im większe zmniejszenie wypalania spowodowane przez antagonistę dopaminy, tym większe opóźnienie dotarcia do dźwigni i mniejsze prawdopodobieństwo, że zwierzę w ogóle dotarło do dźwigni.

Aby ocenić spójność tej korelacji próba po próbie, obliczyliśmy dla każdego neuronu wzbudzonego sygnalizacją korelację rang Spearmana między wielkością wzbudzenia a opóźnieniem naciśnięcia dźwigni. Przydzieliliśmy opóźnienie 10 do prób, w których nie było odpowiedzi; opóźnienie w tych próbach było zatem związane najwyższą rangą. (Podobne wyniki uzyskano, jeśli w analizie pominięto próby bez odpowiedzi dźwigni DS-cued; dane nie zostały pokazane.) Gdy porównaliśmy współczynniki korelacji w okresie wstrzykiwania wstępnego z tymi w połączonym okresie po wstrzyknięciu / odzysku, stwierdziliśmy, że prawie wszystkie współczynników były ujemne w obu okresach. Ponadto antagoniści albo nie mieli znaczącego wpływu na współczynnik mediany, ani nie przesunęli rozkładu w kierunku jeszcze bardziej ujemnych wartości (Rys. 4B,D). Dlatego też populacja neuronów wzbudzonych wskazówką nie tylko wiarygodnie przewiduje opóźnienie odpowiedzi behawioralnej, ale także wzrost opóźnienia odpowiedzi spowodowany przez antagonistę w danym badaniu jest solidnie przewidywany przez wpływ antagonisty na wzbudzenie wywołane wskazówką w tym badaniu. Wyniki te dostarczają mocnych dowodów na przyczynową rolę endogennej dopaminy w ustalaniu siły odpowiedzi w poszukiwaniu nagrody na wskazówkę: dopamina zwiększa wzbudzenie wywołane wskazówką neuronów NAc, co z kolei powoduje krótkie opóźnienie w działaniu dźwigni.

Alternatywna interpretacja tych wyników jest taka, że ​​zmniejszone wzbudzenie wywołane cue jest konsekwencją zmniejszonej odpowiedzi behawioralnej - być może dlatego, że wzbudzenie jedynie śledzi (lub przewiduje) reakcję behawioralną, ale nie jest z nią przyczynowe. Gdyby tak było, wówczas zastosowanie antagonistów w taki sposób, aby nie wpływały na zachowanie, nie powinno skutkować zmniejszonym wzbudzeniem wywołanym przez cue. Jak jednak pokazano w dwóch przykładowych neuronach (Rys. 3B,D) jednostronne wstrzyknięcie antagonistom D1or D2 / D3 znacząco zmniejszyło wielkość wzbudzenia wywołanego cue, mimo że jednostronne wstrzyknięcia nie zmieniły zachowania behawioralnego. Podobne wyniki uzyskano uśredniając wzbudzenia wywołane cue zarejestrowane we wstrzykniętym NAc (Ryc. 5A, , 66A, Histogramy Ipsilateral); ponadto, średnie dane pokazują, że wzbudzone przez cue wzbudzenia w neuronach zarejestrowanych w przeciwnej stronie wstrzyknięcia NAc nie uległy zmianie (Ryc. 5A, , 66A, Histogramy przeciwległe). Aby wykluczyć możliwość, że zmniejszenie wzbudzenia wywołanego cue ipsilateralne do wstrzyknięć było spowodowane niewielkimi różnicami w prawdopodobieństwie odpowiedzi behawioralnej, powtórzyliśmy analizę po wykluczeniu wszystkich prób, w których zwierzę nie zareagowało na dźwignię; uzyskano podobne wyniki (dane niepokazane; p <0.05 zarówno dla antagonistów D1, jak i D2, Wilcoxon). Wyniki te wskazują, że jest mało prawdopodobne, aby redukcja pobudzenia wywołanego bodźcem wywołana przez antagonistę była konsekwencją upośledzenia zachowania.

Chociaż czasowe właściwości wzbudzonego sygnału były dość podobne w neuronach, zahamowania po wystąpieniu sygnału były bardziej zróżnicowane, zazwyczaj wykazywały późniejszy początek i mniej stereotypowe przebiegi czasowe niż pobudzenia (Ryc. 5B, , 66B). Analizy zahamowań (i, do pewnego stopnia, podniecenia), które skupiają się na jednym oknie czasowym, mogą zatem tracić znaczną część sygnału. Co więcej, standardowe metody wykrywania statystycznego nie mogą konsekwentnie identyfikować spadków od bardzo niskich podstawowych częstotliwości wypalania, w tym wielu neuronów NAc. Aby ominąć te problemy, przyjęliśmy bardziej inkluzywne podejście, w którym określiliśmy ilościowo, dla 50 ms przedziałów czasu postingu w każdym zapisanym neuronie, AUC ROC reprezentujące różnicę między wystrzeleniem w bin a linią bazową prekursora. Mapy cieplne wartości AUC w przedziałach czasowych dostosowane do początku DS (Ryc. 5B, , 66B) wykazują, że zmniejszenie pobudzenia wywołanego przez DS po obustronnych i ipsilateralnych (ale nie kontralateralnych) zastrzykach antagonistów D1 i D2 było wyraźne w prawie każdym wzbudzonym przez cue neuronie i występowało przez cały czas wzbudzenia. W przeciwieństwie do tego, hamowanie po wystąpieniu DS nie uległo zmniejszeniu. Aby określić ilościowo te efekty, określiliśmy, czy każda wartość AUC wskazywała na istotną różnicę w stosunku do linii bazowej, obliczając wartość początkową p reprezentującą prawdopodobieństwo, że AUC próbkowano z rozkładu AUC generowanych z losowo przetasowanych poziomów wypalania linii bazowej i kosza ratunkowego (patrz Materiały i Metody). Jak pokazują wykresy proporcji neuronów wykazujących znaczące (p <0.05) wzbudzenie lub zahamowanie w każdym przedziale dostosowane do początku DS (Ryc. 5C, , 66C, pozostawione wykresy w każdej kolumnie), ułamek pobudzeń, ale nie zahamowań, zmniejszył się przez obustronne i ipsilateralne zastrzyki antagonistów. Ta interpretacja została potwierdzona statystycznie przez porównanie proporcji znacząco podekscytowanych i zahamowanych pojemników w całym oknie 1 po DS (Ryc. 5C, , 66C, wykresy punktowe). Zatem pobudzenia po rozpoczęciu DS były zmniejszone przez wstrzyknięcie antagonisty D1 i D2, ale nie było zahamowań.

Rzeczywiście, liczba neuronów wykazujących znaczące hamowanie wzrosła po niektórych rodzajach zastrzyków (Ryc. 5B,C, , 66B,C). Jest mało prawdopodobne, aby te pojawiające się zahamowania przyczyniły się do behawioralnego wpływu obustronnych wlewów antagonistów, ponieważ nie były one spójne (np. Występowały po obustronnym i kontralateralnym, ale nie po ipsilateralnym wstrzyknięciu antagonisty D1 i po ipsilateralnym, ale nie obustronnym wstrzyknięciu antagonisty D2) i dlatego nie wyjaśniają efektów behawioralnych antagonistów. Co więcej, te późne zahamowania były najbardziej znaczącymi ms600 ms po wystąpieniu DS, czas, w którym, w warunkach kontrolnych, ∼50% zachowań ukierunkowanych na cel został już zainicjowany (Rys. 2B). W konsekwencji jest mało prawdopodobne, że pojawiające się zahamowania przyczyniły się do indukowanego przez antagonistę wzrostu opóźnienia inicjacji podejścia lub zmniejszenia prawdopodobieństwa odpowiedzi. Co ciekawe, ogromna większość pojawiających się zahamowań wystąpiła w neuronach wzbudzonych DS, zwykle pod koniec wzbudzenia (obustronny antagonista D1: neurony 14 / 17, 82%; antagonista D2 po obu stronach: neurony 11 / 16, 69%; Ryc. 5B,C, , 66B,C), zgodnie z możliwością, że zostali zdemaskowani przez wywołaną przez antagonistę redukcję odpowiedzi pobudzającej i potwierdzającą hipotezę, że odpalanie wzbudzonych DS neuronów jest przyczyną inicjacji zachowania podejścia.

Prezentacje NS, które rzadko wywoływały reakcje za pomocą dźwigni (Rys. 1B), wywołał małe, ale stałe pobudzenie w tych samych neuronach, które były wzbudzane przez DS (Rys. 2A). Zaskakująco, wzbudzone przez NS wzbudzenia nie były zmniejszone przez antagonistę D1, ani pod względem wielkości (Rys. 7A) lub w liczbie wzbudzonych neuronów (Rys. 7B,C). W przeciwieństwie do tego, wstrzyknięcie antagonisty D2 zmniejszyło zarówno wielkość, jak i liczbę wzbudzonych przez NS pobudzeń (Rys. 8). Hamowanie wywołane przez NS nie było zmniejszone przez żadnego antagonistę (Ryc. 7B,C, , 88B,C). Dlatego w tych warunkach aktywacja receptora D1 jest wymagana dla neuronów NAc w celu wywołania wzbudzeń o dużej wielkości w odpowiedzi na istotne bodźce predykcyjne nagrody, podczas gdy aktywacja receptora D2 jest wymagana dla odpowiedzi zarówno na bodźce przewidujące nagrodę, jak i bodźce obojętne.

Rozważaliśmy możliwość, że zmniejszenie zachowań związanych z poszukiwaniem nagrody po obustronnych wlewach mogło być spowodowane przerwaniem procesu neuronalnego związanego ze wzmocnieniem lub hedonicznym przetwarzaniem nagrody. Takie procesy mogą obejmować subpopulacje neuronów NAc, które są hamowane lub wzbudzane podczas konsumpcji sacharozy (Nicola i in., 2004b; Roitman i wsp., 2005; Taha and Fields, 2005). Ponieważ zwierzęta nadal otrzymywały nagrodę po jednostronnym wlewie antagonisty, byliśmy w stanie określić, czy aktywność neuronalna związana ze spożyciem nagrody była zależna od aktywacji receptora dopaminy. Zbadaliśmy strzelanie w ciągu 5 sekund po wejściu zwierzęcia do pojemnika z nagrodą, okres czasu, w którym zwykle następuje konsumpcja nagrody (Nicola, 2010). Korzystając z analizy ROC, porównaliśmy wypalanie w binach 200 ms w tym oknie z podstawową wartością wyjściową 10; mapy cieplne otrzymanych wartości AUC wykazują niewielki wpływ wstrzyknięcia antagonisty albo ipsilateralnego albo kontralateralnego do zastrzyku (Rys. 9A,C). Antagoniści nie mieli wpływu na proporcje wzbudzonych i zahamowanych neuronów (Rys. 9B,D), silnie sugerując, że pobudzenia i zahamowania związane z konsumpcją nie zależą od dopaminy. Podobne wyniki uzyskano, gdy wykonaliśmy tę samą analizę przy użyciu pojemników 50 ms (dane nie pokazane).

Aby wykluczyć możliwość, że obserwowane wyniki były spowodowane jakimś czynnikiem innym niż antagonista (np. Zaburzenie fizyczne spowodowane wstrzyknięciem lub jakimś składnikiem nośnika leku), wstrzyknęliśmy sól fizjologiczną w niektórych eksperymentach. Jak pokazuje przykładowy neuron (Rys. 10A) i przez średnie wzbudzenie przez neurony wzbudzane cue (Rys. 10B) Wzbudzenia wywołane przez DS nie były zmieniane przez zastrzyk soli fizjologicznej; Podniecenia wywołane przez NS również nie zostały naruszone (Rys. 10C). Ponadto zastrzyk soli fizjologicznej nie wpłynął na proporcje neuronów wykazujących znaczące pobudzenie i zahamowanie po wystąpieniu DS lub NS (Rys. 10D – G).

Na koniec zapytaliśmy, czy aktywacja receptora dopaminy może być dopuszczalna dla zachowania podejrzanego podejścia, przyczyniając się do częstości odpalania neuronów NAc. Wbrew tej hipotezie, nie było znaczącego wpływu antagonisty D1 lub D2 na wyjściowe szybkości wyzwalania neuronów DS lub innych neuronów NAc (Rys. 10H,I).

Dyskusja

Odkrycia te sugerują mechanizm, dzięki któremu dopamina dopaminy sprzyja zachowaniu szukającemu nagrody wywołanemu przez bodźce środowiskowe: aktywacja receptora dopaminy ułatwia wzbudzane przez cue pobudzenia, które z kolei promują inicjację podejścia do obiektów związanych z nagrodami. Wniosek ten jest silnie poparty obserwacją, że obustronne wstrzyknięcie antagonisty dopaminy zwiększyło opóźnienie rozpoczęcia ruchu (Rys. 1D) i zmniejszył wielkość wzbudzonych przez cue ekscytacji (Ryc. 33â € <-6). Zmniejszone wzbudzenie wywołane cue nie mogło być konsekwencją upośledzonego zachowania, ponieważ jednostronne zastrzyki nie zmieniły zachowania DS-cued (Rys. 1C – F), ale znacznie zmniejszone wzbudzenie wywołane przez DS w wstrzykniętej tkance (Ryc. 3B,D, , 5,5, , 6) .6). Te pobudzenia były dominującą odpowiedzią neuronową w NAc (występującą w 45% zarejestrowanych neuronów) i obie poprzedzały początek ruchu (Rys. 2B) i przewidywane opóźnienie inicjacji ruchu z większym wyzwalaniem prób z krótszym opóźnieniem (Rys. 2D) (McGinty i wsp., 2013; Morrison i Nicola, 2014). Dlatego wzbudzanie przywoławcze jest zarówno zależne od dopaminy, jak i konieczne do energicznego poszukiwania nagrody.

Nasze wyniki pokazują, że wzbudzone przez cue wzbudzenie i żadna inna forma aktywności neuronowej w NAc, jest prawdopodobnie krytycznym sygnałem w obwodzie neuronowym, który ustawia opóźnienie ruchów ukierunkowanych na cel. Wniosek ten wynika z obserwacji, że antagoniści zmniejszyli wzbudzenie wywołane cue bez zmniejszania zahamowań wywołanych cue, odpalania związanego z konsumpcją nagrody lub szybkości wypalania linii podstawowej. Ponadto próby, w których obustronne zastrzyki antagonistów były najbardziej skuteczne w zmniejszaniu pobudzenia, były tymi, w których powodowały największe zaburzenia zachowania (Rys. 4), stanowczo argumentując przeciwko możliwości, że za efekty behawioralne odpowiadała inna niewykryta zmiana w kodowaniu neuronów. Dlatego nasze dane ściśle wiążą aktywację receptora dopaminowego w NAc, wielkość pobudzenia wywołanego wskazówkami i opóźnienie zwierzęcia do zainicjowania poszukiwania nagrody.

Wcześniejsze prace pokazały, że inaktywacja VTA, która redukuje wzbudzone przez NAC wzbudzenia i zahamowania, również uniemożliwiła zwierzętom wykazanie zachowania podejrzanego podejścia (Yun i wsp., 2004). Jednakże badanie to nie wyeliminowało możliwości, że zmiany te były efektem obwodu pośredniego. Tutaj pokazujemy, że receptory dopaminowe lokalne dla zarejestrowanych neuronów są niezbędne dla wzbudzonego przez cue wzbudzenia, eliminując możliwość, że efekty antagonistyczne są spowodowane działaniem dopaminy w górę od NAc. W przeciwieństwie do tego, chociaż inhibicje wywołane przez cue zostały zmniejszone przez inaktywację VTA (Yun i wsp., 2004), nie zostały one zmniejszone przez miejscowe wstrzyknięcie antagonisty dopaminy, a zatem jest mało prawdopodobne, aby te zahamowania były wynikiem bezpośredniego działania dopaminy w obrębie NAc.

Efekty działania antagonistów D1 i D2 na zachowanie wywołane przez DS i wyzwalanie wywołane przez DS były niezwykle podobne. Obserwacje te są zgodne z długą linią eksperymentów z mikroiniekcją NAc, w których antagoniści D1 i D2 wytwarzali niemal nieodróżnialne efekty behawioralne w dawkach podobnych do naszych (Hiroi i White, 1991; Ozer i in., 1997; Koch i in., 2000; Eiler i in., 2006; Pezze i in., 2007; Lex and Hauber, 2008; Liao, 2008; Nicola, 2010; Shin i in., 2010; Haghparast i in., 2012). Wyniki te, wraz z kontrastem między stężeniem antagonisty w iniekcji, które jest wymagane do zaobserwowania efektów (mm), a powinowactwem leków do ich celów (nm), stawiają pytanie, czy efekty leku są specyficzne. Chociaż skuteczne stężenie na receptorze jest prawdopodobnie znacznie niższe niż wstrzyknięte stężenie z powodu dyfuzji, metabolizmu i utleniania leków, łączna skuteczność i przebieg czasowy tych procesów nie są znane. Dlatego jedną z formalnych możliwości jest to, że zarówno behawioralne, jak i elektrofizjologiczne efekty SCH23390 i raclopopride są wynikiem obu leków wiążących jeden lub więcej receptorów, które w ogóle nie są związane z dopaminą. Kilka czynników przemawia przeciwko tej możliwości. Zachowanie przywołane przez cue jest blokowane nie tylko przez SCH23390 i raclopridde, ale także przez wstrzyknięcie do NAc szerokiego spektrum antagonisty receptora dopaminy, flupentiksolu (Di Ciano i wsp., 2001; Saunders i Robinson, 2012), poprzez dezaktywację VTA (Yun i wsp., 2004) i przez uszkodzenie NAc za pomocą 6-hydroksydopaminy (Parkinson i wsp., 2002), który selektywnie zabija włókna katecholaminergiczne. Ponadto, wstrzyknięcie NAc blokera wychwytu zwrotnego dopaminy, agonisty receptora D1 lub D2, lub amfetaminy uwalniającej dopaminę zwiększa prawdopodobieństwo podejrzanego podejścia (Wyvell i Berridge, 2000; Nicola i in., 2005; du Hoffmann i Nicola, 2013). Wreszcie, optogenetyczna autostymulacja neuronów dopaminowych VTA (zachowanie niewątpliwie utrzymywane przez aktywację neuronów dopaminowych) jest osłabiona przez wstrzyknięcie SCH23390-a lub raklopridu do NAc w dawkach podobnych do stosowanych tutaj (Steinberg i in., 2014). Trudno jest wyobrazić sobie prosty mechanizm, który mógłby wyjaśnić każdy z tych wyników bez stwierdzenia, że ​​podejście SCH23390 i blokada racloprydu blokują działanie endogennej dopaminy.

Alternatywna możliwość polega na tym, że antagoniści wiążą nie tylko swoje docelowe receptory, ale także niedocelowe receptory dopaminy. Przy stężeniach 10 μm lub niższych, rakloprid nie wiąże receptorów podobnych do D1 (Hall i wsp., 1986); wyższe stężenia nie zostały przetestowane. Dlatego raclopridde może być specyficzny dla receptorów D2 / D3 nawet przy stężeniach wstrzyknięć mm stosowanych przez nas i innych, zwłaszcza po uwzględnieniu dyfuzji, metabolizmu i utleniania. Oszacowania stałej wiązania SCH23390 do receptorów D2 w zakresie między 1 i 5 μm (Bourne, 2001; Mottola i in., 2002); chociaż te wartości sugerują, że SCH23390 wiąże receptory D2 / D3 przy wstrzykniętych stężeniach, skuteczność funkcjonalna SCH23390 w blokowaniu aktywacji receptorów podobnych do D2 przez dopaminę jest nieznana. Nasza obserwacja, że ​​raclopride zmniejszył pobudzenie wywołane przez NS, podczas gdy SCH23390 nie popiera idei, że leki działają na różne receptory, ale nie wykazuje ostatecznie ich specyficzności. Niemniej jednak, nawet jeśli jeden lub oba leki blokowały oba typy receptorów w celu zmniejszenia pobudzenia wywołanego przez DS, byłoby to całkowicie zgodne z naszym wnioskiem, że aktywacja co najmniej jednej formy receptora dopaminy jest wymagana do wzbudzania DS. Tak więc, chociaż kwestia specyficzności leku pozostaje bez odpowiedzi, to pytanie tylko nieznacznie osłabia nasz główny wniosek, że dopamina ułatwia cued podejście poprzez zwiększenie wzbudzania cue.

Jeśli w rzeczywistości leki działały konkretnie, nasze odkrycia, że ​​antagoniści D1 i D2 / D3 przy każdym zredukowanym wyzwalaniu cue w większości neuronów wzbudzonych sygnalizacją sugerują, że aktywacja tych receptorów prowadzi synergistycznie do wzbudzenia w tych samych neuronach. Podczas gdy receptory D1 i D2 znajdują się w zasadniczo oddzielonych populacjach neuronów w NAc (Albin i in., 1989; Gerfen i in., 1990), znaczne proporcje neuronów rdzeniowych i powłokowych NAc, które wyrażają receptory D1, zawierają również mRNA dla receptorów D3 (Le Moine i Bloch, 1996), które są blokowane przez antagonistów D2, w tym rakloprid. Koekspresja receptorów D1 i D3 zapewnia potencjalny mechanizm, dzięki któremu dopamina może pobudzać pobudzenie w neuronach NAc przez efekt synergiczny, który byłby blokowany przez antagonistów D1 lub D2 / 3 (Schwartz i in., 1998). Alternatywnie (lub dodatkowo) interakcja między receptorami D1 i D2 (i / lub D3) może wystąpić na poziomie obwodu lokalnego (Goto and Grace, 2005; Gerfen i Surmeier, 2011). Na przykład dopamina działa na receptory D1, aby zmniejszyć uwalnianie GABA na neurony NAc (Nicola i Malenka, 1997; Hjelmstad, 2004), efekt, który mógłby promować pobudzenie w połączeniu z aktywacją receptorów D2 / D3 na neuronach kolczastych (Hopf i in., 2003). W szczególności mechanizmy te zakładają, że dopamina nie pobudza neuronów NAc bezpośrednio, ale raczej zwiększa ich pobudliwość w odpowiedzi na wejście glutaminergiczne; w ten sposób mogą wyjaśnić, dlaczego wzbudzane przez cue wzbudzenia są blokowane nie tylko przez antagonistów dopaminy, ale także przez inaktywację podstawy-bocznej części ciała migdałowatego i kory przedczołowej (Ambroggi i wsp., 2008; Ishikawa i in., 2008), z których oba przesyłają projekcje glutaminergiczne do NAc (Brog i in., 1993).

Podobieństwa i różnice między efektami SCH23390 i raclopopride mogą wynikać z dwóch kontrastujących mechanizmów neuronalnych, obejmujących dopaminę fazową i toniczną. Ponieważ zarówno antagoniści D1, jak i D2 / D3 zmniejszyli wzbudzenie wywołane przez DS, ale mniejsze wzbudzenie wywołane przez NS występujące w tych samych neuronach zostało zredukowane tylko przez antagonistę D2 / D3 (Ryc. 8, , 9), 9) wydaje się, że dopamina promuje kodowanie wartości bodźca poprzez aktywację receptorów D1, ale ułatwia odpalanie odpowiedzi na wszystkie sygnały (niezależnie od tego, czy są one związane z cennym wynikiem) za pośrednictwem receptorów D2 / D3. Może to wynikać z większych fazowych stanów przejściowych dopaminy wywołanych w NAc przez sygnały przewidujące nagrody niż neutralne (Phillips i wsp., 2003; Roitman i wsp., 2004). Ponieważ receptory D2 / 3 mają wyższe powinowactwo do dopaminy niż receptory D1, małe wywołane przez NS przejściowe dopaminy mogą być wystarczające do aktywacji tylko receptorów D2 / 3, podczas gdy DS przewidujące nagrody mogą podnieść stężenie dopaminy do poziomów wystarczająco wysokich, aby aktywować receptory D1 (Grace, 1991).

Alternatywnie, wielkość wzbudzonego sygnału może być regulowana przez tonikę, a nie fazową dopaminę. Poziom tonicznej dopaminy może odzwierciedlać koszt alternatywny braku działania (Niv i in., 2007), ustawiając tym samym siłę działania operanta. Tak więc, jeśli osiągnięte zostaną wystarczająco wysokie poziomy dopaminy tonicznej, wystarczająca ilość receptorów dopaminy mogłaby zostać aktywowana, aby ułatwić wzbudzone przez cue wzbudzenie i zmniejszyć opóźnienie podejścia poszukującego nagrody. Podobny mechanizm może również leżeć u podstaw dobrze znanego wkładu dopaminy NAc w wykonywanie zadań niewykorzystanych operantów, które wymagają dużego wysiłku (Salamone i Correa, 2012), w którym zakłócenie dopaminy zwiększa opóźnienia, aby zbliżyć się do operandum (Nicola, 2010). Niejawne zewnętrzne sygnały (np. Widok dźwigni) lub wewnętrzne sygnały (np. Wynikające z czasu lub głodu) mogą wywołać podejście przez ekscytujące neurony NAc w większym stopniu, gdy koszty alternatywne i poziomy dopaminy są wysokie.

Podsumowując, niezależnie od specyficznego mechanizmu farmakologicznego, nasze wyniki pokazują, że NA-dopamina promuje zachowanie związane z nagrodą przez podniesienie pobudzenia neuronów NAc do istotnych bodźców środowiskowych. Wielkość tego wzbudzenia określa opóźnienie podmiotu do zainicjowania odpowiedzi podejścia. Poprzez ten mechanizm dopamina reguluje zarówno wigor, jak i prawdopodobieństwo otrzymania nagrody.

Przypisy

Referencje