Dopamina wzmacnia poszukiwania nagrody poprzez promowanie wzbudzanego przez cue wzbudzenia w jądrze półleżącym (2014)

Wprowadzenie

Projekcja dopaminy z brzusznego obszaru nakrywki (VTA) do NAc jest istotnym składnikiem obwodu neuronalnego, który promuje zachowanie poszukiwania nagrody ( Nicola, 2007 ). Jeśli funkcja dopaminy w NAc zostanie zmniejszona eksperymentalnie, zwierzęta będą mniej skłonne do wkładania wysiłku w uzyskanie nagrody ( Salamone i Correa, 2012 ) i często nie będą reagować na wskazówki przewidujące nagrodę ( Di Ciano i in., 2001 ; Yun i in., 2004 ; Nicola, 2007 , 2010 ; Saunders i Robinson, 2012 ). Deficyty te wynikają z upośledzenia określonego składnika poszukiwania nagrody: opóźnienie w zainicjowaniu zachowania zbliżeniowego jest zwiększone, podczas gdy prędkość zbliżania się, zdolność do znalezienia celu i wykonania niezbędnego zachowania instrumentalnego wymaganego do zdobycia nagrody oraz zdolność do jej konsumpcji pozostają niezmienione ( Nicola, 2010 ). Dopamina musi promować zbliżanie się poprzez wpływ na aktywność neuronów NAc, ale natura tego wpływu pozostaje niejasna. Duża część neuronów NAc jest pobudzana lub hamowana przez sygnały przewidujące nagrodę ( Nicola i in., 2004a ; Roitman i in., 2005 ; Ambroggi i in., 2008 , 2011 ; McGinty i in., 2013 ), a pobudzenia rozpoczynają się przed rozpoczęciem zachowania zbliżającego się na sygnał i przewidują opóźnienie w rozpoczęciu lokomocji ( McGinty i in., 2013 ). Dlatego ta aktywność ma cechy wymagane od sygnału zależnego od dopaminy, który promuje zbliżanie się na sygnał, ale czy tak jest, nie wiadomo.

Neurony w dwóch strukturach, które wysyłają glutaminergiczne włókna aferentne do NAc, BLA i grzbietowo-środkowej PFC ( Brog i in., 1993 ), są pobudzane przez wskazówki przewidujące nagrodę ( Schoenbaum i in., 1998 ; Ambroggi i in., 2008 ), a odwracalna inaktywacja którejkolwiek z tych struktur ( Ambroggi i in., 2008 ; Ishikawa i in., 2008 ) lub VTA ( Yun i in., 2004 ) zmniejsza wielkość wzbudzeń wywołanych wskazówką w NAc. Obserwacje te sugerują, że wzbudzenia wywołane wskazówką w NAc są napędzane przez sygnały glutaminergiczne, ale bez dopaminy w NAc nawet te silne pobudzające sygnały są niewystarczające, aby wywołać wzrost wyładowań wywołanych wskazówką. Jednak wniosek ten jest wątpliwy. Wiele neuronów NAc jest hamowanych przez wskazówki ( Nicola i in., 2004a ; Ambroggi i in., 2011 ) i nie wiadomo, czy pobudzenia czy zahamowania są ważniejsze dla aktywacji zachowania zbliżania się. Ponadto inaktywacja VTA może zmniejszyć pobudzenia wywołane bodźcem dyskryminacyjnym (DS) poprzez kilka mechanizmów niezależnych od dopaminy: zmniejszone kodowanie wskazówek w BLA i PFC, które odbierają projekcje z VTA ( Swanson, 1982 ); zmniejszone wyładowania GABAergicznych neuronów VTA, które projektują do NAc ( Van Bockstaele i Pickel, 1995 ); lub zmniejszone uwalnianie glutaminianu z neuronów dopaminergicznych ( Stuber i in., 2010 ). Wreszcie, ponieważ inaktywacja VTA zmniejsza nie tylko wyładowania wywołane DS w NAc, ale także wywołane DS zachowanie zbliżania się ( Yun i in., 2004 ), pobudzenie DS może być warunkiem wtórnym, a nie koniecznym do ruchu ukierunkowanego na cel.

Aby bezpośrednio przetestować rolę dopaminy NAc w aktywacji wywołanej sygnałem, opracowaliśmy nową sondę do zastosowania u zachowujących się gryzoni: okrągłą matrycę elektrod otaczającą centralną kaniulę iniekcyjną, która umożliwia jednoczesną rejestrację aktywności aktywacji jednostkowej i infuzję antagonistów receptora dopaminy do przestrzeni zewnątrzkomórkowej otaczającej rejestrowane neurony ( du Hoffmann i in., 2011 ). Taki układ pozwala nam ustalić powiązania między aktywacją receptora dopaminy, aktywacją neuronów NAc a poszukiwaniem nagrody: jeśli blokada receptorów dopaminy NAc hamuje zarówno sygnały wywołane sygnałem, jak i inicjację zbliżenia, stanowiłoby to silny dowód na to, że odpowiedź neuronalna zależy od endogennej dopaminy i że ten sygnał jest niezbędny do zachowania zbliżenia.

Materiały i Metody

Zwierząt.

Piętnaście samców szczurów Long-Evan (o masie ciała 275–300 g po przybyciu) pozyskano z Charles River i umieszczono w osobnych klatkach. Tydzień po przybyciu szczury były dotykane przez kilka minut dziennie przez 3 dni, aby przyzwyczaić je do eksperymentatora. Po przybyciu szczury przeniesiono na dietę restrykcyjną, w której spożywano 13 g karmy dla szczurów dziennie. Po zabiegu przez 7 dni zwierzęta otrzymywały pokarm ad libitum , po czym ponownie przeniesiono na dietę restrykcyjną. Procedury dotyczące zwierząt były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Użytkowania przy Albert Einstein College of Medicine.

Komory operacyjne.

Wszystkie eksperymenty behawioralne i trening behawioralny odbywały się w wykonanych na zamówienie komorach z pleksiglasu (kwadrat 40 cm, wysokość 60 cm). Znajdowały się one wewnątrz metalowych szafek, które służyły jako klatki Faradaya; szafki zostały wyłożone pianką akustyczną, a biały szum był odtwarzany w sposób ciągły przez dedykowany głośnik, aby zminimalizować słyszalność hałasu zewnętrznego wewnątrz komory. Komory operacyjne były wyposażone w pojemnik nagrody na jednej ścianie z chowanymi dźwigniami po obu stronach. Do pomiaru czasu wejścia i wyjścia pojemnika wykorzystano fotokomórkę z przodu pojemnika. Czasowa rozdzielczość systemu kontroli behawioralnej (Med Associates) wynosiła 1 ms.

Zadanie DS.

Zwierzęta szkolono w zadaniu DS, stosując procedury podobne do tych stosowanych wcześniej ( Nicola i in., 2004a , b ; Ambroggi i in., 2008 , 2011 ; Nicola, 2010 ; McGinty i in., 2013 ). Prezentowano dwa sygnały naraz, albo DS przewidujący nagrodę, albo bodziec neutralny (NS). Sygnały słuchowe składały się z tonu syreny (którego częstotliwość zmieniała się od 4 do 8 kHz przez 400 ms) i tonu przerywanego (dźwięk 6 kHz włączony przez 40 ms, wyłączony przez 50 ms); przypisanie konkretnego tonu do DS lub NS było losowe u wszystkich szczurów. Przerwy między próbami (ITI) wybierano losowo z uciętego rozkładu wykładniczego ze średnią 30 s i maksimum 150 s. NS był zawsze prezentowany przez 10 s; Naciśnięcia dźwigni podczas NS były rejestrowane, ale nie miały zaprogramowanych konsekwencji. Dźwignie „aktywne” i „nieaktywne” zostały losowo przypisane do lewej i prawej dźwigni dla każdego szczura na początku treningu i nie zmieniały się później. Reakcja dźwigni na dźwigni aktywnej podczas DS przerywała sygnał, a pierwsze kolejne wejście do pojemnika powodowało dostarczenie nagrody w postaci 10% sacharozy do zagłębienia znajdującego się w pojemniku. Prezentacje DS, podczas których zwierzę nie reagowało, były przerywane po 10 sekundach. Reakcje podczas ITI (pomiędzy prezentacjami sygnału) i reakcje na dźwigni nieaktywnej były rejestrowane, ale nie skutkowały dostarczeniem nagrody. Zwierzęta były szkolone w zadaniu DS, dopóki nie zareagowały na >80% DS i <20% NS w 2-godzinnych sesjach treningowych.

Macierze mikroelektrod kaniulowane.

Po wstępnym szkoleniu szczurom wszczepiono kaniulowane mikromacierze składające się z ośmiu elektrod z mikrodrutu wolframowego, otaczających centralną kaniulę prowadzącą do mikroiniekcji. Mikromacierze te skonstruowano i zamontowano w specjalnie zaprojektowanych mikronapędach, jak opisano wcześniej ( du Hoffmann i in., 2011 ). Pełny obrót śruby napędowej zgodnie z ruchem wskazówek zegara powodował przesunięcie elektrod i kaniuli jako całości o 300 μm w kierunku brzusznym (bez rotacji sond), co umożliwiło nam rejestrację kilku unikalnych populacji neuronów u tego samego zwierzęcia.

Aby wszczepić kaniulowane macierze, szczury przygotowano do zabiegu i umieszczono w instrumencie stereotaktycznym, jak opisano wcześniej ( du Hoffmann i in., 2011 ; McGinty i in., 2013 ). Znieczulenie wywołano i podtrzymano izofluranem (0.5–3%). Zwierzęta otrzymały antybiotyk (Baytril) bezpośrednio przed zabiegiem i 24 godziny po zabiegu. Kaniulowane macierze wszczepiono obustronnie do grzbietowego rdzenia NAc (1.4 mm z przodu i 1.5 mm z boku od bregma oraz 6.5 mm brzusznie od czaszki). Elektrody i mikronapędy przymocowano do czaszki za pomocą śrub kostnych i akrylu dentystycznego, a do kaniuli prowadzących wprowadzono obturatory druciane, tak aby końce obturatorów były na równi z końcami kaniuli prowadzących. Po zabiegu skórę głowy potraktowano preparatem Neo-Predef w celu zapobiegania infekcji, a zwierzętom pozwolono na 1 tydzień rekonwalescencji przed kontynuowaniem eksperymentów. W celu znieczulenia pooperacyjnego zwierzętom podawano 10 mg/kg niesteroidowego leku przeciwzapalnego ketoprofenu.

Leki.

SCH23390 i raclopridde zostały zakupione od Sigma. W dniach testowych leki przygotowywano na świeżo przez rozpuszczenie ich w sterylnym roztworze soli fizjologicznej 0.9%. Leki podawano w dawkach 1.1 μg SCH233390 w soli fizjologicznej 0.55 μl na stronę i 6.4 μg raclopridu w soli fizjologicznej 0.8 μl na stronę. SCH233390 i raclopridde podawano we wlewie odpowiednio przez 12 i 17.5 min. W eksperymentach pilotażowych odkryliśmy, że obustronne wlewy raclopriddu trwające 12 min miały znaczący, ale przejściowy wpływ na stosunek odpowiedzi DS. Zatem, aby przedłużyć efekt, zwiększyliśmy czas trwania infuzji raclopridu tak, że profil czasowy jego działania farmakologicznego był podobny do profilu SCH23390. Tylko jedna dwustronna lub jednostronna iniekcja została wykonana na sesję nagraniową (jedna sesja dziennie). Wszystkie zwierzęta otrzymały co najmniej jeden obustronny zastrzyk jednego antagonisty i jedno (lub kilka) jednostronne zastrzyki antagonisty. Podczas niektórych jednostronnych eksperymentów antagonistycznych równocześnie podawaliśmy sól fizjologiczną jako kontrolę pojazdu przeciwległą do półkuli, która otrzymała antagonistę.

Procedura mikrowstrzykiwania i nagrywania.

Urządzenie do jednoczesnego mikrowstrzykiwania i rejestracji zostało opisane wcześniej ( du Hoffmann i in., 2011 ). Kabel rejestrujący, wychodzący ze stopnia głowicy, kończył się w 24-kanałowym komutatorze elektrycznym z centralnym otworem (Moog), który przekazywał sygnały do ​​systemu rejestracji elektrofizjologicznej. Dwie strzykawki zamontowano w pojedynczej pompie strzykawkowej znajdującej się na zewnątrz komory; przewody z płynem ze strzykawek prowadziły do ​​dwukanałowego obrotowego układu płynów (Instech Laboratories) zamontowanego nad komutatorem. Przewody z płynem schodziły z obrotowego układu przez otwór w komutatorze, biegły wzdłuż kabla rejestrującego i kończyły się na dwóch mikrowstrzykiwaczach o średnicy 33 mm.

Przed sesją rejestracji, mikrowstrzykiwacze zostały napełnione roztworem leku, a następnie wprowadzone do kaniuli prowadzących zwierzęcia. Końcówki mikrowstrzykiwaczy wystawały 0.5 mm poza kaniule prowadzące, tak aby końcówka mikrowstrzykiwacza znajdowała się poniżej końcówek elektrod i około 670 μm od środka każdej elektrody. Przed napełnieniem lekiem, przewody z płynem i mikrowstrzykiwacze wypełniono olejem mineralnym, a poziom granicy faz olej-woda oznaczono, aby ułatwić post hoc potwierdzenie, że lek został wstrzyknięty. Na koniec, platforma głowy została podłączona do zwierzęcia, a przewody z płynem zostały mocno przymocowane do kabla rejestrującego, aby utrzymać mikrowstrzykiwacze na miejscu przez cały czas trwania eksperymentu. Zwierzętom przygotowanym w ten sposób pozwolono wykonywać zadanie DS przez okres bazowy wynoszący co najmniej 45 minut, podczas którego rejestrowano aktywność neuronalną; następnie zdalnie włączano pompę strzykawkową w celu wlewu leku do mózgu. Wstrzyknięcie nie wymagało dotykania zwierzęcia ani otwierania drzwi komory, a sesja behawioralna trwała nieprzerwanie przez cały okres początkowy, wlewu i po wlewie.

Sygnały napięcia neuronowego rejestrowano za pomocą wzmacniacza czołowego (wzmocnienie jedności), wzmacniano czasy 10,000 i digitalizowano przy użyciu komercyjnego sprzętu i oprogramowania (Plexon). Nagrywaliśmy z neuronów 379 w sesjach nagrywania / wstrzykiwania 38 u szczurów 15. Spośród sesji 38 7 odrzucono z powodu złego zachowania podczas okresu wyjściowego wstrzykiwania wstępnego lub z powodu braku możliwości niezawodnego wyizolowania neuronów. Tak więc nasza analiza neuronowa koncentrowała się na sesjach rejestrowania / wstrzykiwania 31, w których rejestrowaliśmy dobrze wyizolowane neurony 322 u szczurów 12. Po każdej sesji nagrywania / wstrzykiwania mikrodysk przenoszący układy elektrod był zaawansowany ∼150 μm (pół obrotu śruby mikrodysku), aby przesuwać elektrody brzusznie, aby rejestrować z nowej populacji neuronów. Jeśli zaobserwowano kilka (lub nie) neuronów, macierz była przesuwana co drugi dzień, aż do wykrycia neuronów.

Analiza.

Dane podzielono na okresy przediniekcyjne, poiniekcyjne i rekonwalescencji, które zdefiniowano odpowiednio jako 45 minut przed infuzją antagonistów, 40 minut od zakończenia iniekcji oraz ostatnie 33 minuty (2000 s) każdej sesji (która trwała łącznie 2–3 godziny). Okres poiniekcyjny odpowiada czasowi, w którym leki wywierają największy wpływ na zachowanie po podaniu obustronnym ( ryc. 1C ).

 

Rysunek 1.

Wpływ antagonistów receptora dopaminy na zachowanie podejścia DS-cued. A, Schemat zadania DS. B, Mediana (kropka) i środkowe kwartyle (linie pionowe) DS (pomarańczowy) i NS (niebieski) współczynniki odpowiedzi w okresie wstępnego wstrzyknięcia dla wszystkich sesji behawioralnych ...

Izolację pojedynczych jednostek przeprowadzono w trybie off-line za pomocą Offline Sorter (Plexon), stosując analizę głównych składników. W kolejnych analizach uwzględniono tylko jednostki o dobrze zdefiniowanych przebiegach (> 100 μV), które wyraźnie różniły się od poziomu hałasu (<20–50 μV). Aby upewnić się, że pojedyncze jednostki są dobrze odizolowane od siebie i od szumu tła, zastosowano rozkłady interwałów międzypodpikowych i korelogramy krzyżowe (oprogramowanie Neural Explorer; Nex-Tech). Znaczniki czasu zweryfikowanych wartości szczytowych analizowano za pomocą niestandardowych procedur w środowisku oprogramowania R. Histogramy czasu perystymulacyjnego zbudowane wokół DS i NS, w przedziałach czasowych 50 ms, zostały użyte do oceny ilościowej i wykrycia wzbudzeń wywołanych cue w Ryciny 2A, , 3,3, , 4,4, , 55A, , 66A, , 77A, , 88A, I 1010A-C. Aby ustalić, czy neuron wykazywał znaczące wzbudzenie wywołane przez DS, obliczono funkcję rozkładu prawdopodobieństwa Poissona dla okresu linii bazowej 10 przed każdą kolejką. Neuron uznano za wzbudzony przez DS, jeśli wykazywał średnie zliczenia szczytowe powyżej górnego przedziału ufności 99% rozkładu linii strzelania w jednym lub większej liczbie przedziałów 50 ms między 50 i 200 ms po początku cue. W przypadku neuronów ze znacznymi wzbudzeniami wzbudzanymi przez DS w okresie linii bazowej wstrzykiwania wstępnego, średnia szybkość wypalania w czasie przedziałów 50 ms zablokowana dla DS i początku NS została uzyskana dla każdego okresu w każdej sesji, a średnia i mediana (Ryc. 2C – E, , 55A, , 66A, , 77A, , 88A, , 1010B,C) porównano szybkości wystrzeliwania neuronów. Ponieważ neurony z statystycznie wykrywalnym wzbudzeniem NS były prawie zawsze wzbudzane przez DS [nie pokazane, ale wcześniej zgłaszane (Ambroggi i wsp., 2011)], przeanalizowaliśmy odpowiedzi NS dla wszystkich neuronów ze znaczącą odpowiedzią DS. O ile nie wskazano inaczej, wszystkie porównania statystyczne wykorzystywały testy sumy rang Wilcoxona wewnątrz neuronu.

 

Rysunek 2.

Wzbudzone przez DS wzbudzenia przewidują późniejsze zachowanie poszukujące nagrody i kodują bliskość dźwigni. A, Średnie histogramy czasu przed iniekcją peri-event wyrównane do początku DS (ślad pomarańczowy) lub NS (ślad niebieski) dla neuronów 145 ze znaczącym pobudzeniem ...

 

Rysunek 3.

Przykładowe neurony pokazują, że antagoniści D1 i D2 zmniejszają wzbudzenie wywołane przez DS. Rastry i odpowiadające im histogramy pokazują wystrzelenie czterech różnych neuronów wzbudzonych DS wyrównanych do początku DS. Dane pochodzą z ostatnich prób 40 bezpośrednio poprzedzających start ...

 

Rysunek 4.

Skutki obustronnego wstrzyknięcia antagonisty dopaminy na wzbudzone przez cue wzbudzenie przewidują efekty behawioralne na zasadzie próba-próba. A, C, Analiza próba po próbie neuronalnego kodowania opóźnienia szczura w dotarciu do dźwigni dla tych samych neuronów pokazanych ...

 

Rysunek 5.

Aktywacja receptora D1 jest wymagana do wzbudzenia wywołanego przez DS. A, Histogramy czasu zdarzenia około wyrównane do początku DS dla neuronów ze znacznym wzbudzeniem wywołanym przez DS w okresie wstrzykiwania wstępnego. Ślady i chmury wskazują średnią prędkość wypalania ± SEM ...

 

Rysunek 6.

Aktywacja receptora D2 jest niezbędna do wzbudzenia wywołanego przez DS. A, Histogramy czasu zdarzenia około wyrównane do początku DS dla neuronów ze znacznym wzbudzeniem wywołanym przez DS w okresie przed wstrzyknięciem raclopridu. Pobudzenia wywołane przez DS zostały zredukowane przez obustronne ...

 

Rysunek 7.

Aktywacja receptora D1 nie jest wymagana do wzbudzania wywołanego przez NS. A, Histogramy czasu zdarzenia około wyrównane do NS dla neuronów ze znacznym wzbudzeniem wywołanym przez DS w okresie wstrzykiwania wstępnego. Te populacje całkowicie pokrywają się, a więc te same neurony ...

 

Rysunek 8.

Aktywacja receptora D2 jest niezbędna do wzbudzenia wywołanego przez NS. A, Histogramy czasu zdarzenia około wyrównane do NS dla neuronów ze znacznym wzbudzeniem wywołanym przez DS w okresie wstrzykiwania wstępnego. Pobudzenie NS zmniejszyło się w warunkach obustronnych i ipsilateralnych ...

 

Rysunek 10.

Wlew soli fizjologicznej nie wpływa na pobudzenie wywołane przez DS lub NS i ani aktywacja receptora D1, ani D2 nie jest wymagana do utrzymania częstości wypalania linii podstawowej. A, Pojedynczy wzbudzony DS neuron zarejestrowany podczas infuzji soli fizjologicznej. Konwencje są identyczne z tymi ...

W przypadku Rysunku 4 ustaliliśmy, czy wpływ obustronnego wstrzyknięcia antagonisty na opóźnienie dotarcia do dźwigni był skorelowany z wpływem antagonistów na wielkość pobudzenia wywołanego DS w kolejnych próbach. Najpierw obliczyliśmy średnią częstość wyładowań od 100 do 400 ms po wystąpieniu DS w każdej próbie dla wszystkich zarejestrowanych neuronów, które wykazywały istotne pobudzenie DS przed obustronną infuzją antagonistów. Następnie dla każdego neuronu obliczyliśmy współczynnik korelacji rang Spearmana, porównując wielkość pobudzenia wywołanego DS w kolejnych próbach i opóźnienie dotarcia szczura do dźwigni w odpowiadających im próbach. Korelacje te przedstawiono na histogramach na Rysunku 4 B , D. W tej analizie uwzględniono wszystkie próby DS; jeśli zwierzę nie nacisnęło dźwigni, do tej próby przypisywano opóźnienie 10 s (maksymalny czas prezentacji wskazówki). Obliczyliśmy te współczynniki korelacji dla okresu przed wstrzyknięciem, jak zdefiniowano powyżej; Wydłużyliśmy okres po iniekcji o 1000 s, aby uzyskać szerszy zakres latencji w próbach, w których zwierzęta reagowały po obustronnej infuzji. ​​Aby ocenić istotność poszczególnych korelacji, zastosowaliśmy dwustronne asymptotyczne przybliżenie t, ponieważ nie można obliczyć dokładnej wartości p , gdy w danych rangowych występują powiązania. Następnie, za pomocą sparowanych testów Wilcoxona, porównaliśmy mediany rozkładów współczynników korelacji przed i po infuzji antagonisty.

Ponieważ neurony NAc charakteryzują się niską bazową częstością wyładowań, a dolne granice przedziału ufności bardzo często sięgają zera, wykrycie i określenie ilościowe zahamowań jest znacznie trudniejsze niż pobudzeń. Dlatego oprócz procedury opisanej powyżej, która została użyta do wykrycia pobudzenia, zastosowaliśmy również analizę charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC), bardziej czułą metodę, aby określić prawdopodobieństwo, że częstość wyładowań w kolejnych przedziałach czasowych 50 ms po rozpoczęciu sygnału była różna od częstości wyładowań w 10-sekundowej linii bazowej sygnału wstępnego. Analizę tę przeprowadzono oddzielnie dla okresów przed iniekcją i po iniekcji. Dla każdego przedziału obliczyliśmy pole pod krzywą ROC (AUC); wartości AUC równe 0.5 oznaczają brak różnicy w stosunku do sygnału wstępnego, natomiast wartości bliższe 0 lub 1 oznaczają większe prawdopodobieństwo, że neuron jest odpowiednio zahamowany lub pobudzony. Aby w obiektywny sposób przedstawić aktywność neuronalną po sygnale w całej populacji zarejestrowanych neuronów, obliczono częstość wyładowań i wartości AUC dla przedziałów 50 ms; w celu wygładzenia danych przedziały były przesuwane o 10 ms dla kolejnych obliczeń AUC. Wygładzone wartości AUC zostały następnie przedstawione w postaci map cieplnych o rozdzielczości 10 ms (gdzie każda wartość reprezentuje AUC w kolejnych 50 ms) na rysunkach 5 B , 66 B , 77 B , 88 B i 1010 D , E.

Następnie określiliśmy ilościowo, czy wartości AUC, obliczone w nienakładających się przedziałach 50 ms, odzwierciedlały istotną różnicę w wyładowaniach. Dla każdego przedziału najpierw wygenerowaliśmy 10 000 bootstrappingowych wartości AUC z losowych przetasowań częstotliwości wyładowań linii bazowej precue i częstotliwości wyładowań w odpowiednim przedziale postcue. Następnie określiliśmy dwustronne prawdopodobieństwo, że rzeczywista wartość AUC została pobrana z rozkładu bootstrappingowych wartości; jeśli prawdopodobieństwo było <0.05, uważaliśmy wyładowania w przedziale za istotnie różne od punktu wyjściowego precue. Na koniec policzyliśmy liczbę neuronów z częstotliwościami wyładowań w każdym przedziale, które były istotnie większe lub mniejsze od wyładowań linii bazowej precue i przedstawiliśmy te wartości jako ułamki całkowitej populacji ( rys. 5 C , 66 C , 77 C , 88 C , 99 B , D , 1010 F , G ).

 

Rysunek 9.

Na aktywność neuronalną dopasowaną do wejścia do naczynia nagrody nie wpływa wstrzyknięcie antagonisty D1 lub D2 po stronie ipsilateralnej lub przeciwnej. A, C, Wartości AUC ROC są obliczane i wyświetlane zgodnie z opisem w Rysunek 5B, z wyjątkiem przedziałów czasu, które są dłuższe (200 ms) i wyrównane ...

Aby porównać proporcje neuronów pobudzonych lub zahamowanych w okresie przed i po iniekcji zastosowaliśmy podejście redukcji danych. Najpierw obliczyliśmy ułamek przedziałów 50 ms pomiędzy 0 i 1 s po rozpoczęciu sygnału, w których każdy neuron wykazywał istotne pobudzenie lub zahamowanie. Następnie porównaliśmy te ułamki w okresie przed i po iniekcji za pomocą sparowanego testu Wilcoxona. Neurony, które nie wykazywały istotnej modulacji w żadnym przedziale zarówno w okresie przed i po iniekcji, jak i po iniekcji, zostały wyłączone z tej analizy i nie zostały uwzględnione na wykresach przedstawiających medianę ułamka istotnych przedziałów (wykresy kropkowe i wąsowe po prawej stronie każdej części na rys. 5 C , 66 C , 77 C , 88 C , 1010 F , G ). Ta procedura wyeliminowała wpływ dużej populacji neuronów bez różnicy w aktywności pomiędzy oknem po DS a linią bazową przed DS; populacja ta jest mało interesująca, jednak wnosi dużą liczbę wartości zerowych, które przesuwają medianę liczby istotnych przedziałów w stronę 0 i zaciemniają zarówno spadki, jak i wzrosty ułamka istotnych przedziałów po infuzji.

Podobne analizy przeprowadzono dla wyładowań związanych z konsumpcją, występujących po wejściu do pojemnika z nagrodą. Zwierzęta miały tendencję do pozostawania w pojemniku przez >5 s; dlatego, aby uchwycić te stosunkowo długie interwały czasowe, przedstawiamy wyniki z wykorzystaniem przedziałów 200 ms ( ryc. 9 ). Okno czasowe do porównania proporcji neuronów pobudzonych przed i po iniekcji wynosiło od 0 do 1.5 s, natomiast dla zahamowań od 0 do 5 s; krótsze okno analizy zastosowano dla pobudzeń, ponieważ miały one tendencję do bycia bardziej przejściowymi. Analizy ROC przeprowadzono na klastrze obliczeniowym o wysokiej wydajności Albert Einstein College of Medicine, korzystając z pakietu pROC dla R.

Aby porównać „podstawowe” częstości wyładowań występujące poza zdarzeniami zadania, porównaliśmy średnią częstość wyładowań w przedziałach 10 s przed każdym DS przed i po wstrzyknięciu antagonistów. Ta procedura jest funkcjonalnie równoważna losowemu pobieraniu próbek podstawowych częstości wyładowań, ponieważ DS są prezentowane z niemal równym prawdopodobieństwem w dowolnym momencie sesji behawioralnej. Neurony klasyfikowano jako wykazujące istotne wzbudzenie wywołane DS (przed wlewem leku) lub nie, a następnie podstawowe częstości wyładowań w okresach przed i po wstrzyknięciu porównywano w tych grupach za pomocą sparowanego testu Wilcoxona ( Ryc. 10 H , I ). Wykonaliśmy również dopasowanie liniowe dla neuronów wzbudzonych DS i porównaliśmy nachylenie tej linii z linią jedności (nachylenie 1).

Jeśli przeprowadzono wiele porównań podzbiorów danych pochodzących z tego samego tematu (Ryc. 2C – E, , 55A,C, , 66A,C, , 77A,C, , 88A,C, , 99B,D, , 1010B,C,F,G), p wartości zostały skorygowane przez Bonferroniego; tj p wartość została pomnożona przez liczbę dokonanych porównań. Poprawione p wartości uznano za znaczące, jeśli p <0.05. Wszystkie poprawki zostały wykonane współczynnikiem 3 z wyjątkiem Rysunek 2C – E, w którym czynnikiem był 2.

Śledzenie wideo.

W podzbiorze eksperymentów położenie szczura mierzono za pomocą kamery umieszczonej nad głową (30 klatek/s) i komputerowego systemu śledzenia (Cineplex; Plexon). System śledził położenia x i y dwóch różnokolorowych diod LED przymocowanych do głowicy rejestrującej. Jak opisano wcześniej ( McGinty i in., 2013 ), obliczyliśmy centroid, który opisuje punkt środkowy między położeniami diod LED dla każdej klatki wideo. Brakujące punkty danych do 10 kolejnych klatek uzupełniano za pomocą interpolacji liniowej; w rzadkich przypadkach, w których brakowało >10 klatek, dane odrzucano. Dla każdej klatki wideo obliczaliśmy odchylenie standardowe odległości między położeniem centroidu w tej klatce i w oknie czasowym ±200 ms. Te pomiary odchylenia standardowego stanowią wskaźnik lokomotoryczny (LI) dla tej klatki wideo. Przekształcone logarytmicznie wartości LI miały rozkład bimodalny, przy czym dolny pik odpowiadał okresom niewielkiego lub zerowego ruchu, a górny – lokomocji ( Drai i in., 2000 ). Następnie dopasowaliśmy dwie funkcje Gaussa do rozkładu wartości LI i określiliśmy próg ruchu jako punkt, w którym funkcje te najmniej się pokrywały.

Ruchy zdefiniowano jako co najmniej osiem kolejnych klatek z LI powyżej progu lokomotorycznego. Aby określić czas rozpoczęcia ruchu, ograniczyliśmy analizę do prób DS, w których zwierzę było nadal na początku sygnału, a następnie obliczyliśmy latencję między początkiem sygnału a pierwszą klatką, w której LI przekroczyło próg ruchu ( rys. 1 D–F , 22 B , D ). Jeśli w próbie nie zmierzono żadnego dostrzegalnego ruchu, latencję w tej próbie zdefiniowano jako >10 s (długość prezentacji sygnału, rys. 1 D ). Podobne wyniki uzyskano, gdy takie próby pominięto w analizie (dane nie pokazano). Rozkłady latencji ruchu na podstawie sygnałów DS zostały następnie połączone dla wszystkich szczurów, a mediany porównano testem Wilcoxona. Aby określić ilościowo latencję do maksymalnej prędkości i średniej prędkości ruchów kierowanych dźwignią na podstawie sygnałów DS, wykorzystaliśmy wszystkie próby, które zakończyły się naciśnięciem dźwigni, nawet jeśli szczur poruszał się na początku DS ( rys. 1 E , F ).

Histologia.

Zwierzęta znieczulono głęboko preparatem Euthasol i perfundowano dożylnie roztworem soli fizjologicznej z 4% formaliną. Przez każdą z elektrod w matrycach przepuszczano prąd stały (15 μA) przez około 30 sekund w celu wytworzenia zmian. Mózgi pobrano i przechowywano w formalinie do momentu ich przetworzenia. Przed pocięciem kriostatem mózgi poddano krioochronie poprzez zanurzenie w 30% sacharozie na kilka dni. Skrawki (50 μm) barwiono substancją Nissla w celu uwidocznienia śladów kaniuli i elektrod oraz zmian ( ryc. 11 ).

 

Rysunek 11.

Histologiczna rekonstrukcja miejsc wstrzyknięcia antagonisty. Figura przedstawia dwa przekroje wieńcowe mózgu szczura, które obejmują większość przedniego i tylnego zasięgu NAc (0.8 mm – 2.8 mm przedni od bregma). Czarne kropki oznaczają ...

Efekty

Przedstawiliśmy szczurom dwa bodźce słuchowe w różnych odstępach czasu, średnio co 30 sekund: DS przewidujący nagrodę i NS ( Rys. 1 A ; Nicola i in., 2004a , b ; Ambroggi i in., 2008 , 2011 ; McGinty i in., 2013 ). Naciśnięcie dźwigni podczas DS kończyło sygnał, a kropla sacharozy była dostarczana po wejściu do pojemnika z nagrodą; jeśli zwierzęta nie reagowały w ciągu 10 sekund, sygnał był przerywany bez dostarczania nagrody i rozpoczynała się przerwa między próbami. Reakcje w tym odstępie i podczas NS nie miały zaprogramowanych konsekwencji. NS zawsze trwały 10 sekund. Wyszkolonym zwierzętom, które reagowały na większość DS, ale niewiele NS ( Rys. 1 B ), wszczepiono kaniulowane matryce skierowane do rdzenia NAc. Podczas eksperymentów zwierzęta najpierw wykonywały zadanie przez 45 minut przed wstrzyknięciem, podczas których rejestrowano aktywność neuronalną NAc. Następnie do NAc podawano obustronnie lub jednostronnie antagonistę receptora D1 SCH23390 lub antagonistę receptora D2/3 rakloprid; zwierzęta pozostawały w komorze, mając wdrożone zasady wykonywania zadania przez cały czas trwania wlewu i przez co najmniej 75 minut po nim.

Zgodnie z poprzednimi badaniami ( Yun i in., 2004 ; Nicola, 2010 ), obustronne wlewy każdego z antagonistów do rdzenia NAc znacząco zmniejszyły odsetek DS, na które zwierzę reagowało ( Rys. 1 C , ciemnoszare ślady) i zwiększyły opóźnienie w rozpoczęciu lokomocji, mierzone za pomocą śledzenia wideo w podzbiorze sesji ( Rys. 1 D , szare przerywane ślady). Natomiast jednostronne wlewy tych samych dawek nie miały wpływu na współczynnik odpowiedzi DS ( Rys. 1 C , jasnoszare ślady), opóźnienie w rozpoczęciu ruchu po wystąpieniu DS ( Rys. 1 D , przerywane jasnopomarańczowe ślady) i opóźnienie w osiągnięciu dźwigni lub prędkości ruchu podczas zbliżania się do dźwigni ( Rys. 1 E , F ). Te dane behawioralne pokazują, że dopamina NAc w pojedynczej półkuli jest wystarczająca do utrzymania zachowania, mimo że blokada receptorów D1 lub D2/3 w obu półkulach poważnie upośledza reagowanie. To rozróżnienie oferuje istotną zaletę eksperymentalną, ponieważ pozwala nam testować wpływ antagonistów dopaminy na aktywność neuronalną, gdy zachowanie jest zaburzone (wstrzyknięcie obustronne) i gdy nie jest (wstrzyknięcie jednostronne), wykluczając w ten sposób potencjalne zakłócenie, że jakiekolwiek obserwowane zmiany w aktywności neuronalnej po wstrzyknięciu antagonisty są wtórne w stosunku do zmian w zachowaniu.

Rejestrowaliśmy 322 neurony NAc w 31 sesjach rejestrowania/wstrzyknięcia u 12 szczurów. Około 45% zarejestrowanych neuronów było znacząco pobudzonych przez prezentację DS. Pobudzenia te wykazywały właściwości podobne do tych zgłaszanych wcześniej ( Yun i in., 2004 ; Nicola i in., 2004a ; Ambroggi i in., 2011 ; McGinty i in., 2013 ; Morrison i Nicola, 2014 ): były większe niż te wywoływane przez NS ( Rys. 2A ) ; zaczynały się w krótkim czasie latencji po pojawieniu się sygnału (∼120 ms) i występowały przed rozpoczęciem ruchu kierowanego przez dźwignię ( Rys. 2B ) ; a ich wielkość była skorelowana z prawdopodobieństwem reakcji behawioralnej, czasem latencji inicjacji ruchu i bliskością dźwigni ( McGinty i in., 2013 ; Rys. 2C –E ).

Obustronna infuzja antagonisty D1or D2 / D3 spowodowała gwałtowne zmniejszenie wielkości wzbudzenia wywołanego przez DS. Jak pokazano na dwóch przykładowych neuronach (Rys. 3A,C), efekt ten był najbardziej wyraźny w minutach bezpośrednio po wlewie, co odpowiada maksymalnemu zmniejszeniu zachowań wywołanych przez cue wywołanych przez zastrzyki (Rys. 3A,C, niebieskie rastry i histogramy). Gdy efekt behawioralny powróci do normalnego stanu, odpowiedź na ostrzał również się poprawiła (Rys. 3A,C, czarne rastry i histogramy). Ten wzorzec wyników był spójny w neuronach wzbudzonych sygnalizacją (Ryc. 5A, , 66A, Dwustronne histogramy i wykresy wąsów). Na poparcie hipotezy, że te wzbudzenia wyznaczają siłę ruchu zbliżania się dźwigni, wielkość wzbudzenia wywołanego wskazówką w okresie przed wstrzyknięciem przewidywała opóźnienie zwierzęcia w dotarciu do dźwigni (Rys. 4A,C, lewo). Po obustronnym wstrzyknięciu antagonisty D1 lub D2 te opóźnienia zostały znacznie przesunięte do wyższych wartości, często tak wysokich, że nie było żadnej odpowiedzi w prezentacji cue 10 (Rys. 4A,C, lewy i prawy rozkład opóźnień). Uderzające jest to, że mimo że wypalanie przywoływane było zmniejszane przez antagonistów, nadal przewidywało ono siłę reakcji behawioralnej podczas okresów po wstrzyknięciu i regeneracji (Rys. 4A,C, właściwe wykresy rastrowe). Ta obserwacja wskazuje, że działanie behawioralne i neuronalne leku było skorelowane na zasadzie próbnej: im większe zmniejszenie wypalania spowodowane przez antagonistę dopaminy, tym większe opóźnienie dotarcia do dźwigni i mniejsze prawdopodobieństwo, że zwierzę w ogóle dotarło do dźwigni.

Aby ocenić spójność tej korelacji próba po próbie, obliczyliśmy dla każdego neuronu pobudzonego przez wskazówkę korelację rang Spearmana między wielkością pobudzenia a opóźnieniem naciśnięcia dźwigni. Przypisaliśmy opóźnienie 10 s do prób, w których nie było reakcji; opóźnienie w tych próbach było zatem związane z najwyższą rangą. (Podobne wyniki uzyskano, jeśli próby bez reakcji dźwigni z sygnałem DS zostały pominięte w analizie; dane nie pokazano). Kiedy porównaliśmy współczynniki korelacji w okresie przed iniekcją z tymi w połączonym okresie po iniekcji/rekonwalescencji, odkryliśmy, że prawie wszystkie współczynniki były ujemne w obu okresach. Co więcej, antagoniści albo nie mieli istotnego wpływu na współczynnik mediany, albo przesunęli rozkład w kierunku jeszcze bardziej ujemnych wartości ( Rys. 4 B , D ). Zatem nie tylko populacja neuronów pobudzonych sygnałem wiarygodnie przewiduje opóźnienie reakcji behawioralnej, ale wzrost opóźnienia reakcji spowodowany przez antagonistę w danej próbie jest solidnie przewidywany na podstawie wpływu antagonisty na pobudzenie wywołane sygnałem w tej próbie. Wyniki te dostarczają mocnych dowodów na przyczynową rolę endogennej dopaminy w nadawaniu intensywności reakcji poszukiwania nagrody na sygnał: dopamina zwiększa pobudzenie neuronów NAc wywołane sygnałem, co z kolei powoduje krótkie opóźnienie w działaniu dźwigni.

Alternatywną interpretacją tych wyników jest to, że zmniejszone pobudzenie wywołane wskazówką jest konsekwencją zmniejszonej reakcji behawioralnej — być może dlatego, że pobudzenie jedynie śledzi (lub antycypuje) reakcję behawioralną, ale nie jest dla niej przyczyną. Gdyby tak było, to zastosowanie antagonistów w taki sposób, że nie wpływają na zachowanie, nie powinno skutkować zmniejszonym pobudzeniem wywołanym wskazówką. Jednakże, jak wykazano w dwóch przykładowych neuronach ( Rys. 3 B , D ), jednostronne wstrzyknięcie antagonisty D1 lub D2/D3 wyraźnie zmniejszyło wielkość pobudzenia wywołanego wskazówką, nawet jeśli jednostronne wstrzyknięcia nie zmieniły wydajności behawioralnej. Podobne wyniki uzyskano po uśrednieniu pobudzeń wywołanych wskazówką zarejestrowanych w wstrzykniętym NAc ( Rys. 5 A , 66 A , histogramy ipsilateralne); Ponadto, średnie dane pokazują, że wzbudzenia wywołane sygnałem w neuronach zarejestrowanych w NAc po stronie przeciwległej do wstrzyknięcia nie zostały naruszone ( Ryc. 5 A , 66 A , Histogramy kontralateralne). Aby wykluczyć możliwość, że redukcja wzbudzenia wywołanego sygnałem po tej samej stronie wstrzyknięć była spowodowana niewielkimi różnicami w prawdopodobieństwie reakcji behawioralnej, powtórzyliśmy analizę po wykluczeniu wszystkich prób, w których zwierzę nie zareagowało naciśnięciem dźwigni; uzyskano podobne wyniki (dane niepokazane; p < 0.05 dla antagonistów D1 i D2, Wilcoxon). Wyniki te wskazują, że wywołana przez antagonistę redukcja wzbudzenia wywołanego sygnałem prawdopodobnie nie jest konsekwencją upośledzenia funkcji behawioralnych.

Chociaż czasowe właściwości wzbudzonego sygnału były dość podobne w neuronach, zahamowania po wystąpieniu sygnału były bardziej zróżnicowane, zazwyczaj wykazywały późniejszy początek i mniej stereotypowe przebiegi czasowe niż pobudzenia (Ryc. 5B, , 66B). Analizy zahamowań (i, do pewnego stopnia, podniecenia), które skupiają się na jednym oknie czasowym, mogą zatem tracić znaczną część sygnału. Co więcej, standardowe metody wykrywania statystycznego nie mogą konsekwentnie identyfikować spadków od bardzo niskich podstawowych częstotliwości wypalania, w tym wielu neuronów NAc. Aby ominąć te problemy, przyjęliśmy bardziej inkluzywne podejście, w którym określiliśmy ilościowo, dla 50 ms przedziałów czasu postingu w każdym zapisanym neuronie, AUC ROC reprezentujące różnicę między wystrzeleniem w bin a linią bazową prekursora. Mapy cieplne wartości AUC w przedziałach czasowych dostosowane do początku DS (Ryc. 5B, , 66B) wykazują, że zmniejszenie pobudzenia wywołanego przez DS po obustronnych i ipsilateralnych (ale nie kontralateralnych) zastrzykach antagonistów D1 i D2 było wyraźne w prawie każdym wzbudzonym przez cue neuronie i występowało przez cały czas wzbudzenia. W przeciwieństwie do tego, hamowanie po wystąpieniu DS nie uległo zmniejszeniu. Aby określić ilościowo te efekty, określiliśmy, czy każda wartość AUC wskazywała na istotną różnicę w stosunku do linii bazowej, obliczając wartość początkową p reprezentującą prawdopodobieństwo, że AUC próbkowano z rozkładu AUC generowanych z losowo przetasowanych poziomów wypalania linii bazowej i kosza ratunkowego (patrz Materiały i Metody). Jak pokazują wykresy proporcji neuronów wykazujących znaczące (p <0.05) wzbudzenie lub zahamowanie w każdym przedziale dostosowane do początku DS (Ryc. 5C, , 66C, pozostawione wykresy w każdej kolumnie), ułamek pobudzeń, ale nie zahamowań, zmniejszył się przez obustronne i ipsilateralne zastrzyki antagonistów. Ta interpretacja została potwierdzona statystycznie przez porównanie proporcji znacząco podekscytowanych i zahamowanych pojemników w całym oknie 1 po DS (Ryc. 5C, , 66C, wykresy punktowe). Zatem pobudzenia po rozpoczęciu DS były zmniejszone przez wstrzyknięcie antagonisty D1 i D2, ale nie było zahamowań.

Rzeczywiście, liczba neuronów wykazujących istotne hamowanie wzrosła po niektórych rodzajach iniekcji ( rys. 5 B , C , 66 B , C ). Te pojawiające się zahamowania prawdopodobnie nie przyczyniły się do efektów behawioralnych obustronnych infuzji antagonistów, ponieważ nie były spójne (np. występowały po obustronnym i kontralateralnym, ale nie ipsilateralnym wstrzyknięciu antagonisty D1 i po ipsilateralnym, ale nie obustronnym wstrzyknięciu antagonisty D2) i dlatego nie wyjaśniają one efektów behawioralnych antagonistów. Co więcej, te późne zahamowania były najbardziej widoczne ~600 ms po rozpoczęciu DS, w czasie, w którym w warunkach kontrolnych ~50% zachowań podejścia zorientowanych na cel zostało już zainicjowanych ( rys. 2 B ). W związku z tym jest mało prawdopodobne, aby pojawiające się zahamowania przyczyniły się do wywołanego przez antagonistę wzrostu opóźnienia inicjacji podejścia lub zmniejszenia prawdopodobieństwa odpowiedzi. Co ciekawe, zdecydowana większość zahamowań pojawiała się w neuronach pobudzonych przez DS, zwykle pod koniec pobudzenia (dwustronny antagonista D1: 14/17 neuronów, 82%; jednostronny antagonista D2: 11/16 neuronów, 69%; rys. 5 B , C , 66 B , C ), co jest zgodne z możliwością, że zostały one zdemaskowane przez wywołaną przez antagonistę redukcję odpowiedzi pobudzającej i wspiera hipotezę, że aktywacja neuronów pobudzonych przez DS jest przyczyną rozpoczęcia zachowania zbliżania się.

Prezentacje NS, które rzadko wywoływały reakcje za pomocą dźwigni (Rys. 1B), wywołał małe, ale stałe pobudzenie w tych samych neuronach, które były wzbudzane przez DS (Rys. 2A). Zaskakująco, wzbudzone przez NS wzbudzenia nie były zmniejszone przez antagonistę D1, ani pod względem wielkości (Rys. 7A) lub w liczbie wzbudzonych neuronów (Rys. 7B,C). W przeciwieństwie do tego, wstrzyknięcie antagonisty D2 zmniejszyło zarówno wielkość, jak i liczbę wzbudzonych przez NS pobudzeń (Rys. 8). Hamowanie wywołane przez NS nie było zmniejszone przez żadnego antagonistę (Ryc. 7B,C, , 88B,C). Dlatego w tych warunkach aktywacja receptora D1 jest wymagana dla neuronów NAc w celu wywołania wzbudzeń o dużej wielkości w odpowiedzi na istotne bodźce predykcyjne nagrody, podczas gdy aktywacja receptora D2 jest wymagana dla odpowiedzi zarówno na bodźce przewidujące nagrodę, jak i bodźce obojętne.

Rozważaliśmy możliwość, że zmniejszone zachowanie poszukiwania nagrody po obustronnych infuzjach mogło być spowodowane przerwaniem procesu neuronalnego związanego ze wzmocnieniem lub hedonistycznym przetwarzaniem nagrody. Takie procesy mogą obejmować subpopulacje neuronów NAc, które są hamowane lub pobudzane podczas spożywania sacharozy ( Nicola i in., 2004b ; Roitman i in., 2005 ; Taha i Fields, 2005 ). Ponieważ zwierzęta nadal zdobywały nagrodę po jednostronnej infuzji antagonisty, byliśmy w stanie określić, czy aktywność neuronalna związana ze spożyciem nagrody była zależna od aktywacji receptora dopaminy. Zbadaliśmy wyładowania w ciągu 5 sekund po wejściu zwierzęcia do pojemnika na nagrodę, czyli w okresie, w którym zazwyczaj występuje spożycie nagrody ( Nicola, 2010 ). Korzystając z analizy ROC, porównaliśmy wyładowania w przedziałach 200 ms w tym oknie do 10-sekundowej linii bazowej sygnału ostrzegawczego; Mapy cieplne otrzymanych wartości AUC wykazują niewielki wpływ wstrzyknięcia antagonisty, zarówno po tej samej, jak i po przeciwnej stronie wstrzyknięcia ( ryc. 9A , C ) . Antagoniści nie wpłynęli na proporcje pobudzonych i zahamowanych neuronów ( ryc. 9B , D ), co silnie sugeruje, że pobudzenia i zahamowania związane ze spożyciem nie zależą od dopaminy. Podobne wyniki uzyskano, przeprowadzając tę ​​samą analizę z wykorzystaniem przedziałów 50 ms (dane nieprzedstawione).

Aby wykluczyć możliwość, że obserwowane wyniki były spowodowane jakimś czynnikiem innym niż antagonista (np. zaburzenie fizyczne spowodowane wstrzyknięciem lub jakimś składnikiem nośnika leku), w niektórych eksperymentach wstrzykiwaliśmy roztwór soli fizjologicznej. Jak pokazano na przykładzie neuronu ( rys. 10A ) i na podstawie średniego pobudzenia neuronów wzbudzonych sygnałem ( rys. 10B ) , pobudzenia wywołane DS nie zostały zmienione przez wstrzyknięcie roztworu soli fizjologicznej; pobudzenia wywołane NS również nie zostały zmienione ( rys. 10C ) . Ponadto wstrzyknięcie roztworu soli fizjologicznej nie wpłynęło na proporcje neuronów wykazujących istotne pobudzenie i zahamowanie po rozpoczęciu DS lub NS ( rys. 10D–G ).

Na koniec zadaliśmy pytanie, czy aktywacja receptora dopaminy może sprzyjać zachowaniu pod wpływem bodźca, przyczyniając się do wyjściowej częstości aktywacji neuronów NAc. Wbrew tej hipotezie, nie stwierdzono istotnego wpływu antagonisty receptora D1 ani D2 na wyjściową częstość aktywacji neuronów NAc pobudzonych przez DS ani innych neuronów NAc ( ryc. 10H , I ).

Dyskusja

Odkrycia te sugerują mechanizm, dzięki któremu dopamina dopaminy sprzyja zachowaniu szukającemu nagrody wywołanemu przez bodźce środowiskowe: aktywacja receptora dopaminy ułatwia wzbudzane przez cue pobudzenia, które z kolei promują inicjację podejścia do obiektów związanych z nagrodami. Wniosek ten jest silnie poparty obserwacją, że obustronne wstrzyknięcie antagonisty dopaminy zwiększyło opóźnienie rozpoczęcia ruchu (Rys. 1D) i zmniejszył wielkość wzbudzonych przez cue ekscytacji (Ryc. 33​-6). Zmniejszone wzbudzenie wywołane cue nie mogło być konsekwencją upośledzonego zachowania, ponieważ jednostronne zastrzyki nie zmieniły zachowania DS-cued (Rys. 1C – F), ale znacznie zmniejszone wzbudzenie wywołane przez DS w wstrzykniętej tkance (Ryc. 3B,D, , 5,5, , 6) .6). Te pobudzenia były dominującą odpowiedzią neuronową w NAc (występującą w 45% zarejestrowanych neuronów) i obie poprzedzały początek ruchu (Rys. 2B) i przewidywane opóźnienie inicjacji ruchu z większym wyzwalaniem prób z krótszym opóźnieniem (Rys. 2D) (McGinty i wsp., 2013; Morrison i Nicola, 2014). Dlatego wzbudzanie przywoławcze jest zarówno zależne od dopaminy, jak i konieczne do energicznego poszukiwania nagrody.

Nasze wyniki pokazują, że pobudzenie wywołane wskazówką, a nie żadna inna forma aktywności neuronalnej w NAc, jest prawdopodobnie krytycznym sygnałem w obwodzie neuronalnym, który ustala opóźnienie ruchów ukierunkowanych na cel. Wniosek ten wynika z obserwacji, że antagoniści zmniejszali pobudzenie wywołane wskazówką bez zmniejszania zahamowań wywołanych wskazówką, pobudzenia związanego z konsumpcją nagrody lub bazowej częstości pobudzenia. Co więcej, próby, w których obustronne wstrzyknięcia antagonistów były najskuteczniejsze w zmniejszaniu pobudzenia, to te, w których powodowały największe upośledzenie zachowania ( ryc. 4 ), co silnie przemawia przeciwko możliwości, że jakaś inna niewykryta zmiana w kodowaniu neuronalnym była odpowiedzialna za efekty behawioralne. Dlatego nasze dane ściśle wiążą aktywację receptora dopaminy w NAc, wielkość pobudzenia wywołanego wskazówką i opóźnienie zwierzęcia w rozpoczęciu poszukiwania nagrody.

Poprzednie prace wykazały, że inaktywacja VTA, która zmniejszyła pobudzenia i zahamowania wywołane sygnałem NAc, zapobiegła również wykazywaniu przez zwierzęta zachowań zbliżeniowych ( Yun i in., 2004 ). Jednak badanie to nie wykluczyło możliwości, że zmiany te były pośrednim efektem obwodu. W niniejszym badaniu wykazujemy, że lokalne receptory dopaminy dla rejestrowanych neuronów są niezbędne do pobudzenia wywołanego sygnałem, eliminując możliwość, że efekty antagonistyczne wynikają z działania dopaminy przed NAc. W przeciwieństwie do tego, nawet jeśli inaktywacja VTA zmniejszyła zahamowania wywołane sygnałem ( Yun i in., 2004 ), nie zmniejszyły ich lokalne wstrzyknięcia antagonisty dopaminy, a zatem jest mało prawdopodobne, aby te zahamowania były wynikiem bezpośredniego działania dopaminy w NAc.

Efekty działania antagonistów D1 i D2 na zachowanie wywołane przez DS i wyzwalanie wywołane przez DS były niezwykle podobne. Obserwacje te są zgodne z długą linią eksperymentów z mikroiniekcją NAc, w których antagoniści D1 i D2 wytwarzali niemal nieodróżnialne efekty behawioralne w dawkach podobnych do naszych (Hiroi i White, 1991; Ozer i in., 1997; Koch i in., 2000; Eiler i in., 2006; Pezze i in., 2007; Lex and Hauber, 2008; Liao, 2008; Nicola, 2010; Shin i in., 2010; Haghparast i in., 2012). Wyniki te, wraz z kontrastem między stężeniem antagonisty w iniekcji, które jest wymagane do zaobserwowania efektów (mm), a powinowactwem leków do ich celów (nm), stawiają pytanie, czy efekty leku są specyficzne. Chociaż skuteczne stężenie na receptorze jest prawdopodobnie znacznie niższe niż wstrzyknięte stężenie z powodu dyfuzji, metabolizmu i utleniania leków, łączna skuteczność i przebieg czasowy tych procesów nie są znane. Dlatego jedną z formalnych możliwości jest to, że zarówno behawioralne, jak i elektrofizjologiczne efekty SCH23390 i raclopopride są wynikiem obu leków wiążących jeden lub więcej receptorów, które w ogóle nie są związane z dopaminą. Kilka czynników przemawia przeciwko tej możliwości. Zachowanie przywołane przez cue jest blokowane nie tylko przez SCH23390 i raclopridde, ale także przez wstrzyknięcie do NAc szerokiego spektrum antagonisty receptora dopaminy, flupentiksolu (Di Ciano i wsp., 2001; Saunders i Robinson, 2012), poprzez dezaktywację VTA (Yun i wsp., 2004) i przez uszkodzenie NAc za pomocą 6-hydroksydopaminy (Parkinson i wsp., 2002), który selektywnie zabija włókna katecholaminergiczne. Ponadto, wstrzyknięcie NAc blokera wychwytu zwrotnego dopaminy, agonisty receptora D1 lub D2, lub amfetaminy uwalniającej dopaminę zwiększa prawdopodobieństwo podejrzanego podejścia (Wyvell i Berridge, 2000; Nicola i in., 2005; du Hoffmann i Nicola, 2013). Wreszcie, optogenetyczna autostymulacja neuronów dopaminowych VTA (zachowanie niewątpliwie utrzymywane przez aktywację neuronów dopaminowych) jest osłabiona przez wstrzyknięcie SCH23390-a lub raklopridu do NAc w dawkach podobnych do stosowanych tutaj (Steinberg i in., 2014). Trudno jest wyobrazić sobie prosty mechanizm, który mógłby wyjaśnić każdy z tych wyników bez stwierdzenia, że ​​podejście SCH23390 i blokada racloprydu blokują działanie endogennej dopaminy.

Alternatywną możliwością jest to, że antagoniści wiążą nie tylko swoje receptory docelowe, ale także pozacelowe receptory dopaminowe. W stężeniach 10 μm lub niższych rakloprid nie wiąże receptorów typu D1 ( Hall i in., 1986 ); wyższe stężenia nie zostały przebadane. Dlatego rakloprid może być specyficzny dla receptorów D2/D3 nawet przy stężeniach iniekcji mm stosowanych przez nas i innych, szczególnie po uwzględnieniu dyfuzji, metabolizmu i utleniania. Oszacowania stałej wiązania SCH23390 do receptorów typu D2 mieszczą się w zakresie od 1 do 5 μm ( Bourne, 2001 ; Mottola i in., 2002 ); chociaż wartości te sugerują, że SCH23390 wiąże receptory D2/D3 w stężeniach wstrzykiwanych, funkcjonalna skuteczność SCH23390 w blokowaniu aktywacji receptorów typu D2 przez dopaminę jest nieznana. Nasza obserwacja, że ​​rakloprid zmniejszał pobudzenie wywołane przez NS, podczas gdy SCH23390 nie potwierdza hipotezy, że leki te działały na różne receptory, ale nie dowodzi jednoznacznie ich swoistości. Niemniej jednak, nawet jeśli jeden lub oba leki blokowałyby oba typy receptorów, aby zmniejszyć pobudzenie wywołane przez DS, byłoby to całkowicie zgodne z naszym wnioskiem, że aktywacja co najmniej jednej formy receptora dopaminy jest niezbędna do pobudzenia wywołanego przez DS. Zatem, chociaż kwestia swoistości leku pozostaje bez odpowiedzi, pytanie to tylko nieznacznie osłabia nasz główny wniosek, że dopamina ułatwia podejście oparte na wskazówkach poprzez zwiększenie pobudzenia wywołanego przez wskazówkę.

Jeśli w rzeczywistości leki działały specyficznie, nasze odkrycia, że ​​antagoniści D1 i D2/D3 zmniejszali wyładowania wywołane bodźcem w większości neuronów pobudzonych bodźcem, sugerują, że aktywacja tych receptorów prowadzi synergistycznie do pobudzenia w tych samych neuronach. Podczas gdy receptory D1 i D2 znajdują się w dużej mierze wydzielonych populacjach neuronów w NAc ( Albin i in., 1989 ; Gerfen i in., 1990 ), znaczna część neuronów rdzenia i otoczki NAc, które ekspresjonują receptory D1, zawiera również mRNA dla receptorów D3 ( Le Moine i Bloch, 1996 ), które są blokowane przez antagonistów D2, w tym rakloprid. Współekspresja receptorów D1 i D3 zapewnia potencjalny mechanizm, za pomocą którego dopamina mogłaby promować pobudzenie w neuronach NAc poprzez efekt synergistyczny, który zostałby zablokowany przez antagonistów D1 lub D2/3 ( Schwartz i in., 1998 ). Alternatywnie (lub dodatkowo), interakcja między receptorami D1 i D2 (i/lub D3) może zachodzić na poziomie obwodu lokalnego ( Goto i Grace, 2005 ; Gerfen i Surmeier, 2011 ). Na przykład dopamina działa na receptory D1, zmniejszając uwalnianie GABA na neurony NAc ( Nico i Malenka, 1997 ; Hjelmstad, 2004 ), efekt, który może promować pobudzenie w połączeniu z aktywacją receptorów D2/D3 na neuronach kolczastych ( Hopf i in., 2003 ). Co godne uwagi, mechanizmy te zakładają, że dopamina nie pobudza neuronów NAc bezpośrednio, ale raczej zwiększa ich pobudliwość w odpowiedzi na bodźce glutaminergiczne; w ten sposób mogli wyjaśnić, dlaczego pobudzenia wywołane bodźcami są blokowane nie tylko przez antagonistów dopaminy, ale także przez inaktywację jądra migdałowatego bocznego i kory przedczołowej ( Ambroggi i in., 2008 ; Ishikawa i in., 2008 ), z których oba wysyłają projekcje glutaminergiczne do NAc ( Brog i in., 1993 ).

Podobieństwa i różnice między efektami SCH23390 i raklopridu mogą być wynikiem dwóch kontrastujących mechanizmów neuronalnych, obejmujących fazową i toniczną dopaminę. Ponieważ zarówno antagoniści D1, jak i D2/D3 zmniejszali pobudzenie wywołane DS, ale mniejsze pobudzenie wywołane NS występujące w tych samych neuronach było zmniejszane tylko przez antagonistę D2/D3 ( ryc. 8 , 9),9 ), wydaje się, że dopamina promuje kodowanie wartości bodźca poprzez aktywację receptorów D1, ale ułatwia reakcje wyzwalania na wszystkie wskazówki (niezależnie od tego, czy są one powiązane z wartościowym wynikiem) poprzez receptory D2/D3. Może to być spowodowane większymi fazowymi przejściowymi dopaminami wywoływanymi w NAc przez wskazówki przewidujące nagrodę niż neutralne ( Phillips i in., 2003 ; Roitman i in., 2004 ). Ponieważ receptory D2/3 mają większe powinowactwo do dopaminy niż receptory D1, niewielkie przejściowe stężenia dopaminy wywołane przez NS mogą wystarczyć do aktywacji wyłącznie receptorów D2/3, podczas gdy DS przewidujące nagrodę mogą podnieść stężenie dopaminy do poziomów wystarczająco wysokich, aby aktywować receptory D1 ( Grace, 1991 ).

Alternatywnie, wielkość pobudzenia wywołanego sygnałem mogłaby być regulowana przez dopaminę toniczną, a nie fazową. Toniczne poziomy dopaminy mogą odzwierciedlać koszt alternatywny bezczynności ( Niv i in., 2007 ), ustalając w ten sposób wigor działania operantu. Zatem, jeśli osiągnięte zostaną wystarczająco wysokie toniczne poziomy dopaminy, wystarczająca liczba receptorów dopaminy może zostać aktywowana, aby ułatwić pobudzenie wywołane sygnałem i zmniejszyć opóźnienie podejścia poszukującego nagrody. Podobny mechanizm może również leżeć u podstaw dobrze znanego wkładu dopaminy NAc w wykonywanie nieskierowanych zadań operantnych, które wymagają dużego wysiłku ( Salamone i Correa, 2012 ), w których zaburzenie dopaminy zwiększa opóźnienie podejścia do operantu ( Nicola, 2010 ). Ukryte zewnętrzne wskazówki (np. widok dźwigni) lub wewnętrzne wskazówki (np. wynikające z czasu lub głodu) mogą wywoływać podejście poprzez pobudzanie neuronów NAc w większym stopniu, gdy koszty alternatywne i poziomy dopaminy są wysokie.

Podsumowując, niezależnie od specyficznego mechanizmu farmakologicznego, nasze wyniki pokazują, że NA-dopamina promuje zachowanie związane z nagrodą przez podniesienie pobudzenia neuronów NAc do istotnych bodźców środowiskowych. Wielkość tego wzbudzenia określa opóźnienie podmiotu do zainicjowania odpowiedzi podejścia. Poprzez ten mechanizm dopamina reguluje zarówno wigor, jak i prawdopodobieństwo otrzymania nagrody.

Przypisy

Referencje