Jonathan P. Fadok, 1,2 Tavis MK Dickerson, 2 i Richard D. Palmiter2 *
J Neurosci. Rękopis autora; dostępny w PMC 2010 March 9.
Opublikowany w końcowym edytowanym formularzu jako:
J Neurosci. 2009 September 9; 29 (36): 11089 – 11097.
doi: 10.1523 / JNEUROSCI.1616-09.2009.
1 Graduate Program in Neurobiology and Behaviour, University of Washington, Seattle, WA 98195
2 Wydział Biochemii i Howard Hughes Medical Institute, University of Washington, Seattle, WA, 98195
* Korespondencję należy kierować na adres: Richard D. Palmiter, HHMI i Departament Biochemii, Box 357370, University of Washington, Seattle, WA 98195. E-mail: [email chroniony]
Ostateczna, zredagowana wersja tego artykułu wydawcy jest dostępna bezpłatnie na stronie J Neurosci
Zobacz inne artykuły w PMC, które cytują opublikowany artykuł.
Abstrakcyjny
Dopamina (DA) jest związana z wieloma zachowaniami, w tym z funkcją motoryczną, poznaniem i przetwarzaniem nagrody; jednak rola DA w przetwarzaniu strachu pozostaje niejednoznaczna. Aby zbadać rolę DA w uczeniu się związanym ze strachem, myszy z niedoborem dopaminy (DD) testowano w paradygmacie zaskoczenia wywołanym strachem. Syntezę DA można przywrócić u myszy DD przez podawanie 3, 4-dihydroksy-L-fenyloalaniny (L-Dopa), umożliwiając w ten sposób ocenę przetwarzania strachu w stanie zubożonym w DA lub -replete. U myszy DD nie było nasilonego przestraszenia strachu, ale można było je przywrócić przez podanie L-Dopa natychmiast po warunkowaniu strachowym. Selektywne pośredniczone przez wirusy przywrócenie syntezy DA w brzusznym obszarze nakrywkowym w pełni przywróciło uczenie się strachu u myszy DD i przywrócenie syntezy DA do neuronów DA wystających do podstawno-bocznego ciała migdałowatego przywróconego pamięci krótkotrwałej, ale nie pamięci długotrwałej ani uczulenia na wstrząsy. Wykazujemy również, że receptory DA D1 (D1R) i receptory podobne do D2 są niezbędne do zależnego od cue uczenia się strachu.
Odkrycia te wskazują, że DA działający na wiele podtypów receptorów w wielu regionach docelowych ułatwia stabilizację pamięci strachu.
Słowa kluczowe: dopamina, strach, przestraszony lękiem strach, ciało migdałowate, receptor dopaminy D1, receptor dopaminy D2
Wprowadzenie
Neuromodulator DA jest ważny dla uczenia się związanego z nagrodami i poszukiwania leku (Schultz, 2002; Wise, 2004), a gromadzące się dowody sugerują, że DA może być również ważna dla uczenia się związanego ze strachem (Lamont i Kokkinidis, 1998; Guarraci i in. ., 1999; Greba i Kokkinidis, 2000; Guarraci i wsp., 2000; Greba i in., 2001; Pezze i Feldon, 2004; de Oliveira i in., 2006). Neurony DA z brzusznego projektu śródmózgowia do obszarów mózgu limbicznego ważnych dla uczenia się strachu i poziomy DA w tych obszarach mózgu zwiększają się podczas zdarzeń awersyjnych (Abercrombie i in., 1989; Kalivas i Duffy, 1995; Doherty i Gratton, 1997; Inglis i Moghaddam , 1999). Ponadto niektóre neurony DA śródmózgowia zwiększają swoje szybkości wypalania do bodźców awersyjnych i sygnałów prognostycznych (Guarraci i Kapp, 1999; Horvitz, 2000; Joshua i in., 2008). Ponadto wykazano, że DA ułatwia długotrwałe wzmocnienie, kluczowy neuronalny korelator pamięci, w obszarach krytycznych dla uczenia się strachu, takich jak hipokamp i ciało migdałowate (Bissiere i in., 2003; Lemon i Manahan-Vaughan, 2006; Swant i Wagner, 2006).
Pomimo poczynionych postępów związanych z obawą przed fizjologią neuronów DA, dokładna rola DA i jej pokrewnych receptorów w uczeniu się związanym ze strachem pozostaje nierozwiązana. Wykazano, że wstrzyknięcia antagonistów podobnych do D1R lub do ciała migdałowatego blokują nabywanie lub wyrażanie uczenia się związanego ze strachem; jednakże inni wykazali, że leki te nie mają żadnego efektu (Guarraci i in., 1999; Greba i Kokkinidis, 2000; de Oliveira i in., 2006). Ponadto wykazano, że agoniści podobni do D1R wzmacniają lub nie mają wpływu na warunkowanie strachowe (Guarraci i in., 1999; Greba i wsp., 2000; Inoue i in., 2000; de Oliveira i in., 2006). Analogiczne rozbieżności stwierdzono w badaniach wykorzystujących agonistów lub antagonistów receptorów podobnych do D2R (Guarraci i in., 2000; Greba i in., 2001; Ponnusamy i wsp., 2005; de Oliveira i in., 2006). Te rozbieżności mogą wynikać z metodologii behawioralnej, zależnych od dawki efektów wstrzykiwanych leków lub różnic w wyborze środków farmakologicznych. Na przykład, antagoniści receptora DA różnią się znacznie pod względem swojej selektywności, zatem podczas gdy niektóre badania mogą być bardziej selektywnie antagonizujące receptory D2, inne mogą być szerzej antagonizujące receptory D2, D3 i D4 (Missale i wsp., 1998).
Aby wyjaśnić rolę DA w uczeniu się związanym ze strachem, wykorzystaliśmy myszy pozbawione DA (myszy DD), a także myszy pozbawione receptorów D1R lub DA D2 (D2R) i przetestowano je w paradygmacie zaskoczenia wywołanym strachem. Wzbudzone lękiem zaskoczenie jest paradygmatem warunkującym Pavlovian-strach, w którym neutralny bodziec wywołuje wzrost reakcji przestrachu akustycznego po parowaniu ze stopą (Koch, 1999). Wzbudzone lękiem zaskoczenie jest idealnym paradygmatem dla tych badań, ponieważ nie zależy od oceny zachowania zamrażania, które jest trudne do zmierzenia u hipoaktywnych myszy DD (Zhou i Palmiter, 1995). Ponieważ myszy DD mogą być badane zarówno w stanie zubożonym w DA, jak i nasyconym DA, stanowią idealną okazję do zbadania roli DA w uczeniu się i tworzeniu pamięci. Ponadto, stosując dostarczanie rekombinazy Cre za pośrednictwem wirusa, sygnalizację DA można selektywnie przywrócić do specyficznych regionów docelowych przez reaktywację allelu Th myszy DD (Hnasko i in., 2006). Selektywne przywrócenie DA do określonych obszarów docelowych pozwala na ocenę regionów mózgu regulowanych przez sygnalizację DA podczas warunkowania strachu.
Materiały i Metody
Zwierzęta i zabiegi
Myszy DD generowano jak opisano (Hnasko i in., 2006). W skrócie, myszy DD (Thfs / fs; DbhTh / +) niosą dwa niefunkcjonalne allele hydroksylazy tyrozynowej (Th), które zostały inaktywowane przez wstawienie genu oporności na neomycynę (NeoR) oflankowane miejscami lox P do pierwszego intronu genu Th . Myszy te niosą również jeden nienaruszony allel β-hydroksylazy dopaminowej (Dbh) i jeden allel Dbh z ukierunkowaną insercją genu Th. Zwierzęta kontrolne niosą co najmniej jeden nienaruszony allel Th i jeden nienaruszony allel Dbh. Poziomy nie-dopaminergicznych katecholamin są normalne u zwierząt DD i poziomy wszystkich katecholamin są normalne u zwierząt kontrolnych (Zhou i Palmiter, 1995; Szczypka i in., 1999). Myszy utrzymywano na mieszanym tle genetycznym C57BL / 6 X 129 / Sv. Ze względu na ciężką hipofagię, myszom DD wstrzykiwano codziennie (ip) L-Dopa w 50 mg / kg w objętości 33 μl / g (Zhou i Palmiter, 1995), rozpoczynając od około dnia po urodzeniu 10. Te zastrzyki przywracają funkcję DA dla 8 do 10 hr (Szczypka i in., 1999). Opisano myszy z knockoutem D1R (KO) i D2R KO (Drago i wsp., 1994; Kelly i in., 1997). Oba szczepy utrzymywano na tle C57BL / 6. Ze względu na opóźnienie wzrostu u myszy D1R KO, zostały one odstawione po czterech tygodniach, a następnie karmione nawilżoną karmą dla zwiększenia wzrostu. Wszystkie zwierzęta genotypowano za pomocą analizy PCR. Samce i samice myszy poddano testom behawioralnym w wieku 2 – 5 miesięcy. Wszystkie myszy trzymano w cyklu 12: 12 (jasny: ciemny) w środowisku o kontrolowanej temperaturze z pożywieniem (5LJ5; PMI Feeds, St. Louis, MO) i wodą dostępną ad libitum. Wszystkie eksperymenty behawioralne przeprowadzono podczas cyklu świetlnego. Wszystkie myszy leczono zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez National Institutes of Health i University of Washington Institutional Animal Care and Use Committee
Aby ocenić, czy inne receptory podobne do D2 są ważne dla uczenia się strachu, myszom D2R KO podawano antagonistę podobnego do D2 etiklopde (Sigma, St. Louis, MO) przy 0.5 mg / kg (ip). Etiklopryd rozpuszczono w 0.9% soli fizjologicznej i podano w końcowej objętości 10 μl / g. Myszom D2R typu dzikiego (WT) wstrzyknięto nośnik.
Aparatura
Do wyciszenia zahamowania prepulse, reakcji przestrachu i zaskoczenia wywołanego lękiem zastosowano dźwiękoszczelne komory przestrachu (SR-Lab, San Diego Instruments, San Diego, CA). Aby uzyskać reakcje zaskoczenia, wykonano odczyty 65 1-msec, zaczynając od początku impulsu. Aby zmierzyć reakcję na stopę, wykonano odczyty 500 1-msec, zaczynając od początku szoku. Szczytową amplitudę odpowiedzi zastosowano do obliczenia zahamowania prepulse, reakcji przestrachu, wzmożonego strachu i reaktywności szokowej. Biały szum był wytwarzany przez głośnik wysokiej częstotliwości umieszczony w suficie komory. Dźwięk w tle był utrzymywany na stałym poziomie 65 dB. Poziomy dźwięku mierzono w decybelach (skala A) za pomocą czytnika poziomu dźwięku (RadioShack, Fort Worth, TX). Zastosowano jednostkę kalibracyjną w celu zapewnienia integralności odczytów reakcji zaskoczenia (San Diego Instruments, San Diego, CA). Światło 8-watt zostało zamontowane na tylnej ścianie skrzyni zapłonowej do użycia jako sygnalizator.
Krzywe reakcji początkowej
Po okresie przyzwyczajenia 5-min, zwierzętom przedstawiono serię siedmiu prób z rosnącymi poziomami dźwięku: od 80 do 120 dB, z ITI 30 sek. Ta seria została zaprezentowana razy 10 w sumie prób 70. We wszystkich próbach, z wyjątkiem prób zerowych, w których nie było dźwięku, impuls dźwiękowy wynosił 40 msec.
Hamowanie przed pulsem
Zwierzęta otrzymały okres przyzwyczajenia 10-min, po którym uczestnikom przedstawiono badania 5 40-msec, 120-dB, w trybie pulsacyjnym. Myszy były następnie poddawane próbom 50 albo z próbą z samoczynnym pulsowaniem, z jednym z trzech prób wstępnych (5, 10 i 15-dB powyżej tła), albo z próbą zerową, w której nie było bodźca akustycznego. Interwał między próbami (ITI) uśredniony 15 s (zakres 5 – 25 sek). Próba zaskoczenia składała się z impulsu białego szumu 40-msec, 120-dB. Próby Prepulse składały się z 20-msec czasu wstępnego natężenia 70, 75 lub 80-dB, który poprzedzał impuls 40-msec 120-dB przez 100 msec. Hamowanie prepulse obliczono dla każdego poziomu prepulse, stosując następujący wzór:% inhibicji = [(średnia odpowiedź przestrachu na próbę prepulse / średnia odpowiedź przestrachu na próbę z samym pulsem) x 100]. Myszy DD badano w stanie zubożonym w DA, 18-24 hr po wstrzyknięciu L-Dopa.
Wzbudzone strachem zaskoczenie (paradygmat 7-day)
W dniu 1 (poziom wyjściowy), po okresie przyzwyczajenia 5-min, myszom podano pseudolosowo uporządkowaną serię prób 20, podzielonych równomiernie między warunki cue i bez wskazania. W badaniach bez wskazań, zwierzętom podawano impuls akustyczny 40-msec, 105-dB. W badaniach cue zwierzętom podawano sygnalizator świetlny 10-sec, który kończył się impulsem 40-msec, 105-dB. Uśredniony ITI 120 sec (zakres 60 do 180 sec).
Szkolenie miało miejsce w dniach 2, 4 i 6. Po okresie przyzwyczajenia 10-min myszy otrzymywały prezentacje 10 światła cue, które skończyło się ze stopką 0.2-mA, 0.5-sec. Uśredniony ITI 120 sec (zakres 60 do 180 sec). Sesje testowe miały miejsce w dniach 3, 5 i 7 i były identyczne z sesją bazową opisaną powyżej. Myszy DD były w stanie zubożonym w DA, 18 do 24 hr po ostatniej iniekcji L-Dopa, podczas linii bazowej, treningu i sesji testowych. L-Dopa wstrzykiwano po treningach, jak wskazano w legendach figur. Następująca formuła została użyta do obliczenia zaskoczenia wywołanego lękiem:% wzmocnienia = [(średnia odpowiedzi na próby cue / średnia odpowiedzi na próbach bez cue-1) × 100].
Wzbudzone strachem zaskoczenie (paradygmat 3-day)
Dni 1 i 3 (linia bazowa i test) tego paradygmatu były identyczne z tymi opisanymi dla paradygmatu przestraszonego 7-day. W dniu 2 (trening) myszy otrzymały pary 30 lampki sygnalizacyjnej 10-s z footshockiem 0.2-mA, 0.5-sec. Średnia ITI wynosiła 120 s (zakres 60 do 180 s). Myszy DD zostały pozbawione DA podczas linii podstawowej, treningu i testów.
Pamięć krótkotrwała
Sesje wyjściowe i sesje testowe były identyczne z opisanymi dla paradygmatu 7-day. W dniu 2, po okresie przyzwyczajenia 5-min, myszom podano pary 30 z lampą sygnalizacyjną 10-s, która skończyła się z footshockiem 0.5-sec, 0.2-mA. Uśredniony ITI sec 120 (zakres 60 do 180). Po treningu myszy umieszczono w klatkach domowych na 10 min przed badaniem. Pamięć krótkotrwała była oceniana przy użyciu tej samej formuły, którą stosowano do zaskoczenia wywołanego strachem.
Uczulenie na wstrząsy
Odpowiedzi na warunki braku sygnalizacji podczas linii bazowej pamięci krótkotrwałej i sesji testowych uśredniono dla każdego zwierzęcia i zastosowano następujący wzór do obliczenia uczulenia na wstrząsy:% uczulenia = [(średnia reakcja przestrachu podczas badania / średnia reakcja przestrachu na linię bazową- 1) × 100].
Przywrócenie funkcji genu Th za pośrednictwem rekombinazy Cre
Izofluran (1.5 – 5%) znieczulone myszy umieszczono w urządzeniu stereotaktycznym (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). W celu przywrócenia funkcji genu Th w brzusznym obszarze nakrywkowym, rekombinowany wirus AAV1-Cre-GFP (oznaczany jako 1.2 x 1012 / ml) wstrzyknięto obustronnie do brzusznego śródmózgowia (współrzędne w mm: 3.5 za Bregmą, 0.5 bocznie do linii środkowej , 4.5 brzuszny do Bregma; 0.5 μl / półkula). W celu specyficznego przywrócenia BLA DA, rekombinowany wirus CAV2-Cre (oznaczony jako 2.1 × 1012 / ml) wstrzyknięto obustronnie (współrzędne w mm: 1.5 za Bregma, 3.25 poprzecznie do linii środkowej, 5 brzuszny do Bregma; 0.5 μl / półkulę) . Szczegółowe opisy obu wektorów wirusowych zostały opublikowane (Hnasko i in., 2006; Zweifel i in., 2008). Wirusy wstrzykiwano przez okres 10-min, stosując igłę strzykawkową 32 (Hamilton, Reno, NV) przymocowaną do pompy mikro-infuzyjnej (WPI, Sarasota, FL).
Immunohistochemia
Po znieczuleniu za pomocą 50 mg / ml pentobarbitalu sodu (0.2 – 0.3 ml / zwierzę) myszy poddano perfuzji przezsercowej solą fizjologiczną buforowaną fosforanem, a następnie 4% paraformaldehydu w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Rozcięte mózgi utrwalano w 4% paraformaldehydzie przez noc, krioochronnie w 30% sacharozie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, a następnie szybko zamrażano w izopentanie. Swobodnie pływające skrawki czołowe (30 μm) barwiono immunologicznie mysimi przeciwciałami anty-TH (1: 1000, Chemicon) lub króliczymi przeciwciałami anty-TH (1: 2000, Chemicon). Immunofluorescencję osiągnięto stosując wtórne przeciwciała IgG sprzężone z Cy2 lub Cy3 (1: 200, Jackson ImmunoResearch). Barwione skrawki montowano na szkiełkach, nakrywano szkiełkami i fotografowano za pomocą mikroskopu z jasnym polem (Nikon).
Analizy statystyczne
Przeprowadzone analizy obejmowały powtarzane pomiary i jednokierunkową ANOVA, Fisher post-hoc i testy t-Studenta, jak odnotowano w wynikach. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą oprogramowania Statistica (Statsoft, Tulsa, Oklahoma).
Efekt
Myszy DD mają nienaruszoną reakcję przestrachu akustycznego i normalne zahamowanie przedpłytkowe
Wzbudzone lękiem zaskoczenie wymaga nienaruszonej reakcji przestrachu akustycznego i bramkowania sensomotorycznego. Aby określić, czy reakcja przestrachu akustycznego jest zmieniona w nieobecności DA, odpowiedzi myszy DD pozbawionych DA (18 na 24 hr po L-Dopa) na wielokrotne poziomy dźwięku w decybelach zmierzono i porównano z kontrolami (Figura 1A). Powtarzane pomiary ANOVA nie wykazały głównego efektu genotypu i nie wykazywały istotnej interakcji między genotypem a poziomem dźwięku.
Rysunek 1
DA ma kluczowe znaczenie dla uczenia się wzmaganego strachem przestrachu. A, Akustyczna reakcja na przerażenie myszy kontrolnej (n=10, czarne kwadraty) i myszy DD (n=10, puste kwadraty) na różne natężenia dźwięku. Odpowiedzi są podawane w arbitralnych jednostkach. B, Hamowanie przedimpulsowe testowano przy 3 różnych intensywnościach przedimpulsowych u myszy kontrolnych (n=10, czarne słupki) i myszy DD (n=10, puste słupki). Gwiazdki oznaczają p<0.05, powtórzone pomiary ANOVA. C, Schemat ilustrujący 7-dniowy paradygmat przestraszenia wzmocnionego strachem. W dniu wyjściowym i testowym myszy otrzymały 10 prezentacji braku sygnału (40-sekundowa prezentacja 105-dB pulsu przestrajającego) i 10 prezentacji próbnych sygnałów (10-sekundowy sygnał świetlny równoczesny z impulsem przestrachu) w sposób pseudolosowy zamówienie. W dni treningowe myszy otrzymywały 10 par 10-sekundowych sygnałów świetlnych, które kończyły się 0.5-sekundowym wstrząsem łapy 0.2 mA. Uczenie się oceniano w dniach testowych jako procent wzmocnienia w próbach z sygnałami w porównaniu z próbami bez wskazań. Myszy D, DD (n=10, puste słupki) otrzymujące L-Dopę 3 godziny po treningu (dzień 2 i 4) nie uczyły się (Test 1 i 2). Jednakże, gdy myszom DD wstrzykiwano zaraz po treningu (dzień 6) wykazywały one znaczny przestraszony strach (Test 3). Gwiazdki oznaczają p<0.05, powtórzone pomiary ANOVA. E, Pomiary reaktywności na wstrząsy podczas sesji treningowych (Kontrola n=10, czarne słupki; DD n=10, puste słupki). Odpowiedzi są podawane w arbitralnych jednostkach. F, Schemat ilustrujący trzydniowy paradygmat przestraszenia wzmocnionego strachem, stosowany do określenia krytycznego okresu czasu, w którym DA jest ważna. Wszystkie 3 par wskazań-wstrząsów podano jednego dnia treningowego, a myszy DD potraktowano L-Dopą natychmiast, 30 godzinę lub 1 godziny po treningu. G. Tylko kontrola (n=3, pełne czarne słupki, C) i myszy DD, którym wstrzyknięto bezpośrednio po treningu (n=8, pionowe paski, 7 godz.) wykazywały w dniu testu przestraszenie nasilone strachem. Ten poziom strachu wzmożonego strachem był znacznie wyższy niż ten obserwowany u myszy DD, którym podawano L-Dopę 0 godz. (n=1, ukośne paski) lub 6 godz. (n=3, otwarte słupki) po treningu. Gwiazdki oznaczają p<6 w porównaniu do wartości wyjściowej, Fisher post-hoc. Wszystkie podane wartości to średnie ± zubożone w SEMDA myszy DD i myszy kontrolne badano również w paradygmacie hamowania przedimpulsowego, który jest powszechnie stosowany do wykrywania deficytów w bramkowaniu sensomotorycznym. Hamowanie przedimpulsowe było wzmocnione u myszy DD (Figura 0.05B; ANOVA z powtarzanymi pomiarami, genotyp: F1, 1=18; p<5.37; nie wykryto żadnego istotnego genotypu na podstawie interakcji na poziomie przedimpulsowym). Dane te wskazują, że myszy z DD nie mają deficytów w odpowiedziach na przestraszenie lub spadków w mechanizmach bramkowania sensomotorycznego, gdy są w stanie zubożenia DA i potwierdzają ich zastosowanie w eksperymentach z przestrachem wzmaganym strachem.
Dopamina jest niezbędna w krytycznym momencie uczenia się zaskoczenia wywołanego strachem
Aby określić, czy DA jest niezbędna do uczenia się zadania warunkowania bodźcem, myszy DD i myszy kontrolne poddano 7-dniowemu paradygmatowi strachu nasilonego strachem (ryc. 1C). Myszy DD trenowano i testowano w stanie zubożenia DA. Podczas testowania 24 godziny po treningu, myszy kontrolne wykazywały przestraszony strach po pojedynczej sesji treningowej, którego nie obserwowano u myszy DD (Figura 1D; ANOVA z powtarzanymi pomiarami, genotyp, F1, 18=7.4590, p<0.05). Nawet po dodatkowej sesji treningowej myszy DD nie wykazywały wzmożonego strachem przerażenia, podczas gdy myszy kontrolne nadal wykazywały silne uczenie się. Co ciekawe, gdy podano L-Dopa bezpośrednio po treningu w dniu 6, myszy DD wykazywały przestraszenie nasilone strachem, które było znacznie wyższe niż wartość wyjściowa (jednokierunkowa ANOVA F1, 18=9.1999, p<0.01) i nie różniło się od poziomów kontrolnych ( Rysunek 1D). Reaktywność na wstrząsy w dniach treningu u myszy DD i myszy kontrolnych nie różniła się istotnie między genotypami w żadnym dniu treningu, co wskazuje, że deficyt uczenia się u myszy DD nie był spowodowany niezdolnością wyczuwania wstrząsu łapy (ryc. 1E). Scharakteryzowanie krytycznego okna czasowego w przypadku działania DA dodatkowe badanie zmieniało czas podawania L-Dopa. Myszom DD i kontrolnym przeprowadzono sesję treningową składającą się z 30 par wstrząsów świetlnych (Figura 1F), a następnie wstrzyknięto im L-Dopę natychmiast, 1 godzinę lub 3 godziny po treningu i przetestowano je 24 godziny później. Myszy DD, którym wstrzyknięto bezpośrednio po treningu, wykazywały silny, wzmocniony strachem przerażenie w dniu testu, podobny do tego u kontroli, podczas gdy myszy DD, którym wstrzyknięto L-Dopę 1 godzinę lub 3 godziny po treningu, nie wykazywały uczenia się (Figura 1G; ANOVA z powtarzanymi pomiarami; leczenie × sesja F3, 23=5.1032, p<0.01). Dane te wskazują, że DA jest niezbędna w skończonym okresie czasu do uczenia się w paradygmacie przestraszenia nasilonego strachem. Jednak DA nie jest konieczna do wyrażania pamięci bodźca lękowego, ponieważ zwierzęta DD były zawsze testowane pod nieobecność DA. Dodatkowo brak DA nie osłabia reaktywności na wstrząsy.
D1R jest niezbędny dla zaskoczonego strachu
Aby zbadać, które receptory DA są niezbędne do wzbudzania strachu przestraszenia, najpierw przeanalizowaliśmy myszy D1R KO. Myszy D1R KO i myszy kontrolne typu dzikiego (WT) testowano przy wielu poziomach intensywności impulsu przestrachu, jak opisano dla myszy DD (Figura 2A). Nie było znaczącej różnicy między myszami D1R KO i WT przy żadnym testowanym poziomie dźwięku, co wskazuje, że myszy D1R KO mają nienaruszoną reakcję przerażenia akustycznego. Zgodnie z poprzednimi badaniami, zaobserwowaliśmy nienaruszone hamowanie przedimpulsowe u myszy D1R KO (Ralph-Williams i wsp., 2002). Podczas testowania w 7-dniowym paradygmacie strachu nasilonego strachem, myszy D1R KO nie wykazywały zdolności uczenia się w żadnym z dni testu (Figura 2B; genotyp ANOVA z powtarzanymi pomiarami × dzień testu F3, 48=6.28; p<0.01), podczas gdy WT myszy miały znacząco wzmocniony strach w dniach testu 2 i 3 (odpowiednio p<0.05 ip<0.01, kontrolna linia bazowa w porównaniu z testem 2 i 3, Fisher post-hoc). Myszy D1R KO miały większą reaktywność na wstrząs niż WT we wszystkich trzech dniach treningu (Figura 2C; ANOVA z powtarzanymi pomiarami, genotyp F1, 16=10.18; p<0.01; nie zaobserwowano znaczącego genotypu × dzień treningu). Tak więc, chociaż myszy D1R KO mają podwyższoną reakcję na wstrząs stopy w porównaniu z myszami WT, mają one znacznie osłabiony przestraszenie nasilone strachem, nawet po 3 dniach treningu. Dane te wskazują na upośledzenie uczenia się u zwierząt D1R KO i implikują, że D1R pośredniczy w skutkach DA w warunkowaniu strachowym zależnym od sygnału. Figura 2 Myszy D1R KO mają znacząco upośledzone uczenie się. A, Akustyczna reakcja na przerażenie myszy D1R WT (n=9, czarne kwadraty) i KO (n=9, puste kwadraty). B, Wyniki 7-dniowego paradygmatu strachu nasilonego strachem u myszy D1R. Myszy D1R WT (n=9, pełne czarne słupki), ale nie myszy D1R KO (n=9, puste słupki), wykazywały strach nasilony strachem w dniu testu 3. Gwiazdki oznaczają p<0.01, porównując KO do WT, Fisher po hokej. C, Pomiary reaktywności na wstrząsy. Myszy D1R KO (n=9, puste słupki) mają wyższe odpowiedzi na wstrząs stopy niż WT (n=9, pełne słupki). Gwiazdki oznaczają p<0.05, powtórzone pomiary ANOVA. Wszystkie podawane wartości są średnimi ± SEM W przypadku reakcji zaskoczenia i reaktywności na wstrząs, liczby podawane w jednostkach arbitralnych.
U myszy D2R KO zaskoczenie nasilone przez strach jest nienaruszone, ale wymaga innych receptorów podobnych do D2
Aby zbadać, czy receptory podobne do D2 są konieczne dla nasilonego lęku przestrachu, myszy D2R KO i WT poddano reakcji przestrachu i testom zaskoczenia wywołanym strachem. Myszy KO WT i D2R mają równoważne odpowiedzi przestrachu przy wszystkich testowanych poziomach dB, co wskazuje, że myszy D2R KO mają nienaruszoną akustyczną reakcję przestrachu (Figura 3A). Podobnie jak u myszy D1R KO, zaobserwowaliśmy, że myszy D2R KO mają nienaruszone hamowanie prepulse (Ralph-Williams i wsp., 2002). Testowane w paradygmacie przestraszonego 7-a, zarówno myszy WT, jak i D2R KO wykazywały przestraszony efekt strachu na równoważnych poziomach we wszystkich dniach testu 3 (rysunek 3B), a reaktywność szokowa nie różniła się między grupami (rysunek 3C). Dane te wskazują, że D2R nie są konieczne do nauki zaskoczenia wywołanego strachem.
Rysunek 3
Myszy D2R KO mają nienaruszony strach wzmagający się strachem. A, Akustyczna reakcja na przerażenie myszy D2R WT (n=8, czarne kwadraty) i KO (n=8, puste kwadraty). B, Wyniki 7-dniowego paradygmatu strachu nasilonego strachem u myszy D2R. Zarówno myszy WT (n=8, pełne słupki), jak i KO (n=8, puste słupki) wykazywały znaczące poziomy wzmożonego strachu przestraszenia. C, Pomiary reaktywności na wstrząsy podczas treningu (WT, n=8, słupki pełne; KO, n=8, słupki otwarte). Myszy D, WT i D2R KO (każda z n=11) poddano 3-dniowemu paradygmacie wzmożonego strachu. Myszom D2R KO podawano etyklopryd (0.5 mg/kg) przed treningiem i podczas testów nie wykazywały one wzmożonego strachu przestraszenia. Gwiazdki oznaczają p<0.01, KO w porównaniu z WT, Fisher post-hoc. Wszystkie podawane wartości są wartościami średnimi ± SEM W przypadku reakcji na wstrząs i reaktywności na wstrząs, reakcje są podawane w jednostkach arbitralnych. Poprzednie badania wykazały, że podawanie antagonistów receptora D2, układowo lub bezpośrednio do ciała migdałowatego, osłabia strach warunkowy (Guarraci i wsp., 2000; Greba i wsp., 2001; Ponnusamy i wsp., 2005). Aby zbadać rozbieżność między ich wynikami a naszymi, myszom D2R KO podawano etyklopryd, antagonistę podobnego do D2R (0.5 mg/kg; dostarczany ip) przed treningiem w trzydniowym paradygmacie wzmożonego strachu. Podczas testowania 3 godziny po treningu, myszy WT, którym wstrzyknięto podłoże, wykazywały silny strach wzbudzony strachem, podczas gdy myszy D24R KO, którym wstrzyknięto etyklopryd, nie wykazywały zdolności uczenia się (Figura 2D; genotyp ANOVA z powtarzanymi pomiarami × dzień F3, 1=20, p<7.5698) . Wyniki te sugerują, że oprócz D0.05R, członek rodziny receptorów DA podobnych do D1, ale nie D2R, jest niezbędny do wzbudzania strachu przestrachu.
Pamięć krótkotrwała jest zaburzona u myszy DD i D1R KO
DA jest wymagana w ciągu jednej godziny po treningu, aby nauczyć się zaskoczenia wzmacnianego strachem. W tych eksperymentach pamięć długotrwałą dla zaskoczenia wzmacnianego strachem oceniano 24 godziny po treningu. Postanowiliśmy sprawdzić, czy DA jest również wymagana do pamięci krótkotrwałej. Zwierzęta DD i kontrole poddano dwudniowemu paradygmatowi, który testował pamięć krótkotrwałą 2 minut po treningu (Figura 10A). W dniu testu oceniano wrażliwość na wstrząs i pamięć krótkotrwałą. Pamięć krótkotrwała została zdefiniowana jako zależny od sygnału wzrost odpowiedzi na przestrach, podczas gdy uczulenie na wstrząs jest zależnym od kontekstu wzmocnieniem akustycznej odpowiedzi na wstrząs po wstrząsie stopą, które jest niezależne od sygnału (McNish i in., 1997; Richardson, 2000; Risbrough i in. al., 2008). Myszy DD miały znacznie mniejszą wrażliwość na wstrząs niż kontrole (Figura 4B, p <0.05; test t Studenta). Podobnie, myszy kontrolne wykazywały silną pamięć krótkotrwałą, której nie było u myszy DD (Figura 4B, p <0.05, DD w porównaniu z kontrolą, test t Studenta). Dane te sugerują, że DA jest wymagana do krótkotrwałej i długotrwałej pamięci przerażenia wzmacnianego strachem. Co więcej, DA jest niezbędna do zależnego od kontekstu uczenia się strachu, co potwierdza uczulenie na wstrząs. Dane te potwierdzają również poprzedni wniosek, że DA jest wymagana w krytycznym okresie dla stabilizacji śladu pamięciowego warunkowania strachem. Rycina 4 Pamięć krótkotrwała i uczulenie na wstrząs zależą od DA. A, Projekt paradygmatu behawioralnego. Pierwszego dnia uzyskano wyjściowe reakcje zaskoczenia. W dniu 2 myszy otrzymały wszystkie 30 par cue-shock, a następnie umieszczono je z powrotem w ich klatce domowej na 10 minut przed badaniem. B, Myszy kontrolne (n = 10, czarne słupki) mają znacznie większą wrażliwość na wstrząs i strach wzmacniany strachem w porównaniu z DD (n = 10, otwarte słupki). Gwiazdki oznaczają p <0.05; Test t Studenta. Myszy C, WT (n = 7, czarne słupki) i D1R KO (n = 7, puste słupki) wykazują nienaruszoną wrażliwość na wstrząs. Tylko WT podczas testu pamięci krótkotrwałej występuje przerażenie wzmagane strachem. Gwiazdki oznaczają p <0.05, KO w stosunku do WT; Test t Studenta. Myszy D, WT (n = 8, czarne słupki) mają znacznie większą wrażliwość na wstrząs niż D2R KO (n = 8, puste słupki). Poziomy nasilenia strachu są podobne u myszy WT i D2R KO. Gwiazdki oznaczają p <0.05, KO w stosunku do WT; Test t Studenta. Wszystkie podane wartości są średnimi ± SEM Aby zbadać, które podtypy receptorów pośredniczą w roli DA w pamięci krótkotrwałej i uczuleniu na wstrząs, myszy D1R i D2R KO testowano w tym samym paradygmacie co myszy DD. Myszy D1R KO miały znacząco niższe poziomy pamięci krótkotrwałej niż myszy WT (Figura 4C, p <0.05; test t Studenta); jednakże nie było znaczącej różnicy między poziomami uczulenia na wstrząs u myszy D1R KO i myszy kontrolnych, co wskazuje, że uczenie zależne od kontekstu było nienaruszone. Myszy D2R KO miały znacząco niższe poziomy uczulenia na wstrząs niż WT (Figura 4D, p <0.05; test t Studenta), ale nie było znaczącej różnicy między poziomami pamięci krótkotrwałej myszy WT i KO.
Przywrócenie DA do podstawno-bocznego ciała migdałowatego jest wystarczające, aby umożliwić pamięć krótkotrwałą
Ciało migdałowate podstawno-boczne ma kluczowe znaczenie dla uzyskania zależnej od cue pamięci strachu (Maren, 2003; Maren i Quirk, 2004; Sigurdsson i in., 2007). Ponadto istnieją dowody sugerujące ważną rolę DA w ułatwianiu funkcji ciała migdałowatego podstawno-bocznego (Rosenkranz i Grace, 2002; Bissiere i in., 2003; Marowsky i in., 2005). Aby zbadać, czy DA w podstawno-bocznym ciele migdałowatym jest wymagane dla nasilonego lęku zaskoczenia, DD i myszy kontrolne wstrzyknięto obustronnie wektorem CAV2-Cre do podstawy-bocznego ciała migdałowatego (Figura 5A). Ten wektor jest transportowany wstecznie z miejsca wstrzyknięcia do neuronów DA, gdzie przywraca aktywność genu Th (Hnasko i in., 2006). Immunohistochemia ujawniła, że TH był obecny w podstawno-bocznym ciele migdałowatym myszy DD, którym wstrzyknięto CAV2-Cre (Figura 5J), ale nieobecny w prążkowiu grzbietowym i jądrze półleżącym (Figura 5G). TH przywrócono głównie do małej liczby neuronów w części ogonowej brzusznego obszaru nakrywkowego (ryc. 5D). Zwykle mniej niż 10 komórek TH-dodatnich na sekcję 30-μm we wstrzykniętych myszach DD, co jest zgodne z małą liczbą neuronów DA wytwarzających migdałki, opisaną w literaturze (Ford i in., 2006; Lammel i in. , 2008; Margolis i in., 2008).
Rysunek 5
Specyficzne dla regionu przywrócenie endogennej ekspresji TH u myszy DD. A, Schemat ilustrujący współrzędne wtrysku dla eksperymentów ratunkowych ciała podstawno-bocznego (BLA). Myszom DD (n = 7) i kontrolnym (n = 7) wstrzyknięto obustronnie do BLA z wektorami CAV2-Cre (0.5 uL / półkula). B, Schemat ilustrujący współrzędne wtrysku dla eksperymentów ratunkowych strefy nakłucia brzusznego (VTA). AAV1-Cre-GFP wstrzykiwano obustronnie (0.5 uL / półkula) do VTA DD (n = 7) i myszy kontrolnych (n = 10). Figurki zaadaptowane z Paxinosa i Franklina, 2001. C – E, Porównanie barwienia TH w wycinku koronalnym (powiększenie 4 ×) pokazujące brzuszny śródmózgowia kontroli WT z wstrzykniętym wirusem, DD wstrzyknięty BLA i DD wstrzyknięty VTA. Immunohistochemia C, TH w kontrolnym śródmózgowiu demonstruje obecność neuronów DA w VTA i istocie czarnej pars compacta (SNpc; wskazana strzałką). D, myszy DD uratowane przez BLA miały niewielką liczbę neuronów dodatnich pod względem TH w VTA. Wstawka to powiększenie 40 × obszaru w ramce, pokazujące ekspresję TH w somie i procesach. E, myszy DD uratowane VTA miały ekspresję TH głównie w VTA. Zwróć uwagę na brak barwienia TH w SNpc (wskazany strzałką). F – H, przekrój czołowy (powiększenie 4 ×) z kontrolnej iniekcji wirusa WT, myszy uratowanych BLA i uratowanych VTA, wykazujących ekspresję TH w grzbietowym prążkowiu i jądrze półleżącym. Kontrole z iniekcją wirusa F, WT mają ekspresję TH w całym grzbietowym (wskazanym strzałką) i brzusznym prążkowiu. G, Nie wykryto ekspresji TH w prążkowiu myszy DD uratowanych BLA. H, myszy DD uratowane VTA mają ekspresję TH w jądrze półleżącym, z jedynie niewielką ilością barwienia w prążkowiu grzbietowym (wskazaną strzałką). I – K, sekcja koronalna (powiększenie 10 ×) pokazująca ekspresję TH w BLA kontroli WT, którym wstrzyknięto wirusy, myszy BD-uratowane i uratowane VTA.
Myszy, którym wstrzyknięto podstawno-boczne ciało migdałowate, poddano 3-dniowemu paradygmatowi przestraszenia wzmocnionego strachem. Pamięć krótkotrwałą i uczulenie na wstrząsy oceniano 10 minut po treningu, a pamięć długotrwałą w zakresie przestraszenia nasilonego strachem oceniano 24 godziny po treningu (Rycina 6A). Co ciekawe, tylko krótkotrwała pamięć została przywrócona u myszy DD, którym wstrzyknięto podstawno-boczne ciało migdałowate. Poziomy pamięci krótkotrwałej były takie same jak w grupie kontrolnej, jednak poziomy pamięci długotrwałej (p<0.05; test t-Studenta) i uczulenia na wstrząsy (p<0.05; test t-Studenta) były znacznie niższe niż w grupie kontrolnej. Podczas treningu poziomy reaktywności na wstrząsy były takie same między grupami (kontrola: 1613±333 vs. DD uratowany przez BLA: 1758±260). Dane te sugerują, że projekcje DA na podstawno-boczne ciało migdałowate, pochodzące głównie z ogonowego aspektu brzusznego obszaru nakrywkowego, są wystarczające do krótkotrwałego nabywania pamięci o strachu, jednak projekcje DA do innych obszarów korowych lub limbicznych są prawdopodobnie niezbędne dla uczenie kontekstowe i długoterminowa stabilizacja śladu pamięci strachu. Rycina 6 Myszy DD uratowane podstawno-boczne ciało migdałowate (BLA) przywróciły pamięć krótkotrwałą, podczas gdy myszy DD z uratowanym obszarem brzusznym nakrywki (VTA) w pełni przywróciły uczenie się. A, myszy kontrolne WT, którym wstrzyknięto wirusa (n=7) i myszy DD z wstrzyknięciem wirusa BLA (n=7) poddano 3-dniowemu paradygmacie wzmożonego strachu. Po lewej, uczulenie na wstrząs jest znacznie niższe u myszy uratowanych BLA. Pamięć średnia, krótkotrwała (STM) została przywrócona do poziomów kontrolnych u myszy uratowanych BLA. Tak, pamięć długotrwała (LTM), oceniana 24 godziny po treningu, jest nieobecna u myszy uratowanych BLA. B, Wyniki z kontroli WT (n=10) i myszy DD uratowanych przez VTA (n=7) w 3-dniowym paradygmacie wzmożonego strachu. Po lewej, uczulenie na wstrząs u myszy DD uratowanych przez VTA nie różniło się znacząco od kontroli. Pośrodku i po prawej, poziomy pamięci STM i LTM były takie same jak w grupie kontrolnej u myszy ratowniczych VTA. Gwiazdki oznaczają p<0.05, ratowanie w porównaniu z kontrolą, test t-Studenta. Wszystkie podane wartości są średnimi ± SEM
Przywrócenie neuronów DA do brzusznego obszaru nakrywkowego wystarcza do nauki
Istnieją dwa główne obwody DA pochodzące z brzusznego śródmózgowia; obwód mezostriatalny, pochodzący głównie z istoty czarnej pars compacta i obwodu mezokortykolimbicznego, pochodzący głównie z brzusznego obszaru nakrywkowego. Obwód mezokortykolimbiczny rozciąga się szeroko na jądra mózgu, o których wiadomo, że są ważne dla zależnego od cue warunkowania strachowego, w tym podstawno-bocznego ciała migdałowatego (Bjorklund i Dunnett, 2007; Lammel i in., 2008). Aby zbadać, czy bardziej kompletna odbudowa mezokortykolimbicznego DA jest wymagana dla pamięci długotrwałej i uczulenia na wstrząsy; Myszom DD i kontrolnym wstrzyknięto obustronnie wektor AAV1-Cre-GFP do brzusznego obszaru nakrywkowego, aby specyficznie aktywować endogenny gen Th (Figura 5B).
Immunohistochemię wykorzystano do wykrycia, które neurony DA i które cele przywróciły ekspresję TH. Barwienie TH jest nieobecne u nie uratowanych myszy DD (Hnasko i in., 2006). Immunohistochemia wykazała, że przywrócenie TH u myszy DD z wstrzykniętym obszarem brzusznym nakrywkowym było wysoce specyficzne dla brzusznego obszaru nakrywkowego i jego celów (Rysunek 5E, H, K). Wystąpił niedobór barwienia TH w prążkowiu grzbietowym, głównym celu neuronów DA emanujących z istoty czarnej pars compacta (Figura 5H), podczas gdy jądro półleżące i podstawno-boczne ciało migdałowate miały silną ekspresję TH (Fig 5H, K).
Myszy, którym wstrzyknięto obszar brzusznej nakrywki, poddano takiemu samemu paradygmatowi wstrząsu wywołanego przez strach 3, jak myszy z wstrzykniętym podstawnym bokiem ciała migdałowatego (Figura 6B). Uczulenie na wstrząsy, pamięć krótkotrwała i pamięć długotrwała zostały przywrócone do poziomów kontrolnych u myszy DD z wstrzykniętym brzusznym obszarem nakrywkowym. Reaktywność na wstrząsy podczas treningu była taka sama między grupami (kontrola: 1653 ± 268 w porównaniu z VD-uratowanym DD: 1602 ± 198). Dane te sugerują, że projekcje DA z brzusznego obszaru nakrywkowego są wystarczające do tworzenia krótkoterminowej i długotrwałej pamięci strachów wywołanych cuedem, jak również zależnego od kontekstu uczulenia na wstrząsy.
Dyskusja
Wyniki te pokazują, że DA jest wymagany do warunkowania cued-fear, mierzonego zaskoczeniem wywołanym strachem. Myszy DD nie wykazywały zaskoczenia wywołanego strachem, chyba że DA zostanie przywrócone natychmiast po treningu. Myszy DD mają również upośledzoną pamięć krótkotrwałą i uczulenie na wstrząsy. Co ważne, hamowanie prepulse nie było niższe u myszy DD zubożonych w DA, co wskazuje, że bramkowanie sensomotoryczne nie zmniejsza się przy braku DA. Wcześniejsze badania wykazały, że środki psychostymulujące, które zwiększają transmisję DA, mogą obniżać hamowanie prepulse (Schwarzkopf i in., 1992; Bubser i Koch, 1994; Ralph i in., 1999; Swerdlow i in., 2006; Doherty i in., 2007) i inni wykazali, że farmakologiczne hamowanie receptorów dopaminowych nasila hamowanie prepulsu (Schwarzkopf i in., 1993; Depoortere i in., 1997). Zgodnie z tymi odkryciami, myszy DD miały niewielki, ale znaczący wzrost zahamowania prepulse w porównaniu z myszami kontrolnymi. Wcześniejsze badania wykazały również, że farmakologiczne hamowanie receptorów DA może zmniejszyć reakcję przestrachu akustycznego (Davis i Aghajanian, 1976; Schwarzkopf i in., 1993). Myszy DD zubożone w dopaminę nie miały znacząco zmienionych akustycznych reakcji przestrachu; jednakże zaobserwowano tendencję do zmniejszania odpowiedzi w porównaniu z kontrolami, zwłaszcza przy wysokich intensywnościach bodźców, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami (Schwarzkopf i in., 1993).
Przedstawione tu dane wyraźnie pokazują, że DA nie jest ważna dla pobierania lub wyrażania zależnej od cue pamięci strachu, ponieważ myszy DD nie wymagają DA podczas sesji testowej, aby wyrazić przestraszone strachem zaskoczenie, które zostało wcześniej nabyte przez wstrzyknięcie L-Dopa bezpośrednio po trening. Co więcej, nasze eksperymenty dowodzą, że DA jest wymagane do początkowego przetwarzania bodźca podczas treningu, ponieważ myszy DD były zubożone w dopaminę podczas wszystkich sesji treningowych. Zamiast tego nasze dane sugerują, że DA jest niezbędna do wczesnej stabilizacji śladu pamięci, ponieważ myszy DD nie wyrażają pamięci krótkotrwałej, a pamięć długoterminowa jest widoczna tylko wtedy, gdy L-Dopa jest podawana natychmiast, ale nie 1 hr, po trening. Przypuszczalnie, wstrzyknięcie myszom DD L-Dopa natychmiast po treningu stabilizuje ślad pamięci, pozwalając mu wejść w formę długoterminową. Bodźce awersyjne powodują przedłużony wzrost poziomów DA w obszarach mózgu kluczowych dla warunkowania strachu, które pozwoliłyby na taką stabilizację pamięci strachu (Abercrombie i in., 1989; Kalivas i Duffy, 1995; Doherty i Gratton, 1997; Inglis i Moghaddam, 1999). Zgodnie z naszymi danymi inni wykazali, że manipulacje po treningu funkcji DA zmieniają pamięć związaną ze strachem (Bernaerts i Tirelli, 2003; Lalumiere i in., 2004; LaLumiere i in., 2005).
Nasze odkrycia wskazują, że wiele podtypów receptora DA jest koniecznych do zaskoczenia wywołanego strachem. Myszy D1R KO nie mają pamięci krótkotrwałej i długotrwałej z powodu zaskoczenia wywołanego strachem, co sugeruje kluczową rolę tego podtypu receptora w pośredniczeniu w działaniu DA w zależnym od cue uczeniu się strachu. Co ciekawe, zależne od kontekstu uczenie się strachu było nietknięte u myszy D1R KO. Dane te potwierdzają inne badania wykazujące, że antagoniści podobni do D1R osłabiają uczenie się strachu z uwarunkowanymi sygnałami bez wpływu na uczulenie na wstrząsy i wykazują, że manipulacje farmakologiczne w tych eksperymentach były specyficzne dla D1R (Lamont i Kokkinidis, 1998; Guarraci i in., 1999) . Dane te są również zgodne z badaniami wykazującymi krytyczną rolę D1R w innych paradygmatach uczenia się zależnych od sygnalizacji (Smith i in., 1998; Eyny and Horvitz, 2003).
D2R KO miał nienaruszone przestraszone lękiem zaskoczenie, ale brakowało uczulenia na wstrząsy. Greba i in. (2001) wykazali, że antagonizm wewnątrzkomórkowy D2R prowadził do upośledzenia uczulenia na wstrząsy i wzmożonego strachu przestraszenia bez wpływu na zaskoczenie linii podstawowej lub reakcje na wstrząs. Aktywacja D2R prowadzi do indukcji długotrwałego wzmocnienia w BLA, która przypuszczalnie byłaby istotna dla wzmożonej strachu pamięci przestrachu (Bissiere i in., 2003). Nasze dane pokazują, że D2R nie są konieczne do zależnego od cue uczenia się strachu, ale raczej, że ten podtyp receptora DA jest ważny dla zależnego od kontekstu uczulenia na wstrząsy. Wstrzyknięcie myszom D2R KO ogólnoustrojowo antagonistą podobnym do D2, etliklopidem, przed treningiem zapobiegało zaskoczeniu wywołanemu strachem; dlatego jest prawdopodobne, że inne receptory D2R-podobne, które są również hamowane przez etlikloprid, są krytyczne w zaskoczeniu wywołanym strachem (Sigala i in., 1997; Bernaerts i Tirelli, 2003; Laviolette i in., 2005; Swant i Wagner , 2006). Tak więc upośledzenia w uczeniu się zależnym od sygnalizacji wywołane przez antagonistów podobnych do D2 w poprzednich badaniach można przypisać tym lekom hamującym innych członków rodziny D2R.
Selektywne przywrócenie endogennego TH specyficznie do brzusznej strefy nakrywkowej doprowadziło do przywrócenia uczenia się u myszy DD. Immunohistochemia wykazała, że TH przywrócono do ważnych jąder limbicznych, takich jak jądro półleżące i podstawno-boczne ciało migdałowate, ale nie do prążkowia grzbietowego. Ponadto, bardzo niewiele neuronów było dodatnich dla TH w istocie czarnej pars compacta. Dane te wskazują, że DA z neuronów obszaru brzusznej nakrywki jest ważny dla warunkowania cued i kontekst-strach.
Myszy z selektywnym przywróceniem DA do podstawno-bocznego ciała migdałowatego wyrażały pamięć krótkotrwałą, ale nie pamięć długotrwałą lub uczulenie na wstrząsy. Wcześniejsze badania wykazały, że DA ułatwia funkcję ciała migdałowatego poprzez zmiany w hamującym tonie GABAergicznym, a efekt ten jest pośredniczony przez D1R lub D2R (Bissiere i wsp., 2003; Kroner i in., 2005; Marowsky i in., 2005). Przedstawione tutaj dane pokazują, że DA w podstawno-bocznej części ciała migdałowatego ma kluczowe znaczenie dla uzyskania pamięci krótkotrwałej z powodu zaskoczenia wywołanego strachem, ale nie jest wystarczające dla długoterminowej stabilności pamięci. W przywróceniu pamięci krótkotrwałej pośredniczy niewielka liczba podstawno-bocznych neuronów DA wystających z ciała migdałowatego pochodzących z brzusznego obszaru nakrywkowego. Bardziej powszechne przywracanie endogennej TH u brzusznych myszy z DD z uszkodzoną powierzchnią nakrywkową prowadziło do nienaruszonej pamięci krótkoterminowej i długotrwałej; dlatego przywrócenie TH do innych obwodów mezokortykolimbicznych jest prawdopodobnie wymagane do ustanowienia pamięci długotrwałej na zaskoczenie wywołane strachem. Poprzednie badania sugerują, że jądro półleżące i kora przedczołowa mogą być również ważnymi celami DA podczas warunkowania strachu (Kalivas i Duffy, 1995; Murphy i in., 2000; Pezze i in., 2003; LaLumiere i in., 2005; Laviolette et al., 2005; Floresco i Tse, 2007). Dlatego możliwe jest, że sygnalizacja DA w jądrze półleżącym lub korze przedczołowej jest wymagana do tworzenia pamięci długotrwałej.
Podsumowując, w naszym badaniu wykorzystano kombinację genetycznych modeli mysich, farmakologii i specyficznego dla regionu ratowania funkcji w celu wykazania, że DA jest wymagany do zaskoczenia wywołanego strachem, zależnego od cue zadania warunkowania strachu. Odkrycia te podkreślają ważną rolę tego neuroprzekaźnika poza przetwarzaniem nagrody. Ponadto, nasze badanie wskazuje na potrzebę DA działającego na wiele receptorów DA jednocześnie w wielu regionach mózgu dla zależnego od cue warunkowania strachowego. Ostatnie badania ujawniły, że neurony DA obszaru brzusznej nakrywki różnią się znacznie pod względem właściwości molekularnych i fizjologicznych w zależności od lokalizacji docelowej (Ford i wsp., 2006; Margolis i in., 2006; Bjorklund i Dunnett, 2007; Lammel i in., 2008; Margolis i in., 2008). Eksperymenty, w których przeprowadziliśmy selektywną reaktywację genu Th w neuronach DA wystających do podstawy ciała bocznego, pokazują, że są to małe, wybrane populacje neuronów obszaru brzusznego nakrywkowego, a nie obojętne neurony DA rzutujące na inne obszary mózgu. Nasze dane, w połączeniu z badaniami wykazującymi heterogeniczność populacji neuronów DA, podkreślają potrzebę zrozumienia roli każdego z tych dyskretnych obwodów DA. Poszerzanie wiedzy na temat wielu behawioralnych i fizjologicznych funkcji DA w celu włączenia uczenia się związanego ze strachem może prowadzić do lepszego zrozumienia powszechnych zaburzeń związanych ze strachem, takich jak zespół stresu pourazowego, zaburzenie obsesyjno-kompulsyjne i uogólnione zaburzenie lękowe.
Podziękowanie
Dochodzenie to zostało częściowo poparte przez Public Health Service, National Research Service Award, T32 GM07270, z Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych i NIH National Institutes of Medical Sciences Grant 4 R25 GM 058501-05. Dziękujemy Ilene Bernstein, Lisy Beutler, Charlesowi Chavkinowi i Larry'emu Zweifelowi za pomocne komentarze do manuskryptu, Alberta Quintany za pomoc w zakresie histologii oraz Valerie Wall za utrzymanie myszy w kolonii. Dziękujemy również dr Miguelowi Chillonowi (Jednostka Produkcji Wektorów CBATEG na Universitat Autonoma w Barcelonie) za CAV2 i Matthew While za wirusa AAV1.
Referencje
1. Abercrombie ED, Keefe KA, DiFrischia DS, Zigmond MJ. Różnicowy wpływ stresu na uwalnianie dopaminy in vivo w prążkowiu, jądrze półleżącym i przyśrodkowej korze czołowej. J Neurochem. 1989; 52: 1655 – 1658. [PubMed]
2. Bernaerts P, Tirelli E. Ułatwiający wpływ agonisty receptora dopaminy D4 PD168,077 na konsolidację pamięci wyuczonej reakcji hamującego unikania u myszy C57BL/6J. Behav Brain Res. 2003;142:41–52. [PubMed]
3. Bissiere S, Humeau Y, Luthi A. Bramy dopaminowe Indukcja LTP w bocznym ciele migdałowatym przez tłumienie hamowania przedniego. Nat Neurosci. 2003; 6: 587 – 592. [PubMed]
4. Bjorklund A, Dunnett SB. Układy neuronów dopaminowych w mózgu: aktualizacja. Trendy Neurosci. 2007; 30: 194 – 202. [PubMed]
5. Bubser M, Koch M. Hamowanie Prepulse akustycznej reakcji przestrachu szczurów jest zmniejszone przez zmiany 6-hydroksydopaminowe w przyśrodkowej korze przedczołowej. Psychofarmakologia (Berl) 1994;113:487–492. [PubMed]
6. Davis M, Aghajanian GK. Wpływ apomorfiny i haloperidolu na akustyczną reakcję przestrachu u szczurów. Psychofarmakologia (Berl) 1976;47:217–223. [PubMed]
7. de Oliveira AR, Reimer AE, Brandao ML. Mechanizmy receptora dopaminy D2 w ekspresji warunkowanego strachu. Pharmacol Biochem Behav. 2006; 84: 102 – 111. [PubMed]
8. Depoortere R, Perrault G, Sanger DJ. Wzmocnienie przedimpulsowego hamowania odruchu przestrachu u szczurów: ocena farmakologiczna procedury jako modelu wykrywania aktywności przeciwpsychotycznej. Psychofarmakologia (Berl) 1997;132:366-374. [PubMed]
9. Doherty JM, Masten VL, Powell SB, Ralph RJ, Klamer D, Low MJ, Geyer MA. Wkład podtypów receptorów dopaminy D1, D2 i D3 w destrukcyjny wpływ kokainy na hamowanie przedimpulsowe u myszy. Neuropsychofarmakologia. 2007;12:12.
10. Doherty MD, Gratton A. Receptory NMDA w jądrze półleżącym modulują uwalnianie dopaminy wywołane stresem w jądrze półleżącym i brzusznym obszarze nakrywkowym. Synapsa. 1997;26:225–234. [PubMed]
11. Drago J, Gerfen CR, Lachowicz JE, Steiner H, Hollon TR, Love PE, Ooi GT, Grinberg A, Lee EJ, Huang SP i in. Zmieniona funkcja prążkowia u zmutowanej myszy pozbawionej receptorów dopaminy D1A. Proc Natl Acad Sci US A. 1994;91:12564-12568. [darmowy artykuł PMC] [PubMed]
12. Eyny YS, Horvitz JC. Przeciwstawne role receptorów D1 i D2 w warunkowaniu apetytu. J Neurosci. 2003;23:1584-1587. [PubMed]
13. Floresco SB, Tse MT. Dopaminergiczna regulacja transmisji hamującej i pobudzającej w szlaku podstawno-bocznym ciała migdałowatego i kory przedczołowej. J Neurosci. 2007;27:2045–2057. [PubMed]
14. Ford CP, Mark GP, Williams JT. Właściwości i inhibicja opioidów mezolimbicznych neuronów dopaminowych zmienia się w zależności od lokalizacji docelowej. J Neurosci. 2006; 26: 2788 – 2797. [PubMed]
15. Greba Q, Kokkinidis L. Obwodowe i śródmiąższowe podawanie antagonisty receptora dopaminy D1 SCH 23390 blokuje przestrach wzmocniony strachem, ale nie reaktywność szoku lub uczulenie na szok akustycznego zaskoczenia. Behav Neurosci. 2000;114:262–272. [PubMed]
16. Greba Q, Munro LJ, Kokkinidis L. Zaangażowanie cholinergicznych receptorów muskarynowych obszaru brzusznego nakrywki w klasycznie uwarunkowaną ekspresję strachu mierzoną przestrachem wzmocnionym strachem. Mózg Res. 2000;870:135–141. [PubMed]
17. Greba Q, Gifkins A, Kokkinidis L. Hamowanie receptorów dopaminy D2 w ciele migdałowatym upośledza uczenie się emocjonalne mierzone przestrachem wzmocnionym strachem. Mózg Res. 2001;899:218–226. [PubMed]
18. Guarraci FA, Kapp BS. Charakterystyka elektrofizjologiczna neuronów dopaminergicznych brzusznego obszaru nakrywkowego podczas różnicowego warunkowania strachu pawłowego w przebudzonym króliku. Behav Brain Res. 1999; 99: 169 – 179. [PubMed]
19. Guarraci FA, Frohardt RJ, Kapp BS. Zaangażowanie receptora dopaminy Amygdaloid D1 w warunkowanie strachu Pawłowa. Mózg Res. 1999;827:28–40. [PubMed]
20. Guarraci FA, Frohardt RJ, Falls WA, Kapp BS. Wpływ infuzji wewnątrz ciała migdałowatego antagonisty receptora dopaminy D2 na warunkowanie strachu Pawłowa. Behav Neurosci. 2000;114:647–651. [PubMed]
21. Hnasko TS, Perez FA, Scouras AD, Stoll EA, Gale SD, Luquet S, Phillips PE, Kremer EJ, Palmiter RD. Przywrócenie dopaminy nigrostriatalnej za pośrednictwem rekombinazy Cre u myszy z niedoborem dopaminy odwraca hipofagię i spowolnienie ruchowe. Proc Natl Acad Sci US A. 2006;103:8858-8863. [darmowy artykuł PMC] [PubMed]
22. Horvitz JC. Mezolimbokortykalne i nigrostriatalne reakcje dopaminy na najistotniejsze zdarzenia niezwiązane z nagrodą. Neuronauka. 2000;96:651–656. [PubMed]
23. Inglis FM, Moghaddam B. Dopaminergiczne unerwienie ciała migdałowatego jest bardzo wrażliwe na stres. J Neurochem. 1999; 72: 1088 – 1094. [PubMed]
24. Inoue T, Izumi T, Maki Y, Muraki I, Koyama T. Wpływ antagonisty dopaminy D(1/5) SCH 23390 na nabywanie warunkowego strachu. Pharmacol Biochem Behav. 2000;66:573–578. [PubMed]
25. Joshua M, Adler A, Mitelman R, Vaadia E, Bergman H. Neurony dopaminergiczne Midbrain i cholinergiczne interneurony prążkowia kodują różnicę między wydarzeniami nagrody i awersji w różnych epokach probabilistycznych klasycznych prób warunkowania. J Neurosci. 2008; 28: 11673 – 11684. [PubMed]
26. Kalivas PW, Duffy P. Selektywna aktywacja transmisji dopaminy w skorupie jądra półleżącego przez stres. Brain Res. 1995; 675: 325 – 328. [PubMed]
27. Kelly MA, Rubinstein M, Asa SL, Zhang G, Saez C, Bunzow JR, Allen RG, Hnasko R, Ben-Jonathan N, Grandy DK, Low MJ. Hiperplazja laktotropowa przysadki i przewlekła hiperprolaktynemia u myszy z niedoborem receptora dopaminy D2. Neuron. 1997;19:103–113. [PubMed]
28. Koch M. Neurobiologia przestrachu. Prog Neurobiol. 1999; 59: 107 – 128. [PubMed]
29. Kroner S, Rosenkranz JA, Grace AA, Barrionuevo G. Dopamina moduluje pobudliwość podstawno-bocznych neuronów ciała migdałowatego in vitro. J Neurophysiol. 2005; 93: 1598 – 1610. [PubMed]
30. Lalumiere RT, Nguyen LT, McGaugh JL. Potreningowe intrabasolateralne infuzje ciała migdałowatego dopaminy modulują konsolidację pamięci unikania hamowania: zaangażowanie układów noradrenergicznych i cholinergicznych. Eur J Neurosci. 2004;20:2804–2810. [PubMed]
31. LaLumiere RT, Nawar EM, McGaugh JL. Modulacja konsolidacji pamięci przez podstawno-boczne ciało migdałowate lub jądro półleżące wymaga jednoczesnej aktywacji receptora dopaminy w obu obszarach mózgu. Learn Mem. 2005; 12: 296 – 301. [Bezpłatny artykuł PMC] [PubMed]
32. Lammel S, Hetzel A, Hackel O, Jones I, Liss B, Roeper J. Unikalne właściwości neuronów mezoprzedczołowych w podwójnym mezokortykolimbicznym układzie dopaminowym. Neuron. 2008;57:760–773. [PubMed]
33. Lamont EW, Kokkinidis L. Wlew antagonisty receptora dopaminy D1 SCH 23390 do ciała migdałowatego blokuje ekspresję strachu w paradygmacie wzmocnionego zaskoczenia. Mózg Res. 1998;795:128-136. [PubMed]
34. Laviolette SR, Lipski WJ, Grace AA. Subpopulacja neuronów w przyśrodkowej korze przedczołowej koduje uczenie się emocjonalne za pomocą kodów wybuchu i częstotliwości poprzez zależne od receptora dopaminy wejście ciała migdałowatego D4. J Neurosci. 2005;25:6066–6075. [PubMed]
35. Lemon N, Manahan-Vaughan D. Receptory dopaminy D1/D5 bramują nabywanie nowych informacji poprzez długoterminowe wzmocnienie hipokampa i długotrwałą depresję. J Neurosci. 2006;26:7723–7729. [PubMed]
36. Maren S. Ciało migdałowate, plastyczność synaptyczna i pamięć strachu. Ann NY Acad Sci. 2003;985:106–113. [PubMed]
37. Maren S, Dziwactwo GJ. Sygnalizacja neuronalna pamięci strachu. Nat Rev Neurosci. 2004;5:844–852. [PubMed]
38. Margolis EB, Mitchell JM, Ishikawa J, Hjelmstad GO, Fields HL. Neurony dopaminowe śródmózgowia: cel projekcji określa czas trwania potencjału czynnościowego i hamowanie receptora dopaminy D (2). J Neurosci. 2008; 28: 8908 – 8913. [PubMed]
39. Margolis EB, Lock H, Chefer VI, Shippenberg TS, Hjelmstad GO, Fields HL. Opioidy kappa selektywnie kontrolują neurony dopaminergiczne wystające do kory przedczołowej. Proc Natl Acad Sci US A. 2006;103:2938-2942. [darmowy artykuł PMC] [PubMed]
40. Marowsky A, Yanagawa Y, Obata K, Vogt KE. Wyspecjalizowana podklasa neuronów pośrednich pośredniczy w dopaminergicznym ułatwianiu funkcji ciała migdałowatego. Neuron. 2005; 48: 1025 – 1037. [PubMed]
41. McNish KA, Gewirtz JC, Davis M. Dowody na kontekstualny strach po uszkodzeniach hipokampa: zakłócenie zastygnięcia w bezruchu, ale nie nasilonego strachem. J Neurosci. 1997;17:9353-9360. [PubMed]
42. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG. Receptory dopaminy: od struktury do funkcji. Physiol Rev. 1998;78:189–225. [PubMed]
43. Murphy CA, Pezze M, Feldon J, Heidbreder C. Zróżnicowane zaangażowanie dopaminy w powłoce i rdzeniu jądra półleżącego w ekspresji ukrytego hamowania na awersyjnie uwarunkowany bodziec. Neuronauka. 2000;97:469-477. [PubMed]
44. Pezze MA, Feldon J. Mesolimbic szlaki dopaminergiczne w warunkowaniu strachu. Prog Neurobiol. 2004; 74: 301 – 320. [PubMed]
45. Pezze MA, Bast T, Feldon J. Znaczenie transmisji dopaminy w przyśrodkowej korze przedczołowej szczura dla strachu warunkowego. Kora mózgowa. 2003;13:371–380. [PubMed]
46. Ponnusamy R, Nissim HA, Barad M. Systemowa blokada receptorów dopaminowych podobnych do D2 ułatwia wygaszanie warunkowanego strachu u myszy. Learn Mem. 2005; 12: 399 – 406. [Bezpłatny artykuł PMC] [PubMed]
47. Ralph RJ, Varty GB, Kelly MA, Wang YM, Caron MG, Rubinstein M, Grandy DK, Low MJ, Geyer MA. Podtyp receptora dopaminy D2, ale nie D3 lub D4, jest niezbędny do przerwania hamowania przedimpulsowego wytwarzanego przez amfetaminę u myszy. J Neurosci. 1999;19:4627-4633. [PubMed]
48. Ralph-Williams RJ, Lehmann-Masten V, Otero-Corchon V, Low MJ, Geyer MA. Zróżnicowane efekty bezpośrednich i pośrednich agonistów dopaminy na hamowanie prepulse: badanie na myszach z nokautem receptora D1 i D2. J Neurosci. 2002;22:9604–9611. [PubMed]
49. Richardson R. Wstrząsy uczulające na zaskoczenie: wyuczony czy niewyuczony strach? Behav Brain Res. 2000;110:109–117. [PubMed]
50. Risbrough VB, Geyer MA, Hauger RL, Coste S, Stenzel-Poore M, Wurst W, Holsboer F. Receptory CRF(1) i CRF(2) są wymagane w przypadku wzmocnionego zaskoczenia w przypadku wskazówek kontekstowych, ale nie dyskretnych. Neuropsychofarmakologia. 2008;19:19.
51. Rosenkranz JA, Grace AA. Modulacja dopaminowa wywołanych zapachami potencjałów ciała migdałowatego podczas warunkowania pavlovian. Natura. 2002; 417: 282 – 287. [PubMed]
52. Schultz W. Formalizm z dopaminą i nagrodą. Neuron. 2002;36:241–263. [PubMed]
53. Schwarzkopf SB, Mitra T, Bruno JP. Bramkowanie sensoryczne u szczurów pozbawionych dopaminy jako noworodki: potencjalne znaczenie dla wyników u pacjentów ze schizofrenią. Biol Psychiatria. 1992;31:759-773. [PubMed]
54. Schwarzkopf SB, Bruno JP, Mitra T. Wpływ haloperidolu i SCH 23390 na wstrząs akustyczny i hamowanie impulsu wstępnego w warunkach podstawowych i stymulowanych. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 1993;17:1023-1036. [PubMed]
55. Sigala S, Missale C, Spano P. Przeciwny wpływ receptorów dopaminy D2 i D3 na uczenie się i pamięć u szczurów. Eur J Pharmacol. 1997;336:107–112. [PubMed]
56. Sigurdsson T, Doyere V, Cain CK, LeDoux JE. Długotrwałe wzmocnienie w ciele migdałowatym: komórkowy mechanizm uczenia się strachu i pamięci. Neurofarmakologia. 2007;52:215–227. [PubMed]
57. Smith DR, Striplin CD, Geller AM, Mailman RB, Drago J, Lawler CP, Gallagher M. Ocena behawioralna myszy pozbawionych receptorów dopaminy D1A. Neuronauka. 1998;86:135-146. [PubMed]
58. Swant J, Wagner JJ. Blokada transportera dopaminy zwiększa LTP w regionie CA1 hipokampa szczura poprzez aktywację receptora dopaminy D3. Naucz się pam. 2006;13:161–167. [darmowy artykuł PMC] [PubMed]
59. Swerdlow NR, Shoemaker JM, Kuczenski R, Bongiovanni MJ, Neary AC, Tochen LS, Saint Marie RL. Funkcja przodomózgowia D1 i bramkowanie sensomotoryczne u szczurów: skutki blokady D1, uszkodzenia czołowe i odnerwienie dopaminy. Neurosci Lett. 2006;402:40–45. [PubMed]
60. Szczypka MS, Rainey MA, Kim DS, Alaynick WA, Marck BT, Matsumoto AM, Palmiter RD. Zachowania żywieniowe u myszy z niedoborem dopaminy. Proc Natl Acad Sci US A. 1999;96:12138-12143. [darmowy artykuł PMC] [PubMed]
61. Mądry RA. Dopamina, uczenie się i motywacja. Nat Rev Neurosci. 2004;5:483–494. [PubMed]
62. Zhou QY, Palmiter RD. Myszy z niedoborem dopaminy są ciężko hipoaktywne, adypijne i afagiczne. Komórka. 1995; 83: 1197 – 1209. [PubMed]
63. Zweifel LS, Argilli E, Bonci A, Palmiter RD. Rola receptorów NMDA w neuronach dopaminowych dla plastyczności i zachowań uzależniających. Neuron. 2008;59:486–496. [darmowy artykuł PMC] [PubMed]
;
