Proc Natl Acad Sci USA A. 2007 20 marca;104(12):5181-6. EPUB 2007, 9 marca.
Ventura R., Morrone C., Puglisi-Allegra S.
Źródło
Fundacja Santa Lucia, Europejskie Centrum Badań Mózgu (CERC), Via del Fosso di Fiorano 65, 00143 Rzym, Włochy. [email chroniony]
Abstrakcyjny
Najnowsze dowody sugerują, że bodźce nagradzające i awersyjne wpływają na te same obszary mózgu, w tym przyśrodkową korę przedczołową i jądro półleżące. Chociaż wiadomo, że jądro półleżące reaguje na istotne bodźce, niezależnie od ich wartościowości hedonicznej, selektywnie zwiększonym uwalnianiem dopaminy, niewiele wiadomo na temat roli kory przedczołowej w motywacji związanej z nagrodą i niechęcią lub na temat zaangażowanych neuroprzekaźników. Tutaj stwierdzamy, że selektywne wyczerpanie noradrenaliny w przyśrodkowej korze przedczołowej myszy zniosło wzrost uwalniania noradrenaliny przez korę przedczołową i dopaminy przez jądro półleżące, wywołane przez żywność, kokainę lub chlorek litu i zaburzyło warunkowanie miejsca wywołane zarówno przez lit chlorek (awersja) i żywność lub kokaina (preferencja). Jest to dowód na to, że transmisja noradrenaliny w korze przedczołowej jest konieczna do motywacyjnego przypisania istotności zarówno bodźcom związanym z nagrodą, jak i niechęcią, poprzez modulację dopaminy w jądrze półleżącym, obszarze mózgu zaangażowanym we wszystkie motywowane zachowania.
Zarówno zwierzęta, jak i ludzie mają skłonność do szukania nagród i unikania kar. To wyraźnie adaptacyjne zachowanie obejmuje zdolność do reprezentowania wartości bodźców nagradzających i karających, ustalania przewidywań na ich temat i wykorzystywania tych przewidywań do kierowania zachowaniem (1). O ile emocje można zdefiniować jako „stany wywoływane przez czynniki wzmacniające (nagrody i kary)” (2), zrozumienie obszarów mózgu zaangażowanych w przetwarzanie najistotniejszych motywacyjnie bodźców nagradzających lub awersyjnych może być istotne dla zrozumienia licznych deficytów emocjonalnych u ludzi.
Najnowsze dane wskazują, że jądro półleżące (NAc) i kora przedczołowa (pFC) stanowią wspólny substrat do przetwarzania zarówno bodźców nagradzających, jak i awersyjnych (3–7). Prążkowie brzuszne (lub NAc) biorą udział w przetwarzaniu informacji leżących u podstaw kontroli motywacyjnej zachowań ukierunkowanych na cel, a badania na ludziach i zwierzętach potwierdzają ogólną rolę tego obszaru mózgu w przetwarzaniu zarówno bodźców nagradzających, jak i awersyjnych, niezależnie od wartościowości (3–8). ).
Co więcej, duża część dowodów sugeruje, że pFC jest bezpośrednio zaangażowana w zachowania ukierunkowane na cel, a także w przetwarzanie afektywne (1, 9). Jednakże, chociaż zaproponowano, że transmisja dopaminy w NAc pośredniczy we wspólnym procesie „motywacyjnej istotności” w dodatniej i ujemnej wartościowości (3, 6), rola pFC w tym procesie i zaangażowany substrat neurochemiczny są nadal nieznane.
Transmisja noradrenaliny w pFC jest aktywowana przez bodźce awersyjne (10, 11) oraz przez awersyjne i warunkowe bodźce apetytywne (12, 13). Co więcej, niedawno wykazano, że noradrenalina w przyśrodkowym pFC (mpFC) bierze udział w nagradzającym działaniu niektórych powszechnie nadużywanych narkotyków poprzez swoje modulujące działanie na uwalnianie dopaminy w NAc (14, 15). Sugeruje to, że transmisja noradrenaliny w korze przedczołowej angażuje dopaminę półleżącą w celu przetwarzania istotnych bodźców motywacyjnych.
Tutaj, używając myszy, postanowiliśmy ocenić, czy układ dopaminowy kory przedczołowej norepinefryny / mezopółleżącego jest powszechnym substratem neuronowym zaangażowanym w przetwarzanie afektywnie pozytywnych i negatywnych bodźców. W szczególności zbadaliśmy, czy noradrenalina w mpFC, poprzez jej modulujące działanie na dopaminergiczny układ mezolimbiczny, jest konieczna do przypisania znaczenia motywacyjnego bodźcom związanym z nagrodą i niechęcią.
Ponieważ doświadczenie jest głównym czynnikiem determinującym wpływ motywacyjny danego bodźca (7), oceniliśmy skutki pierwszej ekspozycji na nagradzające bodźce naturalne (smaczne jedzenie, mleczna czekolada) i farmakologiczne (kokaina) oraz na awersyjny bodziec farmakologiczny [chlorek litu (LiCl)] na norepinefrynę w korze przedczołowej i uwalnianie dopaminy w półleżącej drodze mikrodializy śródmózgowej. Ponadto, aby ustalić, czy przedczołowa transmisja noradrenaliny reguluje zwiększony odpływ dopaminy z półleżącej części ciała, wywołany pierwszą ekspozycją na te motywująco istotne bodźce, oceniliśmy również wpływ selektywnego wyczerpania noradrenaliny w mpFC na uwalnianie dopaminy w NAc i na uwalnianie noradrenaliny w mpFC wywołane pierwszą ekspozycją na te bodźce.
Na koniec zbadaliśmy wpływ selektywnego noradrenergicznego wyczerpania przedczołowego na warunkową preferencję miejsca (CPP) wywołaną czekoladą i kokainą oraz na niechęć do warunkowego miejsca (CPA) wywołaną LiCl. Do tego badania wybrano procedurę warunkowania miejsca, ponieważ umożliwiła ocenę nabywania warunkowanych właściwości apetycznych i awersyjnych pod wpływem bodźców w połączeniu z pierwotnymi nagrodami i zdarzeniami awersyjnymi, a także ponieważ duża ilość dowodów wskazuje, że jest to wiarygodna miara procesów leżących u podstaw tego badania. przypisywanie znaczenia motywacyjnego bodźcom (3, 16).
WYNIKI
Eksperymentuj 1.
Aby ocenić, czy pierwsza ekspozycja zarówno na nagradzające, jak i awersyjne istotne bodźce wpływa na przedczołowy wypływ noradrenaliny i odpływ dopaminy w części półleżącej, oceniliśmy, za pomocą mikrodializy śródmózgowej, wpływ ogólnoustrojowego spożycia kokainy lub LiCl i czekolady na uwalnianie noradrenaliny w mpFC i odpływ dopaminy w NAc. Ponadto, aby ustalić, czy korowa transmisja noradrenergiczna jest konieczna dla odpływu dopaminy z półleżącego obszaru wywołanego pierwszą ekspozycją na te motywująco istotne bodźce, oceniliśmy wpływ selektywnego wyczerpania noradrenergii na odpowiedź dopaminy półleżącej indukowaną przez kokainę, czekoladę i LiCl. Kokaina, czekolada i LiCl powodowały zależny od czasu wzrost odpływu noradrenaliny w mpFC w grupach leczonych pozornie, osiągając maksymalny wzrost ≈200% po 40 minutach, ≈70% po 120 minutach i ≈100% po 60 minutach, odpowiednio (ryc. 1a). Chociaż szeroko donoszono o zwiększonym uwalnianiu noradrenaliny w pFC w odpowiedzi na kokainę, według naszej wiedzy jest to pierwszy raport o zwiększonym odpływie noradrenaliny wywołanym pierwszą ekspozycją na czekoladę lub ogólnoustrojowy LiCl w mpFC. Bodźce te spowodowały również równoległy zależny od czasu wzrost odpływu dopaminy w NAc zwierząt leczonych pozornie (ryc. 1b), zgodnie z poglądem, że obszar ten odgrywa główną rolę w przetwarzaniu istotnych bodźców niezależnie od ich wartościowości (3 , 6). Oceniono także wpływ tego wyczerpania na uwalnianie noradrenaliny w mpFC. Ubytek noradrenaliny przedczołowej uzyskano poprzez selektywne neurotoksyczne wyczerpanie przedczołowych kory doprowadzającej noradrenalinę (grupy zubożone w noradrenalinę) w mpFC po ochronie dopaminy przez selektywny inhibitor wychwytu. Metoda ta spowodowała głębokie zmniejszenie poziomu noradrenaliny w tkankach (≈90%), pozostawiając praktycznie niezmieniony poziom dopaminy w tkankach. Zwierzęta kontrolne (grupy leczone pozornie) poddano takiemu samemu leczeniu jak myszy zubożone w noradrenalinę, ale otrzymały nośnik śródmózgowy. (Poziomy noradrenaliny w tkankach były następujące: grupa leczona pozornie, 698 ± 26 ng/g mokrej tkanki; grupa zubożona w noradrenalinę, 63 ± 17 ng/g mokrej tkanki. Poziomy dopaminy w tkankach były następujące: grupa pozornie leczona, 203 ± 18 ng/g mokrej tkanki; grupa zubożona w noradrenalinę, 189 ± 16 ng/g mokrej tkanki.)
Rys.. 1.
Ubytek noradrenaliny w korze przedczołowej w noradrenalinie zewnątrzkomórkowej w mpFC i dopaminie w NAc. Pozakomórkowa noradrenalina (NE) w mpFC (a) i dopamina (DA) w NAc (b) zwierząt pozornie leczonych lub zubożonych w noradrenalinę, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, (więcej…)
Selektywne wyczerpanie noradrenaliny w mpFC zaburzyło wzrost uwalniania dopaminy w półleżącej części ciała i uwalnianie noradrenaliny w korze przedczołowej indukowane zarówno lekami, jak i czekoladą (ryc. 1), chociaż nie wpłynęło to znacząco na podstawową zewnątrzkomórkową dopaminę w NAc (grupa leczona pozornie, 1.35 ± 0.15 pg na 20 µl; grupa zubożona w noradrenalinę, 1.29 ± 0.18 pg na 20 µl) lub podstawna zewnątrzkomórkowa noradrenalina w mpFC (grupa leczona pozornie, 1.31 ± 0.18 pg na 20 µl; grupa zubożona w noradrenalinę, 1.26 ± 0.17 pg na 20 µl). Średnie podstawowe wartości dopaminy w NAc i norepinefryny w mpFC dla każdej grupy [sól fizjologiczna, kokaina (20 mg/kg), LiCl (3 meq/kg) i czekolada] nie różniły się istotnie
Nasze wyniki wskazują, że nienaruszona transmisja noradrenergiczna w mpFC jest warunkiem koniecznym stymulacji uwalniania dopaminy indukowanej zarówno przez bodźce nagradzające, jak i awersyjne w NAc, co silnie sugeruje jej główną rolę w znaczeniu motywacyjnym.
Eksperymentuj 2.
Aby zbadać, czy przedczołowa transmisja noradrenaliny jest konieczna do uzyskania warunkowych właściwości apetycznych i awersyjnych na bodźce w połączeniu z pierwotnymi nagrodami i zdarzeniami awersyjnymi, oceniliśmy wpływ selektywnego wyczerpania noradrenaliny przedczołowej na warunkowanie miejsca.
Przedczołowe wyczerpanie noradrenergii zniosło zarówno CPP indukowane kokainą i czekoladą, jak i CPA indukowane przez LiCl. Tak więc, chociaż zwierzęta leczone pozornie wykazywały znaczną preferencję dla przedziału sparowanego z kokainą lub czekoladą i znaczną niechęć do przedziału sparowanego z LiCl (ryc. 2a), zwierzęta zubożone w noradrenalinę nie wykazywały preferencji dla żadnego przedziału (ryc. 2b ).
Rys.. 2.
Wyczerpanie noradrenaliny w korze przedczołowej w wyniku warunkowania miejsca. Skutki spożycia pokarmu (1 g mlecznej czekolady; grupa pozorowana, n = 8; grupa zubożona w noradrenalinę, n = 8) i ogólnoustrojowe wstrzyknięcie (ip) soli fizjologicznej (Sal) (grupa pozorowana, (więcej…)
Należy zauważyć, że we wstępnych eksperymentach zaobserwowaliśmy, że zarówno CPP, jak i CPA zwierząt leczonych pozornie były nie do odróżnienia od zwierząt nieleczonych wcześniej. Zwierzęta, które doświadczyły parowania soli fizjologicznej w obu przedziałach, nie wykazywały preferencji dla żadnego przedziału, niezależnie od stanu uszkodzenia (leczenie pozorowane lub niedobór noradrenaliny). Zachowanie zwierząt zubożonych w noradrenalinę, którym podawano kokainę, czekoladę lub LiCl, było podobne do zachowania zwierząt, którym podczas szkolenia podawano wyłącznie roztwór nośnika; tj. nie wykazali preferencji dla żadnego przedziału.
DYSKUSJA
Tutaj przedstawiamy dowody na to, że transmisja noradrenaliny w korze przedczołowej, poprzez modulację dopaminy w NAc, jest warunkiem koniecznym przypisywania motywacyjnego znaczenia zarówno bodźcom związanym z nagrodą, jak i niechęcią.
Po pierwsze, ponieważ wcześniejsze doświadczenie jest głównym wyznacznikiem motywacyjnego wpływu danego bodźca (7), za pomocą mikrodializy śródmózgowej oceniliśmy skutki pierwszego narażenia na ogólnoustrojową kokainę lub LiCl, a także wpływ spożycia czekolady na noradrenalinę lub dopaminę wydanie odpowiednio w mpFC i NAc. Kokaina, czekolada i LiCl powodowały zależny od czasu wzrost poziomu dopaminy w półleżącej części ciała, a także przedczołowego wypływu noradrenaliny w grupach leczonych pozornie. Znaczący wzrost nadmiaru noradrenaliny był widoczny w mpFC zwierząt, którym podano pozornie, w ciągu 20 minut od otrzymania czekolady; następnie przepełnienie powróciło do poziomów wyjściowych, po czym nastąpił duży, trwały wzrost. Chociaż ten dwufazowy wzrost noradrenaliny w mpFC wywołany czekoladą nie był równy wzrostowi dopaminy w NAc przez cały czas, początkowy wzrost był prawdopodobnie związany z wpływem smacznej żywności i wzrostem dopaminy w NAc. Z drugiej strony drugi duży wzrost może reprezentować neurochemiczny korelat pobudzenia korowego wymaganego do przetwarzania informacji przestrzennych związanych z wyszukiwaniem i lokalizowaniem nagrody pożywieniowej (17). W rzeczywistości zasugerowano, że zwiększony odpływ noradrenaliny służy do sygnalizowania obecności bodźców o dużym znaczeniu motywacyjnym (17). Zatem ten zwiększony odpływ noradrenaliny może pozwolić na selektywną uwagę wymaganą do poszukiwania dodatkowego smacznego pożywienia i może pomóc w nabyciu uwarunkowanych właściwości apetycznych na bodźce połączone z jedzeniem. Nie można jednak wykluczyć wpływu spożycia pokarmu na noradrenalinę.
Chociaż szeroko donoszono o zwiększonym uwalnianiu dopaminy w NAc wywołanym bodźcami nagradzającymi lub awersyjnymi oraz zwiększonym uwalnianiu noradrenaliny w pFC w odpowiedzi na kokainę, według naszej wiedzy jest to pierwszy raport o zwiększonym odpływie noradrenaliny wywołanym ekspozycją na czekoladę lub LiCl w mpFC. Co najważniejsze, pokazujemy tutaj, że przedczołowa korowa transmisja noradrenergiczna jest konieczna do odpływu dopaminy z półleżącej części ciała, wywołanego pierwszą ekspozycją na te motywująco istotne bodźce. W rzeczywistości u myszy zubożonych w noradrenalinę nie zaobserwowano znaczącego wzrostu zarówno przedczołowego, jak i półleżącego wypływu dopaminy, wywołanego tymi bodźcami. Noradrenalina w mpFC może aktywować uwalnianie dopaminy w obszarze mezopółleżącym poprzez pobudzającą projekcję korową przedczołową do komórek dopaminowych brzusznego obszaru nakrywkowego (18, 19) i/lub poprzez projekcje glutaminergiczne korowo-półleżące (20). Co więcej, można przewidzieć rolę projekcji pFC do miejsca sinawego w wywieraniu wpływu pobudzającego, ponieważ wykazano, że jądro to aktywuje neurony dopaminowe brzusznego obszaru nakrywkowego (21–23), co może prowadzić do zwiększonego uwalniania dopaminy w NAc.
Zatem nasze wyniki, zgodnie z wcześniejszymi raportami, pokazują, że zarówno bezwarunkowe bodźce nagradzające, jak i awersyjne zwiększają odpływ noradrenaliny w mpFC (10–15), a także uwalnianie dopaminy w NAc (3, 24). Co jednak najważniejsze, pokazują, że nienaruszona transmisja noradrenergiczna w mpFC jest warunkiem koniecznym stymulacji uwalniania dopaminy indukowanej zarówno przez nagradzające, jak i awersyjne bodźce farmakologiczne i naturalne w NAc. Dlatego wskazują na norepinefrynę przedczołową oraz półleżąca transmisja dopaminy jako układ nerwowy, którego aktywacja przez bezwarunkowe bodźce nagradzające i awersyjne jest prawdopodobnie podłożem dla wyrazistości motywacyjnej. Pogląd ten potwierdzają wyniki eksperymentów behawioralnych dotyczących wpływu wyczerpania noradrenaliny przedczołowej na warunkowanie miejsca indukowane kokainą, czekoladą lub LiCl.
Zatem drugim ważnym wnioskiem z tego badania jest to, że wyczerpanie noradrenaliny w korze przedczołowej upośledza zarówno CPP indukowane przez kokainę lub żywność, jak i CPA indukowane przez LiCl. Chociaż zwierzęta leczone pozornie wykazywały znaczną preferencję dla przedziału sparowanego z kokainą lub czekoladą i znaczną niechęć do przedziału sparowanego LiCl, zwierzęta zubożone w noradrenalinę nie wykazywały preferencji dla żadnego przedziału, wykazując w ten sposób, że konieczne jest nienaruszone przekazywanie noradrenaliny przez korę przedczołową do nabywania uwarunkowanych właściwości bodźców w połączeniu z pierwotnymi zdarzeniami nagradzającymi lub awersyjnymi w procedurze warunkowania miejsca.
Niniejsze wyniki wskazują, że u myszy zubożonych w noradrenalinę w korze przedczołowej brak uwalniania noradrenaliny wywołany ekspozycją na bodźce nagradzające i awersyjne (kokaina, żywność lub LiCl, bodziec bezwarunkowy) uniemożliwiał przypisanie wyrazistości motywacyjnej bodźcowi warunkowemu (wzorzec przestrzenny) podczas sesje parowania. Należy również zauważyć, że niedobór noradrenaliny w przedczołowej części ciała nie zakłócał ani procesów skojarzeniowych, ani mnemonicznych, ponieważ, jak wykazano wcześniej, zwierzęta zubożone w noradrenalinę okazały się zdolne do nauczenia się zadania biernego unikania (15) i powiązania kontekstu z działaniem leku (14). Jednakże konieczne są dalsze badania, aby zrozumieć dokładny charakter zaburzeń u zwierząt z niedoborem noradrenaliny w korze przedczołowej.
Uważa się, że transmisja dopaminergiczna w NAc pośredniczy w hedonicznym wpływie nagrody lub niektórych aspektach uczenia się poprzez nagrodę (przegląd w ref. 25). Nasze wyniki, zgodnie z innym poglądem (3), pokazują, że transmisja dopaminy w NAc odgrywa rolę zarówno w zachowaniach motywowanych pozytywnie, jak i awersyjnie; co jednak najważniejsze, pokazują, że tym procesem motywacyjnym zarządza norepinefryna z kory przedczołowej. W rzeczywistości selektywne wyczerpanie noradrenaliny w przedczołowej powoduje blokadę CPP indukowanego zarówno kokainą lub czekoladą, jak i CPA indukowanego LiCl oraz upośledzenie uwalniania dopaminy w NAc indukowane przez te istotne bodźce u myszy kontrolnych, co pokazuje, że noradrenergiczna transmisja przedczołowa poprzez modulację uwalniania dopaminy w NAc, jest warunkiem niezbędnym do motywacyjnego przetwarzania bodźców związanych zarówno z nagrodą, jak i niechęcią.
Podsumowując, obecne wyniki eksperymentów behawioralnych i mikrodializ pokazują, że przedczołowa transmisja noradrenaliny nie tylko pośredniczy w nagradzających właściwościach powszechnie nadużywanych narkotyków, jak sugerowały poprzednie badania (14, 15), ale jest niezbędna do przypisywania motywacyjnego znaczenia zarówno nagrodom, jak i bodźce związane z niechęcią, co dodatkowo pokazuje, że leki uzależniające, a także awersyjne bodźce farmakologiczne wykorzystują ten sam mechanizm neurobiologiczny, co bodźce naturalne.
Podsumowując, nasze dane stanowią uzupełnienie wcześniejszych ustaleń, które wskazywały na mezolimbiczny układ dopaminergiczny jako „system istotności” zaangażowany we wszystkie motywowane zachowania (3, 6, 26). Wykazują również, że układ ten znajduje się pod kontrolą kory przedczołowej noradrenaliny, co potwierdza pogląd, że bodźce nagradzające i awersyjne wpływają na podobne ścieżki w OUN (7).
Nasze wyniki dostarczają wiedzy na temat neurobiologii nagrody i niechęci, ponieważ pokazują, że przetwarzanie zarówno istotnych bodźców nagradzających, jak i awersyjnych angażuje te same obszary mózgu; tj. wskazują na przedczołową transmisję noradrenergiczną i półleżącą transmisję dopaminergiczną jako wspólny układ nerwowy. Zrozumienie systemów neuroprzekaźników aktywowanych przez afektywnie nagradzające lub awersyjne bodźce oraz ich mechanizmów molekularnych pomoże zapewnić podstawę do wyjaśnienia funkcjonowania układów nerwowych zaangażowanych w pozytywne i negatywne emocje.
MATERIAŁY I METODY
Zwierząt.
Samce myszy wsobnego szczepu C57BL/6JIco (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), które są powszechnie stosowane w fenotypowaniu neurobehawioralnym, w wieku 8–9 tygodni w momencie eksperymentów, trzymano jak opisano wcześniej (14, 15). Każda grupa doświadczalna składała się z sześciu do ośmiu zwierząt. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono zgodnie z włoskim prawem krajowym (Decreto Legislative nr 116, 1992) regulującym wykorzystywanie zwierząt do celów badawczych.
Leki.
Wodzian chloralu, 6-hydroksydopaminę (6-OHDA), GBR 12909, chlorowodorek kokainy i LiCl zakupiono od Sigma – Aldrich (St. Louis, MO). Kokainę (20 mg/kg), LiCl (3.0 meq/kg), wodzian chloralu (350–450 mg/kg) i GBR 12909 (15 mg/kg) rozpuszczono w soli fizjologicznej (0.9% NaCl) i wstrzyknięto dootrzewnowo objętość 10 ml/kg. 6-OHDA rozpuszczono w soli fizjologicznej zawierającej pirosiarczyn sodu (0.1 M). W przypadku eksperymentów z jedzeniem nagrodą była mleczna czekolada (1 g; Nestlé, Vevey, Szwajcaria).
Mikrodializa.
Zwierzęta znieczulono wodzianem chloralu (450 mg/kg), umieszczono w ramie stereotaktycznej (David Kopf Instruments, Tujunga, Kalifornia) wyposażonej w adapter myszy i wszczepiono jednostronnie kaniulę prowadzącą (stal nierdzewna, zewnętrzna średnica trzonu 0.38 mm ;Metalant AB, Sztokholm, Szwecja) w mpFC lub NAc (14, 15). Długość kaniuli prowadzącej wynosiła 1 mm dla mpFC i 4.5 mm dla NAc. Kaniulę prowadzącą umocowano klejem epoksydowym i dodano cementu dentystycznego w celu dalszej stabilizacji. Współrzędne z bregmy [mierzone według metod Franklina i Paxinosa (27)] były następujące: +2.52 przednio-tylne i 0.6 boczne dla mpFC oraz +1.60 przednio-tylne i 0.6 boczne dla NAc [głównie uwzględniając podział powłoki (27)]. Sondę (długość membrany dializacyjnej 2 mm dla mpFC i 1 mm dla NAc i średnica zewnętrzna 0.24 mm, sonda do mikrodializy miedziowej MAB 4; Metalant AB) wprowadzono 24 godziny przed eksperymentami z mikrodializą. Zwierzęta lekko znieczulono wodzianem chloralu (350 mg/kg), aby ułatwić ręczne wprowadzenie sondy do mikrodializy do kaniuli prowadzącej. Zwierzęta wróciły do swoich domowych klatek. Rurki sondy wylotowej i wlotowej zabezpieczono lokalnie nałożoną folią Parafilm. Błony badano pod kątem odzysku dopaminy i noradrenaliny in vitro (odzysk względny był następujący: dopamina 10.7 ± 0.82%; norepinefryna 12.2 ± 0.75%; n = 20) dzień przed użyciem w celu sprawdzenia odzysku.
Sondę do mikrodializy podłączono do pompy CMA/100 (Carnegie Medicine, Sztokholm, Szwecja) poprzez rurkę PE 20 (Metalant AB) i dwukanałowy krętlik do cieczy o ultraniskim momencie obrotowym (model 375/D/22QM; Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA), aby umożliwić swobodny przepływ. Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (147 mM NaCl/1 mM MgCL/1.2 mM CaCl2/4 mM KCl) pompowano przez sondę dializacyjną przy stałym natężeniu przepływu 2 µl/min. Eksperymenty przeprowadzono 22–24 godziny po umieszczeniu sondy. Każde zwierzę umieszczono w okrągłej klatce wyposażonej w sprzęt do mikrodializy (Instech Laboratories) i wyściółkę klatki domowej na podłodze. Perfuzję dializacyjną rozpoczęto 1 godzinę później. Po rozpoczęciu perfuzji dializacyjnej myszy pozostawiono w spokoju przez około 2 godziny przed pobraniem próbek wyjściowych. Jako stężenie podstawowe przyjęto średnie stężenie trzech próbek pobranych bezpośrednio przed leczeniem (zmienność <10%). Przed rozpoczęciem eksperymentów z mikrodializą myszy przydzielono do jednej z różnych terapii (sól fizjologiczna, kokaina, czekolada lub LiCl) w każdej grupie (leczone pozornie lub z wyczerpaniem noradrenaliny). W przypadku eksperymentów z pożywieniem zwierzęta objęto harmonogramem pozbawienia pożywienia (28) na 4 dni przed rozpoczęciem eksperymentów.
Dializat zbierano co 20 minut przez 120 (dla grup kokainy i LiCl) lub 160 (dla grup żywności) min. Przedstawiono jedynie dane dotyczące myszy z prawidłowo umieszczoną kaniulą. Umiejscowienie oceniano poprzez barwienie błękitem metylenowym. Dwadzieścia mikrolitrów próbek dializatu analizowano metodą HPLC. Pozostałe 20 µl zachowano do ewentualnej późniejszej analizy. Stężenia (pg na 20 µl) nie zostały skorygowane pod kątem odzysku sondy. System HPLC składał się z systemu HPLC Alliance (Waters, Milford, MA) i detektora kulometrycznego (model 5200A; Coulochem II, ESA, Chelmsford, MA) wyposażonego w kuwetę kondycjonującą (M 5021) i kuwetę analityczną (M 5011). . Komórkę kondycjonującą ustawiono na 400 mV, elektrodę 1 na 200 mV, a elektrodę 2 na -250 mV. Zastosowano kolumnę Nova-Pack C18 (3.9 x 150 mm; Waters) utrzymywaną w temperaturze 33°C. Szybkość przepływu wynosiła 1.1 ml/min. Fazę ruchomą opisano wcześniej (14, 15). Granica wykrywalności testu wynosiła 0.1 pg.
Wyczerpanie noradrenaliny w mpFC.
Znieczulenie i zestaw chirurgiczny opisano powyżej. Zwierzętom wstrzyknięto GBR 12909 (15 mg/kg) 30 minut przed mikroiniekcją 6-OHDA w celu ochrony neuronów dopaminergicznych. Wstrzyknięto obustronnie 6-OHDA (1.5 μg na 0.1 μl przez 2 minuty z każdej strony) do mpFC [współrzędne +2.52 przednio-tylne, ±0.6 boczne i -2.0 brzuszne względem bregmy (27)] przez stalową rurkę ze stali nierdzewnej kaniulę (zewnętrzna średnica 0.15 mm; Unimed, Lozanna, Szwajcaria) połączoną ze strzykawką o pojemności 1 μl rurką polietylenową i napędzaną pompą CMA/100. Po zakończeniu infuzji kaniulę pozostawiono na miejscu na dodatkowe 2 minuty. Zwierzęta leczone pozornie poddano temu samemu leczeniu, ale otrzymały nośnik śródmózgowy. Zwierzęta wykorzystano do mikrodializy lub eksperymentów behawioralnych 7 dni po operacji.
Poziomy noradrenaliny i dopaminy w tkankach mpFC oceniano jak opisano wcześniej (14, 15), aby ocenić stopień wyczerpania.
Klimatyzacja miejsca.
Eksperymenty behawioralne przeprowadzono przy użyciu aparatu do warunkowania miejsca (14, 15, 29). Aparat składał się z dwóch komór z szarego pleksiglasu (15 × 15 × 20 cm) i centralnej alei (15 × 5 × 20 cm). Dwoje drzwi przesuwnych (4×20 cm) łączyło aleję z komnatami. W każdej komorze jako bodźce warunkowe wykorzystano dwa trójkątne równoległościany (5 × 5 × 20 cm) wykonane z czarnej pleksiglasu i ułożone w różne wzory (zawsze pokrywające tę samą powierzchnię komory). Zwierzęta wykorzystano do eksperymentów behawioralnych 7 dni po operacji. Przed kondycjonowaniem myszy przydzielono do jednego z różnych sposobów leczenia (sól fizjologiczna, kokaina, czekolada lub LiCl) w każdej grupie (leczone pozornie lub z wyczerpaniem noradrenaliny).
Procedura treningu warunkowania miejsca została opisana wcześniej (14, 15). W skrócie, pierwszego dnia (test wstępny) myszy mogły swobodnie eksplorować cały aparat przez 1 minut. Przez następne 20 dni (faza kondycjonowania) myszy zamykano codziennie na 8 minut na przemian w jednej z dwóch komór. W przypadku kondycjonowania miejsca bodźcami farmakologicznymi, jeden ze wzorów był konsekwentnie łączony z solą fizjologiczną, a drugi z kokainą (40 mg/kg ip, CPP) lub LiCl (20 meq/kg ip, CPA) podczas fazy kondycjonowania. Dawki te wybrano na podstawie wcześniejszych badań wykazujących, że myszy C3.0BL/57JIco wykazują silniejszy CPP przy dawce kokainy 6 mg/kg (20, 30) i tendencję do niechęci w teście CPA przy dawce LiCl wynoszącej 31 meq/ kg (3.0). W przypadku zwierząt w grupie kontrolnej obie komory połączono z solą fizjologiczną. W przypadku CPP z jedzeniem jeden ze wzorców był konsekwentnie łączony ze standardową karmą (32 g standardowej diety myszy), a drugi ze smacznym pokarmem (1 g mlecznej czekolady). Zwierzęta umieszczono w harmonogramie ograniczeń pokarmowych (1) na 28 dni przed rozpoczęciem kondycjonowania. Ten harmonogram trwał przez cały okres kondycjonowania.
We wszystkich eksperymentach z warunkowaniem miejsca pary były zrównoważone tak, że dla połowy każdej grupy eksperymentalnej bodziec bezwarunkowy (kokaina, czekolada lub LiCl) został sparowany z jednym z dwóch wzorców; w przypadku drugiej połowy każdej grupy bodziec bezwarunkowy sparowano z drugim wzorcem. Testowanie ekspresji CPP lub CPA przeprowadzono 10 dnia, stosując procedurę przedtestową. Dane behawioralne zebrano i przeanalizowano za pomocą w pełni zautomatyzowanego systemu śledzenia wideo EthoVision (Noldus, Wageningen, Holandia). W skrócie, układ eksperymentalny jest rejestrowany za pomocą kamery wideo CCD. Sygnał jest następnie digitalizowany (przez urządzenie sprzętowe zwane chwytakiem ramki) i przekazywany do pamięci komputera. Później dane cyfrowe są analizowane za pomocą oprogramowania EthoVision w celu uzyskania „czasu spędzonego” (w sekundach), który jest wykorzystywany jako surowe dane do oceny preferencji w każdym sektorze aparatu przez każdego badanego.
Statystyki.
Klimatyzacja miejsca.
W przypadku eksperymentów z warunkowaniem miejsca przeprowadzono analizy statystyczne poprzez obliczenie czasu (w sekundach) spędzonego w przedziałach środkowym (środek), z parą leku/czekolady (sparowane) i solą fizjologiczną/standardową parą z żywnością (niesparowane) w dniu testu. W przypadku zwierząt otrzymujących połączenie soli fizjologicznej z obydwoma przedziałami, przedział Sparowany został zidentyfikowany jako pierwszy, na który były narażone.
Wpływ selektywnego wyczerpania noradrenaliny w korze przedczołowej na warunkowanie miejsca.
Dane z eksperymentów z warunkowaniem miejsca analizowano za pomocą ANOVA z powtarzanymi pomiarami, z jednym czynnikiem międzyczynnikowym (wstępne leczenie, dwa poziomy: leczenie pozorowane i niedobór noradrenaliny) i jednym wewnątrzczynnikowym (parowanie, trzy poziomy: środkowy, sparowany i niesparowany) dla każdego leczenia [ sól fizjologiczna/sól fizjologiczna, sól fizjologiczna/kokaina (20 mg/kg), sól fizjologiczna/LiCl (3 meq/kg) i standardowa żywność/czekolada]. Ponieważ ważne porównania dotyczą przedziałów sparowanych i niesparowanych, średnie porównania czasu spędzonego w tych komorach przeprowadzono przy użyciu ANOVA z powtarzanymi pomiarami w każdej grupie.
Dwuczynnikowa analiza ANOVA ujawniła istotną interakcję wstępnego leczenia × parowanie dla kokainy [F (2, 28) = 3.47; P < 0.05], LiCl [F (2, 28) = 4.55; P < 0.05] i czekolada [F (2, 28) = 3.5; p < 0.05].
ANOVA z powtarzanymi pomiarami w każdej grupie ujawniła istotny wpływ współczynnika parowania tylko w przypadku zwierząt leczonych pozornie, którym wstrzyknięto kokainę [F (1, 14) = 24.3; P < 0.0005], LiCl [F (1, 14) = 10.3; P < 0.01] lub czekolada [F (1, 14) = 7.31; p < 0.05].
Niedobór noradrenaliny w mpFC.
Wpływ niedoboru noradrenaliny w przedczołowej części ciała na poziomy dopaminy i noradrenaliny w tkankach w mpFC analizowano za pomocą dwuczynnikowej analizy ANOVA. Czynniki były następujące: uszkodzenie (dwa poziomy: leczenie pozorowane i niedobór noradrenaliny) i eksperyment (dwa poziomy: eksperyment behawioralny i eksperymenty z mikrodializą). W stosownych przypadkach przeprowadzono indywidualne porównania między grupami za pomocą testu post hoc, testu wielozakresowego Duncana. Analizy statystyczne przeprowadzono na danych z eksperymentów behawioralnych i mikrodializ. Dwuczynnikowa analiza ANOVA dla wpływu niedoboru noradrenaliny w okolicy czołowej na poziomy dopaminy i noradrenaliny w tkance w mpFC wykazała istotny efekt uszkodzenia tylko dla noradrenaliny [F (1, 188) = 2.02; P < 0.0005], ale bez efektów eksperymentalnych.
Mikrodializa.
Analizy statystyczne przeprowadzono na danych surowych (stężenia pg na 20 µl). Wpływ wyczerpania przedczołowej noradrenaliny na uwalnianie noradrenaliny w mpFC lub na odpływ dopaminy w NAc zwierząt poddanych prowokacji kokainą (20 mg/kg) lub LiCl (3 meq/kg) analizowano za pomocą ANOVA z powtarzanymi pomiarami z dwoma czynnikami pomiędzy (podawanie wstępne, dwa poziomy, leczenie pozorowane i wyczerpanie noradrenaliny oraz leczenie, trzy poziomy, sól fizjologiczna, kokaina i LiCl) i jeden w obrębie czynnika (czas, siedem poziomów, 0, 20, 40, 60, 80, 100 i 120). Wpływ niedoboru noradrenaliny w przedczołowym układzie nerwowym na uwalnianie noradrenaliny w mpFC lub na odpływ dopaminy w NAc zwierząt narażonych na działanie czekolady analizowano za pomocą powtarzanych pomiarów ANOVA z jednym pomiędzy czynnikami (obróbka wstępna, dwa poziomy, leczenie pozorowane i zubożenie noradrenaliny) i jednym w obrębie czynnika ( czas, dziewięć poziomów, 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140 i 160). Proste efekty oceniano za pomocą jednokierunkowej analizy ANOVA dla każdego punktu czasowego. W stosownych przypadkach przeprowadzono indywidualne porównania między grupami za pomocą testu post hoc, testu wielozakresowego Duncana.
Analizy statystyczne dotyczące wpływu bodźców farmakologicznych na przedczołowy odpływ noradrenaliny wykazały istotną interakcję wstępne leczenie × leczenie × czas [F (12, 180) = 4.98; p < 0.005]. Analizy statystyczne dotyczące wpływu spożycia czekolady na uwalnianie noradrenaliny wykazały interakcję wstępnego leczenia × czas [F (8, 80) = 7.77; p < 0.005]. Proste analizy efektów wykazały istotny wpływ czasu tylko w przypadku grupy otrzymującej pozornie i znaczącą różnicę między grupami otrzymującymi pozornie a grupami zubożonymi w noradrenalinę po wstrzyknięciu kokainy lub LiCl, a także po spożyciu czekolady.
Analizy statystyczne dotyczące wpływu bodźców farmakologicznych na odpływ dopaminy z części półleżącej wykazały istotną interakcję leczenie wstępne × leczenie × czas [F (12, 180) = 10.02; P < 0.0005]. Analizy statystyczne danych dotyczących czekolady wykazały istotną interakcję obróbka wstępna × czas [F (8, 80) = 2.12; p < 0.05]. Proste analizy efektów wykazały istotny wpływ czasu tylko dla grup otrzymujących pozornie i znaczącą różnicę pomiędzy grupami otrzymującymi pozornie i grupami zubożonymi w noradrenalinę po wstrzyknięciu leku (kokainy lub LiCl), jak również po spożyciu czekolady.
PODZIĘKOWANIA
Dziękujemy dr E. Catalfamo za umiejętną pomoc. Badania te były wspierane przez Ministero della Ricerca Scientifica e Tecnologica (PRIN 2005), Università „La Sapienza” Ateneo (2004/2005) i Ministero della Salute (Progetto Finalizzato RF03.182P).
SKRÓTY
Jądro półleżące NAc
kora przedczołowa pFC
mpFC środkowe pFC
Preferencja miejsca uwarunkowana CPP
CPA uwarunkowana niechęcią do miejsca
6-OHDA 6-hydroksydopamina.
PRZYPISY
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Ten artykuł został przesłany bezpośrednio do PNAS.
LITERATURA
1. O'Doherthy J. Curr Opinia Neurobiol. 2004;14:769–776.[PubMed]
2. Rzuca ET. Zachowaj mózg Sci. 2000;23:177–191.[PubMed]
3. Berridge KC, Robinson TE. Brain Res Rev. 1998;28:309–369.[PubMed]
4. Becerra L, Breiter HC, Wise R, Gonzalez RG, Borsook D. Neuron. 2001;32:927–946.[PubMed]
5. Gottfried JA, O'Doherthy J, Dolan RJ. J Neurosci. 2002;22:10829–10837.[PubMed]
6. Jensen J, Mcintosh AR, Crawley AP, Mikulis DJ, Remington GR, Kapur S. Neuron. 2003;40:1251–1257.[PubMed]
7. Borsook D, Becerra L, Carlezon WA, Jr, Shaw M, Renshaw P, Elman I, Levine J. Eur J Pain. 2007;11:7–20.[PubMed]
8. Wise R. Nat Rev Neurosci. 2004;5:483–494.[PubMed]
9. Bechara A, Tranel D, Damasio H. Brain. 2000;123:2189–2202.[PubMed]
10. McQuade R., Creton D., Stanford SC. Psychofarmakologia. 1999;145:393–400.[PubMed]
11. Dazzi L, Seu E, Cherchi G, Biggio G. Eur J Pharmacol. 2003;476:55–61.[PubMed]
12. Feenstra MGP, Teske G, Botterblom MHA, de Bruin JP. Neurosci Lett. 1999;272:179–182.[PubMed]
13. Mingote S, de Bruin JPC, Feenstra MGP. J Neurosci. 2004;24:2475–2480.[PubMed]
14. Ventura R, Cabib S, Alcaro A, Orsini C, Puglisi-Allegra S. J Neurosci. 2003;23:1879–1885.[PubMed]
15. Ventura R, Alcaro A, Puglisi-Allegra S. Cereb Cortex. 2005;15:1877–1886.[PubMed]
16. Di Chiara G, Bassareo V, Fenu S, De Luca MA, Spina L, Cadoni C, Acquas E, Carboni E, Valentini V, Lecca D. Neurofarmakologia. 2004;47:227–241.[PubMed]
17. Aston-Jones G, Rajkowski J, Cohen J. Biol Psychiatry. 1999;46:1309–1320.[PubMed]
18. Shi WX, Pun CL, Zhang XX, Jones MD, Bunney BS. J Neurosci. 2000;20:3504–3511.[PubMed]
19. Sesack SR, Pickel VM. J Comp Neurol. 1992;320:145–160.[PubMed]
20. Darracq L, Drouin C, Blanc G, Głowinski J, Tassin JP. Neuronauka. 2001;103:395–403.[PubMed]
21. Jodo E, Chiang C, Aston-Jones G. Neuroscience. 1998;83:63–79.[PubMed]
22. Grenhoff J, Nisell M, Ferre S, Aston-Jones G, Svensson TH. J Transmisja neuronowa. 1993;93:11–25.
23. Liprando LA, Miner LH, Blakely RD, Lewis DA, Sesack SR. Synapsa. 2004;52:233–244.[PubMed]
24. Salamone JD, Correa M, Mingote S, Weber SM. J Pharmacol Exp Ther. 2003;305:1–8.[PubMed]
25. Everitt BJ, Robbins TW. Nat Neurosci. 2005;11:1481–1487.[PubMed]
26. Horvitz JC. Zachowaj mózg Res. 2002;137:65–74.[PubMed]
27. Franklin KBJ, Paxinos G. Mózg myszy: we współrzędnych stereotaktycznych. San Diego: akademickie; 1997.
28. Ventura R., Puglisi-Allegra S. Synapse. 2005;58:211–214.[PubMed]
29. Cabib S, Orsini C, Le Moal M, Piazza PV. Nauka. 2000;289:463–465.[PubMed]
30. Romieu P, Phan VL, Martin-Fardon R, Maurice T. Neuropsychofarmakologia. 2002;4:444–455.[PubMed]
31. Orsini C, Bonito-Oliva A, Conversi D, Cabib S. Psychofarmakologia. 2005;181:327–336.[PubMed]
32. Risinger FO, Cunningham CL. Pharmacol Biochem Zachowanie. 2000;1:17–24.[PubMed]
;
