Umiarkowana dieta wysokotłuszczowa zwiększa samozatrudnienie sacharozą u młodych szczurów (2013)

Apetyt. Rękopis autora; dostępny w PMC 2014 Feb 1.

Opublikowany w końcowym edytowanym formularzu jako:

Apetyt. 2013 luty; 61 (1): 19 – 29.

Opublikowano online 2012 Sep 27. doi: 10.1016 / j.appet.2012.09.021

PMCID: PMC3538965

NIHMSID: NIHMS411020

Dianne P. Figlewicz,^1,² Jennifer L. Jay,² Molly A. Acheson, Irwin J. Magrisso,⁴ Constance H. West,¹ Aryana Zavosh,² Stephen C. Benoit,³ i Jon F. Davis³

Abstrakcyjny

Wcześniej informowaliśmy, że dieta o umiarkowanie wysokiej zawartości tłuszczu zwiększa motywację dla sacharozy u dorosłych szczurów. W tym badaniu przetestowaliśmy motywacyjne, neurochemiczne i metaboliczne efekty diety wysokotłuszczowej u samców szczurów przechodzących przez okres dojrzewania, w wieku 5-8. Zaobserwowaliśmy, że dieta wysokotłuszczowa zwiększyła motywację do reakcji na sacharozę, która była niezależna od zmian metabolicznych lub zmian w metabolitach neuroprzekaźników katecholaminowych w jądrze półleżącym. Jednak poziomy mRNA AGRP w podwzgórzu były znacząco podwyższone. Wykazaliśmy, że zwiększona aktywacja neuronów AGRP wiąże się z zachowaniem motywowanym, a egzogenne (trzecie mózgowo-komorowe) podawanie AGRP spowodowało znacznie zwiększoną motywację dla sacharozy. Obserwacje te sugerują, że zwiększona ekspresja i aktywność AGRP w przyśrodkowym podwzgórzu może leżeć u podstaw zwiększonej odpowiedzi na sacharozę spowodowanej przez dietę wysokotłuszczową. Wreszcie porównaliśmy motywację dla sacharozy u dojrzałych szczurów w porównaniu z dorosłymi szczurami i obserwowaliśmy zwiększoną motywację dla sacharozy u szczurów pokwitających, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami, że młode zwierzęta i ludzie preferują słodki smak w porównaniu z dorosłymi. Razem nasze badania sugerują, że dieta tła odgrywa silną rolę modulacyjną w motywowaniu słodkiego smaku u dorastających zwierząt.

Słowa kluczowe: Motywacja, nagrody żywieniowe, dieta wysokotłuszczowa, młodzież

Wprowadzenie

Wcześniej informowaliśmy, że krótka ekspozycja na dietę o umiarkowanie wysokiej zawartości tłuszczu (31.8%) powoduje wzrost motywacji dla sacharozy u dorosłych szczurów (Figlewicz i in., 2006). Wpływy środowiskowe a biologiczne, lub ich synergia, na preferencje żywieniowe i motywację do żywności o dużej gęstości energii, zostały docenione w ciągu ostatniej dekady. To zwiększyło znaczenie u młodych, ponieważ otyłość pediatryczna dramatycznie wzrosła w ciągu ostatniej dekady (Ogden i Carroll, 2010). Zwiększone preferencje dla słodkiego smaku udokumentowano zarówno u młodych zwierząt, jak iu populacji pediatrycznej człowieka (Coldwell, Oswald i Reed, 2009; Desor i Beauchamp, 1987; Desor, Greene i Maller, 1975; Mennella, Pepino i Reed, 2005; Meyers & Sclafani, 2006)) i jest podstawową podstawą dla przemysłu spożywczego do projektowania i wprowadzania na rynek pakowanych produktów spożywczych i napojów o wysokiej zawartości cukru dla dzieci. Jednak wpływ czynników środowiskowych, takich jak dieta w tle, na motywację sacharozy u młodych szczurów nie był systematycznie oceniany.

Aktualne szacunki sugerują, że 10-20% dzieci i młodzieży w USA uważa się za otyłych (Ogden i Carroll, 2010). Przeciętnie populacja Stanów Zjednoczonych codziennie spożywa 336 kcal dodanego cukru (National Cancer Institute Applied Research Program). Kiedy populacja jest podzielona na dorosłych (19 + lat) i populację pediatryczną (2-18 lat), liczba ta jest nieco wyższa dla dzieci / młodzieży i nieco niższa dla dorosłych. Dla młodzieży większość dodanych cukrów pochodzi z napojów gazowanych, napojów energetycznych i napojów sportowych (National Cancer Institute Applied Research Program). Obszerny przegląd systematyczny i metaanaliza wykazały, że przyjmowanie napojów bezalkoholowych wiąże się ze zwiększonym poborem energii i masą ciała (Vartanian, Schwartz i Brownell, 2007). Młodzież (14–18 lat) dziennie spożywa 444 kcal dodanego cukru, a dzieci w wieku od 9 do 13 lat spożywają 381 kcal dodanego cukru dziennie (Program Badań Stosowanych National Cancer Institute). To dodatkowe spożycie można częściowo przypisać zwiększonemu upodobaniu do słodyczy u osób młodszych w porównaniu z dorosłymi (Coldwell, Oswald i Reed, 2009; Desor i Beauchamp, 1987; Desor, Greene i Maller, 1975; Mennella, Pepino i Reed, 2005). Badania wykazały, że dzieci w wieku 9 i 15 preferują roztwory cukru o wyższym stężeniu niż preferowane stężenie próbki dla dorosłych (Desor, Greene i Maller, 1975). Badania podłużne przetestowały słodką preferencję tych dzieci dziesięć lat później, kiedy to ich preferencje zmniejszyły się i nie różniły się znacząco od preferencji dorosłych (Desor i Beauchamp, 1987). Badania wykazały również preferencje dla wyższych stężeń sacharozy u dzieci w porównaniu z ich matkami (Mennella, Pepino i Reed, 2005). Sugeruje to, że podwyższona preferencja cukru dziecięcego nie jest spowodowana genetyką, ale może odzwierciedlać zjawisko rozwojowe. Badania wykazały również tę podwyższoną preferencję sacharozy u szczurów (Meyers & Sclafani, 2006).

Wiele układów i połączeń ośrodkowego układu nerwowego jest plastikowych w okresie dojrzewania u ludzi i gryzoni, w tym układu mezokortykolimbicznego i aktywności dopaminergicznej w jądrze półleżącym, kluczowym miejscu pośredniczenia w nagradzaniu i motywacji (Ikemoto & Panksepp, 1996; Kelley i Berridge, 2002) (widzieć Andersen i Teicher [2008] do ostatniej recenzji). Znaczenie funkcjonalne tych zmian anatomicznych i neurochemicznych jest obecnie wyjaśnione. Ostatnie badania przeprowadzone przez Bolañosa i jego współpracowników oraz innych badają efekty po leczeniu antagonisty transportera wychwytu zwrotnego dopaminy, metylophendatu (Ritalin), u młodocianych gryzoni po odsadzeniu. Istnieją doniesienia o zmienionej neurochemii i zachowaniu w dorosłym życiu jako funkcja leczenia okołoporodowego metylofenidatem (Bolaños i in., 2003; Bolaños, Glatt i Jackson, 1998; Brandon, Marinelli, Baker i White, 2001; Brandon, Marinelli i White, 2003). Chociaż wyniki nie są całkowicie spójne, być może z powodu różnych modeli zwierzęcych, badania te łącznie podkreślają, że okres dojrzewania wydaje się być oknem rozwojowym dla zmiany funkcji dopaminy. Pokarm jest naturalnym bodźcem do uwalniania dopaminy z projekcji brzusznej strefy nakrywkowej (VTA) do jądra półleżącego, a przyjmowanie sacharozy przez szczury prowadzi do bardzo ostrego uwalniania dopaminy (Roitman i wsp., 2004). Postawiliśmy hipotezę, że motywacja dla sacharozy jest związana ze wzrostem jądra półleżącego dopaminy, a modulacja przez wpływy środowiskowe może być wyjątkowo wrażliwa podczas tego okresu dojrzewania okołoporodowego u szczura.

Biorąc pod uwagę wysokie preferencje dla słodkiego smaku u dzieci i młodych gryzoni, uznaliśmy, że ważne jest również określenie parametrów motywacji dla sacharozy u nastolatków gryzoni. W tej serii badań oceniliśmy wpływ diety wysokotłuszczowej na motywację sacharozy u szczurów, które rosły od odsadzenia po okresie dojrzewania. Następnie przeprowadziliśmy oceny metaboliczne i OUN w celu stwierdzenia zmian metabolicznych, hormonalnych lub nerwowych związanych z interwencją dietetyczną. Porównywalny z tym, co odnotowaliśmy u dorosłych szczurów, umiarkowana, wysokotłuszczowa (31.8%) dieta była skuteczna w zwiększaniu samopodawania sacharozy. Zbadaliśmy również, czy w przypadku motywacji sacharozy u szczurów występował wpływ na leczenie po diecie u młodych osób dorosłych, porównywalny z typami efektów późnego życia zgłaszanymi w przypadku innych zachowań. Nasze badania pokazują, że młode szczury wykazują zwiększoną motywację dla sacharozy, gdy są karmione dietą o umiarkowanej zawartości tłuszczu, w której może pośredniczyć oreksygeniczny, podwzgórzowy peptyd AGRP; wydaje się, że nie ma efektu przeniesienia wczesnej interwencji dietetycznej w dorosłość po okresie dojrzewania; i że zachowanie jest oczywiste, chociaż szczury są metabolicznie normalne, a przed otyłością. Wreszcie, szczury obwodowe wykazują zwiększoną motywację dla sacharozy w stosunku do młodych dorosłych szczurów.

Materiały i Metody

Tematy

Osobnikami były samce szczurów Albino z Simonsen (Gilroy, CA). Szczury utrzymywano na chow (laboratoryjna dieta gryzoni 5001, LabDiet) lub umiarkowanie wysokotłuszczowa dieta (31.8%; Research Diets Inc) ad libitum. Diety są dopasowane do ogólnej zawartości węglowodanów (58% kcal vs. 51% kcal odpowiednio dla niskiej zawartości tłuszczu i wysokiej zawartości tłuszczu). Chow niskotłuszczowy ma 6.23 gm% darmowych cukrów, a dieta wysokotłuszczowa zawiera 29 gm% sacharozy. Zostały one utrzymane w cyklu 12: 12 h światło-ciemność z włączonymi światłami w 6 AM. O ile nie wskazano inaczej, szczury wprowadzono w wieku 3, natychmiast po odstawieniu od matki i trzymano do aklimatyzacji do 5 w wieku tygodni. W tym wieku rozpoczęto trening i testy dietetyczne i / lub behawioralne. Szczegółowe protokoły opisano szczegółowo poniżej i podsumowano w Tabela 1. Ponieważ samce szczurów przechodzą okres dojrzewania w 6^th-7^th w tygodniu, czas badań zaprojektowano tak, aby badać szczury przechodzące przez ten etap rozwoju. Wszystkie procedury wykonywane na szczurach były zgodne z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki nad zwierzętami i zostały zatwierdzone przez podkomitet ds. Opieki nad zwierzętami i komitetem ds. Badań i rozwoju w VA Puget Sound Health Care System.

Protokoły eksperymentalne

Samozapylenie sacharozy

Protokół ogólny. Procedury opierały się na naszej opublikowanej metodologii (Figlewicz i in., 2008; Figlewicz i in., 2006). Wszystkie procedury szkoleniowe i testowe przeprowadzono między 0700 a 1200 hr. Eksperyment obejmował fazy 2-3: szkolenie w zakresie autoformowania i stałego stosunku (FR); operacja i regeneracja w określonych kohortach (patrz Tabela 1); i progresywne proporcje (PR) szkolenia z wykorzystaniem algorytmu PR Richardsona i Robertsa (Richardson i Roberts, 1996). Algorytm PR wymaga 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437, 575, 759, 999, 999, 27, 5, 0.5, 10, 1, 50, 5, 2900 (20, 7.5, 20) itp.) naciska dźwignię dla kolejnych nagród w ramach sesji i jest rygorystycznym testem motywacji i nagrody (3). Szczury szkolono do samodzielnego podawania 30% sacharozy (nagroda XNUMX ml) dostarczonej do pojemnika z kroplami cieczy. Skrzynki operacyjne, kontrolowane przez system Med Associates (Georgia, VT), miały dwie dźwignie, ale tylko jedna dźwignia (aktywna, chowana dźwignia) aktywowała pompę infuzyjną. Naciskano również na drugą dźwignię (nieaktywna, stacjonarna dźwignia). Roztwór sacharozy dostarczano do pojemnika z kroplami cieczy do spożycia doustnego (Med Associates). Początkowe szkolenie przeprowadzono podczas jednogodzinnych sesji w dniach XNUMX w ramach ciągłego harmonogramu wzmacniania (FRXNUMX: wzmocniono każdą dźwignię), z maksymalną możliwą ilością nagród XNUMX sacharozy na sesję. Każda sesja rozpoczęła się od wstawienia aktywnej dźwigni i oświetlenia białego światła domowego, które pozostało włączone przez całą sesję. Dźwięk XNUMX (XNUMX Hz, XNUMX dB powyżej tła) + światło (białe światło XNUMX W powyżej aktywnej dźwigni) dyskretny sygnał złożony towarzyszył każdej dostawie nagrody, po czym następował czas XNUMX-s po każdej dostawie sacharozy. Przeprowadzono szkolenie PR dla maksymalnego możliwego XNUMX h / dzień przez dziesięć dni. Codzienne sesje kończyły się po XNUMX min braku aktywnego naciśnięcia dźwigni, w którym to momencie światło w domu zostało wyłączone, a aktywna dźwignia cofnięta.

Wpływ AGRP na samopodawanie sacharozy

Ponieważ nasze wyniki wykazały wzrost ekspresji mRNA AGRP u szczurów pokwitających karmionych dietą wysokotłuszczową, chcieliśmy potwierdzić, że AGRP może zwiększać samopodawanie sacharozy. Stare szczury karmione karmą 5-wk były pobierane przez trening FR, a następnie otrzymywały kaniule do trzeciej komory mózgowej (ICV). Po tygodniu powrotu do zdrowia potwierdzenie umieszczenia w teście odpowiedzi na angiotensynę II (patrz Figlewicz i in., [2006]) i jedna sesja ponownego szkolenia FR, szczury zostały uruchomione w paradygmacie samorządności PR. Po PR Day 1, szczury przypisano do jednej z dwóch grup, tak że oznaczenie skuteczności PR Day 1 nie różniło się między dwiema grupami (nośnik sztucznego CSF, aCSF lub AGRP, 2 μl 0.01 nmol). Otrzymali zastrzyki aCSF (n = 8) lub AGRP (n = 7) w dniach PR 2, 5 i 8. Całkowite dzienne spożycie pokarmu określono ilościowo w czasie szkolenia PR.

Wpływ wieku na samopodawanie sacharozy

Porównaliśmy zachowanie samokontroli pomiędzy dojrzałymi szczurami i młodymi dorosłymi, karmioną karmą lub dietą tłuszczową 31.8%. Szczury miały dwa tygodnie aklimatyzacji do wiwarium VAPSHCS (3 - 5wk lub 8 - wkręt 10). Następnie otrzymali dietę przez cały okres testowy / treningowy (wklej 4). Tak więc, jak w początkowym eksperymencie, szczury dojrzewania badano w wieku 5-8. Młodych dorosłych badano w wieku 10-13.

Oznaczanie składu ciała

Skład ciała mierzono za pomocą ilościowej spektroskopii rezonansu magnetycznego (QMR [Nixon i in., 2010]) w celu określenia zawartości wody w organizmie u poszczególnych szczurów, z których oblicza się względną tkankę tłuszczową. Zwierzęta umieszczano w cylindrycznych uchwytach bez znieczulenia, a następnie uchwyty wkładano do maszyny QMR w celu skanowania minutowego 2, które wykonuje trzykrotne pomiary. Dane są zapisywane na zintegrowanym komputerze (EchoMRI, Echo Medical Systems, Houston, TX) w celu natychmiastowego obliczenia wody, tłuszczu i masy beztłuszczowej całego ciała.

Dożylne badanie tolerancji glukozy (IVGTT)

Świadome IVGTT przeprowadzono na szczurach z przewlekle wszczepionymi kaniulami IV, które głodzono przez noc przed badaniem, wykorzystując metodologię opartą na Frangioudakis, Gyte, Loxham i Poucher (2008). Dwustronne kaniule dożylne implantowano dwa tygodnie przed badaniem, zgodnie z naszą ustaloną metodologią (Figlewicz i in., 2009). Próbki wyjściowe pobierano w t-10 min (0.5 ml do oznaczania insuliny i glukozy, we wszystkich punktach czasowych) i t0 min. Szczury otrzymywały wlew 1 gm glukozy / 2ml / kg w ciągu 15-20 sekund, a następnie 0.5 ml spłukiwania solą fizjologiczną. Próbki krwi pobierano w 5, 15, 30, 60, 90 i 120 min. Z powodu zatkania cewnika podczas zabiegu (a zatem niezdolności do uzyskania próbek krwi), ostatnimi „n” prezentowanymi danymi wyjściowymi / IVGTT są 7-8 dla szczurów karmionych karmą i 8 dla szczurów karmionych dietą tłuszczową 31.8% (Tabela 3). Insulinę w osoczu oznaczano za pomocą zestawów RIA insuliny szczurzej Linco (# RI-13K i SRI-13K, Linco) i oznaczano stężenie glukozy w osoczu w analizatorze glukozy YSI). Pole pod krzywą (AUC) dla odpowiedzi z linii podstawowej obliczono przy 5 min i 120 min. Wskaźnik HOMA obliczono jako post (glukoza [mM] x insulina [U / L]) / 22.5 i obliczono przy użyciu końcowych próbek na czczo zmierzonych dla insuliny i glukozy.

Parametry metaboliczne¹

Parametry metaboliczne na czczo

Szczury z Experiment 1 były głodzone przez noc przed eutanazją, kilka dni po zakończeniu IVGTT. Szczury głęboko znieczulono wziewnie izofluranem i wykrwawiono. Mózgi szybko usuwano i zamrażano w ciekłym azocie w celu pomiaru mRNA peptydu podwzgórzowego i jądra półleżącego katecholamin. Końcowe osocze lub surowicę stosowano do pomiaru insuliny na czczo, glukozy, leptyny i triglicerydów. W przypadku triglicerydów zastosowano zestaw Triglyceride GPO Kit # T7531-400 (Fisher # 23-666-418) i standardy KIT # 7531-STD (Fisher # 23-666-422) i 3 μl surowicy oznaczono w dwóch powtórzeniach. Leptyna w osoczu była mierzona za pomocą Millipore Linco RIA Kit # RL 83K.

Metody HPLC z katecholaminą [Davis i wsp., 2008]

Szczury uśmiercano za pomocą znieczulenia izofluranem, a mózgi szybko usuwano, zamrażano i przechowywano w -80 ° C. Z każdego zwierzęcia izolowano obustronne mikro-stemple jądra półleżącego (NAcc). Chociaż podjęto znaczną staranność w celu zminimalizowania zanieczyszczenia przez sąsiednie regiony mózgu, ze względu na charakter i rozmiar każdego mikropunktu nasza metoda nie pozwoliła nam rozróżnić podregionów (tj. Rdzeń NAcc od powłoki) w obrębie NAcc. Do analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) dodano do próbek roztwór przeciwutleniacza (nadchloran 0.4 N, kwas 1.343 mM etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) i pirosiarczyn sodu 0.526 mM, a następnie homogenizowano przy użyciu ultradźwiękowego homogenizatora tkanek (Biologics; Gainesville, VA ) Niewielką część homogenatu tkankowego rozpuszczono w 2% dodecylosiarczanie sodu (SDS) (w / v) w celu oznaczenia białka (Pierce BCA Protein Reagent Kit; Rockford, IL). Pozostałą zawiesinę wirowano przy 14,000 g dla 20 min w wirówce z chłodzeniem Supernatant zarezerwowano dla HPLC.

Próbki rozdzielano na kolumnie Microsorb MV C-18 (5 Am, 4.6_250 mm, Varian; Walnut Creek, CA) i jednocześnie badano na DA, kwas 3,4-dihydroksyfenylooctowy (DOPAC) i kwas homowanilinowy (HVA), z których oba są markerami degradacji dopaminy, 5-HT i 5-HIAA. Związki wykrywano stosując kanałowy detektor matrycowy 12 (CoulArray 5200, ESA; Chelmsford, MA) przyłączony do Waters 2695 Solvent Delivery System (Waters; Milford, MA) w następujących warunkach: szybkość przepływu 1 ml / min; potencjały wykrywania 50, 175, 350, 400 i 525 mV oraz; potencjał szorowania 650 mV. Faza ruchoma składała się z roztworu 10% metanolu w destylowanej H₂O zawierający 21 g / l (0.1 M) kwas cytrynowy, 10.65g / l (0.075 M) Na2HPO4, 176 mg / l (0.8 M) kwas heptanosulfonowy i 36 mg / l (0.097 mM) EDTA przy pH 4.1. Nieznane próbki oznaczono ilościowo względem krzywej standardowej punktu 6 z minimalnym R² 0.97. Próbki kontroli jakości przeplatano z każdą serią, aby zapewnić kalibrację HPLC.

Peptydy oreksygeniczne mRNA qPCR

Zmierzyliśmy ekspresję peptydów podwzgórzowych, które stymulują karmienie i są zaangażowane w motywację i zachowania nagradzające (Figlewicz & Sipols, 2010): neuropeptyd Y (NPY [ Hahn, Breininger, Baskin i Schwartz, 1998; Jewett i in., 1995; Kelley, Nannini, Bratt i Hodge, 2001]); peptyd związany z agouti (AGRP [Aponte, Atasoy i Sternson, 2011; Barnes, Argyropoulos i Bray, 2010; Broberger i in., 1998; Hagan i in., 2000; Hahn, Breininger, Baskin i Schwartz, 1998; Kaushik i in., 2011; Krashes i in., 2011; Rossi i in., 1998; Tracy i in., 2008]); i oreksyna (Cason i in., 2010; Choi, Davis, Fitzgerald i Benoit, 2010). Szczury uśmiercono w znieczuleniu izofluranem, a mózgi szybko usunięto, zamrożono i przechowywano w -80 ° C do czasu przetworzenia. Podwzgórze przyśrodkowe i boczne poddano mikrorozdrobnieniu jako jeden blok przy użyciu płaszczyzny zamrażania AHP-1200CPV (Thermoelectric Cooling America, Chicago, II), która utrzymywała stałą temperaturę 12 ° C przez cały proces rozbioru. Całkowity RNA z mikrorozdrobnionej tkanki wyizolowano odczynnikiem Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) i oczyszczono przy użyciu zestawu RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA) zgodnie z instrukcjami producenta. Całkowity RNA potraktowano w celu usunięcia jakiegokolwiek potencjalnego zanieczyszczenia genomowego DNA przy użyciu DNazy wolnej od RNazy (Promega, Madison, WI) i oznaczono ilościowo za pomocą spektrofotometru NanoVue (GE Healthcare, Cambridge, Wielka Brytania). Jakość RNA potwierdzono standardową elektroforezą w żelu agarozowym. Komplementarny DNA (cDNA) poddano następnie retrotranskrypcji (RT) z 1-2 µg całkowitego RNA przez mieszaninę losowych heksamerów i startera oligo DT przy użyciu zestawu iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Z każdej próbki przygotowano również reakcje nie podlegające retrotranskrypcji (brak RT) w celu kontroli potencjalnego zanieczyszczenia genomowym DNA. Kontrole cDNA i bez RT rozcieńczono i 5-10 ng matrycowego cDNA z każdej próbki użyto do pomiaru ekspresji mRNA wybranych genów metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem MyIQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules Potrójne pomiary dla każdej próbki przeprowadzono na standardowych 96-dołkowych płytkach iCycler, wraz z kontrolami bez matrycy (NTC) w celu wykrycia potencjalnego zanieczyszczenia krzyżowego, w 20 μl objętości reakcyjnej składającej się z 10 μl 2 x iQ Sybr Green Supermix (Bio- Rad, Hercules, CA), 2 μl 0.2-0.5 μM każdego podkładu, 3 μl wody DEPC i 5 μl matrycy. Wszystkie reakcje qPCR obejmowały analizę krzywej topnienia w celu zapewnienia specyficzności sygnału. Względną ekspresję dla każdego genu będącego przedmiotem zainteresowania obliczono przez ekstrapolację do krzywej standardowej indywidualnie prowadzonej na każdej płytce i wyprowadzono z seryjnych rozcieńczeń zbiorczej próbki referencyjnego cDNA i znormalizowano względem względnej ekspresji genów odniesienia (kwasowa rybosomalna fosfoproteina 36B4 do tkankę podwzgórza i mitochondrialne białko rybosomalne L32 do ekspresji w jądrze półleżącym). Następujące sekwencje starterów (IDT, San Diego, CA) zastosowano do amplifikacji szczurzej prepro-oreksyny, NPY i AGRP: Prepro-orexin, Forward: 5′-TTCCTTCTACAAAGGTTCCCT-3 ′, 5′-GCAACAGTTCGTAGAGACGGCAG-3 ′; NPY: do przodu, 5- TACTCCGCTGCGACACTACATC-3 ′; Rewers: 5′-CACATGGAAGGGTCTTCAAGCC-3 ′; AGRP, do przodu: 5′-GCAGAAGGCAGAAGCTTTGGC-3 ′; Rewers: 5′-CCCAAGCAGGACTCGTGCAG-3 ′.

cFos Immunocytochemistry (ICC) i Quantitation

Fluorescencję ICC zastosowano do identyfikacji Fos-dodatnich i AGRP-dodatnich ciał komórek nerwowych w przyśrodkowym podwzgórzu, zgodnie z naszą ustaloną metodologią (Figlewicz i in., 2011). Ostatniego dnia (dzień PR 10) szczury umieszczono w ich komorach do samodzielnego podawania, jak zwykle, na 90 minut. Natychmiast po ostatniej 90-minutowej sesji szczury głęboko znieczulono inhalacją izofluranu i perfundowano 0.9% NaCl, a następnie zimnym 4% roztworem paraformaldehydu. Czas znieczulenia i eutanazji oparto na znanym przebiegu w czasie szczytowej ekspresji białka cFos w 90–120 min po zdarzeniu. Zatem ekspresja cFos odzwierciedlałaby aktywację OUN na początku zadania behawioralnego, a nie byłaby wynikiem doświadczania tego zadania przez zwierzęta. Mózgi usuwano i później utrwalano w paraformaldehydzie przez kilka dni, a następnie umieszczano w 20% roztworze sacharozy-PBS, a następnie 30% roztworze sacharozy-PBS. Mózgi pocięto na kriostat (kriostat Leica CM 3050S) w celu wykonania immunohistochemii. Wykorzystaliśmy naszą ustaloną metodologię do ilościowego oznaczenia immunoreaktywnego białka cFos w skrawkach mózgu (Figlewicz i in., 2011). Sekcje 12 μm z całych mózgów na szkiełkach płukano trzy razy w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, OXOID, Hampshire, Anglia). Skrawki przemywano przez 20 min za pomocą 100% etanolu / wody DI (50%, v / v), a następnie przemywano PBS, a następnie blokowano przez godzinę 1 w temperaturze pokojowej w PBS zawierającym 5% normalnej surowicy koziej lub osiołkowej. Skrawki następnie płukano wielokrotnie w PBS i inkubowano przez noc w 4 ° C w roztworach pierwszorzędowych przeciwciał wytworzonych w PBS. Skrawki przemyto trzykrotnie w PBS, a następnie inkubowano w ciemności w temperaturze pokojowej w roztworze przeciwciała drugorzędowego przygotowanym w PBS przez godzinę 1. Skrawki następnie przemyto ponownie w PBS i zamontowano i ześlizgnięto w podłożu do mocowania Vectashield z twardym zestawem (Vector; Burlingame, CA). Cyfrowe obrazy skrawków uzyskano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Nikon Eclipse E-800 podłączonego do cyfrowej kamery przechwytującej Qimaging Retiga przy użyciu oprogramowania NIS Elements (Nikon).

Na podstawie badań PCR wykazujących zwiększone poziomy mRNA AGRP, skupiliśmy się na środkowych obszarach podwzgórza, szczególnie jądrze brzuszno-przyśrodkowym i jądrze łukowatym (ARC). Dopasowane do Atlas sekcje 12 μm oceniano pod kątem ekspresji i kwantyfikacji cFos w dopasowanych sekcjach i regionach, na podstawie atlasu Paxinos i Watson [2005]. Do oceny ilościowej (przy powiększeniu 40 ×) wybrano regiony dopasowane do atlasu. Oprogramowanie NIS Elements (Nikon) zostało wykorzystane do przechwycenia obrazu żądanego obszaru. Wyznaczono obszar do liczenia i ustalono próg dla dodatnich zliczeń komórek. Identyczny obszar i tło (próg) wykorzystano dla wycinków z odpowiednich grup eksperymentalnych, a zliczanie oprogramowania dodatnich komórek (oznaczenie ilościowe) przeprowadzono w tej samej sesji dla wszystkich grup eksperymentalnych, aby zapobiec zmianom między sesjami w ustawieniach tła. Do analizy statystycznej zliczenia pobierano od pojedynczego szczura tylko wtedy, gdy dostępne były odpowiednie lub kompletne przekroje przez każdy obszar; dane dotyczące określonego obszaru nie zostały pobrane od szczura, jeśli nie było niepełnej reprezentacji dwustronnej dla tego obszaru.

Oprócz oznaczenia ilościowego cFos przeprowadzono ilościową immunohistochemię podwójnego znacznika dla cFos i AGRP. Ponieważ nie chcieliśmy zakłócać sprawności behawioralnej zwierząt, nie traktowano ich wstępnie kolchicyną w celu optymalizacji wizualizacji AGRP. Dlatego wizualizacja neuronów AGRP-dodatnich może być niedoceniana. Procedura podwójnego barwienia dla AGRP była porównywalna z samym testem immunoreaktywności cFos, z tym wyjątkiem, że skrawki blokowano przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w PBS-5% surowicy osła. Następnie mieszaninę pierwszorzędowych przeciwciał fos-Ab i AGRP zastosowano do inkubacji przez noc w 4 ° C; podobnie oba drugorzędowe przeciwciała znajdowały się w tym samym roztworze i inkubowano przez jedną godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej. Przeprowadzono wstępne testy optymalizacyjne w celu określenia odpowiedniego rozcieńczenia pierwotnych przeciwciał. Jako pierwszorzędowe przeciwciała zastosowano królicze anty-cFos (1: 500) (sc-52) i kozie anty-AGRP (1: 100) (18634) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Drugorzędowymi przeciwciałami były sprzężone z Cy3 ośle anty-królicze (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA) i ośle przeciwciało przeciw kozie IgG Alexa fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR); wszystkie drugorzędowe przeciwciała rozcieńczono 1: 500.

Analizy statystyczne

Dane grupowe przedstawiono jako średnie ± błąd standardowy średniej (SEM) w tekście, tabelach i na rysunkach. Istotność definiuje się jako p ≤ 0.05. Porównania statystyczne są dokonywane między grupami eksperymentalnymi, jak przedstawiono w części „Wyniki” przy użyciu testu Studenta dla nieparowanych (np. Porównanie diety, wieku lub leczenia). „Normalizacja” danych jest definiowana w sposób, w jaki są używane.

Efekt

Wpływ umiarkowanej diety wysokotłuszczowej na motywację okołoporodową sacharozy

Szczury karmione dietą 31.8% tłuszczu podczas wks 5-8, podczas sesji samo-podawania, miały znacząco podwyższoną motywację do sacharozy, w porównaniu ze szczurami karmionymi karmą. Jak pokazano w Rysunek 1a, nie było różnicy w wydajności podczas początkowego treningu FR (uśrednione FRDays 1-10 aktywne dźwignie, 38 ± 5 vs. 39 ± 2 dla chow vs. 31.8% dieta tłuszczowa, odpowiednio). Jednakże, gdy szczury zostały przełączone na bardziej rygorystyczne zadanie PR, nastąpił znaczny wzrost liczby aktywnych dźwigni i liczba zdobytych nagród sacharozy, ale nie w całkowitej długości sesji (Rysunek 1b). Przewlekła dieta nie miała wpływu na liczbę nieaktywnych pras dźwigniowych. Kiedy szczury były karmione dietą wysokotłuszczową podczas wks 5-8, ale później powróciły do diety karmy stosowanej w FR i szkoleniu PR w tygodniach 9-12, zaobserwowano trend, ale bez znaczącej różnicy w aktywnych prasach dźwigniowych. Wydaje się zatem, że nie ma behawioralnego efektu przeniesienia diety o umiarkowanie wysokiej zawartości tłuszczu spożywanej w okresie okołoporodowym. Dane parametrów PR dla tych kohort są podsumowane w Tabela 2. Aby rozpocząć wyjaśnianie mechanizmu (mechanizmów) przyczyniających się do indukowanego dietą wzrostu motywacji sacharozy, przeprowadziliśmy szereg pomiarów metabolicznych i CNS.

Rysunek 1

Zmotywowana reakcja PR na nagrody w postaci sacharozy jest zwiększona u szczurów z obwodem podeszwowym karmionych dietą tłuszczową 31.8% (n = 8). 1a. W sesjach FR nie było wpływu diety, ale efekt diety jest widoczny, gdy szczury są przełączane na paradygmat PR. 1b. Dane są ...

Wpływ diety wysokotłuszczowej okołoporodowej na wydajność progresywną dla sacharozy

Wpływ umiarkowanej diety wysokotłuszczowej na parametry metaboliczne

Natychmiast po zakończeniu testów behawioralnych określono skład tkanki tłuszczowej u szczurów, które miały interwencję dietetyczną i paradygmat behawioralny podczas XKSUMX-5. Następnie szczury otrzymywały przewlekłe kaniule dożylne do (świadomych) IV testów tolerancji glukozy (IVGTT). Następnie uzyskano końcowe stężenie osocza i surowicy na czczo w celu przeprowadzenia dodatkowych pomiarów metabolicznych. Jak pokazano w Tabela 3, nie było różnic w składzie ciała, masie ciała, pomiarach insuliny na czczo lub glukozy, wrażliwości na insulinę (obliczenia HOMA) lub odpowiedzi na IVGTT między szczurami karmionymi karmą i dietą wysokotłuszczową. Pomiary leptyny i triglicerydów na czczo nie różniły się między dwiema grupami. Tak więc, chociaż leczenie dietą miało znaczący wpływ na motywację dla sacharozy, odzwierciedla reakcję behawioralną u szczurów karmionych wysokotłuszczem, które są przed otyłością.

Wpływ umiarkowanej diety wysokotłuszczowej na neurochemię homeostazy i nagrody CNS

Oprócz końcowych pomiarów metabolicznych, mózgi z kohorty, które miały zarówno interwencję dietetyczną, jak i trening behawioralny w ciągu tygodni 5-8, zmierzono pod kątem profili aminowych jądra półleżącego (n = 4 na grupę dietetyczną) lub poziomów mRNA peptydów podwzgórzowych oreksigenicznych. Jak pokazano w Tabela 4, nie było znaczącego wpływu diety wysokotłuszczowej na metabolity dopaminy, norepinefryny lub serotoniny w jądrze półleżącym, centralnym miejscu nagrody i aktywności motywacyjnej (Ikemoto & Panksepp, 1996; Kelley i Berridge, 2002), w którym każdy z tych systemów neuroprzekaźników odgrywa kluczową rolę regulacyjną. W ekstraktach z podwzgórza mierzono poziomy mRNA peptydów oreksogennych, NPY, AGRP i oreksyny. W tej kohorcie zaobserwowano silny, ale nieistotny trend zwiększonego AGRP u szczurów karmionych tłuszczem (n = 8 dla obu diet); dlatego powtórzyliśmy paradygmat dieta / trening behawioralny w dodatkowej kohorcie i zmierzyliśmy mRNA NPY, AGRP i oreksyny w podwzgórzu. W połączonych kohortach zaobserwowaliśmy istotny (p <0.05) wzrost mRNA AGRP u szczurów karmionych dietą wysokotłuszczową w porównaniu z kontrolną karmą (Rysunek 2), ale bez istotnej zmiany w ekspresji NPY lub oreksyny. Aby ocenić możliwe powiązania między ekspresją AGRP i zachowaniem samopodawania, mierzyliśmy immunopozytywne neurony cFos i AGRP w podwzgórzu śródmózgowia. Grupy szczurów karmiono dietą chow lub 31.8%; niektóre z nich zostały poddane protokołowi samopodawania (tygodnie 5-8), a inne traktowano jako kontrole behawioralne. Rysunek 3a pokazuje przykład kolokalizacji cFos i AGRP w łukowatym neuronie jądra. Jak podsumowano Tabela 5, aktywacja neuronów AGRP (koekspresja cFos-ICC i AGRP-ICC w tych samych komórkach) była związana z aktywnością samopodawania. Jest to pokazane w Rysunek 3b, gdzie liczba aktywowanych (cFos-dodatnich) neuronów jest pokazana jako liczba komórek neuronowych lub jako procent całkowitych neuronów AGRP-dodatnich: istnieje znacząca aktywacja neuronów AGRP u samozasilającej się sacharozy szczurów, w porównaniu z kontrolą obsługi , w połączonych grupach dietetycznych. Porównanie leczenia w obrębie diety w odniesieniu do liczby aktywowanych neuronów AGRP w grupie samopodawającej w porównaniu z grupą kontrolną wykazało trend, który nie osiągnął istotności statystycznej (karma, p = .078; 31.8% dieta tłuszczowa, p = .073) . Co ważne, nie tylko ta aktywacja neuronowa AGRP łączy dane z zachowaniem samopodawania, ale ze względu na czas pomiaru cFos (90 minut po umieszczeniu szczurów w ich komorach do samodzielnego podawania), ekspresja cFos odzwierciedla aktywność neuronów AGRP w antycypacja lub na początku aktywności samorządowej. Występowała nieistotna tendencja do zwiększania całkowitej liczby neuronów AGRP-dodatnich w grupie samopodawającej (w porównaniu z kontrolą, p = 0.16). U tych szczurów, u których naciskanie dźwigni było dopasowane pomiędzy grupami diety, dopasowano również liczbę neuronów AGRP-dodatnich. Nie było wpływu samego leczenia dietą na liczbę neuronów AGRP-dodatnich u behawioralnych szczurów kontrolnych.

Rysunek 2

Wpływ diety 31.8% tłuszczu na ekspresję mRNA peptydu w środkowej części podwzgórza. Dane normalizowano dla szczurów karmionych wysokotłuszczem (n = 17) w porównaniu z kontrolnymi karmami (n = 16). MRNA AGRP jest znacząco podwyższone (p <0.05).

Rysunek 3

Aktywacja neuronów AGRP na początku samodzielnego podawania sacharozy. 3a. Kolokalizacja cFos i AGRP w łukowatym neuronie jądra, powiększenie 60x. 3b. Liczba aktywowanych (cFos-immunopozytywnych) immunopozytywnych neuronów AGRP w podwzgórzu mediobasalnym ...

Nucleus Accumbens Amine Metabolites

Aktywacja neuronów Agrp: dieta i leczenie behawioralne

Wpływ podawania AGRP na motywację sacharozy

Nasza interpretacja tego odkrycia jest taka, że ekspresja AGRP u dojrzałych szczurów jest kluczowym mechanizmem leżącym u podstaw zwiększonego samopodawania sacharozy szczurów karmionych dietą o wysokiej zawartości tłuszczu. Aby potwierdzić skuteczność AGRP w zwiększaniu motywacji dla sacharozy, AGRP podawano przez trzecią komorę do karmionych karmą szczurów okołoporodowych podczas części PR paradygmatu behawioralnego. Ten schemat dawkowania AGRP był podprogowy do stymulacji spożycia karmy przez dwa tygodnie paradygmatu PR, ale spowodował znaczne zwiększenie samo-podawania sacharozy, jak pokazano na Rysunek 4. (Zauważ, że każda nagroda sacharozy ma kaloryczną zawartość 0.1 kcal, dlatego aktywność samodzielnego podawania sacharozy przyczynia się do znikomych kalorii do całkowitej dziennej dawki). Tabela 6 pokazuje dane parametrów samo-podawania w paradygmacie PR 9-day, z ICV wstrzykiwanymi AGRP lub aCSF w dniach 2, 5 i 8. U szczurów traktowanych AGRP liczba aktywnych dźwigni została znacznie zwiększona ogólnie w dniach PR 2-10 (p = 0.03) oraz w dniach bez iniekcji (p = 0.048) z tendencją do wzrostu w (uśrednionym) dni iniekcji. Ponadto czas zatrzymania (który odzwierciedla całkowity czas spędzony na zadaniu samopodawania) był znacznie zwiększony w dni bez iniekcji (p = 0.02) z tendencjami w kierunku ogólnego wzrostu i dni wstrzyknięcia. Liczba nagród sacharozy została zwiększona w całym Dniu PR 2-10 (p = 0.03). Nie stwierdzono wpływu leczenia AGRP na nieaktywne naciśnięcie dźwigni, w porównaniu z kontrolami traktowanymi aCSF, lub pomiędzy dniami wstrzyknięcia i bez wstrzyknięcia. Wyniki potwierdzają interpretację trwałego wpływu AGRP na zwiększenie samopodawania sacharozy: szczury naciskały bardziej na dźwignię nagradzającą, otrzymywały więcej nagród sacharozy i poświęcały więcej czasu na wykonywanie zadania.

AGRP trzeciej komory (ICV) (0.01 nmol) stymuluje samodzielne podawanie sacharozy w paradygmacie PR, ale nie ma wpływu na dzienne spożycie pokarmu w okresie badania (PR Days 2 - 10, z zastrzykami w dniach 2, 5 i 8) . Dane AGRP (n = 9) są wyrażone ...

Wpływ ICV AGRP vs. aCSF na wydajność progresywną dla sacharozy

Wpływ etapu życia na preferencje i motywację dla sacharozy

W końcowym eksperymencie ocenialiśmy, czy motywacja sacharozy różni się między dojrzewaniem a dorosłymi szczurami. Początkowo szczurom 5 i 10-wk podawano test preferencji sacharozy z wyborem roztworów w zakresie od 0 do 20% sacharozy, przed rozpoczęciem testów i treningu samopodawania. Jak pokazano w Rysunek 5ai zgodnie z odkryciami opisanymi w literaturze szczury przed dojrzewaniem wydawały się preferować słodszy roztwór niż młode dorosłe szczury: większość szczurów przed dojrzewaniem miała szczytowe spożycie roztworu sacharozy 20%, podczas gdy dorosłe szczury wykazywały szczytowe spożycie 15% sacharozy. Następnie obie grupy wiekowe zostały podzielone między karmę dla szczurów i dietę wysokotłuszczową podczas szkoleń i testów samorządowych. Wystąpił niewielki, ale istotny statystycznie wzrost liczby aktywnych dźwigni przez szczury okołoporodowe i dorosłe (45 ± 3 vs. 37 ± 2, p = 0.05) uśredniony dla sesji FR, bez różnicy w liczbie nagrody sacharozy lub liczba naciśnięć dźwigni nieaktywnej. Jak pokazano w Rysunek 5b, był bardzo znaczący ogólny wpływ wieku, w sesjach PR, ze znacznie zwiększonym aktywnym naciskaniem dźwigni w okresie dojrzewania (n = 15) w porównaniu do młodych dorosłych (n = 14) szczurów (2-way ANOVA, PRDay × wiek; wpływ wieku, p = 0.017, brak niezależnego efektu PRDay, brak znaczącej interakcji). Występowała tendencja do większego wpływu wieku w warunkach żywienia wysokotłuszczowego, ale nie osiągnęło to istotności statystycznej (p = .13). Tabela 7 wymienia parametry behawioralne PR: oprócz zwiększonych aktywnych naciśnięć dźwigni, szczury okołoporodowe otrzymywały znacznie więcej nagród sacharozy i wykazywały tendencję do zwiększonego czasu zatrzymania. Dodatkowo, szczury okołoporodowe miały niewielki, ale znaczący wzrost nacisku na nieaktywną (tj. Nie nagradzającą) dźwignię, chociaż zarówno dla okołoporodowych, jak i dorosłych szczurów, liczba nieaktywnych pras dźwigniowych wynosiła w przybliżeniu 10% liczby aktywnych pras dźwigniowych. Wyniki te sugerują, że szczury okołoporodowe preferują i będą chętniej poszukiwać słodko smakujących potraw, a efekt może być wzmocniony na tle diety wysokotłuszczowej.

Rysunek 5

Młode szczury mają zwiększoną motywację do nagrody za sacharozę w porównaniu z dorosłymi szczurami. 5a. Test preferencji sacharozy u młodych szczurów (okołoporodowych, n = 15) i młodych dorosłych (n = 14). Szczury miały 30 min do picia z zakresu stężeń (0-20% sacharoza). ...

Wpływ wieku na wydajność progresywnych wskaźników^a dla sacharozy

Dyskusja

Głównym odkryciem tego badania jest to, że dieta o umiarkowanie wysokiej zawartości tłuszczu spożywana w okresie około-dojrzewania (tuż przed, w trakcie i tuż po osiągnięciu dojrzałości płciowej) znacząco zwiększyła motywację do roztworów sacharozy. To odkrycie jest zgodne z naszą poprzednią, podobną obserwacją u dorosłych szczurów (Figlewicz i in., 2006). U tych zwierząt i w dodatkowych kohortach dobranych pod względem wieku i leczenia ustaliliśmy, poprzez szeroką charakterystykę metaboliczną, że szczury były nieotyłe lub były otyłe i nie były obwodowo oporne na insulinę. Nie możemy wykluczyć, że szczury miały oporność na ośrodkowy układ nerwowy na działanie insuliny lub leptyny: oba te hormony przyczyniają się do specyficznej dla CNS modulacji nagrody żywieniowej (Davis, Choi i Benoit, 2010; Davis i in., 2011a; Figlewicz & Sipols, 2010).

W podzbiorze szczurów mierzyliśmy neuroprzekaźniki aminowe i pokrewne metabolity w jądrze półleżącym, które otrzymuje duże nakłady projekcji dopaminergicznych z śródmózgowia i jest uważane za kluczowe i centralne miejsce dla OUN za pośrednictwo w nagradzaniu i motywowaniu (Ikemoto & Panksepp, 1996; Kelley i Berridge, 2002). Nie zaobserwowaliśmy żadnych zmian w bezwzględnych poziomach lub stosunkach żadnego z tych metabolitów przekaźnika, co sugeruje, że zmieniona aktywność katecholaminergiczna lub serotoninergiczna w jądrze półleżącym nie jest podstawowym ani głównym mechanizmem OUN leżącym u podstaw zwiększonej motywacji sacharozy. Jest to zgodne z ostatnim raportem z Davis i in. [2011 b], który wykazał u dorosłych szczurów, że ICV AGRP zwiększa obrót dopaminy w przyśrodkowej korze przedczołowej, ale nie jądro półleżące. Co więcej, nie zaobserwowano efektu „przeniesienia behawioralnego” diety testowanej na szczurach bezpośrednio po okresie dojrzewania, jako młodych dorosłych. Kontrastuje to z wynikami Bolañosa i innych, dotyczącymi parametrów behawioralnych i katecholaminergicznych, u dorosłych gryzoni leczonych metylofenidatem (Bolaños i in., 2003; Bolaños, Glatt i Jackson, 1998; Brandon, Marinelli, Baker i White, 2001; Brandon, Marinelli i White, 2003). Jest to prawdopodobnie spowodowane bezpośrednim ukierunkowaniem neuronów dopaminergicznych przez metylofenidat i może również być funkcją czasu interwencji dietetycznej i czasu testowania zwierząt. Wreszcie, możemy nie zaobserwować efektów przenoszenia, ponieważ w tym badaniu głównym miejscem występowania efektu diety jest podwzgórze przyśrodkowe.

W tym badaniu trzy linie dowodowe potwierdzają kluczową rolę przyśrodkowego podwzgórzowego neuropeptydu AGRP w zwiększonym samopodawaniu sacharozy u szczurów karmionych dietą wysokotłuszczową. Po pierwsze, zaobserwowaliśmy wzrost ekspresji AGRP (mRNA) w ekstraktach całego podwzgórza u szczurów karmionych dietą tłuszczową 31.8% w stosunku do kontroli chow. Jednak poziomy mRNA oreksyny i mRNA NPY nie uległy zmianie. Zatem efekt diety wysokotłuszczowej / paradygmatu behawioralnego wydaje się być specyficzny dla AGRP i nie uogólniony na neuropeptydy oreksigeniczne. Podkreśla to rolę AGRP w motywowaniu lub poszukiwaniu żywności i jest zgodna z szeregiem ostatnich raportów w literaturze (omówionych poniżej). Nasze ostatnie prace wykazały kluczową rolę aktywacji przyśrodkowej podwzgórza w powiązaniu z wydajnością PR w naszym modelu motywacji, ze zwiększoną ekspresją cFos w kilku przyśrodkowych jądrach podwzgórza (Figlewicz i in., 2011). Zidentyfikowaliśmy również ARC jako kluczowy region dla wpływu (egzogennej) insuliny na zmniejszenie samo-podawania sacharozy (Figlewicz i in., 2008). ARC zawiera neurony AGRP / NPY (Broberger i in., 1998; Hahn, Breininger, Baskin i Schwartz, 1998), które działają w środkowym podwzgórzu, aby stymulować karmienie przez wiele mechanizmów. W tym badaniu immunocytochemiczne oznaczenie ilościowe aktywowanych neuronów AGRP wykazało wzrost neuronów cFos / AGRP u szczurów, które zostały przeszkolone do samodzielnego podawania sacharozy, w porównaniu z nie przeszkolonymi kontrolami behawioralnymi. Jest to drugie podejście prowadzące do interpretacji, że aktywacja neuronowa AGRP przyczynia się do (samoczynnego) podania sacharozy. Zarówno wcześniejsze, jak i nowsze badania wiązały ekspresję AGRP i działanie z preferencyjnym spożyciem tłuszczu, albo jako dietę (Hagan i in., 2000) lub w kontekście paradygmatu motywacyjnego (Tracy i in., 2008); a u dorosłych szczurów ICV AGRP preferencyjnie warunkuje preferencję miejsca względem tłuszczu (Davis i in., 2011b). Ostatnie badania wykorzystujące ukierunkowane techniki molekularne, które umożliwiają specyficzną aktywację neuronów AGRP u myszy (Aponte, Atasoy i Sternson, 2011; Krashes i in., 2011) potwierdziły, że AGRP silnie stymuluje karmienie, zwiększa poszukiwanie pożywienia i zmniejsza wydatek energetyczny. Warto zauważyć, że w grupach eksperymentalnych karmionych dietą wysokotłuszczową całkowite spożycie kalorii było znacząco niższe w porównaniu ze szczurami karmionymi karmą kontrolną (Tabela 8), co byłoby zgodne z endogennym efektem AGRP, aby zmniejszyć wydatek energetyczny. Te efekty są zgodne z wcześniejszymi ustaleniami Hagan i in. [2000], że egzogenny wpływ AGRP na niektóre aspekty bilansu energetycznego może być dość długi. Tak więc, jako trzecie podejście, nasze wyniki pokazujące zwiększone samopodawanie sacharozy przez szczury dojrzewające z karmieniem mlecznym, którym podano ICV AGRP, również sugerują działanie, które jest podtrzymywane. Specyficzny wzrost ekspresji mRNA AGRP u szczurów karmionych dietą wysokotłuszczową przez cztery tygodnie jest zgodny z ostatnimi badaniami z Kaushik i współpracownicy [2011] który łączy egzogenne kwasy tłuszczowe, wewnątrzkomórkowe kwasy tłuszczowe i zwiększoną ekspresję AGRP w neuronach podwzgórza. Zatem dodanie kwasu oleinowego lub palmitynowego do hodowanych komórek podwzgórza spowodowało zwiększoną ekspresję AGRP. Podczas gdy zastosowana dieta zwiększyła kwas stearynowy, palmitynowy i oleinowy, nie można wiedzieć, czy te kwasy tłuszczowe są zwiększone w in vivo środowisko podwzgórza, czy ich zlokalizowane stężenia odpowiadałyby profilowi kwasów tłuszczowych w diecie, oraz czy jedna lub więcej z nich prowadziłaby szczególnie do zwiększenia ekspresji AGRP. Niemniej jednak kuszące jest spekulowanie, że składniki diety mogą przyczyniać się do zwiększonej motywacji do słodyczy poprzez podstawowe działanie na przyśrodkowym podwzgórzu.

Protokoły eksperymentalne: Kcal Consumed

Nasze badanie pokazuje, że młode szczury mają zwiększoną motywację do sacharozy w porównaniu z dorosłymi szczurami. Było to widoczne przez cały czas samoopieki PR, a dieta wysokotłuszczowa miała tendencję do zwiększania efektu wiekowego. Możliwe, że nie osiągnęło to istotności statystycznej ze względu na stosunkowo małe rozmiary grup; zatem dane sugerują, że u zwierząt pokwitających (i być może u ludzi) umiarkowanie podwyższony poziom tłuszczu w diecie może przyczyniać się do wzmożonych zachowań poszukiwawczych w celu uzyskania słodzonych napojów lub żywności. Pod względem społecznym podkreśla potrzebę zwrócenia uwagi na tłuszczowy składnik diet „nastolatków” lub nastolatków, nie tylko z powodu bezpośrednich, negatywnych konsekwencji metabolicznych nadmiaru tłuszczu w diecie, ale także dlatego, że może przyczynić się do zachowań, które powodują w zwiększonym spożyciu cukrów. Jak ostatnio recenzowane przez Stanhope [2012], jednoczesne spożywanie cukrów z tłuszczem może mieć poważne negatywne konsekwencje metaboliczne. Kombinacje tłuszczu i cukru u ludzi są również stosunkowo mniej sycącą dietą (Drewnowski, 1998). Wraz ze wzrostem zachorowalności na cukrzycę (Cizza, Brown i Rother, 2012) i stłuszczenie wątroby (Kohli i in., 2010) występujące w populacji pediatrycznej, znaczenie zdrowej i zrównoważonej diety w młodości jest jasne. Zaobserwowaliśmy znaczny wzrost nacisku na nieaktywną dźwignię u szczurów pokwitających (w porównaniu z dorosłymi szczurami), chociaż liczba naciśnięć dźwigni była nadal bardzo niska. Jest to możliwe, ale wydaje się mało prawdopodobne, aby ulepszone naciśnięcie aktywnej dźwigni mogło być uwzględnione jako „niespecyficzny” efekt ogólnej aktywności, ponieważ większość aktywności była ukierunkowana na aktywną dźwignię. Chociaż rzeczywista liczba nieaktywnych naciśnięć dźwigni została zwiększona, proporcja w stosunku do aktywnych naciśnięć dźwigni była porównywalna między okołoporodowymi i dorosłymi szczurami, a zwiększone naciśnięcia dźwigni mogą odzwierciedlać dłuższy czas aktywności w komorach samorządowych. Innym paradygmatem (niektóre ograniczenia jedzenia, używanie granulatu żywności zamiast słodkiej nagrody i harmonogram FR1) Sturman, Mandell i Moghaddam [2010] ostatnio donosili o zmianach w instrumentalnej skuteczności u młodzieży i dorosłych szczurów. Nie zaobserwowano żadnej różnicy w uderzeniach nosa, które dostarczały granulki pokarmowe między młodymi i dorosłymi szczurami. U młodych szczurów zaobserwowali jednak zwiększone zachowanie perseweracyjne podczas wyginięcia. Podsumowując, oba badania podkreślają wpływ wieku i etapu rozwoju na motywację do jedzenia, zgodnie z szybkim wzrostem szczurów dojrzewania. W tym badaniu oceniliśmy samce, ale nie kobiety, szczury. Obecnie istnieją ograniczone badania bezpośrednio porównujące samce i samice szczurów w paradygmacie motywacji żywieniowej, a systematyczna ocena w okresie dojrzewania jest uzasadniona. Należy zauważyć, że w badaniu młodzieży (człowieka) Coldwell i współpracownicy (2009) zaobserwowano związek między markerem wzrostu, a nie steroidami gonadowymi per se. Niemniej jednak skutki płci w tej grupie wiekowej zasługują na dalsze badania.

Podsumowując, nasze badania wykazują zwiększoną motywację dla sacharozy u dojrzałych szczurów w porównaniu z dorosłymi, a to zwiększa dostęp do diety o umiarkowanie wysokiej zawartości tłuszczu. Wpływ diety wysokotłuszczowej na motywację sacharozy może zależeć od zwiększonej aktywności AGRP w przyśrodkowym podwzgórzu. Jest to kolejny dowód na silną wewnętrzną funkcjonalność obwodów CNS, która reguluje homeostazę energii za pomocą obwodów, które regulują nagrodę i motywację. Zwiększenie motywacji dla sacharozy przez dietę o umiarkowanie wysokiej zawartości tłuszczu poprzedza zaburzenia metaboliczne i jawną otyłość i sugeruje, że zachowanie może początkowo prowadzić do zmian metabolicznych, a nie odwrotnie. Spożywanie słodkich pokarmów o wysokiej zawartości tłuszczu i fruktozy przyczyniłoby się wspólnie do profilu metabolicznego, który stanowi wysokie ryzyko zarówno dla cukrzycy typu 2, jak i chorób układu krążenia. Odkrycia te podkreślają wagę skupienia się na wzorcach żywieniowych i diecie w okresie dojrzewania, jako że wpływają na nie nie tylko wpływy społeczno-środowiskowe, ale także zmiany neurochemiczne i behawioralne ośrodkowego układu nerwowego jako przemiany zwierzęce lub ludzkie w okresie wielu zmian dojrzewania w celu nabycia kompetencji reprodukcyjnych.

â € <

Umiarkowana dieta wysokotłuszczowa zwiększa motywację dla sacharozy u dorosłych szczurów.
W tym badaniu dieta wysokotłuszczowa zwiększa motywację sacharozy u szczurów okołoporodowych.
Około pokwitania szczury miały zwiększoną motywację sacharozy w porównaniu z dorosłymi.
W zwiększonej motywacji sacharozy może pośredniczyć podwzgórze AGRP.
Wniosek: Dieta wysokotłuszczowa napędza motywację do słodyczy niezależnie od otyłości.

Podziękowanie

Badania te były wspierane przez grant NIH DK40963. Dianne Figlewicz Lattemann jest starszym naukowcem-naukowcem, Programem Badań Biomedycznych, Departamentem Spraw Weteranów Puget Sound Health Care System, Seattle, Waszyngton. Stephen Benoit był wspierany przez NIH DK066223 i Ethicon Endosurgery Inc. Autorzy dziękują dr Tami Wolden-Hanson za wsparcie w pomiarze składu ciała; Dr William Banks i Lucy Dillman za wsparcie w pomiarach triglicerydów; oraz Amalie Alver i Samantha Thomas-Nadler za pomoc w badaniach behawioralnych.

Referencje

Andersen SL, Teicher MH. Stres, wrażliwe okresy i wydarzenia dojrzewania w depresji u młodzieży. Trendy w neuronauce. 2008; 31: 183 – 191. [PubMed]
Aponte Y, Atasoy D, Sternson SM. Neurony AGRP są wystarczające, aby szybko i bez treningu trenować zachowanie żywieniowe. Natura Neuroscience. 2011; 14: 351 – 355. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Barnes MJ, Argyropoulos G, Bray GA. Preferowanie diety wysokotłuszczowej, ale nie hiperfagii po aktywacji receptorów opioidowych mu jest blokowane u myszy z nokautem AgRP. Brain Research. 2010; 1317: 100 – 107. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Bolaños CA, Barrot M, Berton O, Wallace-Black D, Nestler EJ. Leczenie metylofenidatem podczas okresu przed i po okresie dojrzewania zmienia reakcje behawioralne na bodźce emocjonalne w wieku dorosłym. Psychiatria biologiczna. 2003; 54: 1317 – 1329. [PubMed]
Bolaños CA, Glatt SJ, Jackson D. Nadwrażliwość na leki dopaminergiczne u periadolescentów szczurów: analiza behawioralna i neurochemiczna. Brain Research Developmental Brain Research. 1998; 111: 25 – 33. [PubMed]
Brandon CL, Marinelli M, Baker LK, White FJ. Zwiększona reaktywność i podatność na kokainę po leczeniu metylofenidatem u dorastających szczurów. Neuropsychofarmakologia. 2001; 25: 651 – 61. [PubMed]
Brandon CL, Marinelli M, White FJ. Narażenie młodzieży na metylofenidat zmienia aktywność neuronów dopaminowych śródmózgowia szczura. Psychiatria biologiczna. 2003; 54: 1338 – 1344. [PubMed]
Broberger C, Johansen J, Johansson C, Schalling M, Hokfelt T. Neuropeptyd związany z genem białka Y / agouti (AGRP) w mózgu u myszy normalnych, anorektycznych i leczonych glutaminianem sodu. Materiały z Narodowej Akademii Nauk. 1998; 95: 15043 – 15048. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Cason AM, Smith RJ, Tahsili-Fahadan P, Moorman DE, Sartor GC, Aston-Jones G. Rola orexin / hypocretin in poszukiwanie nagrody i uzależnienie: implikacje dla otyłości. Fizjologia i zachowanie. 2010; 100: 419–428. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Choi DL, Davis JF, Fitzgerald ME, Benoit SC. Rola oreksyny-A w motywacji pokarmowej, zachowania żywieniowego opartego na nagrodzie i indukowanej przez żywność aktywacji neuronalnej u szczurów. Neuroscience. 2010; 167: 11 – 20. [PubMed]
Cizza G, Brown RJ, Rother KI. Rosnąca częstość występowania i wyzwania cukrzycy u dzieci. Mini przegląd. Journal of Endocrinological Investigation. 2012 epub May 8, 2012. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Coldwell SE, Oswald TK, Reed DR. Marker wzrostu różni się między nastolatkami z preferencją wysokiego i niskiego poziomu cukru. Fizjologia i zachowanie. 2009; 96: 574–580. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Davis JF, Choi DL, Benoit SC. Insulina, leptyna i nagroda. Trendy w endokrynologii i metabolizmie. 2010; 21: 68 – 74. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Davis JF, Choi DL, Schurdak JD, Fitzgerald MF, Clegg DJ, Lipton JW, Figlewicz DP, Benoit SC. Leptyna reguluje równowagę energetyczną i motywację poprzez działanie w różnych obwodach nerwowych. Psychiatria biologiczna. 2011a; 69: 668 – 674. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Davis JF, Choi DL, Schurdak JD, Krause EG, Fitzgerald MF, Lipton JW, Sakai RR, Benoit SC. Centralne melanokortyny modulują aktywność mezokortykolimbiczną i zachowania poszukujące pożywienia u szczurów. Fizjologia i zachowanie. 2011b; 102: 491–495. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Davis JF, Tracy AL, Schurdak JD, Tschop MH, Clegg DJ, Benoit SC, Lipton JW. Narażenie na podwyższony poziom tłuszczu w diecie osłabia nagrodę psychostymulującą i mezolimbiczny obrót dopaminy u szczura. Neurobiologia behawioralna. 2008; 122: 1257 – 1263. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Desor JA, Beauchamp GK. Podłużne zmiany preferencji słodyczy u ludzi. Fizjologia i zachowanie. 1987; 39: 639–641. [PubMed]
Desor JA, Greene LS, Maller O. Preferencje dla słodkich i słonych w 9- dla 15-letnich i dorosłych ludzi. Nauka. 1975; 190: 686 – 687. [PubMed]
Drewnowski A. Gęstość energii, smakowitość i sytość: implikacje dla kontroli wagi. Recenzje żywienia. 1998; 56: 347 – 353. [PubMed]
Figlewicz DP, Bennett JL, Aliakbari S, Zavosh A, Sipols AJ. Insulina działa w różnych miejscach ośrodkowego układu nerwowego w celu zmniejszenia ostrego karmienia sacharozą i samodzielnego podawania sacharozy u szczurów. American Journal of Physiology. 2008; 295: R388 – R394. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Figlewicz DP, Bennett JL, Naleid AM, Davis C, Grimm JW. Insulina i leptyna dokomorowa zmniejszają samopodawanie sacharozy u szczurów. Fizjologia i zachowanie. 2006; 89: 611–616. [PubMed]
Figlewicz DP, Bennett-Jay JL, Kittleson S, Sipols AJ, Zavosh A. Samosprawianie sacharozy i aktywacja OUN u szczura. Am J Physiol. 2011; 300: R876 – R884. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Figlewicz DP, Ioannou G, Bennett Jay J, Kittleson S, Savard C, Roth CL. Wpływ umiarkowanego spożycia substancji słodzących na zdrowie metaboliczne szczurów. Fizjologia i zachowanie. 2009; 98: 618–624. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Figlewicz DP, Sipols AJ. Sygnały regulacji energetycznej i nagrody żywnościowe. Farmakologia, biochemia i zachowanie. 2010; 97: 15 – 24. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Frangioudakis G, Gyte AC, Loxham SJ, Poucher SM. Dożylny test tolerancji glukozy u kaniulowanych szczurów Wistar: Solidna metoda oceny in vivo stymulowanego glukozą wydzielania insuliny. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 2008; 57: 106 – 113. [PubMed]
Hagan MM, Rushing PA, Pritchard LM, Schwartz MW, Strack AM, Van Der Ploeg LHT, Woods SC, Seeley RJ. Długotrwałe działanie oreksigeniczne AgRP- (83-132) obejmuje mechanizmy inne niż blokada receptora melanokortyny. American Journal of Physiology. 2000; 279: R47 – R52. [PubMed]
Hahn TM, Breininger JF, Baskin DG, Schwartz MW. Koekspresja Agrp i NPY w neuronach podwzgórza aktywowanych na czczo. Natura Neuroscience. 1998; 1: 271 – 272. [PubMed]
Hodos W. Wskaźnik progresywny jako miara siły nagrody. Nauka. 1961; 134: 943 – 944. [PubMed]
Ikemoto S, Panksepp J. Dysocjacje między reakcjami apetycznymi i konsumpcyjnymi poprzez farmakologiczne manipulacje regionów mózgu istotnych dla nagrody. Neurobiologia behawioralna. 1996; 110: 331 – 345. [PubMed]
Jewett DC, Cleary J., Levine AS, Schaal DW, Thompson T. Wpływ neuropeptydu Y, insuliny, deoksyglukozy 2 i deprywacji żywności na zachowania motywowane żywnością. Psychofarmakologia. 1995; 120: 267 – 271. [PubMed]
Kaushik S, Rodriguez-Navarro JA, Arias E, Kiffin R, Sahu S, Schwartz GJ, Cuervo AM, Singh R. Autophagy w podwzgórzowych neuronach AgRP regulują przyjmowanie pokarmu i bilans energetyczny. Metabolizm komórek. 2011; 14: 173 – 183. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Kelley AE, Berridge KC. Neuronauka naturalnych nagród: znaczenie dla uzależniających leków. Journal of Neuroscience. 2002; 22: 3306 – 3311. [PubMed]
Kelley SP, Nannini MA, Bratt AM, Hodge CW. Neuropeptyd-Y w jądrze okołokomorowym zwiększa samopodawanie etanolu. Peptydy. 2001; 22: 515 – 522. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Kohli R, Boyd T, Jezioro K, Dietrich K, Nicholas L, Balistreri WF, Ebach D, Shashidkar H, Xanthakos SA. Szybki postęp NASH w dzieciństwie. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 2010; 50: 453 – 456. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Krash MJ, Koda S, Ye CP, Rogan SC, Adams AC, Cusher DS, Maratos-Flier E, Roth BL, Lowell BB. Szybka odwracalna aktywacja neuronów AgRP napędza zachowania żywieniowe u myszy. Journal of Clinical Investigation. 2011; 121: 1424 – 1428. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Mennella JA, Pepino MY, Reed DR. Genetyczne i środowiskowe uwarunkowania gorzkiej percepcji i słodkich preferencji. Pediatria. 2005; 115: 216 – 222. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Myers KP, Sclafani A. Rozwój wyuczonych preferencji smakowych. Psychobiologia rozwojowa. 2006; 48: 380 – 388. [PubMed]
Program badań stosowanych w National Cancer Institute. Źródła kalorii z dodanych cukrów wśród populacji USA, 2005-06. Zaktualizowano 21 December 2010. [Dostęp do 21 September 2011]; 2010 Dostępny od: http://riskfactor.cancer.gov/diet/foodsources/added_sugars/
Nixon JP, Zhang M, Wang CF, Kuskowski MA, Novak CM, Levine JA, Billington CJ, Kotz CM. Ocena ilościowego systemu obrazowania rezonansu magnetycznego do analizy składu całego ciała u gryzoni. Otyłość. 2010; 18: 1652 – 1659. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Ogden CL, Carroll MD. Wydział Badania Zdrowia i Odżywiania. Częstość występowania otyłości wśród dzieci i młodzieży: Stany Zjednoczone, trendy 1963-1965 za pośrednictwem 2007-2008. [Dostęp do 21 September 2011]; Health E-Stat. 2010 2010 Dostępne od: http://www.cdc.gov/nchs/fastats/overwt.htm.
Paxinos G, Watson C. Atlas mózgu szczura o współrzędnych stereotaktycznych. 5th. San Diego CA: Elsevier Academic Press; 2005.
Richardson NR, Roberts DC. Harmonogramy progresywnego stosunku w badaniach samopodawania leku u szczurów: metoda oceny skuteczności wzmacniającej. Journal of Neuroscience Methods. 1996; 66: 1 – 11. [PubMed]
Roitman MF, Stuber GD, Phillips PE, Wightman RM, Carelli RM. Dopamina działa jako drugi modulator poszukiwania pożywienia. Journal of Neuroscience. 2004; 24: 1265 – 1271. [PubMed]
Rossi M, Kim M, Morgan D, Small C, Edwards C, Sunter D, Abusnana S, Goldstone A, Russell S, Stanley S, Smith D, Yagaloff K, Ghatei M, Bloom S. C-końcowy fragment Agouti pokrewne białko zwiększa karmienie i antagonizuje działanie hormonu stymulującego alfa-melanocyty in vivo. Endokrynologia. 1998; 139: 4428 – 4431. [PubMed]
Stanhope KL. Rola cukrów zawierających fruktozę w epidemiach otyłości i zespołu metabolicznego. Roczne recenzje medycyny. 2012; 63: 329 – 343. [PubMed]
Sturman DA, Mandell DR, Moghaddam B. Młodzież wykazuje różnice behawioralne w porównaniu z dorosłymi w trakcie uczenia się i wymierania w czasie. Neurobiologia behawioralna. 2010; 124: 16 – 25. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Tracy AL, Clegg DJ, Johnson JD, Davidson TL, Woods SC. Antagonista melanokortyny AgRP (83-132) zwiększa reakcję apetyczną na tłuszcz, ale nie na wzmacniacz węglowodanów. Farmakologia Biochemia i zachowanie. 2008; 89: 263 – 271. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]
Vartanian LR, Schwartz MB, Brownell KD. Wpływ spożycia napojów bezalkoholowych na odżywianie i zdrowie: przegląd systematyczny i metaanaliza. American Journal of Public Health. 2007; 97: 667 – 75. [Artykuł bezpłatny PMC] [PubMed]