Antagonista receptora greliny (GHS-R1A) osłabia nagradzające właściwości morfiny i zwiększa poziom peptydów opioidowych w obszarach nagrody u myszy (2015)

Ostra, jak również przewlekła ekspozycja na uzależniające leki ma głęboki wpływ na mezolimbiczny układ dopaminowy, ważny kluczowy układ mózgowych systemów nagradzania (Nestler, 2005). Te efekty zostały zaproponowane, aby przynajmniej częściowo przyczynić się do rozwoju narkomanii (Wise, 2004). Uzależnienie od narkotyków powoduje wiele szkodliwych skutków dla jednostki, jak również społeczeństwa, a nowe interwencje farmakologiczne, leczące ten poważny problem zdrowia publicznego, są uzasadnione (Koob i Le Moal, 2001). Wyjaśniając systemy sygnalizacji pośredniczące w zdolności uzależniających leków do aktywacji mezolimbicznego układu dopaminowego, można zidentyfikować unikalne strategie leczenia zaburzeń związanych z używaniem substancji.

Badania wykazały, że powszechne mechanizmy neurobiologiczne regulują spożycie i nagrodę indukowaną przez żywność i uzależniające leki (Morganstern i in., 2011), proponując, że rola regulujących pokarmy peptydów jelitowo-mózgowych, takich jak grelina, obejmuje mediację nagrodową. Początkowo wykazano, że grelina powoduje uwalnianie hormonu wzrostu (Kojima i wsp., 1999) i wywołuje otyłość u szczurów (Tschop i wsp., 2000). Do tej pory wiadomo, że grelina zwiększa spożycie pokarmu, głód, a także pobudza apetyt przez obwody podwzgórza (przegląd patrz Egecioglu i wsp. (2011)). Oprócz podwzgórza, receptory greliny (GHS-R1A) są wyrażane w obszarach związanych z nagrodą, takich jak ciało migdałowate, prążkowie, kora przedczołowa, obszar nakrywki brzusznej (VTA) i hipokamp (przegląd patrz Engel i Jerlhag (2014)), co oznacza, że Fizjologiczna rola greliny wykracza poza regulację homeostazy energetycznej. Rzeczywiście, wykazano, że oreksogenna grelina peptydowa jest aktywatorem mezolimbicznego układu dopaminowego, a także regulatorem nagrody, motywacji i spożycia alkoholu, nikotyny, amfetaminy i kokainy u myszy (przegląd patrz Engel i Jerlhag (2014)).

Opioidy, podobnie jak inne uzależniające leki, aktywują mezolimbiczny układ dopaminowy powodując odkładające się dopaminy przez aktywacja receptorów opioidowych μ i / lub δ w jądrze półleżącym (NAc) (Hirose i wsp., 2005, Murakawa i in., 2004, Yoshida i in., 1999) oraz w VTA, przypuszczalnie przez zmniejszenie GABA -hamowanie neuronów dopaminowych (Johnson i North, 1992). Ponadto, odkładające się receptory opioidowe κ regulują aktywność mezolimbicznego układu dopaminowego (Chefer i wsp., 2005, Spanagel i in., 1992). Powtarzające się narażenie na opioidy powoduje zmiany adaptacyjne kilku neuroprzekaźników, w tym peptydów opioidowych, w obszarach nagrody, które przyczyniają się do rozwoju uzależnienia (De Vries i Shippenberg, 2002). U szczurów supresja farmakologiczna GHS-R1A osłabia indukowane przez morfinę uwalnianie dopaminy na podłożu, jak również zachowania stereotypowe (Sustkova-Fiserova i in., 2014). Celem pierwszej części obecnej serii eksperymentów było zbadanie ostrego działania antagonisty GHS-R1A, JMV2959, na zdolność morfiny do wywoływania stymulacji lokomotorycznej, uwalniania dopaminy na podłożu i warunkowej preferencji miejsca u myszy. Celem drugiej części tego badania była ocena wpływu powtarzanego leczenia JMV2959 lub greliną na poziomy peptydów opioidowych (Met-enkephalin-Arg⁶Phe⁷ (MEAP), dynorfina B (DynB) i Leu-enkefalina-Arg⁶ (LeuArg)) w obszarach związanych z nagrodami, w tym w ciele migdałowatym, prążkowiu, korze przedczołowej, VTA i hipokampie.

Wykorzystano dorosłe samce myszy NMRI w wieku pokwitania (wiek 8 – 12 i masa ciała 25 – 40 g; Charles River, Sulzfeld, Niemcy). W skrócie, wszystkie myszy były trzymane w grupach i utrzymywane w cyklu 12 / 12 h światło / ciemność (światła włączały się o siódmej rano). Dostarczono wodę wodociągową i żywność (normalna karma; Harlan Teklad, Norfolk, Anglia) ad libitum, z wyjątkiem podczas konfiguracji eksperymentalnych. Nowe myszy stosowano do każdego pojedynczego testu behawioralnego, jak również do analizy peptydu opioidowego. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Szwedzką Komisję Etyczną ds. Badań Zwierząt w Göteborgu. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt i zmniejszyć liczbę wykorzystywanych zwierząt. Wszystkim zwierzętom pozwolono aklimatyzować się co najmniej tydzień przed rozpoczęciem eksperymentów.

Chlorowodorek morfiny (Apoteksbolaget Sahlgrenska Hospital; Göteborg, Szwecja) rozpuszczono w nośniku (0.9% roztwór chlorku sodu) i podawano dootrzewnowo w dawce 20 mg / kg 10 min przed rozpoczęciem eksperymentu. Dawka ta została wybrana, ponieważ mniejsza dawka (10 mg / kg, ip) nie spowodowała stymulacji lokomotorycznej u naszych myszy (dane nie pokazane). Wybrana dawka (6 mg / kg, ip) JMV2959 (zsyntetyzowana w Institut des Biomolécules Max Mousseron (IBMM), UMR5247, CNRS, Montpellier 1 i 2 Universities, Francja), antagonista GHS-R1A, została określona wcześniej i ma brak wpływu na aktywność lokomotoryczną, uwalnianie dopaminy na podłożu i warunkową preferencję miejsca u myszy (Jerlhag i in., 2009). JMV2959 rozpuszczono w nośniku (0.9% roztwór chlorku sodu) i zawsze podawano dwadzieścia minut przed ekspozycją na morfinę lub dekapitacją w celu analizy poziomów peptydów opioidowych. Wybrana dawka JMV2959 nie wpłynęła na ogólne zachowanie myszy w żadnym eksperymencie. W testach behawioralnych podawano ostro JMV2959, ponieważ nasze wcześniejsze badania wykazały, że pojedyncze wstrzyknięcie JMV2959 osłabia nagrodę wywołaną lekami (przegląd patrz Engel i Jerlhag (2014)). JMV2959 podawano przewlekle przez pięć kolejnych dni w celu analizy peptydu opioidowego w celu zwiększenia możliwości wykrycia silnego efektu. Ponadto, dzięki wielokrotnym wstrzyknięciom, unikniesz możliwego zakłócającego wpływu ostrego stresu zastrzykowego na peptydy. Grelowaną szczurzej acylowaną (Bionuclear; Bromma, Szwecja) rozcieńczono w 0.9% chlorku sodu i wykazano, że wybrana dawka greliny (0.33 mg / kg, ip) powoduje nagrodę u myszy (Jerlhag, 2008). Zrównoważony projekt został wykorzystany do wszystkich wyzwań związanych z narkotykami.

Poprzednie badania wykazały, że morfina wywołuje stymulację lokomotoryczną u gryzoni (Wise i Bozarth, 1987). Aktywność lokomotoryczną zarejestrowano w ośmiu tłumionych, wentylowanych i słabo oświetlonych skrzynkach lokomotorycznych (420 × 420 × 200 mm, Kungsbacka mät- och reglerteknik AB; Fjärås, Szwecja). Pięć po pięć rzędów wiązek fotokomórek, na poziomie podłogi pudełka, wykrywanie fotokomórki pozwoliło systemowi komputerowemu zarejestrować aktywność myszy. Aktywność lokomotoryczną zdefiniowano jako skumulowaną liczbę nowych wiązek fotokomórek przerwanych w okresie 60-min. We wszystkich doświadczeniach myszom pozwolono przyzwyczaić się do pola aktywności ruchowej na godzinę przed wyzwaniem na lek. Nie było różnic między przyzwyczajeniem w żadnej z grup leczenia (danych nie pokazano).

W pierwszej serii eksperymentów badano wpływ JMV2959 (6 mg / kg, ip) na indukowaną morfiną (20 mg / kg, ip) stymulację ruchową. JMV2959 podawano 20 min przed morfiną i rejestrację aktywności rozpoczęto dziesięć minut po ostatnim wstrzyknięciu. Każda mysz otrzymała jedną kombinację leczenia (podłoże / podłoże, JMV2959 / podłoże, morfina / podłoże lub JMV2959 / morfina; n= 8 na kombinację leczenia) i został poddany tylko jednej próbie eksperymentalnej.

Aby ocenić wpływ JMV2959 na nagradzające efekty morfiny u nowych myszy, przeprowadzono testy preferencji miejscowych na myszach, jak opisano wcześniej (Jerlhag, 2008). W skrócie, zastosowano dwukomorowy aparat CPP z oświetleniem 45 lx i wyraźnymi wizualnymi i dotykowymi wskazówkami. Jedna komora była określona przez czarno-białe ściany w paski i ciemną laminowaną podłogę, podczas gdy druga miała białą drewnianą podłogę i ściany z drewnianej tekstury. Procedura składała się z wstępnego kondycjonowania (dzień 1), kondycjonowania (dni 2 – 5) i kondycjonowania (dzień 6). Podczas wstępnego przygotowania myszom wstrzyknięto dootrzewnowo pojazd i umieszczono w komorze z wolnym dostępem do obu przedziałów podczas 20 min, aby określić preferencję początkowego miejsca (lub boku). Kondycjonowanie (min. 20 na sesję) przeprowadzono stosując procedurę tendencyjną, w której morfinę (20 mg / kg) sparowano z najmniej korzystną komorą i nośnikiem z korzystną komorą. Wszystkie myszy otrzymywały codziennie jedno wstrzyknięcie morfiny, jak również pojazdu, a zastrzyki były zmieniane między porankiem a popołudniem w projekcie wagi. Po kondycjonowaniu myszy (n= 16) wstrzyknięto JMV2959 (6 mg / kg, ip) lub równą objętość roztworu nośnika i 20 min później umieszczono w linii środkowej między dwoma przedziałami z wolnym dostępem do obu przedziałów dla 20 min (tworząc następujące grupy leczenia; Morph-Veh i Morph-JMV2959).

Preferencję miejsca warunku obliczono jako różnicę w% całkowitego czasu spędzonego w parach leków (czyli. najmniej preferowany) przedział podczas post-kondycjonowania i sesji przygotowawczej.

Biorąc pod uwagę, że JMV2959 osłabia stymulowaną morfiną stymulację lokomotoryczną i warunkową preferencję miejsca u myszy, badano wpływ JMV2959 (6 mg / kg, ip) na indukowane morfiną (20 mg / kg, ip) uwalnianie dopaminy in vivo mikrodializa u swobodnie poruszających się myszy. Do pomiarów pozakomórkowych poziomów dopaminy myszy wszczepiano jednostronnie sondą do mikrodializy umieszczoną w jądrze półleżącym. Dlatego myszy znieczulono izofluranem (Isofluran Baxter; Univentor 400 Anesthesia Unit, Univentor Ldt., Zejtun, Malta), umieszczono w ramie stereotaktycznej (David Kopf Instruments; Tujunga, CA, USA) i trzymano na poduszce grzewczej, aby zapobiec hipotermia. Jako środek znieczulający miejscowo zastosowano adrenalinę Xylocain (5 μg / ml; Pfizer Inic; New York, USA) i karprofen (Rimadyl, 5 mg / kg ip) (Astra Zeneca; Göteborg, Szwecja) w celu złagodzenia ewentualnego bólu. Odsłonięto kość czaszki i wywiercono jeden otwór na sondę i jeden na śrubę kotwiącą. Sonda była losowo zmieniana na lewą lub prawą stronę mózgu. Współrzędne 1.5 mm przed bregma, ± 0.7 poprzecznie do linii środkowej i 4.7 mm poniżej powierzchni powierzchni mózgu użyto dla jądra półleżącego (Franklin i Paxinos, 1997). Odsłonięta końcówka membrany dializacyjnej (20,000 kDa odcięta od / id 310 / 220 μm, HOSPAL, Gambro, Lund, Szwecja) sondy wynosiła 1 mm. Wszystkie sondy wszczepiono chirurgicznie dwa dni przed eksperymentem. Po zabiegu myszy trzymano w indywidualnych klatkach do dnia testu (Macrolon III).

W dniu testu sondę podłączono do pompy mikroperfuzyjnej (pompa strzykawkowa U-864; AgnThós AB) i perfundowano roztworem Ringera z szybkością 1.5 μl / min. Po jednej godzinie przyzwyczajenia do konfiguracji mikrodializy, próbki perfuzji zbierano co 20 min. Wyjściowy poziom dopaminy zdefiniowano jako średnią z trzech kolejnych próbek przed pierwszym prowokacją lek / nośnik, a wzrost dopaminy w osoczu obliczono jako procentowy wzrost od linii podstawowej. Po próbkach podstawowych (-40 min do 0 min), myszom wstrzyknięto JMV2959 lub nośnik (w 0 min), po którym nastąpiło wstrzyknięcie morfiny lub nośnika (w 20 min). Po tych podaniach leku zebrano dodatkowe osiem próbek 20 min. Łącznie następujące grupy terapeutyczne (n= 8 w każdej grupie) zostały utworzone: pojazd-pojazd (pojazd-pojazd), pojazd-morfina (pojazd-morf), JMV2959-pojazd (JMV2959-pojazd) i JMV2959-morfina (JMV2959-Morph).

Poziomy dopaminy w dializatach oznaczono metodą HPLC z detekcją elektrochemiczną. Pompa (Gyncotec P580A; Kovalent AB; V. Frölunda, Szwecja), kolumna jonowymienna (2.0 × 100 mm, Prodigy 3 μm SA; Skandinaviska GeneTec AB; Kungsbacka, Szwecja) i detektor (Antec Decade; Antec Leyden; Zoeterwoude , Holandia) zostały wyposażone w komorę przepływową VT-03 (Antec Leyden). Faza ruchoma (pH 5.6), składająca się z kwasu sulfonowego 10 mM, kwasu cytrynowego 200 mM, cytrynianu sodu 200 mM, 10% EDTA, 30% MeOH, była filtrowana próżniowo przy użyciu filtra membranowego 0.2 μm (GH Polypro; PALL Gelman Laboratory; Lund, Szwecja). Fazę ruchomą dostarczano przy szybkości przepływu 0.2 ml / min przechodzącej przez odgazowywacz (Kovalent AB), a analit utleniano przy + 0.4 V.

Po zakończeniu eksperymentów mikrodializy myszy pozbawiono głowy, a sondy perfundowano błękitem pontaminowym 6BX, aby ułatwić lokalizację sondy. Mózgi zamontowano na urządzeniu wibroizolacyjnym (752 M Vibroslice; Campden Instruments Ltd., Loughborough, UK) i pocięto na sekcje 50 μm. Lokalizacja sondy została określona przez obserwację całkowitą przy użyciu mikroskopii świetlnej. Dokładna pozycja sondy została zweryfikowana (Franklin i Paxinos, 1997) i do analizy statystycznej użyto tylko myszy z prawidłowymi położeniami.

Zbadano wpływ leczenia JMV2959 na poziomy MEAP, DynB i LeuArg w obszarach związanych z nagrodami. Myszom wstrzykiwano albo JMV2959 (6 mg / kg, ip, n= 8) lub równą objętość pojazdu (ip, n= 8) przez pięć kolejnych dni. 20 min po ostatnim wstrzyknięciu myszy uśmiercono i zebrano mózgi tych myszy. Osobnym myszom wstrzykiwano grelinę (0.33 mg / kg, ip, n= 8) lub równą objętość pojazdu (ip, n= 8) przez pięć kolejnych dni. Pięć minut po ostatnim wstrzyknięciu myszy uśmiercono i zebrano mózgi tych myszy. Ciało migdałowate, prążkowie, kora przedczołowa, VTA i hipokamp zostały szybko wycięte i natychmiast włożone do suchego lodu, a następnie przechowywane w -80 ° C aż do dalszego przetwarzania.

Procedury homogenizacji i ekstrakcji peptydów były zgodne ze standardową procedurą, opisaną wcześniej szczegółowo (Nylander i in., 1997). W skrócie, gorący (95 ° C) kwas octowy (1 M) dodano do zamrożonych próbek. Próbki ogrzewano w łaźni wodnej (95 ° C) przez 5 min, ochłodzono na lodzie, a następnie homogenizowano za pomocą Sonson Branson (Danbury, CT, USA). Homogenat ponownie ogrzewano w 95 ° C przez 5 min i ochłodzono na lodzie przed odwirowaniem dla 15 min w 4 ° C i 12,074 ×g w wirówce Beckman GS-15R (Fullerton, CA, USA). Ekstrakty dalej oczyszczano zgodnie z wcześniej opisaną procedurą (Nylander i in., 1997). Zebrano dwie frakcje: frakcja III (Leu-Arg i MEAP) i frakcja V (DynB). Próbki wysuszono w wirówce próżniowej (Savant SpeedVac Plus SC210A; Thermo Scientific Inc., Waltham, MA USA) i przechowywano w zamrażarce (-20 ° C) do analizy peptydu.

Poziomy immunoreaktywne (ir) DynB, LeuArg i MEAP analizowano za pomocą dobrze znanych testów radioimmunologicznych, a protokoły opisano szczegółowo w innym miejscu (Nylander i in., 1997). W teście DynB kozią anty-króliczą IgG (GARGG; Bachem, Bubendorf, Szwajcaria) zastosowano do oddzielenia wolnego i związanego z przeciwciałem peptydu. Surowicę Dyn (113 +) zastosowano w końcowym rozcieńczeniu 1: 600000. Reaktywność krzyżowa z dużym Dynem wynosiła 100% iz DynB (1 – 29) 1%. Nie zaobserwowano reaktywności krzyżowej z innymi peptydami opioidowymi. W testach LeuArg i MEAP zastosowano zawiesinę węgla drzewnego do oddzielenia wolnego i związanego z przeciwciałem peptydu. Dla antysurowicy LeuArg (91: 6D +, końcowe rozcieńczenie 1: 60000), reaktywność krzyżowa była mniejsza niż 0.01% dla Leu-enkefaliny i MEAP, 0.02% dla DynB, 0.04% dla DynA i 0.08% dla alfa-neoendorfiny. Surowicę MEAP 90: 3D (II) zastosowano w końcowym rozcieńczeniu 1: 160 000. Reaktywność krzyżowa z Met-enkefaliną, Met-enkefaliną-Arg⁶, Met-enkefalina-Arg⁶Gly⁷Leja⁸, Leu-enkefalina i Leu-enkefalina-Arg⁶ było <0.1%

Ogólny główny efekt leczenia stwierdzono na aktywność lokomotoryczną u myszy po ogólnoustrojowym podaniu morfiny (20 mg / kg) i JMV2959 (6 mg / kg) (F (3,27) = 7.409, P= 0.0009; n= 8 dla pojazdów-pojazdów, JMV2959-Veh, JMV2959-Morph i n= 7 dla pojazdu-Morph). Jak pokazano w Rysunek 1Analiza posthoc wykazała, że ​​leczenie wstępne pojedynczym wstrzyknięciem JMV2959 (P<0.001) istotnie osłabiał stymulację lokomotoryczną wywołaną przez morfinę (P<0.01 pojazd – pojazd vs Veh-Morph). Wybrana dawka JMV2959 nie miała wpływu na aktywność ruchową w porównaniu z leczeniem pojazdem (P> 0.05). Nie było różnicy w odpowiedzi na aktywność lokomotoryczną u myszy leczonych podłożem i myszy leczonych JMV2959-morfiną (P> 0.05).

  

Rysunek 1

Antagonista GHS-R1A, JMV2959, osłabia indukowaną morfiną stymulację lokomotoryczną, uwalnianie dopaminy na podłożu i warunkową preferencję miejsca u myszy. (A) Stymulację lokomotoryczną indukowaną przez morfinę (20 mg / kg ip) osłabiono przez pojedyncze wstrzyknięcie JMV2959 (6 mg / kg ip) (n= 7 – 8 w każdej grupie; **P<0.01, ***P<0.001 jednokierunkowa ANOVA, a następnie test post-hoc Bonferroniego). (B) Preferencja miejsca (CPP) wywołana morfiną (20 mg / kg ip) została osłabiona przez ostry pojedynczy zastrzyk JMV2959 (6 mg / kg ip) u myszy (n= 8 w każdej grupie, *P<0.05, niesparowany test t). (C) Najpierw wykazaliśmy istotny wpływ morfiny (20 mg / kg ip) na zwiększenie uwalniania dopaminy w porównaniu z leczeniem nośnikiem (przedział czasu 40–180 min (P<0.001), pojazd – pojazd vs Veh-Morph). Jak pokazano w (C) wstępne leczenie JMV2959 (6 mg / kg ip) osłabiło indukowany morfiną wzrost uwalniania dopaminy w porównaniu do wstępnego leczenia pojazdem w przedziale czasowym 40 – 100 i 140 – 180 min (^##P<0.01, ^{# # #}P <0.001, JMV2959-Morph w porównaniu do leczenia Veh-Morph). Wybrana dawka JMV2959 nie miała istotnego wpływu na uwalnianie dopaminy w pozycji leżącej w porównaniu z leczeniem nośnikiem w żadnym przedziale czasowym (P> 0.05, pojazd – pojazd vs JMV2959-Veh). JMV2959 zmniejszył się, ale nie został całkowicie zablokowany, indukowane morfiną uwalnianie dopaminy w odstępie czasu 60-140 (*P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001, JMV2959-Morph w porównaniu do leczenia Veh-Morph). Strzałki przedstawiają punkty czasowe wstrzyknięcia JMV2959, nośnika i morfiny. Dane analizowane za pomocą dwukierunkowej analizy ANOVA, a następnie testu post-hoc Bonferroniego (n= 8 w każdej grupie). Veh-veh (Square), Veh-Morph (rhomb), JMV2959-Veh (Trójkąt), JMV2959-Morph (koło). Wszystkie wartości oznaczają średnią ± SEM.

Zobacz obraz | Zobacz obraz Hi-Res | Pobierz slajd programu PowerPoint

Wywołane morfiną (20 mg / kg) (Morph-Veh) uwarunkowane miejsce było znacznie osłabione przez ostry pojedynczy wstrzyknięcie JMV2959 (6 mg / kg) (Morph-JMV2959) w dniu po kondycjonowaniu (P= 0.025, n= 8 w każdej grupie; Rysunek 1B).

Pomiary mikrodializy dopaminy u myszy ujawniły ogólny główny efekt leczenia (F(3,33) = 24.15, P<0.0001), czas F(11,308) = 7.05, P<0.0001) i interakcja leczenie × czas (F(11,308) = 8.63, P<0.0001) (Rysunek 1C; n= 8 w każdej grupie). Morfina zwiększała wydzielanie dopaminy w stosunku do podłoża w stosunku do leczenia pojazdem w przedziale czasowym 40 – 180 min (P<0.001). Jak pokazano w Rysunek 1C ten efekt został zmniejszony przez wstępne traktowanie JMV2959 w przedziale czasowym 40 – 80 (P<0.01, 100), XNUMX (P<0.001, 140), XNUMX (P<0.01) i 160–180 min (P<0.001). JMV2959 zmniejszył, ale nie całkowicie zablokował, uwalnianie dopaminy w pozycji leżącej indukowane morfiną, ponieważ istniała różnica między leczeniem nośnikiem a leczeniem JMV2959-morfiną w przedziale czasowym 60–80 (P<0.01, 100), XNUMX (P<0.001, 140), XNUMX (P<0.01) i 160 min (P<0.05). Wybrana dawka JMV2959 nie miała istotnego wpływu na uwalnianie dopaminy w pozycji leżącej w porównaniu z leczeniem nośnikiem w żadnym przedziale czasowym (P> 0.05).

Niniejsze badanie dodatkowo potwierdza hipotezę, że fizjologiczna rola peptydu oreksygenicznego obejmuje regulację nagrody. Rzeczywiście, wykazaliśmy, że obwodowe podawanie antagonisty GHS-R1A osłabia zdolność morfiny do wywoływania stymulacji lokomotorycznej, zwiększania poziomów dopaminy w NAc i indukowania warunkowej preferencji miejsca u myszy. Stwierdziliśmy również, że leczenie przewlekłe JMV2959, ale nie greliny, zwiększyło poziom MEAP w tkankach ir w VTA, DynB w hipokampie i LeuArg w prążkowiu, dając pierwszy dowód, że zdolność sygnalizacji ghreliny do regulacji wzmocnienia może obejmować peptydy opioidowe .

Przedstawione tu dane pokazują, że antagonizm GHS-R1A wpływa na zdolność morfiny do aktywacji mezolimbicznego układu dopaminowego u myszy. Zgodne są ustalenia pokazujące, że JMV2959 blokuje zdolność morfiny do zwiększania pozakomórkowych poziomów dopaminy w pozycji leżącej i wywoływania stereotypowego zachowania u szczurów (Sustkova-Fiserova et al., 2014). Pomocniczo, centralne podawanie greliny zwiększa punkt przerwania, ale nie liczbę aktywnych naciśnięć dźwigni, w progresywnym harmonogramie wzmacniania współczynnika u szczurów samodzielnie przyjmujących heroinę (Maric i in., 2012). Twierdzenie, że sygnalizacja greliny leży u podstaw uzależnienia od narkotyków, jest dodatkowo poparte odkryciami wskazującymi, że JMV2959 zmniejsza spożycie, a także motywację do spożywania alkoholu u szczurów oraz że nagroda indukowana amfetaminą, kokainą i nikotyną jest blokowana przez antagonizm GHS-R1A u gryzoni ( do przeglądu patrz Engel i Jerlhag (2014)) oraz że polimorfizmy w genach związanych z greliną są związane ze spożyciem alkoholu, paleniem i amfetaminą (przegląd patrz Engel i Jerlhag (2014)).

Obecne wyniki ze zwiększonymi poziomami peptydów opioidowych w prążkowiu, VTA i hipokampie po leczeniu przewlekłym JMV2959 sugerują pierwsze interakcje między peptydami opioidowymi a sygnalizacją greliny. Endogenne opioidy biorą udział w efektach nagradzających, nie tylko indukowanych przez opioidy, ale także inne leki nadużywające i naturalne nagrody, oraz w procesach adaptacyjnych obserwowanych po wielokrotnym narażeniu na lek (Trigo i in., 2010, Van Ree i in., 2000). Rzeczywiście, aktywność mezolimbicznego układu dopaminowego jest regulowana przez endogenne opioidy zarówno na poziomie VTA, jak i NAc (Hirose i in., 2005, Spanagel i in., 1992), a działania okazały się albo bezpośrednie, albo pośrednie poprzez modulację innych nadajników (Charbogne i in., 2014).

Odkryliśmy tutaj, że leczenie przewlekłe JMV2959 zwiększyło poziomy MEAP w VTA. MEAP pochodzi wyłącznie z proenkefaliny i został użyty jako marker peptydów proenkefalinowych, które aktywują głównie receptory opioidowe δ. Przypuszczamy, że zwiększone poziomy endogennego MEAP w VTA po leczeniu JMV2959 mogą zapobiec zdolności morfiny do zmniejszenia hamowania GABA mezoakumulacyjnych neuronów dopaminowych (Johnson i North, 1992), co może przyczynić się do zmniejszenia efektów indukowanych morfiną obserwowanych po JMV2959. Wspierając, GHS-R1A znajdują się na interneuronach GABAergicznych w VTA (Abizaid i in., 2006). Co więcej, wcześniejsze badania wykazały, że infuzja JMV2959 wewnątrz VTA, przez nieznane mechanizmy, osłabiają nagrody indukowane greliną (Jerlhag i in., 2011), a także spożycie sacharozy za pośrednictwem greliny u gryzoni (Skibicka i in., 2011), sugerują, że brzuszna nakrywkowa GHS-R1A jest ważna dla regulacji nagrody. Na poparcie takiego sporu są wyniki pokazujące, że inne peptydy regulujące głód, takie jak galanina i oreksyna, pośredniczą w nagradzających właściwościach morfiny przez lokalne mechanizmy w VTA (Narita i in., 2006, Richardson i Aston-Jones, 2012).

W prążkowiu odkryliśmy, że podchroniczny JMV2959 zwiększa ir poziomy LeuArg, co sugeruje, że zdolność JMV2959 do łagodzenia warunkowanej morfiną warunkowanej preferencji miejsca, uwalniania dopaminy i stymulacji lokomotorycznej zależy, przynajmniej częściowo, od wzmocnionego umb- zwiększonego aktywność receptora opioidowego. Zwiększone poziomy LeuArg mogą wynikać ze zwiększonej konwersji enzymatycznej peptydów dynorfiny do enkefalin lub ze zwiększonego uwalniania Dyn w NAc w odpowiedzi na zwiększoną dopaminę, a następnie degradację do LeuArg. Chociaż wcześniejsze badania wykazały, że aktywność mezolimbicznego układu dopaminowego jest regulowana przez Receptory opioidowe κ w NAc (Spanagel i wsp., 1992) i endogenne receptory opioidowe κ zapewniają toniczne hamowanie mezoakustycznej neurotransmisji dopaminy i łagodzą indukowane kokainą uwalnianie dopaminy w NAc (Chefer i wsp., 2005), nie pokazują, że JMV2959 zmienia poziomy ir DynB w prążkowiu. Dlatego też uzasadnione są dalsze badania peptydów prodynorfiny w celu wyjaśnienia interakcji między antagonizmem GHS-R1A a dynorfinami.

W niniejszym badaniu wykazaliśmy również, że leczenie JMV2959 znacząco zwiększa poziom DynB hipokampa. Grelina zwiększa konsolidację pamięci, jak również kształtowanie kręgosłupa dendrytycznego, generuje długotrwałe wzmocnienie i wywołuje ułatwienie pamięci przez hipokampalny GHS-R1A u gryzoni (Carlini i wsp., 2010, Diano i in., 2006). Ponadto myszy z nokautem GHS-R1A wykazują ulepszoną pamięć przestrzenną w teście labiryntu wodnego Morrisa i zakłóconą pamięć kontekstową w paradygmacie warunkowania strachu w porównaniu z myszami typu dzikiego (Albarran-Zeckler i in., 2012). Peptydy dynorfiny, w tym DynB, występują obficie w hipokampie i osłabiają długotrwałe wzmacnianie (Chavkin i wsp., 1985, Wagner i wsp., 1993), jak również upośledzają uczenie przestrzenne u szczurów (Sandin i in., 1998). Dlatego hipotezujemy, że antagonista GHR-R1A może osłabiać pamięć nagrody poprzez hamowanie długoterminowego wzmocnienia hipokampa przez aktywacja DynB. Łącznie dane te zapewniają nowy potencjalny mechanizm, dzięki któremu JMV2959 przez peptydy opioidowe mogą zmieniać wzmocnienie. Jednakże receptory opioidowe są szeroko rozpowszechnione w mózgu, co sugeruje, że inne obszary, nie ujęte w niniejszym badaniu, mogą być zaangażowane w regulowaną przez GHS-R1A nagrodę indukowaną morfiną. Na przykład, indukowane greliną przyjmowanie pokarmu, jak również naciskanie dźwigni dla sacharozy jest zmniejszone przez centralne lub podwzgórzowe podawanie antagonisty receptora opioidowego κ (Romero-Pico i in., 2013). Jednak rola peptydów opioidowych w innych obszarach musi być wyjaśniona w nadchodzących badaniach.

Endogenne ligandy receptora μ, endomorfiny i beta-endorfiny, nie były tutaj analizowane, więc nie możemy wykluczyć możliwego wpływu JMV2959 na te peptydy. Rzeczywiście, nagradzające właściwości morfiny obejmują receptory opioidowe μ w VTA, jak również NAc (Hirose i wsp., 2005, Johnson and North, 1992, Murakawa i in., 2004, Yoshida i in., 1999). Jednakże antagonista receptora μ nie osłabia poboru pokarmu indukowanego greliną (Naleid i in., 2005) ani indukowanej greliną stymulacji lokomotorycznej i uwalniania dopaminy w warunkach półleżących (Jerlhag i in., 2011), sugerując, że zdolność GHSR- Antagonista 1A do regulacji wzmocnienia nie zawiera receptorów μ. Z drugiej strony, JMV2959 wpływał na peptydy opioidowe pochodzące z proenkephaliny i prodynorfiny, pokazując, że mogą one uczestniczyć w działaniach wywołanych przez antagonistów GHSR-1A.

Podczas gdy poprzednie badania wykazały, że ogólnoustrojowe podawanie ghreliny powoduje nagrodę (Jerlhag, 2008), jak również poprawia nagradzające właściwości uzależniających leków (do przeglądu patrz Engel i Jerlhag (2014)), tutaj pokazujemy, że leczenie podchroniczne greliny nie zmieniło się poziom peptydów opioidowych w tkankach ir w dowolnym z badanych obszarów związanych z nagrodą. Ogólnoustrojowa ekspresja aktywnej c-fos greliny w obszarach podwzgórza, ale nie w obszarach mezolimbicznych i hipokampowych (Pirnik i wsp., 2011) i wiązanie fluorescencyjnie znakowanej greliny jest ograniczona do neuronów regulujących żywność w podwzgórzu (Schaeffer i in., 2013 ). Razem z odkryciami wskazującymi, że grelina, z wyjątkiem śladowych ilości w podwzgórzu, nie może być wykryta w głębszych obszarach mózgu po podaniu obwodowej greliny (Furness i wsp., 2011, Grouselle i in., 2008, Sakata i in., 2009 ), podnosi możliwość, że systemowa grelina aktywuje system nagród przez pośrednie mechanizmy niezależne od endogennych opioidów. Wspierając, indukowane ghreliną uwalnianie dopaminy na podłożu wymaga wcześniejszego sygnalizacji podwzgórzowej oreksigenicznej (Cone et al., 2014), podawanie obwodowej greliny nie zmienia spożycia alkoholu u myszy (Lyons i in., 2008) i że neutralizacja obwodowej greliny nie osłabia alkoholu -indukowana nagroda u myszy lub spożycie alkoholu u szczurów (Jerlhag i in., w druku). Należy wziąć pod uwagę możliwość, że podchroniczne podawanie greliny zwiększa poziom peptydów opioidowych w tkankach podczerwonych, jednak należy to szczegółowo zbadać w nadchodzących badaniach.

Zdolność uzależniających leków do wywoływania stymulacji, uwalniania dopaminy i wywoływania warunkowej preferencji miejsca jest ściśle związana z właściwościami wzmacniającymi uzależniających leków i te parametry są uważane za stanowiące część procesu uzależnienia (Wise, 2004). Biorąc pod uwagę, że tutaj odkryliśmy, że JMV2959 osłabia te parametry nagrody u myszy, przypuszczamy, że GHS-R1A może odgrywać ważną rolę w procesach uzależnień i że endogenne opioidy biorą udział w tych procesach. Łącznie dane te wskazują, że antagonistów GHS-R1A należy wyjaśnić jako leczenie uzależnienia od leków.

JE i EJ są wspierane przez granty ze Szwedzkiej Rady ds. Badań (Grant nr 2011-4646, 2009-2782 i 2011-4819), szwedzkiej fundacji mózgowej, LUA / ALF (Grant nr 148251) ze Szpitala Uniwersyteckiego Sahlgrenska, Alkohol rada badawcza szwedzkiego monopolu handlu detalicznego alkoholem oraz fundacje Adlerbertska, Fredrik i Ingrid Thuring, Tore Nilsson, Längmanska, Torsten i Ragnar Söderberg, Wilhelm i Martina Lundgren, NovoNordisk, Knut i Alice Wallenberg, Magnus Bergvall, Anérs, Jeansons, Åke Wiberg , Szwedzkie Towarzystwo Medycyny, Szwedzkie Towarzystwo Badań Medycznych i Gothenburg Psychiatry Research Foundation. Rada Badań nad Alkoholem Szwedzkiego Monopolu Sprzedaży Alkoholów i Szwedzka Rada ds. Badań (K2012-61X-22090-01-3) wspierały IN. Źródła finansowania nie odgrywały żadnej roli w projekcie badania, w gromadzeniu, analizie i interpretacji danych, w pisaniu raportu oraz w decyzji o opublikowaniu danych