Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2-рецептор и ослабляет сигнализацию в нисходящем направлении (2013)

Комментарии: По всей видимости, показывает, что Cdk5 снижает регуляцию дофаминовых рецепторов D2. Удивительно, но фактор трансляции deltafosb вызывает производство Cdk5. Итог: Deltafosb играет важную роль как в сенсибилизации, так и в десенсибилизации.

Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) PLOS ONE 8 (12): e84482. DOI: 10.1371 / journal.pone.0084482

Абстрактные

Рецептор дофамина D2 (DRD2) является ключевым рецептором, который обеспечивает функции мозга, связанные с дофамином, такие как настроение, вознаграждение и эмоции. Циклин-зависимая киназа 5 (Cdk5) представляет собой пролин-направленную серин / треонин-киназу, чья функция участвует в цепи вознаграждения мозга. В этом исследовании мы обнаружили, что сериновый остаток 321 (S321) в третьей внутриклеточной петле DRD2 (D2i3) является новым регуляторным сайтом Cdk5. Cdk5-зависимое фосфорилирование S321 в D2i3 наблюдалось в в пробирке и систем клеточной культуры.

Мы также отметили, что фосфорилирование S321 нарушало индуцированную агонистом поверхностную экспрессию DRD2 и уменьшало связывание белка G с DRD2. Более того, тропосферный путь cAMP был затронут в гетерологичной системе и в первичных культурах нейронов из эмбрионов с нокаутом p35, вероятно, из-за сниженной ингибирующей активности DRD2. Эти результаты показывают, что Cdk5-опосредованное фосфорилирование S321 ингибирует функцию DRD2, обеспечивая новый регуляторный механизм передачи сигналов допамина.

цифры

12

Образец цитирования: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 Phosphorylates Допамин D2-рецептор и ослабляет сигнальную систему. PLOS ONE 8 (12): e84482. DOI: 10.1371 / journal.pone.0084482

Редактор: Джеймс Портер, Университет Северной Дакоты, Соединенные Штаты Америки

Получено: Май 20, 2013; Принято: Ноябрь 14, 2013; Опубликовано: 31 декабря 2013

Авторское право: © 2013 Jeong et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями Лицензии Creative Commons Attribution, который допускает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинал автора и источник зачисляются.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантами (NRF-2012R1A2A2A01012923 и NRF-2012R1A4A1028200) от корейского правительства (MSIP), а также поддерживалась в рамках программы международного сотрудничества, управляемой NRF of Korea (2012K2A1A2033117) и Корейским исследовательским институтом мозга (KBRI) Основная исследовательская программа MSIP (2031-415). SKP был лауреатом 2004 и 2006 National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD) Young Investigator Awards. Финансисты не играли никакой роли в разработке исследований, сборе и анализе данных, решении опубликовать или подготовить рукопись.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов.

Введение

Дофаминовая сигнализация участвует в различных функциях мозга, включая координацию движений, контроль настроения и механизмы вознаграждения [1]. Основным компонентом передачи сигналов допамина у позвоночных является стригальная среда, колющие нейроны (MSN), которые выборочно выражают подмножество дофаминовых рецепторов и получают дофаминергический вход, главным образом, из вентральной области (VTA) и субстанциальной нигры (SN) [2], Допаминовые рецепторы представляют собой рецепторы, связанные с белками G (GPCR) с семью трансмембранными доменами и состоят из двух подтипов, D1-подобные и D2-подобные рецепторы, которые опосредуют взаимные действия в сигнале допамина [1]. Например, дофаминовые D1-подобные рецепторы (D1, D5) активируют аденилилциклазу через G& alpha; S и повышают внутриклеточный уровень цАМФ, но дофаминовые D2-подобные рецепторы (D2, D3, D4) ингибируют аденилатциклазу через Gщ и снижение внутриклеточного уровня цАМФ [1], [3].

Среди рецепторов допамина рецептор D2 (DRD2) участвует в патофизиологии многих основных психических расстройств, включая шизофрению и наркоманию [4], так что многие антипсихотические препараты по меньшей мере частично нацелены на DRD2. Также известно, что активность DRD2 хорошо коррелирует с поведенческими последствиями злоупотребления наркотиками на животных моделях [5], Антидепрессанты и эффективность стабилизатора настроения также были связаны с изменениями экспрессии клеточной поверхности DRD2 или последующей внутриклеточной сигнализации, опосредованной PKA, ERK и GSK3 [1], [4], [6], Несмотря на эти критические роли DRD2 в мозге, подробные механизмы регулирования, которые придают неоднородность и сложность свойствам DRD2, не полностью поняты.

Сходящиеся строки доказательств указывают на то, что при тонкой настройке DRD2 задействованы множественные посттрансляционные модификации. Обширное гликозилирование DRD2 было обнаружено в ранних исследованиях фотоаффинной маркировки [7], и образование дисульфидной связи в DRD2 также было идентифицировано как важная модификация связывания лиганда [8], Кроме того, сайты фосфорилирования DRD2 были первоначально идентифицированы в пробирке анализ с помощью радиоизотопов, обеспечивающий маршруты для различных регуляторных путей, опосредованных различными киназами [9], Действительно, протеинкиназа C (PKC) регулирует DRD2-опосредованную мобилизацию внутриклеточного кальция и модулирует взаимодействие DRD2 с цитоскелетными белками [10], Фосфорилирование с помощью GPCR-киназы 2 (GRK2) регулирует модели реенсибилизации, вызванные агонистом DRD2 [11].

Циклин-зависимая киназа 5 (Cdk5) представляет собой направленную по пролину серин / треонинкиназу, которая обладает преимущественной активностью из-за специфической для мозга экспрессии ее основных активаторов, p35 и p39 [12], Cdk5 участвует в различных процессах нейронов, включая миграцию нейронов и наведение аксонов, а нулевые мыши Cdk5 и p35 обнаруживают дефекты в корковых слоях [13], Недавно было показано, что фосфорилирование WAVE1 и ephexin Cdk5 регулирует морфогенез дендритного позвоночника [14], Кроме того, Cdk5 также регулирует уровни поверхностного экспрессии NMDA-рецепторов, NR2B и NR2A-опосредованных токов NMDA [15], [16], Следует отметить, что несколько доказательств указывают на тесную связь между Cdk5 и допаминовой системой. Cdk5 фосфорилирует тирозингидроксилазу (TH), регулируя ее стабильность и тем самым поддерживая дофаминергический гомеостаз [17], В постсинаптических нейронах, когда остаток T75 дофамина и циклически-AMP-регулируемого фосфопротеина-32kD (DARPP-32) фосфорилируется Cdk5, он может ингибировать активность PKA и, таким образом, антагонизировать дофаминную DRD1-опосредованную PKA-сигнализацию [18]. Интересно, что когда кокаин, косвенный агонист дофаминовых рецепторов, хронически вводится у крыс, мРНК и уровней белка увеличения Cdk5 в средних колючих нейронах [19]. В совокупности Cdk5, по-видимому, участвует в индуцированной наркотиками синаптической адаптации. В этом исследовании показано функциональное взаимодействие DRD2 и Cdk5, что еще больше расширяет роль Cdk5 в сигнале допамина.

Материалы и методы

Антитела

Анти-кроличьи сыворотки повышали против пептидов, содержащих фосфосерин 321 (pS321) третьей внутриклеточной петли DRD2 (D2i3). Фосфопептид CNPDpSPAKPEK (PEPTRON) использовали для получения конъюгированной с пептидом колонки для аффинной очистки (20401, PIERCE). Анти-pS321-антитело обогащалось системой аффинной очистки по инструкции производителя. Очищенное фосфо-антитело хранили в PBS с помощью 0.1% азида натрия и 0.1% желатина. Для Вестерн-блоттинга и иммуноцитохимии Cdk5 / p249 использовали антимышиное антитело против Cdk35 (sc-820) и анти-кроличье антитело против p5 (sc-35). Антимуновое анти-GFP-антитело (sc-9996) использовали для иммунопреципитации и Вестерн-блоттинга DRD2-GFP. Анти-кроличьи анти-FLAG-антитела (sc-807), анти-кроличьи анти-HA-антитела (sc-805), антимышиное антитело против GST (sc-138) и антимышиное антитело против GAPDH (sc- 32293) были приобретены у Santa Cruz Biotechnologies.

Животные

Нокаутная мышь p35 была добрым подарком от доктора Кацухико Микошибы в Научном институте мозга RIKEN в Японии и использовалась для первичной нейронной культуры. Наборы грунтов для генотипирования были 5'-GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC и 5'-TCCATCT GCACGAGACTAGT, как описано выше [20], Мышей ICR и крыс Sprague Dawley использовали для приготовления лизата головного мозга. Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных в области науки и техники Пхохан.

Плазмидные конструкции

Использовали длинную изоформу DRD2 человека в векторе плазмиды EGFP-N1 и третью внутриклеточную петлю аминокислотных остатков DRD2 (212-373, включая дополнительные аминокислотные остатки 29, уникальные для длинной изоформы DRD2) в плазмидном векторе pFLAG-CMV-2. Человеческий Cdk5 вводили в плазмидный вектор pCMV-HA, а человеческий p35 вставляли в плазмидный вектор pcDNA 3.1. Человеческий Cdk5 был вставлен под промотором цитомегаловируса (CMV) вместе с человеческим p35 в векторе pcDNA 3.1, чтобы получить конструкцию с двойной экспрессией (Cdk5 / p35) для иммуноцитохимии, анализ интернализации рецептора, [35S] -GTPγS, анализ связывания радиолиганда и иммуноферментный анализ цАМФ.

В пробирке Анализ киназы

IP-сшитый в пробирке киназы проводили следующим образом. Один цельный мозг мыши лизировали в буфере для лизиса 3 мл эритроцитов (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 0.1% NP-40) с помощью 20-ходов гомогенизатора Dounce для получения гомогенизированных лизатов мозга , Лизаты инкубировали на льду в течение 30 мин, обрабатывали ультразвуком и центрифугировали при 16,000 × g для 10 мин. Супернатанты иммунопреципитировали анти-кроличьим анти-p35-антителом для получения активного комплекса Cdk5 / p35. Комплекс Cdk5 / p35 и очищенный слитый белок GST смешивали с аденозиновым 5'-трифосфатом, [γ-32P] (NEG-502H, PerkinElmer) и инкубировали в киназном буфере (30 мМ HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl2, 0.2 mM DTT) для 1 h при комнатной температуре [18], [21], Очищенный комплекс Cdk5 / p25 (14-516, Millipore) также использовался для в пробирке киназы, как описано выше. Буфер для загрузки образца 2 × добавляли к реакционной смеси и кипятили при 100 ° C. Образцы затем подвергали SDS-PAGE и высушенный гель оценивали с помощью авторадиографии.

Жидкая хроматография (LC) -Масс-спектрометрия (MS) / MS-анализ

Рекомбинантный белок GST-D2i3 анализировали с помощью LC-MS / MS после IP-связи в пробирке киназы. Мы выполнили идентификацию пептида данных LC-MS / MS с использованием X !! Tandem (версия Dec-01-2008). Каждый файл данных RAW был сначала преобразован в mzXML с использованием транс-протеомного конвейера (TPP, версия 4.3). MS / MS-сканирование в преобразованных mzXMLs затем подвергали поиску по базе данных последовательности белка мыши UniProt (релиз 2010_07), включая последовательность GST-D2i3, используя X !! Tandem. Допуск устанавливали на 3 Da для ионов-предшественников и 2 Da для фрагментных ионов. Использовалась ферментативная специфичность для трипсина. Варианты вариационной модификации были использованы для карбамидометилирования цистеина (57.021 Da), окисления метионина (15.995 Da), гидролиза аспарагина (0.987 Da) и фосфорилирования серина (79.966 Da).

иммунопреципитация

Иммунопреципитацию проводили на клеточных лизатах в буфере для лизиса ELB. Анти-GFP-антитело добавляли к лизатам и инкубировали для 3 h при 4 ° C. Иммунокомплексы очищали с использованием агарозы белка А. Осадки инкубировали с буфером для загрузки образцов SDS для 30 мин при 37 ° C и подвергали SDS-PAGE и Вестерн-блотам.

Аналитический анализ GST

10 мкг очищенного GST и GST-D2i3 инкубировали с лизатом крысиного мозга мозга для 1.5 h при 4 ° C. Добавляли 30 мкл глутатион (GSH) -конъюгированных гранул Sepharose 4B (17-0756-01, GE Healthcare), уравновешенных буфером для лизиса, и инкубировали для дополнительного 1 h. Бусины собирали центрифугированием при 2,000 ×g и промывают буфером для лизиса 4 раз [22], [23], Осадки анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антител против Cdk5 и анти-p35.

Иммуноцитохимическая

Трансфицированные клетки HEK 293 и полосатые нейроны, культивированные на покровных стеклах, один раз промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) и фиксировали погружением в холодный 4% параформальдегид / PBS для 30 мин. Первичное антитело разводили в блокирующем растворе (2% лошадиной сыворотки и 1% Triton X-100 в PBS). В качестве вторичных антител использовались антитело против конъюгата антитело против мышиного антитела типа Alexafluor-647 (A20990, Invitrogen) и Alexafluor-568-конъюгированное антитело (A11011, Invitrogen). Hoechst использовали для окрашивания ядер. Изображения были получены с помощью конфокальной микроскопии (Olympus, FluoView-1000).

Анализ интернализации рецептора

24 h после трансфекции клетки обрабатывали 1 μM quinpirole (Q102, Sigma) для 30 мин и 90 мин при 37 ° C. Клетки повторно суспендировали в 2 мл холодной PBS и аликвоты 200 мкл использовали для каждой реакции. Лекарственные препараты проводили при комнатной температуре для 3 h в следующих концентрациях; 3 nM [3H] -пиперон (NET-565, PerkinElmer), 3 мкМ сульпирида (895, TOCRIS), 10 мкМ галоперидола (H1512, Sigma). Гидрофобный [3H] -пиперон использовали для обозначения тотальных экспрессированных рецепторов, а гидрофильный сульпирид использовали для замены мембранных рецептор-связанных [3H] -пипероновых сигналов. Мембранно-ассоциированные рецепторные сигналы рассчитывали путем вычитания значений внутриклеточных рецепторов из общих выраженных рецепторных значений. Клетки фильтровали через фильтр GF / B (Millipore) и промывали 3 раза промывочным буфером (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 мМ NaCl). Фильтры высушивали и измеряли остаточную радиоактивность с использованием жидкого сцинтилляционного счетчика [24].

Подготовка мембран для клеток

Конфлюэнтные клетки в культуральных чашках 100 мм после трансфекции промывали ледяным PBS и собирали в буфере HME 1 мл (25 мМ HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 1 мМ ЭДТА). Гомогенизированные лизаты центрифугировали с помощью 500 × g для 15 мин и супернатанты затем центрифугировали с помощью 36,000 × g для 30 мин. Пеллеты, повторно суспендированные в буфере HME, использовали для анализа.

[35S] -GTPγS Binding Assay

Фрагменты клеточной мембраны предварительно инкубировали с 1 μM-квинпиролом (Q102, Sigma) в буфере для анализа (25 мМ HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA и 0.01 мМ ВВП) для 10 мин. [35S] -GTPγS (NET-030H, PerkinElmer) добавляли к конечной концентрации 3 nM в 30 мкл и дополнительно инкубировали в течение 90 мин. 170 мкл ледяного буфера (10 мМ Трис-HCl (pH 8.0), 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, и 0.1 mM GTP), чтобы остановить реакцию. Мембраны фильтровали на фильтре GF / B (Millipore) и промывали 3 раз промывочным буфером (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 мМ NaCl). Фильтры сушили и измеряли радиоактивность с использованием сцинтилляционного счетчика [25], [26].

Анализ связывания с радиолигандом

Готовые клеточные мембраны инкубировали с 0.01 nM [3H] -пипероном (NET-565, PerkinElmer) и увеличением концентрации квинпирола (Q102, Sigma) для 30 min в буфере для анализа (25 мМ HEPES (pH 7.5), 1.5 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА). Мембраны фильтровали на фильтре GF / B (Millipore) и промывали 3 раз промывочным буфером (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 мМ NaCl). Реакцию прерывали быстрой фильтрацией через фильтры GF / C. Остаточную радиоактивность измеряли с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика [27]–[29].

Иммуноанализ фермента цАМФ

Трансфицированные клетки HEK 293 предварительно обрабатывали 10 μM rolipram (R6520, Sigma) для 1 h, а затем обрабатывали 0.1 μM форсколином (F6886, Sigma) и увеличивали концентрации quinpirole (Q102, Sigma) для 30 мин. Первичные культивируемые стриатальные нейроны обрабатывали 10 μM ролипрамом для 1 h, а затем 1 мкМ допамина для 1 h [22], Клеточные лизаты готовили с помощью HNUMX M HCl и уровни цАМФ были обнаружены с помощью набора для иммуноферментного анализа cAMP (Sapphire Bioscience) в соответствии с инструкцией производителя.

Первичный культивированный стриатальный нейрон

Полосатая область была выделена из эмбрионального мозга мыши (E15). Рассеянную ткань диссоциировали в минимальной основной среде (МЕМ) (11095, Invitrogen), содержащей 0.25% трипсина (T4549-100, Sigma) и 0.1% ДНКазу I для 6 мин при 37 ° C. Клетки повторно суспендировали в гальванической среде (MEM с 0.01 M HEPES (pH 7.4) и 10% (объем / объем) лошадиной сывороткой (16050-122, GIBCO)). Нейроны культивировались в течение 7 дней в пробирке (DIV 7) в MEM с добавкой B27 (17504-044, Invitrogen) перед применением к иммуноферментным анализам cAMP.

Итоги

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 в третьей внутриклеточной петле DRD2 в пробирке

Чтобы идентифицировать новые субстраты Cdk5, мы провели систематический поиск с использованием (S / T) PX (K / H / R) в качестве консенсусных последовательностей распознавания Cdk5 [30] и идентифицировали DRD2 в качестве субстрата-кандидата. Консенсусная последовательность, включая серин 321, расположена в третьей внутриклеточной петле DRD2 (D2i3), где задействованы различные механизмы регулирования [3], [10], [11], Последовательность эволюционно сохраняется в DRD2 у позвоночных, что подразумевает функциональное значение остатка (Рис. 1A).

миниатюрами

Рисунок 1. Cdk5 фосфорилирует серин 321 в третьей внутриклеточной петле DRD2 в пробирке.

(A) Выравнивание аминокислотной последовательности, показывающее сохраненные области DRD2 от различных видов (заштрихованные). Потенциальный сайт фосфорилирования Cdk5 обозначен звездочкой. (B) IP-связь в пробирке киназы с рекомбинантными мутантными белками GST-D2i3 и GST-D2i3. Для киназных реакций использовали комплекс Cdk5 / p35, обогащенный экстрактом мозга мыши иммунопреципитацией против p35. Показан авторадиограф фосфорилированных белков наряду с голубым окрашиванием Кумасси с тем же гелем. Arrowhead указывает на радиоактивный сигнал, соответствующий GST-D2i3s, а открытый стрелка указывает на радиоактивные сигналы от p35. (C) MS / MS-спектр фосфорилированного пептидного фрагмента D2i3. Теоретические схемы фрагментации показаны ниже спектра. Среди всех фрагментных ионов обнаруженные y- и b-ионы обозначены в спектре. Oни6 и y7 ионы сильно указывают на фосфорилирование серина 321. (D) В пробирке киназы с очищенным комплексом Cdk5 / GST-p25 с использованием мутантных белков GST-D2i3 и GST-D2i3. Фосфорилированные белки были показаны в авторадиографе наряду с синим окрашиванием Кумасси. Arrowhead указывает на радиоактивный сигнал, соответствующий GST-D2i3, а открытый стрелка указывает на радиоактивные сигналы из GST-p25.

DOI: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Чтобы оценить способность Cdk5 к фосфорилированию D2i3, мы выполнили IP-соединение в пробирке киназы с использованием активного комплекса Cdk5 / p35, обогащенного лизатом мозга мыши, путем иммунопреципитации p35 с использованием очищенных рекомбинантных белков GST-D2i3 (аминокислотных остатков 212-373) в качестве субстратов. Мы наблюдали сигналы фосфорилирования в очищенных белках GST-D2i3 и GST-D2i3 S297A, но сигнал значительно уменьшался с использованием GST-D2i3 S321A (1B). Чтобы дополнительно проверить фосфорилирование серина 321 в GST-D2i3, мы провели LC-MS / MS анализ образцов из IP-связанных в пробирке киназы с использованием масс-спектрометрии LTQ XL. Последовательно восстанавливали фосфопептиды, соответствующие массе пептидов фосфосерина 321 (Рис. 1C). Принимая во внимание, что зависящее от данных получение во время анализа LC-MS / MS имеет тенденцию обнаруживать обильные белки в образце [31], эти данные показывают, что остаток серина 321 является доминирующим сайтом фосфорилирования Cdk5 в области D2i3. Чтобы доказать прямое фосфорилирование серина 321 в GST-D2i3 с помощью Cdk5, в пробирке киназы с использованием очищенного комплекса Cdk5 / GST-p25 с очищенными рекомбинантными белками GST-D2i3. Мы идентифицировали значительный сигнал фосфорилирования в GST-D2i3, который отсутствовал в GST-D2i3 S321A (Рис. 1D). В совокупности эти результаты показывают, что остаток D2i3 S321 является предпочтительной мишенью для опосредованного Cdk5 фосфорилирования.

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 в третьей внутриклеточной петле DRD2 в клетках

Чтобы идентифицировать фосфорилирование серина 321, мы выращивали антитело, специфичное для фосфосерина 321 (pS321). Образцы из IP-связанных в пробирке киназы анализировали путем Вестерн-блоттинга с использованием антитела против pS321. Блоты показали отчетливую полосу в реакции киназы, которая зависела от GST-D2i3 (Рис. 2A). Чтобы проверить потенциальное фосфорилирование серина 321 в DRD2 с помощью Cdk5 в клетках, анти-GFP-иммунопреципитаты из клеток HEK 293, экспрессирующие DRD2-GFP и DRD2 S321A-GFP с или без HA-Cdk5 и p35, анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием анти-GFP и анти-pS321. Характерные сигналы полосчатых полос от анти-GFP-антител, которые, как известно, обусловлены чрезмерным гликозилированием DRD2, наблюдаются только в присутствии DRD2-GFP, а антитело против pS321 обнаруживает аналогичные сигналы DRD2 только с выражением Cdk5 / p35 co (2B) [7], Для дальнейшей проверки фосфорилирования серина 321 с помощью Cdk5 были созданы D2i3 (FLAG-D2i3) и мутантная форма D2i3 (FLAG-D2i3 S321A). FLAG-D2i3 и FLAG-D2i3 S321A, экспрессированные с помощью HA-Cdk5 или без них, в p35 в клетках HEK 293 анализировали с помощью анализа сдвига подвижности SDS-геля. Значительный сдвиг подвижности Cdk5 наблюдался для FLAG-D2i3, но не для FLAG-D2i3 S321A (Рис. 2C). Мы также оценили уровень фосфорилирования DRD2 в Ser321 при стимуляции агониста. Клетки HEK 293, экспрессирующие комплекс DRD2-GFP и Cdk5 / p35, стимулировали с помощью квинпирола, а иммунопреципитаты против GFP из клеточных лизатов анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием анти-GFP и антител против pS321. Мы обнаружили, что опосредованное Cdk5 фосфорилирование DRD2 на Ser321 не подвержено воздействию агонистической стимуляции, которая отличается от GRK- и PKC-опосредованных фосфорилирования (Рис. 2D) [32], [33], Вместе эти результаты показывают, что Cdk5 может фосфорилировать остаток серина 321 DRD2 в клеточной среде.

миниатюрами

Рисунок 2. Cdk5 фосфорилирует серин 321 в третьей внутриклеточной петле DRD2 в клетках.

Cdk5-опосредованное фосфорилирование серина 321 анализировали с использованием антитела против pS321. (A) Образцы от IP-связанных в пробирке киназы с использованием GST-D2i3-белков анализировали с помощью Вестерн-блоттинга (WB) с указанными антителами. Стрелки указывают GST-D2i3. (B) DRD2-GFP и DRD2 S321A-GFP были экспрессированы с HA-Cdk5 или без них с p35 в клетках HEK 293. Анти-GFP иммунопреципитаты анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием анти-GFP и антител против pS321. Скобка указывает сигналы DRD2, а открытый наконечник стрелки указывает неспецифические сигналы от анти-GFP-иммунопреципитатов. «% input» - это% объема общего лизата для реакции IP. Слабые эндогенные сигналы Cdk5 были обозначены звездочками. (C) Анализ сдвига подвижности геля. Клетки HEK 293, трансфицированные, как указано, анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. (D) Трансфицированные клетки HEK 293 обрабатывали хинпиролом, а иммунопреципитаты против GFP анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с анти-GFP и антителами против pS321. Открытая стрелка указывает неспецифические сигналы от анти-GFP иммунопреципитатов.

DOI: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Комплекс Cdk5 / p35 и DRD2 являются физически связанными

Мы исследовали потенциальное физическое взаимодействие между комплексом Cdk5 / p35 и DRD2, поскольку многие подложки Cdk5, как известно, физически связаны с комплексом Cdk5 / p35 [23], [34], [35], Сначала был выполнен эксперимент по вытеснению GST. Очищенный рекомбинантный белок GST-D2i3 инкубировали с лизатом крысиного мозга и выпадающими осадками GST для анализа Вестерн-блоттинга. Как показано в Рис. 3A, эндогенные Cdk5 и p35 были идентифицированы в выпадающих осадках, что указывает на физическое взаимодействие между DRD2 и комплексом Cdk5 / p35 (Рис. 3A). Более того, HA-Cdk5 и p35 были обнаружены в иммунопреципитатах анти-GFP из лизатов клеток HEK 293, экспрессирующих DRD2-GFP и Cdk5 / p35 (3B). Кроме того, мы провели иммуноцитохимический анализ и отметили, что DRD2-GFP, HA-Cdk5 и p35 показывают значимые сигналы ко-локализации в мембранной области клеток HEK 293 (Рис. 3C, верхние панели). Мы также исследовали совместную локализацию DRD2 и Cdk5 / p35 в нейронном контексте. Последовательно, DRD2-GFP также продемонстрировал значительную совместную локализацию с эндогенными Cdk5 и p35 в культивируемых полосатых нейронах (DIV7), дополнительно поддерживая функциональные связи между DRD2 и Cdk5 / p35 (Рис. 3C, нижние панели). Результаты показывают, что DRD2 и Cdk5 / p35 могут образовывать комплекс и, таким образом, поддерживать представление о том, что DRD2 является физиологическим субстратом Cdk5.

миниатюрами

Рисунок 3. Cdk5 / p35 может образовать комплекс с DRD2.

(A) GST с использованием очищенного рекомбинантного белка GST-D2i3 с экстрактом головного мозга крысы. Выпадающие осадки GST подвергали анализу Вестерн-блоттинга. «Бусина» обозначает выпадающий осадок без белков GST. (B) Иммунопреципитация комплекса DRD2 и Cdk5 / p35. Анти-GFP IP из лизатов из трансфицированных клеток подвергали анализу Вестерн-блоттинга. Скобка указывает сигналы DRD2, а открытый наконечник стрелки указывает неспецифические сигналы от анти-GFP-иммунопреципитатов. Сверхвозбужденное пятно для входов также показано справа. (C) Иммуноцитохимический анализ DRD2 и Cdk5 / p35. Клетки HEK 293, экспрессирующие DRD2-GFP и Cdk5 / p35, были окрашены анти-Cdk5 и анти-p35 антителами (верхние панели). DRD2-GFP экспрессировали отдельно в культивируемых полосатых нейронах и окрашивали антителами против Cdk5 и анти-p35 (нижние панели). Hoechst использовали для окрашивания ядер. Шкала масштабирования - 5 мкм. Все изображения были получены с использованием конфокальной микроскопии (Olympus, FluoView-1000).

DOI: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Cdk5-опосредованное фосфорилирование активности рецепторов DRD2

Сообщалось, что фосфорилирование модулирует критические свойства GPCR, такие как связывание G-белка, интернализация рецепторов, внутриклеточная локализация и связь с протеинами модулятора [9], [11], [24], индуцированная гонистом рецепторная интернализация является критическим регуляторным процессом трансдукции сигнала. Мы исследовали Cdk5-опосредованную модуляцию интернализации DRD2. Клетки HEK 293, экспрессирующие DRD2-GFP и DRD2 S321A-GFP с или без Cdk5 / p35, инкубировали с 1 μM-квинпиролом для индуцирования агонистической стимуляции DRD2 (Рис. 4A). [3H] -пипероновых сигналов экспрессирующих клеток DRD2-GFP значительно снижали при обработке 30 min quinpirole и восстанавливали при 90 мин. Что интересно, [3H] -пипероновых сигналов экспрессирующих клеток DRD2-GFP и Cdk5 / p35 также снижали при обработке 30 min quinpirole, но не восстанавливали при 90 мин (Рис. 4A, второй раздел). С другой стороны, [3H] -пипероновых сигналов экспрессирующих клеток DRD2 S321A-GFP уменьшали на 30 мин и восстанавливали при 90 мин независимо от коэкпозиции с Cdk5 / p35. Предыдущие исследования показали, что интернализованный DRD2 рециркулирует обратно в плазматическую мембрану при длительной стимуляции агониста [11]. ТПохоже, что Cdk5-опосредованное фосфорилирование DRD2 участвует в процессах регенерации после последующей интернализации DRD2, вызванной агонистом.

миниатюрами

Рисунок 4. Cdk5-опосредованное фосфорилирование ослабляет поверхностную экспрессию DRD2 и сигнализацию вниз по потоку.

(A) поверхностное выражение DRD2, измеренное с помощью [3H] -пиперонов. Трансфицированные клетки HEK293 стимулировали 1 мкМ квинпиролом в течение указанного времени и собирали, а затем 3 nM [3Лечение H] -спипероном в течение 3 часов. Измерялась радиоактивность и рассчитывались сигналы от поверхности. Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; односторонний дисперсионный анализ с апостериорным тестом Даннета: сравните все столбцы с контрольным столбцом). (B) [35S] -GTPγS. Клеточные мембраны получали из клеток, трансфицированных, как указано. Мембранные препараты инкубировали с 1 μM quinpirole с последующим 3 nM [35S] -GTPγS в течение 90 мин. Планки ошибок представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; односторонний дисперсионный анализ с апостериорным тестом Бонферрони: сравните все пары столбцов). (C) Конкурирующий с хинпиролом [3H] -пиперонов. Мембранные препараты из трансфицированных клеток инкубировали с 0.01 nM [3H] -спиперон и увеличение концентрации хинпирола в течение 30 мин. Нелинейная регрессия была получена с помощью GraphPad. Планки погрешностей указывают среднее значение ± стандартная ошибка (n = 3). (D) Иммуноферментный анализ цАМФ в трансфицированных клетках HEK 293. Трансфицированные клетки предварительно обрабатывали 10 мкМ ролипрамом в течение 1 ч, а затем совместно обрабатывали 0.1 мкМ форсколином и увеличивающимися концентрациями хинпирола в течение 30 мин. Нелинейная регрессия была получена с помощью GraphPad. Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка (n = 4; ** p <0.01; двусторонний t-тесты). (E) Культивируемые стриатальные нейроны из дикого типа и эмбрионов нокаута p35 (DIV 7) обрабатывали 10 μM rolipram для 1 h, а затем 1 мкМ допамина для 1 h. Полосы ошибок представляют среднее значение ± SE (n = 4; **p<0.01; двусторонний t-тесты).

DOI: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Мы также оценили потенциальное изменение связывания белков, стимулированных агонистами, с DRD2, связанным с фосфорилированием, опосредованным Cdk5, с использованием [35S] -GTPγS-связывающий анализ [25], [26], DRX2-GFP и DRD2 S321A-GFP с или без Cdk5 / p35 были экспрессированы в клетках HEK 293. Мембраны готовили и стимулировали 1 мкМ квинпиролом и дополнительно допускали [35S] -GTPγS. DRD2-GFP и Cdk5 / p35, экспрессирующие клеточную мембрану, показали значительное снижение [35S] -GTPγS по сравнению со всеми другими клеточными мембранами (4B). Эти результаты показывают, что фосфорилирование, опосредованное Cdk5, снижает регуляцию связывания белка, стимулированного агонистом, на DRD2.

Кроме того, конкурирующие с quinpirole [3H] -пиперонов связывали для исследования любого потенциального изменения агонистической аффинности в DRD2 с помощью Cdk5-опосредованного фосфорилирования. Конкурентное связывание [3H] -пиперона при лечении возрастающих концентраций квинпирола в мембранном препарате из трансфецированных. Конкурирующие связывание квинпирола и [3H] -пиперон в DRD2-GFP и DRD2 S321A-GFP сделал аналогичный logKi (-9.789 для DRD2-GFP; -9.691 для DRD2 S321A-GFP), что указывает на то, что сродство лиганда к DRD2 существенно не зависит от связанного с Cdk5 фосфорилирования на DRD2 (Рис. 4C).

Cdk5-опосредованное фосфорилирование Даун-регулирует сигнал сигнализации DRD2-cAMP

Затем мы исследовали, влияет ли модификация DRD2 на Cdk5 на пути передачи сигналов ниже по потоку. Мы контролировали DRD2-опосредованное ингибирование индуцированного форсколином производства цАМФ аденилилциклазой в клетках, экспрессирующих DRD2-GFP и DRD2 S321A-GFP с использованием иммуноферментного анализа цАМФ. DRD2-экспрессирующие клетки показали снижение уровня цАМФ в ответ на квинпирол дозозависимым образом. Примечательно, что совместная экспрессия Cdk5 / p35 значительно уменьшала максимальное ингибирование образования цАМФ (Рис. 4D, левая панель). С другой стороны, в экспрессирующих клетках DRD2 S321A-GFP образования цАМФ эффективно ингибировали в ответ на лечение хинпиролом независимо от экспрессии Cdk5 / p35 (Рис. 4D, правая панель). Эти результаты показывают, что Cdk5-опосредованное фосфорилирование DRD2 ослабляет ингибирующую активность DRD2 на сигнальном пути цАМФ ниже по потоку. Для дальнейшего подтверждения явлений в более физиологически значимой обстановке мы использовали первичные культивируемые нейроны из нокаутных эмбрионов, дефицитных в p35, существенном активаторе Cdk5. Первичные культивируемые стригальные нейроны обрабатывали дофамином 1 мкМ и анализировали с помощью иммуноферментного анализа цАМФ. Нейроны от нокаутных мышей p35 демонстрировали снижение уровней цАМФ по сравнению с нейронами дикого типа при стимуляции дофамином (Рис. 4E). Taken вместе, мы пришли к выводу, что Cdk5-опосредованное фосфорилирование DRD2 приводит к уменьшению ингибирующего тона на пути cAMP, оказываемом DRD2.

Обсуждение

Мы идентифицировали DRD2 как новый субстрат Cdk5. Фосфорилирование, по-видимому, снижает регуляцию поверхностной экспрессии DRD2, влияя на судьбу DRD2 после интернализации рецептора, тем самым уменьшая DRD2 Gi-связывание и последующий путь цАМФ. Поскольку остаток фосфорилирования S321 существует как в длинных, так и в коротких изоформах DRD2, механизм, предложенный в этом исследовании, может быть общим режимом регулирования в DRD2-опосредованной передаче сигналов.

DRD2 в средних колючих нейронах не только рассматривается как основной подтип рецептора допамина, но также признан за его восприимчивость к изменениям в доступности в ответ на экологические стимулы. Широко изучены индуцированная агонистами десенсибилизация и ресуспендирование DRD2 [11], [24]. В частности, ряд исследований показал, что эффекты воздействия хронического психостимулятора, такие как кокаин и амфетамин, которые повышают внеклеточный уровень дофамина в полосатом синапсе, сопровождаются динамическими изменениями DRD2 постсинаптически [36]. Действительно, хронические пользователи кокаина, как известно, уменьшили уровни DRD2 в полосатой области, а доступность DRD2 в ядре accumbens (NAcc) показывает отрицательную корреляцию с поведением для поиска наркотиков и подкрепления у мышей и приматов [37]–[39]. Эти данные показывают, что функциональность DRD2 очень восприимчива к адаптивной или компенсаторной регуляции в ответ на различные стимулы, включая хроническое лекарственное воздействие. Наши результаты показывают, что остаток S321 в третьей внутриклеточной петле DRD2 может быть фосфорилирован Cdk5, что приводит к снижению ингибирующего влияния DRD2 на путь cAMP. Это взаимодействие предлагает новый регуляторный механизм, связанный с Cdk5 в допаминоцептивных нейронах, который может быть связан с динамической природой поверхности DRD2.

Следует отметить, что известно, что Cdk5 является ключевым компонентом в опосредовании адаптивных изменений среды нейронов. Например, структурные и функциональные изменения дендритных шипов в нейронах лимбической цепи являются одним из последствий повторного воздействия психостимулятора [40]. Эти изменения сопровождаются различными молекулярными изменениями, в том числе индукцией связывающего белок cAMP-связывающего белка (CREB) и ΔFosB, факторов транскрипции, которые проявляют устойчивую регуляцию в ответ на хроническое введение кокаина [41], [42]. Важно отметить, что Cdk5 является целью ΔFosB [19], и многие критические компоненты, участвующие в динамике дендритного позвоночника, такие как PSD-95, p21-активированная киназа (PAK), β-катенин и спинофилин, были зарегистрированы как субстраты Cdk5 [43]–[46]. Последовательно, генетические или фармакологические манипуляции с активностью Cdk5 вызывают изменения морфологии дендритных позвонков и поведенческих реакций на кокаин, что подразумевает критические роли Cdk5 в молекулярных и морфологических изменениях цепей мезолимбического допамина [47], [48]. Наши результаты, показывающие, что DRD2 является новой мишенью Cdk5, дает дополнительное представление об адаптивных изменениях системы допамина в ответ на хронические экспозиции лекарств из-за последующей опосредованной ΔFosB повышающей регуляции Cdk5, может вызвать тоническое увеличение фосфорилирования DRD2 , Кроме того, известно, что DRD2 влияет на многочисленные клеточные процессы, включая регуляцию каналов cAMP и MAP-киназы и последующие транскрипционные события [42], [49]. Таким образом, результаты этого исследования могут не только отражать прямое регулирование DRD2 с помощью Cdk5, но и дать новое представление об адаптивных ответах системы допамина на хроническое лекарственное воздействие.

Авторские вклады

Задуманные и разработанные эксперименты: JJ YUP DH SKP. Провели эксперименты: JJ YUP DKK YK. Проанализированы данные: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Добавленные реагенты / материалы / инструменты анализа: YHS. Написал газету: JJ SKP.

Рекомендации

  1. 1. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG (1998) Допаминовые рецепторы: от структуры к функции. Physiol Rev 78: 189-225.
  2. 2. Мудрая RA (2002) Схема вознаграждения за мозг: идеи от ненасильственных стимулов. Neuron 36: 229-240. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00965-0
  3. Просмотр статей
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Просмотр статей
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Просмотр статей
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Просмотр статей
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Просмотр статей
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Просмотр статей
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Просмотр статей
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Просмотр статей
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Просмотр статей
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Просмотр статей
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Просмотр статей
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Просмотр статей
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Просмотр статей
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Просмотр статей
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Просмотр статей
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Просмотр статей
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Просмотр статей
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Просмотр статей
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Просмотр статей
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Просмотр статей
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Просмотр статей
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Просмотр статей
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Просмотр статей
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Просмотр статей
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Просмотр статей
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Просмотр статей
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Просмотр статей
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Просмотр статей
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Просмотр статей
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. Просмотр статей
  91. PubMed / NCBI
  92. Google Scholar
  93. Просмотр статей
  94. PubMed / NCBI
  95. Google Scholar
  96. Просмотр статей
  97. PubMed / NCBI
  98. Google Scholar
  99. Просмотр статей
  100. PubMed / NCBI
  101. Google Scholar
  102. Просмотр статей
  103. PubMed / NCBI
  104. Google Scholar
  105. Просмотр статей
  106. PubMed / NCBI
  107. Google Scholar
  108. Просмотр статей
  109. PubMed / NCBI
  110. Google Scholar
  111. Просмотр статей
  112. PubMed / NCBI
  113. Google Scholar
  114. Просмотр статей
  115. PubMed / NCBI
  116. Google Scholar
  117. Просмотр статей
  118. PubMed / NCBI
  119. Google Scholar
  120. Просмотр статей
  121. PubMed / NCBI
  122. Google Scholar
  123. Просмотр статей
  124. PubMed / NCBI
  125. Google Scholar
  126. Просмотр статей
  127. PubMed / NCBI
  128. Google Scholar
  129. Просмотр статей
  130. PubMed / NCBI
  131. Google Scholar
  132. Просмотр статей
  133. PubMed / NCBI
  134. Google Scholar
  135. Просмотр статей
  136. PubMed / NCBI
  137. Google Scholar
  138. Просмотр статей
  139. PubMed / NCBI
  140. Google Scholar
  141. Просмотр статей
  142. PubMed / NCBI
  143. Google Scholar
  144. 3. Neve KA, Seamans JK, Trantham-Davidson H (2004) Передача сигналов дофаминового рецептора. J Перехват сигнала передачи Res 24: 165-205. doi: 10.1081 / lrst-200029981
  145. 4. Amar S, Shaltiel G, Mann L, Shamir A, Dean B, et al. (2008) Возможное вовлечение сигнальных компонентов рецептора D2 после дофамина в патофизиологию шизофрении. Int J Neuropsychopharmacol 11: 197-205. doi: 10.1017 / s1461145707007948
  146. 5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, et al. (2002) Роль дофаминовых D2-подобных рецепторов при самообмене кокаина: исследования с мутантными мышами-рецепторами D2 и новыми антагонистами рецептора D2. J Neurosci 22: 2977-2988.
  147. 6. Lee S, Jeong J, Park YU, Kwak Y, Lee SA и др. (2012) Вальпроат изменяет сигнальную связь допамина в связи с индукцией экспрессии белка Par-4. PLoS One 7: e45618. doi: 10.1371 / journal.pone.0045618
  148. 7. Fishburn CS, Elazar Z, Fuchs S (1995) Дифференциальное гликозилирование и внутриклеточный трафик для длинной и короткой изоформ дофаминового рецептора D2. J Biol Chem 270: 29819-29824. doi: 10.1074 / jbc.270.50.29819
  149. 8. Reader TA, Molina-Holgado E, Lima L, Boulianne S, Dewar KM (1992) Специфическое [3H] раклопридное связывание с неостратальными дофаминами D2-рецепторы: роль дисульфидных и сульфгидрильных групп. Neurochem Res 17: 749-759. doi: 10.1007 / bf00969008
  150. 9. Ng GY, O'Dowd BF, Caron M, Dennis M, Brann MR, et al. (1994) Фосфорилирование и пальмитоилирование рецептора дофамина D2L человека в клетках Sf9. J Neurochem 63: 1589-1595. doi: 10.1046 / j.1471-4159.1994.63051589.x
  151. 10. Li M, Bermak JC, Wang ZW, Zhou QY (2000) Модуляция передачи сигналов дофамина D (2) рецептором актин-связывающего белка (ABP-280). Mol Pharmacol 57: 446-452.
  152. 11. Cho D, Zheng M, Min C, Ma L, Kurose H, et al. (2010) Агонист-индуцированный эндоцитоз и фосфорилирование рецепторов опосредуют реенсибилизацию рецепторов допамина D (2). Mol Endocrinol 24: 574-586. doi: 10.1210 / me.2009-0369
  153. 12. Tsai LH, Delalle I, Caviness VS Jr, Chae T, Harlow E (1994) p35 является нейронной специфической регуляторной субъединицей циклинзависимой киназы 5. Природа 371: 419-423. doi: 10.1038 / 371419a0
  154. 13. Dhavan R, Tsai LH (2001) Десятилетие CDK5. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 749-759. doi: 10.1038 / 35096019
  155. 14. Fu AK, Ip NY (2007) Циклон-зависимая киназа 5 связывает внеклеточные сигналы с актиновым цитоскелетом при развитии дендритного позвоночника. Cell Adh Migr 1: 110-112. doi: 10.4161 / cam.1.2.4617
  156. 15. Wang J, Liu S, Fu Y, Wang JH, Lu Y (2003) Активация Cdk5 индуцирует гибель клеток гиппокампа CA1 путем прямого фосфорилирования NMDA-рецепторов. Nat Neurosci 6: 1039-1047. doi: 10.1038 / nn1119
  157. 16. Zhang S, Edelmann L, Liu J, Crandall JE, Morabito MA (2008) Cdk5 регулирует фосфорилирование тирозина 1472 NR2B и поверхностную экспрессию NMDA-рецепторов. J Neurosci 28: 415-424. doi: 10.1523 / jneurosci.1900-07.2008
  158. 17. Moy LY, Tsai LH (2004) Циклин-зависимая киназа 5 фосфорилирует серин 31 тирозингидроксилазы и регулирует ее стабильность. J Biol Chem 279: 54487-54493. doi: 10.1074 / jbc.m406636200
  159. 18. Bibb JA, Snyder GL, Nishi A, Yan Z, Meijer L, et al. (1999) Фосфорилирование DARPP-32 с помощью Cdk5 модулирует сигнализацию допамина в нейронах. Природа 402: 669-671.
  160. 19. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, et al. (2001). Влияние хронического воздействия на кокаин регулируется белком нейронов Cdk5. Природа 410: 376-380.
  161. 20. Ohshima T, Ogawa M, Veeranna, Hirasawa M, Longenecker G, et al. (2001) Синергические вклады циклинзависимой киназы 5 / p35 и Reelin / Dab1 к позиционированию кортикальных нейронов в развивающемся мозге мыши. Proc Natl Acad Sci USA 98: 2764-2769. doi: 10.1073 / pnas.051628498
  162. 21. Morabito MA, Sheng M, Tsai LH (2004) Циклин-зависимая киназа 5 фосфорилирует N-концевой домен белка постсинаптической плотности PSD-95 в нейронах. J Neurosci 24: 865-876. doi: 10.1523 / jneurosci.4582-03.2004
  163. 22. Park SK, Nguyen MD, Fischer A, Luke MP, Affar el B, et al. (2005) Par-4 связывает дофаминовую сигнализацию и депрессию. Ячейка 122: 275-287. doi: 10.1016 / j.cell.2005.05.031
  164. 23. Niethammer M, Smith DS, Ayala R, Peng J, Ko J и др. (2000) NUDEL - это новый субстрат Cdk5, который ассоциируется с LIS1 и цитоплазматическим динеином. Neuron 28: 697-711. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 00147-1
  165. 24. Ким К.М., Валенцано К.Дж., Робинсон С.Р., Яо В.Д., Барак Л.С. и др. (2001) Дифференциальная регуляция дофаминовых рецепторов D2 и D3 G-рецепторными киназами и β-астранинами. J Biol Chem 276: 37409-37414. doi: 10.1074 / jbc.m106728200
  166. 25. Waldhoer M, Bofill-Cardona E, Milligan G, Freissmuth M, Nanoff C (1998) Дифференциальное расцепление дофаминовых рецепторов A1 и D2 сурамином и диэметилированным сурамином (NF037). Mol Pharmacol 53: 808-818.
  167. 26. Bofill-Cardona E, Kudlacek O, Yang Q, Ahorn H, Freissmuth M и др. (2000) Связывание кальмодулина с рецептором D2-допамина снижает передачу сигналов рецепторов путем остановки активатора активации белка G. J Biol Chem 275: 32672-32680. doi: 10.1074 / jbc.m002780200
  168. 27. Список SJ, Seeman P (1981) Разрешение рецепторов допамина и серотонина рецептора [3H], связывающего спиперон с областями мозга крыс. Proc Natl Acad Sci USA 78: 2620-2624. doi: 10.1073 / pnas.78.4.2620
  169. 28. Gardner B, Strange PG (1998) Агонистическое действие на D2 (длинные) дофаминовые рецепторы: связывание лиганда и функциональные анализы. Br J Pharmacol 124: 978-984. doi: 10.1038 / sj.bjp.0701926
  170. 29. Seeman P, Tallerico T, Ko F (2003) Допамин вытесняет [3H] домперидон из высокоаффинных сайтов рецептора дофамина D2, но не [3H] раклоприд или [3H] спиперон в изотонической среде: последствия для позитронно-эмиссионной томографии человека. Synapse 49: 209-215. doi: 10.1002 / syn.10232
  171. 30. Obenauer JC, Cantley LC, Yaffe MB (2003) Scansite 2.0: Протеомическое предсказание взаимодействия сигнальных клеток с использованием коротких последовательностей. Нуклеиновые кислоты Res 31: 3635-3641. doi: 10.1093 / nar / gkg584
  172. 31. Liu H, Sadygov RG, Yates JR 3rd (2004) Модель для случайной выборки и оценки относительного содержания белка в протеомике дрожжей. Anal Chem 76: 4193-4201. doi: 10.1021 / ac0498563
  173. 32. Ito K, Haga T, Lameh J, Sadee W (1999). Секвенирование рецепторов дофамина D2 зависит от коэкспрессии G-белковых рецепторных киназ 2 или 5. Eur J Biochem 260: 112-119. doi: 10.1046 / j.1432-1327.1999.00125.x
  174. 33. Namkung Y, Sibley DR (2004). Протеинкиназа C опосредует фосфорилирование, десенсибилизацию и торговлю дофаминовым рецептором D2. J Biol Chem 279: 49533-49541. doi: 10.1074 / jbc.m408319200
  175. 34. Wong AS, Lee RH, Cheung AY, Yeung PK, Chung SK, et al. (2011) Cdk5-опосредованное фосфорилирование эндофилина B1 требуется для индуцированной аутофагии в моделях болезни Паркинсона. Nat Cell Biol 13: 568-579. doi: 10.1038 / ncb2217
  176. 35. Kesavapany S, Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J, Ackerley S, et al. (2001) p35 / cdk5 связывает и фосфорилирует бета-катенин и регулирует взаимодействие бета-катенин / пресенилин-1. Eur J Neurosci 13: 241-247. doi: 10.1046 / j.1460-9568.2001.01376.x
  177. 36. Kuhar MJ, Ritz MC, Boja JW (1991) Дофаминовая гипотеза об укрепляющих свойствах кокаина. Тенденции Neurosci 14: 299-302. doi: 10.1016 / 0166-2236 (91) 90141-g
  178. 37. Volkow ND, Fowler JS, Wolf AP, Schlyer D, Shiue CY, et al. (1990) Влияние хронического злоупотребления кокаином на постсинаптические рецепторы дофамина. Am J Psychiatry 147: 719-724.
  179. 38. Dalley JW, Fryer TD, Brichard L, Robinson ES, Theobald DE и др. (2007) Nucleus accumbens D2 / 3-рецепторы прогнозируют импульсивность и усиление кокаина. Наука 315: 1267-1270. doi: 10.1126 / science.1137073
  180. 39. Nader MA, Morgan D, Gage HD, Nader SH, Calhoun TL и др. (2006) ПЭТ-изображений рецепторов дофамина D2 при хроническом самодействии кокаина у обезьян. Nat Neurosci 9: 1050-1056. doi: 10.1038 / nn1737
  181. 40. Robinson TE, Kolb B (1997) Стойкие структурные модификации в ядрах accumbens и префронтальных нейронах коры, полученных в результате предыдущего опыта с амфетамином. J Neurosci 17: 8491-8497.
  182. 41. Robinson TE, Kolb B (1999) Изменения в морфологии дендритов и дендритных шипов в ядре accumbens и префронтальной коре после повторного лечения амфетамином или кокаином. Eur J Neurosci 11: 1598-1604. doi: 10.1046 / j.1460-9568.1999.00576.x
  183. 42. McClung CA, Nestler EJ (2003) Регулирование экспрессии генов и вознаграждение кокаина CREB и DeltaFosB. Nat Neurosci 6: 1208-1215. doi: 10.1038 / nn1143
  184. 43. Feng J, Yan Z, Ferreira A, Tomizawa K, Liauw JA, et al. (2000) Спинофилин регулирует образование и функцию дендритных шипов. Proc Natl Acad Sci USA 97: 9287-9292. doi: 10.1073 / pnas.97.16.9287
  185. 44. Prange O, Murphy TH (2001) Модульный перенос постсинаптической плотности-95-кластеров и ассоциация со стабильными предшественниками позвоночника в раннем развитии кортикальных нейронов. J Neurosci 21: 9325-9333.
  186. 45. Murase S, Mosser E, Schuman EM (2002) Деполяризация приводит в действие бета-катенин в нейронные шипы, способствуя изменениям синаптической структуры и функции. Neuron 35: 91-105. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00764-x
  187. 46. Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK, et al. (2004) Измененная кортикальная синаптическая морфология и ослабленная консолидация памяти у трансферических мышей с преобладанием-отрицательных PAK с преобладанием переднего мозга. Neuron 42: 773-787. doi: 10.1016 / j.neuron.2004.05.003
  188. 47. Benavides DR, Quinn JJ, Zhong P, Hawasli AH, DiLeone RJ и др. (2007) Cdk5 модулирует стимуляцию кокаина, мотивацию и полосатую нейроновую возбудимость. J Neurosci 27: 12967-12976. doi: 10.1523 / jneurosci.4061-07.2007
  189. 48. Meyer DA, Richer E, Benkovic SA, Hayashi K, Kansy JW и др. (2008) Нарушение стриатальной реакции Cdk5 изменяет локомоторные ответы на кокаин, моторное обучение и дендритную морфологию. Proc Natl Acad Sci USA 105: 18561-18566. doi: 10.1073 / pnas.0806078105
  190. 49. Impey S, Obrietan K, Storm DR (1999) Создание новых связей: роль сигналов ERK / MAP киназы в пластичности нейронов. Neuron 23: 11-14. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 80747-3