Абстрактные
Вызванное психостимулятором изменение дендритных шипиков на дофаминоцептивных нейронах в ядре accumbens (NAcc) было предположено как адаптивный нейрональный ответ, который связан с длительным аддиктивным поведением. NAcc в основном состоит из двух отдельных субпопуляций колючих нейронов среднего размера, экспрессирующих высокие уровни дофаминовых рецепторов D1 или D2. В настоящем исследовании мы проанализировали плотность дендритных позвоночников после хронической обработки кокаином в отдельных колючих нейронах среднего размера, содержащих рецепторы D1 или D2, в NAcc. В этих исследованиях использовались трансгенные мыши, которые экспрессировали EGFP под контролем промотора рецептора D1 или D2 (Drd1-EGFP или Drd2-EGFP). После 28 дней лечения кокаином и 2 дней отмены плотность позвоночника увеличивалась как в Drd1-EGFP-, так и в Drd2-EGFP-позитивных нейронах. Однако увеличение плотности позвоночника поддерживалось только в Drd1-EGFP-позитивных нейронах 30 через несколько дней после отмены препарата. Примечательно, что повышенная экспрессия ΔFosB также наблюдалась в Drd1-EGFP- и Drd2-EGFP-позитивных нейронах после 2-дней отмены препарата, но только в Drd1-EGFP-позитивных нейронах после 30-дней отмены препарата. Эти результаты позволяют предположить, что повышенная плотность позвоночника, наблюдаемая после хронической обработки кокаином, стабильна только в нейронах, содержащих рецептор D1, и что экспрессия ΔFosB связана с образованием и / или поддержанием дендритных шипов в D1, а также в нейронах, содержащих рецептор D2. в NAcc.
Мезолимбический дофаминергический путь состоит из нейронов в вентральной области сегмента, которые иннервируют прилежащее ядро (NAcc), обонятельный бугорок, префронтальную кору и миндалины (1), тогда как нигростриатальные дофаминергические нейроны в черной субстанции (pars compacta) обеспечивают восходящую проекцию на дорсальный стриатум (2). Психостимуляторы повышают синаптическую концентрацию дофамина в NAcc: кокаин, блокируя поглощение дофамина из синаптической щели, и амфетамин, способствуя выбросу дофамина из нервных окончаний (3–5). Повторное прерывистое введение психостимуляторов приводит к усилению поведенческих реакций (сенсибилизации) на острые стимулирующие эффекты этих препаратов (6–8). Большинство доказательств указывают на то, что адаптивные изменения в вентральной области сегмента - дофаминергическая система NAcc являются центральными для изменений зависящей от опыта пластичности, которая лежит в основе лекарственно-индуцированного поведения.
В дополнение к дофамину глутамат необходим для развития поведенческой сенсибилизации в ответ на психостимуляторы (9, 10). Колючие нейроны среднего размера (MSNs) в вентральном стриатуме получают возбуждающие глутаматергические проекции из префронтальной коры, которые синапсируют к головкам дендритных шипов. MSN также являются основной мишенью для дофаминергических аксонов, которые синапсируют на шейках позвоночника (1, 11, 12). Следовательно, дендритные шипы в MSN представляют собой клеточный компартмент, в который изначально интегрированы допаминергическая и глутаматергическая передача.
Дофамин действует на два основных подсемейства рецепторов, подсемейство D1 (подтипы D1 и D5) и подсемейство D2 (подтипы D2, D3 и D4) (13). В дорсальном стриатуме анатомические исследования показали, что стриатонигральные MSN содержат высокие уровни рецепторов D1 (вместе с веществом P и динорфином), тогда как стриатопаллидные MSN преимущественно экспрессируют рецепторы D2 (вместе с энкефалином) (14–17). Проекции от NAcc являются более сложными, чем в дорсальном стриатуме, с оболочкой и центральными частями NAcc, выступающими в различные субрегионы вентрального паллидума и в вентральную область тегмента и черную субстанцию (18). Принимая во внимание, что рецепторы D2 и энкефалин в высокой степени выражены в проекциях на вентральный паллидум, рецепторы D1 и вещество P одинаково распределены в проекциях на вентральный паллидум и вентральную сегментарную область (19). Исследования агонистов и антагонистов, селективных в отношении рецепторов D1 или D2, показали, что как рецепторы D1, так и D2 необходимы для психостимулирующих зависимых изменений в поведении (20–25). Однако роли этих рецепторов, по-видимому, различны. Например, стимуляция рецепторов D1 ослабляет поиск кокаина, индуцированный инъекциями кокаина, и стимулы рецепторов D2 облегчают восстановление, вызванное кокаином (26–28).
Нарушения поведения, связанные с психостимулирующей зависимостью, чрезвычайно долговечны. Следовательно, существует значительный интерес к выявлению длительных вызванных лекарством изменений на молекулярном и структурном уровне в нейронных цепях, регулируемых дофамином и глутаматом (29–32). Примечательно, что длительное воздействие кокаина или амфетамина, как было обнаружено, увеличивает количество дендритных точек ветвления и колючек MSN в NAcc (33–35). Было показано, что эти структурные изменения сохраняются в течение ≈1 – 3.5 месяцев после последнего воздействия препарата (30, 35) и было предложено лежать в основе длительных изменений в синаптической пластичности, связанных с воздействием психостимуляторов.
Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы изучить вызванные кокаином структурные изменения дендритных шипов в субпопуляциях прилежащих MSN, которые экспрессируют рецепторы D1 или D2. В этих исследованиях мы использовали бактериальных трансгенных мышей с искусственной хромосомой (BAC), которые экспрессируют EGFP под контролем промотора дофаминового рецептора D1 (Drd1-EGFP) или D2 (Drd2-EGFP) (36). Результаты показывают, что, хотя первоначально повышенная плотность позвоночника наблюдается в MSN, содержащих рецептор D1, и в MSN, содержащих рецептор D2, измененная плотность позвоночника стабильна только в нейронах, содержащих рецептор D1. Кроме того, мы обнаруживаем аналогичные изменения в экспрессии фактора транскрипции FosB, что позволяет предположить, что FosB может участвовать в формировании и / или поддержании дендритных шипов в D1, а также в нейронах, содержащих рецептор D2 в NAcc.
Итоги
Анализ MSN у трансгенных мышей Drd1-EGFP и Drd2-EGFP BAC.
Характер проекции MSN из дорсального и вентрального полосатого тела у трансгенных мышей Drd1-EGFP или Drd2-EGFP BAC был охарактеризован с помощью анализа экспрессии GFP (36). Дифференциальная экспрессия GFP в MSN дорсального полосатого тела в целом соответствует экспрессии эндогенных рецепторов D1 или D2, соответственно (36). Мы также проанализировали дифференциальную экспрессию GFP в NAcc у мышей Drd1-EGFP или Drd2-EGFP (Рис 1a и b). Хотя ≈58% нейронов в NAcc экспрессировали GFP у мышей Drd1-EGFP (Рис 1a), ≈48% нейронов в экспрессии NAcc GFP у мышей Drd-2-EGFP (Рис 1b). MSN представляют 90 – 95% всех нейронов в NAcc (12, 37). Рецепторы D1 экспрессируются только в MSN, а рецепторы D2 экспрессируются в MSN и в холинергических интернейронах, которые представляют 1 – 3% стриатальных нейронов (37). Принимая во внимание эти факторы, результаты показывают, что минимально ≈10 – 15% MSN в NAcc, вероятно, экспрессируют как рецепторы D1, так и рецепторы D2.
Анализ дендритных шипов у мышей Drd1-EGFP и Drd2-EGFP.
Экспрессия GFP у мышей Drd1-EGFP и Drd2-EGFP была полезна для окрашивания тел нейронных клеток. Однако сигнал GFP в дендритах и дендритных шипиках был слишком слабым, чтобы проводить анализ после иммуноокрашивания антителами против GFP. Опосредованная частицами баллистическая доставка флуоресцентных красителей недавно была использована для быстрой и эффективной маркировки популяций нейронов (38). С помощью этого метода можно пометить целые нейроны, и этот метод, по-видимому, сопоставим с окрашиванием по Гольджи-Коксу Для анализа морфологии дендритов нейронов в NAcc фиксированные аккумбальные срезы метили липофильным флуоресцентным красителем 1,1'-диодадецил-3,3,3 ', 3'-тетраметилиндокарбоцианиновый перхлорат (DiI) с использованием генной пушки. Пример окрашенного DiI MSN показан в Рис 1c, В используемых условиях мы обычно наблюдали меченые нейроны без каких-либо перекрывающихся дендритов от других меченых нейронов. При большем увеличении можно наблюдать детальную морфологию дендритов, включая дендритные шипы (Рис 1d).
Затем мы использовали комбинацию DiI-мечения и иммуногистохимии для GFP у трансгенных мышей Drd1-EGFP или Drd2-EGFP, что стало возможным благодаря использованию низкой концентрации детергента для проницаемости тканей (см. методы). Посредством тщательного сравнения окраски DiI и экспрессии GFP в клеточных телах MSN мы могли идентифицировать DiI- и GFP-позитивные или DiI-позитивные и GFP-негативные нейроны в Drd1-EGFP (Рис 2a) или Drd2-EGFP (Рис 2b) мышей. Для следующих исследований мы проанализировали морфологию дендритов только в DiI- и GFP-позитивных нейронах мышей Drd1-EGFP или Drd2-EGFP.
Хроническое лечение кокаином приводит к увеличению плотности позвоночника в прилежащих MSN, экспрессирующих либо Drd1-EGFP, либо Drd2-EGFP.
Мышам Drd1-EGFP или Drd2-EGFP неоднократно вводили кокаин (30 мг / кг) или физиологический раствор в течение четырех последовательных недель (см. методы). Через два дня (2WD) или 30 дни (30WD) после последней лекарственной обработки мозг обрабатывали для мечения DiI и иммуногистохимии, как описано выше. Предыдущее исследование сообщало, что хроническое лечение амфетамином увеличивало плотность позвоночника на дистальных, но не проксимальных дендритах MSNs при NAcc35). Поэтому мы ограничили наш анализ дистальными дендритами (т. Е. С ветвями второго или третьего порядка), включая концевые области. При анализе в 2WD было обнаружено, что плотность позвоночника увеличивается в Drd1-EGFP-позитивных MSN (128% в физиологическом растворе) (Рис 3a и c) и в меньшей степени в Drd2-EGFP-позитивных нейронах (115% от физиологического раствора группы) (Рис 3 b и d). После 30WD повышенная плотность позвоночника поддерживалась в Drd1-EGFP-позитивных нейронах (118% от физиологического контроля) (Рис 3 a и c) но не в Drd2-EGFP-позитивных нейронах (Рис 3 b и d).
Морфология дендритных колючек варьируется в зависимости от их длины и ширины головки позвоночника. Поэтому мы классифицировали дендритные выпячивания на четыре класса позвоночника (толстый, грибной, тонкий и филоподий) в 2WD из кокаина (данные не показаны). Плотность грибного типа (119.7 ± 4.0%, P <0.01) и тонкие колючки (120.0 ± 3.4%, P <0.01) была увеличена при лечении кокаином в Drd1-EGFP-положительных MSN, тогда как плотность коротких (182.4 ± 21.6%, P <0.05) и грибовидных колючек (122.5 ± 5.0%, P <0.01) был увеличен в Drd2-EGFP-положительных MSN. Не было значительного увеличения количества коротких шипов в Drd1-EGFP-позитивных нейронах или тонких шипов в Drd2-EGFP-позитивных нейронах.
Хронический кокаин индуцирует экспрессию ΔFosB в Drd1-EGFP- или Drd2-EGFP-положительных MSN в NAcc.
ΔFosB является членом семейства транскрипционных факторов Fos. В то время как острое введение кокаина вызывает быструю и кратковременную индукцию нескольких изоформ Fos в NAcc, повторное воздействие кокаина увеличивает уровень ΔFosB. Кроме того, увеличение экспрессии ΔFosB сохраняется в NAcc в течение недель или месяцев после прекращения воздействия лекарственного средства и, как предполагается, участвует в длительной регуляции экспрессии гена, даже после прекращения приема лекарственного средства (29, 39, 40).
Чтобы исследовать индукцию ΔFosB в NAcc у мышей Drd1-EGFP или Drd2-EGFP после обработки кокаином, мы проанализировали экспрессию FosB и GFP с помощью двойной маркировки (Рис 4 и Таблица 1) Антитело против FosB распознает все формы FosB, но мы предполагаем, что повышенное иммунологическое состояние представляет собой ΔFosB (см. методы для дальнейшего обсуждения). У мышей, получавших физиологический раствор, 16% Drd1-EGFP-позитивных нейронов и 15% Drd2-EGFP-позитивных нейронов экспрессировали иммунореактивность FosB с относительно слабой интенсивностью (Рис 4 a и b и Таблица 1). Повторная обработка кокаином с последующим 2WD привела к значительному увеличению числа Drd1-EGFP-позитивных нейронов, которые совместно экспрессировали ΔFosB (55% от GFP-позитивных нейронов) (Рис 4c и Таблица 1). Меньшее, но все же значительное увеличение экспрессии ΔFosB было обнаружено в Drd2-EGFP-позитивных нейронах (25% GFP-позитивных нейронов) (Рис 4d и Таблица 1). Как и в случае изменений в плотности позвоночника, повышенная экспрессия ΔFosB поддерживалась в Drd1-EGFP-позитивных нейронах (46% GFP-позитивных нейронов), но не в Drd2-EGFP-позитивных нейронах (15% GFP-позитивных нейронов) после 30WD (Рис 4 e и f и Таблица 1). Обратите внимание, что увеличение экспрессии ΔFosB наблюдается в Рис 4f присутствует в Drd2-EGFP-негативных нейронах.
Обсуждение
Считается, что длительные адаптации при дофаминергической нейротрансмиссии лежат в основе зависимого поведения, связанного с психостимулирующими препаратами. В частности, было предположено, что вызванное психостимулятором увеличение плотности дендритных позвоночников MSNs в NAcc связано с реорганизацией синаптической связи (30). NAcc в основном состоит из двух отдельных субпопуляций MSN, экспрессирующих высокие уровни дофаминовых рецепторов D1 или D2. В настоящем исследовании мы проанализировали плотность позвоночника в различных MSN, содержащих рецепторы D1 или D2 в NAcc после хронической обработки кокаином. Полученные результаты показывают, что, хотя первоначально увеличение плотности позвоночника происходит в MSN, содержащих рецептор D1, и в MSN, содержащих рецептор D2, измененная плотность позвоночника стабильна только в нейронах, содержащих рецептор D1. Кроме того, мы находим сходную картину изменений в экспрессии фактора транскрипции FosB в MSN, содержащих рецепторы D1 и D2.
В этих исследованиях использовались трансгенные по BAC мыши, которые экспрессируют GFP в специфических субпопуляциях MSN под контролем промотора рецептора D1 или D2. Кроме того, мы разработали метод двойной маркировки, который сочетал иммуногистохимию для GFP с баллистической маркировкой нейронов с использованием DiI. В предыдущих исследованиях использовался метод Гольджи-Кокса для анализа влияния психостимуляторов на плотность позвоночника (34), и метод DiI, использованный здесь, дал результаты, которые были количественно сопоставимы. Мы разработали метод двойной маркировки, поскольку окрашивание по Гольджи несовместимо с иммуногистохимией. Иммуноокрашивание обычно требует проницаемости ткани с моющими средствами, процесс, который обычно приводит к солюбилизации липофильных красителей из мембраны (38). Однако в наших текущих исследованиях иммуноокрашивание GFP не требовало высокой концентрации детергента для проницаемости тканей и, следовательно, могло использоваться в сочетании с маркировкой липофильным красителем. Наш метод двойной маркировки должен быть в целом полезен для изучения структурных изменений в дендритных шипах, например, когда он используется для анализа линий трансгенных мышей ВАС, где GFP экспрессируется в специфических популяциях нейронов в коре головного мозга (36).
Хотя все еще несколько спорным, считается, что D1 и D2 рецепторы в основном анатомически разделены на прямой (striatonigral) и косвенный (striatopallidal) нейроны полосатого проекции соответственно (17, 41). Первоначальная характеристика локализации GFP у мышей Drd1-EGFP и Drd2-EGFP соответствовала этому заключению (36). Более того, наш анализ числа GFP-позитивных нейронов в NAcc у мышей Drd1-EGFP и Drd2-EGFP согласуется с заключением, что ≈50% MSN экспрессируют только рецепторы D1, а ≈35-40% экспрессируют только рецепторы D2, и что ≈10 – 15% совместно экспрессируют рецепторы D1 и D2. Это значение коэкспрессии сходно с тем, что подразумевается в исследованиях дорсального полосатого тела, в которых комбинированный патч-анализ одиночных полосатых нейронов с методами ОТ-ПЦР используется для выделения и амплификации мРНК (≈17% коэкспрессии энкефалина и вещества Р) (42). Следует отметить, что наши текущие исследования не затрагивают вопрос экспрессии рецепторов D3, D4 и D5, а также не затрагивают проблему низких уровней экспрессии рецепторов D1 в MSN, экспрессирующих высокие уровни рецепторов D2 или наоборот.
Несколько предыдущих исследований изучали нейрональную локализацию индуцированной психостимулятором экспрессии Fos и роль рецепторов D1 и D2 (43–45). Эти исследования подтвердили вывод о том, что индукция Fos и ΔFosB опосредуется активацией рецепторов D1. Однако на клеточную локализацию экспрессии Fos влияет окружающая среда, в которой вводятся психостимулирующие препараты (46, 47). Например, амфетамин или кокаин, введенные в домашнюю клетку, индуцируют немедленные ранние гены (включая Fos) преимущественно в субстанциях P-позитивных клеток, которые коэкспрессируют рецепторы D1. Напротив, эти лекарства могут индуцировать экспрессию Fos как в MSN, содержащих D1, так и в рецепторах, содержащих D2, при введении в новой среде. Протокол, используемый в наших текущих исследованиях, не включал в себя сочетание инъекций наркотиков с воздействием новой среды. Тем не менее, мы не можем исключить некоторый вид контекстно-зависимого стресса, который ответственен за экспрессию ΔFosB в MSN, содержащих рецептор D2.
Примечательной особенностью настоящих результатов была параллельная картина увеличения плотности позвоночника и экспрессии ΔFosB. Повышенная плотность позвоночника и экспрессия ΔFosB первоначально имели место в MSN, экспрессирующих Drd1-EGFP и Drd2-EGFP. Однако эти изменения были стабильны только в нейронах, содержащих рецептор D1. Одним из возможных объяснений наблюдения того, что повышенная плотность позвоночника и экспрессия ΔFosB были временно обнаружены в нейронах, содержащих рецептор D2, является то, что это произошло в небольшой части MSN, которые коэкспрессируют рецепторы допамина D1 и D2. Таким образом, временная природа этих повышений может быть связана с антагонистическими эффектами активации рецептора D2 на D1-зависимых сигнальных путях (48). Интересно, что изменения плотности позвоночника и экспрессии ΔFosB были обратимыми, что может отражать способность рецептор-зависимых сигнальных путей D2 влиять на стабильность ΔFosB.
Наблюдение, что есть параллельные изменения в экспрессии ΔFosB и плотности позвоночника, согласуется с идеей, что ΔFosB участвует в начальном образовании и последующем поддержании дендритных шипов в нейронах, содержащих рецептор D1 в NAcc. Экспрессия ΔFosB контролируется D1 / DARPP-32 / PP1-зависимым сигнальным путем в MSN (49). Несколько исследований показали, что ΔFosB играет важную роль в полезных и локомоторно-активирующих действиях психостимуляторов (39), вероятно, влияя на экспрессию множества генов, которые включают нейромедиаторные рецепторы, сигнальные белки и белки, участвующие в регуляции морфологии нейронов (50). Однако конкретные молекулярные механизмы, вовлеченные в хроническое образование позвоночника, вызванное кокаином, в настоящее время не известны. Наши предыдущие исследования показали, что интрааккумбальная инфузия ингибитора Cdk5 росковитина ослабляла вызванное кокаином увеличение плотности позвоночника (51). Кроме того, Cdk5 является нижестоящим целевым геном для ΔFosB и участвует в компенсаторных адаптивных изменениях, связанных с хроническим лечением кокаином (52). Следовательно, изменение Cdk5-зависимого фосфорилирования является вероятным механизмом, лежащим в основе вызванного кокаином формирования позвоночника и / или стабильности позвоночника. ПАК (53), β-катенин (54), PSD-95 (55) и спинофилин (56) являются субстратами для Cdk5 и все участвуют в регуляции морфогенеза позвоночника (57–60). Можно надеяться, что дальнейшая характеристика этих и других субстратов Cdk5 в позвоночниках позволит пролить свет на механизмы, регулирующие формирование позвоночника психостимуляторами.
методы
Животные.
Мыши, несущие трансген EGFP под контролем рецепторов допамина D1 или D2, были получены в результате трансгенного проекта BAC Gensat (36). Трансгенные мыши, использованные в этом исследовании, были неделями 4 – 5 и были на фоне швейцарского Вебстера. Мышей содержали в цикле свет / темнота 12: 12-h и содержали в группах 2-5 с доступной пищей и водой ad libitum. Все протоколы на животных соответствовали Руководству по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здравоохранения и были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Рокфеллера.
Лекарственное лечение.
Сообщалось, что хроническая обработка кокаином (30 мг / кг, ежедневно) приводила к значительному увеличению плотности MSN в позвоночнике как в ядре, так и в оболочке NAcc от крысы, но более низкая доза (15 мг / кг) увеличивала плотность позвоночника только в оболочка (61). Поэтому мы использовали более высокую дозу кокаина, чтобы вызвать структурную модификацию в обеих частях NAcc. Мыши получали одну инъекцию (внутрибрюшинно) 30 мг / кг кокаин-HCl (или физиологический раствор) каждый день в течение 5 последовательных дней, после чего следовали дни без инъекций 2, и эту процедуру повторяли в течение 4 последовательных недель. Инъекции проводились в домашней клетке. 2WD или 30WD, мозг мыши обрабатывали для мечения DiI и / или иммуногистохимии.
Баллистическая маркировка флуоресцентным красителем DiI.
Мышей анестезировали пентобарбиталом натрия 80 мг / кг и перфузировали транскардиально 5 мл PBS с последующей быстрой перфузией 40 мл параформальдегида 4% в PBS (20 мл / мин). Мозги были быстро удалены из черепа и постфиксированы в 4% параформальдегиде в течение 10 мин. Срезы мозга (100 мкм) метили баллистической доставкой флуоресцентного красителя DiI (Molecular Probes), как описано в ссылке. 38, Был разработан комбинированный метод мечения DiI-иммуногистохимия с низкой концентрацией моющего средства. DiI-меченые срезы проникали через 0.01% Triton X-100 в PBS в течение 15 min, а затем инкубировали в 0.01% Triton X-100 и 10% нормальной козьей сыворотке в PBS в течение 1 h для минимизации неспецифического мечения. Затем срезы ткани инкубировали с нормальной козьей сывороткой 1% / 0.01% Triton X-100 и антителом против GFP (Abcam, Cambridge, MA) в течение 2 h при комнатной температуре, промывали и инкубировали в разведении 1: 1,000 FITC- конъюгированное вторичное антитело (Molecular Probes). Срезы помещали на предметные стекла микроскопа и накрывали их монтажной средой. Метод баллистической маркировки позволил провести детальный анализ структуры дендритного отдела позвоночника, а полученные результаты были качественно и количественно сопоставимы с предыдущими исследованиями с использованием метода пропитки Гольджи-Кокса в срезах мозга крыс (34). Однако, в отличие от предыдущих исследований, мы редко наблюдали двуглавые шипы в DiI-окрашенных нейронах. Это различие может быть вызвано чувствительностью методов окрашивания или изменчивостью мыши (это исследование) по сравнению с тканями крысы (34).
Immunohistochemistry.
Животных анестезировали и перфузировали, как описано выше. Мозги удаляли и хранили в течение ночи в 4% параформальдегиде при 4 ° C. Мозги переносили в 30% сахарозу в растворе PBS для криозащиты. Корональные срезы (12 мкм) разрезали на замораживающем микротоме (Leica) и затем обрабатывали для иммуногистохимии. Затем срезы головного мозга проникали в 0.3% Triton X-100 в PBS в течение 15 min и дважды промывали в PBS. Срезы предварительно инкубировали в 10% нормальной козьей сыворотке в PBS в течение 1 h при 37 ° C, подвергали воздействию первичных антител (разведенных в 1% нормальной козьей сыворотки в PBS) в течение ночи при 4 ° C, а затем промывали в PBS и инкубировали с вторичным антитела к 1 ч при 37 ° C. Использовали следующие антитела: кроличьи анти-пан-FosB (SC-48, 1: 500; Santa Cruz Biotechnology), мышиные анти-NeuN (Chemicon), кроличьи анти-GFP, FITC-конъюгированные анти-кроличьи IgG и родамин- конъюгированный анти-мышиный IgG (молекулярные зонды). Для тройного мечения (ΔFosB, NeuN и GFP) срезы головного мозга сначала иммуноокрашивали анти-пан-антителом FosB и анти-NeuN-антителом, а затем инкубировали со вторичными антителами (конъюгированным с родамином анти-кроличьи IgG и циан-конъюгированным анти-мышиным IgG ). Дважды окрашенные срезы головного мозга дополнительно обрабатывали для иммуноокрашивания GFP с использованием технологии мечения Zenon (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes). Антитело против пан-FosB было выращено до N-конца FosB и распознает FosB и FosB полной длины (62). Основываясь на предыдущих исследованиях, которые показали, что ΔFosB, но не FosB или другие связанные с Fos антигены, стабильно экспрессируются после лечения хроническим кокаином, мы предполагаем, что длительное увеличение иммунореактивности представляет собой стабильную экспрессию ΔFosB. Однако идентичность иммунореактивного сигнала FosB, наблюдаемого у мышей, получавших физиологический раствор, неизвестна. Статистический анализ в Таблица 1 использовал студенческий t тест.
Дендритный анализ позвоночника.
Отдельные MSN в NAcc были выбраны для анализа позвоночника на основе нескольких критериев. (i) Было минимальное или полное отсутствие совпадений с другими мечеными клетками, чтобы гарантировать, что процессы из разных клеток не будут перепутаны. (ii) По крайней мере три первичных дендрита должны были быть видны для клеток, которые будут использоваться для анализа. (III) Были исследованы дистальные дендриты (концевые дендриты или близкие к концевым дендритам). Были проанализированы дендриты обоих MSN в ядре и оболочке NAcc. Хотя мы наблюдали MSN с редкими шипами (тип II с шипами), мы анализировали только MSN с плотными шипами (тип I с шипами). Для расчета плотности шипов длина дендрита (длина> 20 мкм) отслеживалась с помощью конфокального микроскопа (Zeiss LSM 510) с масляной иммерсионной линзой (× 40). Все изображения дендритов были сделаны на разных z уровни (интервалы глубины 0.5 – 1 мкм) для изучения морфологии дендритных шипов. Все измерения были сделаны с помощью программного обеспечения для анализа метаморфных изображений (Universal Imaging, Даунингтаун, Пенсильвания). В статистическом анализе использовался критерий Колмогорова – Смирнова.
Выступы от дендритов были классифицированы на четыре типа в зависимости от их длины, как описано в ссылках. 63 и 64. Выступы класса 1, также называемые короткими выступами, имели длину <0.5 мкм, не имели большого шипа и, по-видимому, не имели шеи; класс 2, или грибовидные шипы, имели длину от 0.5 до 1.25 мкм и характеризовались короткой шеей и большой головкой с шипами; класс 3, или тонкие шипы, размером от 1.25 до 3.0 мкм, с удлиненными шейками шипов с небольшими головками; класс 4, или филоподиальные расширения, представляли собой длинные нитчатые выступы, не имевшие заметной головки шипа.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом службы здравоохранения США DA10044 (для PG и ACN), а также Фондом Саймонса, Фондом Питера Дж. Шарпа, Фондом Пикауэра и Фондом Ф. Кирби.
Сокращения
- NACC
- прилежащего ядра
- MSN
- колючий нейрон среднего размера
- BAC
- бактериальная искусственная хромосома
- Drd1
- рецептор допамина D1, управляемый промотором
- Drd2
- рецептор допамина D2, управляемый промотором
- DiI
- 1,1'-диотадецил-3,3,3 ', 3'-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат
- 2WD
- 2 дней после последнего лечения наркотиками
- 30WD
- 30 дней после последнего лечения наркотиками.
Рекомендации
;
