DeltaFosB косвенно регулирует активность промотора Cck (2010)

Brain Res. 2010 May 6; 1329: 10-20.

Опубликован онлайн 2010 March 11. DOI:  10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

Джон Ф. Энтрайт, III,¹ Меган Вальд,¹ Мэдисон Паддок,¹ Элизабет Хоффман,¹ Рейчел Арей,² Скотт Эдвардс,² Саде Спенсер,² Эрик Дж. Нестлер,³ и Коллин А. МакКлунг^{2 *}

Информация об авторе ► Информация об авторских правах и лицензии ►

Окончательная редакция этой статьи издателя доступна по адресу Brain Res

См. Другие статьи в PMC, которые цитата опубликованной статьи.

Перейти к:

Абстрактные

Некоторые из важных биохимических, структурных и поведенческих изменений, вызванных хроническим воздействием наркотических средств, по-видимому, опосредованы высокостабильным транскрипционным фактором ΔFosB. Предыдущая работа показала, что избыточная экспрессия ΔFosB у мышей в течение недель 2 приводит к увеличению экспрессии многочисленных генов в полосатом теле, большинство из которых позднее снижается после 8 недель экспрессии ΔFosB. Интересно, что большое количество этих генов было также усилено у мышей, сверхэкспрессирующих транскрипционный фактор CREB. Однако было непонятно из этого исследования, однако, краткосрочный ΔFosB регулирует эти гены через CREB. Здесь мы обнаруживаем, что 2 недель избыточной экспрессии ΔFosB увеличивает экспрессию CREB в полосатом теле, эффект, который рассеивается через 8 недели, Ранняя индукция связана с увеличением связывания CREB с некоторыми промоторами гена-мишени в этой области мозга. Удивительно, но один ген, который был подозреваемой целью CREB на основе предыдущих отчетов, холецистокинин (Cck), не контролировался CREB в полосатом теле. Для дальнейшего изучения ССК после сверхэкспрессии ΔFosB, мы подтвердили, что кратковременная избыточная экспрессия ΔFosB увеличивает как ССК промоторной активности и экспрессии генов. Он также увеличивает активность связывания на предполагаемом сайте связывания CREB (CRE) в ССК промоутер. Однако, хотя сайт CRE необходим для нормальной основной экспрессии ССК, для индукции ΔFosB не требуется ССК, В совокупности эти результаты показывают, что, хотя кратковременная индукция ΔFosB увеличивает экспрессию CREB и активность у определенных промоторов генов, это не единственный механизм, посредством которого гены регулируются в этих условиях.

Ключевые слова: ядро accumbens, транскрипция, наркомания

Перейти к:

ВВЕДЕНИЕ

Хроническое воздействие лекарств от злоупотребления вызывает биохимические и структурные изменения в нескольких областях мозга. Считается, что эти изменения включают изменения в профилях экспрессии генов в мезолимбической системе. Эта система состоит из дофаминергических нейронов, которые выступают из брюшной тегментальной области (VTA) в среднем мозге в средние колючие нейроны в ядре accumbens (NAc) (брюшной полосатый мозг), а также в ряде других областей мозга. Были предложены изменения в активности двух факторов транскрипции, связывающего белка элемента CAMP (CREB) и ΔFosB (белок семейства Fos), чтобы опосредовать многие биохимические, структурные и поведенческие изменения, наблюдаемые при хроническом воздействии на наркотики, рассмотрено Nestler, 2005).

CREB - это распространенный транскрипционный фактор, который является членом семейства CREB / ATF. Гомодимеры CREB связываются с вариациями последовательности CRE (консенсус: TGACGTCA), обнаруженной в промоторах многих генов. Фосфорилирование CREB (преимущественно в серине 133, хотя были идентифицированы и другие сайты) может стимулироваться несколькими сигнальными каскадами, включая те, которые находятся ниже по течению от дофаминовых рецепторов (Cole et al., 1995). После фосфорилирования в серине 133 CREB набирает коактиватор CREB-связывающий белок (CBP) или родственные белки, приводящие к увеличению экспрессии гена (рассмотренный Johannessen et al., 2004). Хроническое воздействие опиатных или психостимуляторных препаратов злоупотребления вызывает кратковременное повышение активности CREB в ядре accumbens (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman и др., 2002, 2003), адаптация, призванная уменьшить полезные свойства этих лекарств и способствовать негативному эмоциональному состоянию отмены наркотиков (Nestler, 2005).

Lполагают, что длительная адаптация к наркотикам злоупотребления частично опосредована ΔFosB, высокостабильным вариантом сращивания FosB (Nestler et al., 1999; McClung и др., 2004; Nestler, 2008). Члены семейства Fos димеризуются с членами семейства Jun, чтобы сформировать комплекс белка-активатора 1 (AP-1). Комплексы транскрипции AP-1 связываются с вариациями элемента ответа AP-1 (консенсус: TGACTCA) для регулирования транскрипции (см. Чиненов и Керппола, 2001). Хотя острое заражение наркотиками приводит к короткоживущей индукции (hrs) членов семейства Fos (а также к увеличению активности CREB), повторное воздействие лекарственного средства приводит к накоплению высокостабильного ΔFosB (Хоуп и др., 1994; Perrotti et al., 2008), выражение которого сохраняется в течение нескольких недель.

Би-трансгенные мыши, индуцируемо сверхэкспрессирующие либо ΔFosB, либо CREB в полосатом теле взрослого человека, демонстрируют многие биохимические и поведенческие фенотипы, наблюдаемые у животных, подвергшихся повторному воздействию психостимуляторов или других наркотических средств. анализ изменений экспрессии генов у этих трансгенных животных выявил многочисленные гены, усиленные кратковременной (2 недель) сверхэкспрессией ΔFosB, изменения, связанные с сопутствующим снижением вознаграждения за лекарство. Изменения экспрессии генов и поведенческого ответа с кратковременным ΔFosB были удивительно похожи на изменения, наблюдаемые у животных, сверхэкспрессирующих CREB для 2 или 8 недель (McClung и Nestler, 2003). В поразительном контрасте долгосрочная избыточная экспрессия (8 недель) ΔFosB уменьшала экспрессию многих из этих же генов и приводила к увеличению вознаграждения за лекарство (Kelz et al., 1999; McClung и Nestler, 2003).

Один ген, идентифицированный в этих исследованиях, холецистокинин (ССК), нейропептид, продуцируемый в нескольких областях мозга, включая стриатум (Hokfelt и др., 1980). CCK может модулировать дофаминергическую передачу (Vaccarino, 1992), участвует в вознаграждении и усилении лекарств (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld и др., 2002; Rotzinger и др., 2002), и индуцируется в полосатом теле с помощью хронического кокаина (Дин и Моккетти, 1992). Кроме того, ССК Было показано, что промотор реагирует как на CREB, так и на AP-1 комплексы (Хаун и Диксон, 1990; Deavall и др., 2000; Хансен, 2001). Поскольку многие гены (включая ССК), которые показали повышенную экспрессию после обоих CREB, и кратковременную экспрессию ΔFosB были известны или предполагались гены мишеней CREB (McClung и Nestler, 2003), мы хотели бы определить, приводит ли краткосрочная экспрессия ΔFosB к регуляции этих генов (с упором на ССК) через регуляцию CREB или посредством более сложных механизмов генной регуляции.

Перейти к:

РЕЗУЛЬТАТЫ

Избыточная экспрессия ΔFosB временно увеличивает уровни CREB

Мы использовали Вестерн-блоттинг для исследования того, увеличивает ли избыточная экспрессия ΔFosB уровень белка CREB в полосатом теле мышей. Для этого исследования мы использовали двутрангенные мыши (линия 11A), которые несут как трансген NSE-tTA, так и трансген TetOp-ΔFosB. В отсутствие доксициклина эти мыши демонстрируют устойчивое увеличение экспрессии ΔFosB в положительных нейронах диорфина в полосатом теле (Kelz et al., 1999). Этот метод сверхэкспрессии ΔFosB был широко документирован и позволяет обладать повышенной экспрессией, которая параллельна индукции ΔFosB, наблюдаемой у животных, подвергнутых воздействию хронического кокаина (Хоуп и др., 1994; Kelz et al., 1999). Мы обнаружили, что у мышей 11A, сверхэкспрессирующих ΔFosB, уровни белка CREB достоверно повышались после 2 недель экспрессии, и эти уровни возвращались к исходному уровню после 8 недель экспрессии (Рисунок 1A, n = 8). Чтобы определить, могут ли изменения уровней CREB при кратковременной сверхэкспрессии ΔFosB реплицироваться в другой системе, мы временно сверхэкспрессировали ΔFosB в клетках PC12 и обнаружили, что уровни CREB значительно увеличились (p <0.05) по сравнению с контролем (Рисунок 1B, n = 4). Эти результаты показывают, что кратковременная экспрессия ΔFosB увеличивает уровни белка CREB.

Рисунок 1

Уровни CREB увеличиваются с избыточным выражением ΔFosB. Вестерн-блот-анализ лизатов из (A) мышь striata от мышей 11A от dox для 2 или 8 недель или (B) Ячейки PC12, сверхэкспрессирующие ΔFosB. Данные в A показаны как процентное изменение вне dox по сравнению ...

Оба ΔFosB и CREB связываются с промоторами определенных генов-мишеней в полосатом теле после кратковременной избыточной экспрессии ΔFosB

Мы использовали анализы ChIP (хроматин иммунопреципитации) полосатой ткани, чтобы определить, произошло ли связывание ΔFosB или CREB у определенных промоторов гена-мишени, и если это связывание было увеличено после кратковременной сверхэкспрессии ΔFosB. Мы проанализировали привязку на BDNF и ССК промоторы, поскольку оба гена сильно повышаются после кратковременной избыточной экспрессии AFosB, чрезмерной экспрессии CREB или хронической обработки кокаина (McClung и Nestler, 2003). Мы также проанализировали привязку к CDK5 промотор, поскольку он является известной прямой мишенью ΔFosB (Chen et al., 2000; Bibb et al., 2001; Kumar et al., 2005). Наконец, мы измерили привязку на prodynorphin промотор, поскольку в предыдущих исследованиях было установлено, что он может быть связан как ΔFosB, так и CREB в разных условиях (Andersson et al., 2001; Zachariou et al., 2006).

Анализ ChIP проводили на стриатах у мышей 11A, сверхэкспрессирующих ΔFosB для недель 2 с использованием антител, которые распознают CREB или ΔFosB. В нормальных условиях мы обнаружили, что ΔFosB связывается с CDK5 и prodynorphin промоторов, тогда как на BDNF or ССК промоутеров (Таблица 1). Кроме того, избыточная экспрессия ΔFosB увеличивала связывание ΔFosB на CDK5 промоутер, но не на prodynorphin промоутер. Затем мы измерили связывание CREB у этих промоторов и обнаружили, что CREB связывается с CDK5, BDNF и prodynorphin промоутеров, но не ССК промотора, в нормальном полосатом теле, и что избыточная экспрессия ΔFosB для недель 2 увеличивает связывание CREB на BDNF и prodynorphin промоутеров, но не CDK5 промоутер. В совокупности эти результаты показывают, что ΔFosB и CREB могут связываться с определенными промоторами генов, такими как prodynorphin и CDK5, однако связывание CREB специфично для других промоторов, таких как BDNF, Кроме того, избыточная экспрессия ΔFosB приводит к увеличению связывания ΔFosB у определенных промоторов, как и следовало ожидать, но также к связыванию CREB с конкретными промоторами, что согласуется с опосредованной ΔFosB индукцией CREB, наблюдаемой в этот момент времени.

Таблица 1

Связывание предполагаемых регуляторных белков с различными промоторами у мышей, сверхэкспрессирующих ΔFosB в течение двух недель.

Предыдущие работы показали, что изменения экспрессии генов, вызванные долгосрочной экспрессией ΔFosB, связаны с модификациями хроматина, в частности, с ацетилированием гистона H3 у конкретных промоторов генов (Kumar et al., 2005). Чтобы определить, может ли это объяснить изменения экспрессии генов при более короткой избыточной экспрессии ΔFosB, мы измерили связывание ацетилированного гистона H3 (модификация гистона, связанного с транскрипционно активным хроматином), или метилированный гистон H3 (Lys9, модификация гистона, связанная с транскрипционным неактивный хроматин). Мы обнаружили, что избыточная экспрессия ΔFosB для 2 недель не приводила к изменениям связывания ацетилированного H3 у любого из исследованных промоторов генов (Таблица 1). Мы обнаружили значительное снижение связывания метилированного гистона H3 на prodynorphin промотор, но не связывание на ССК промотор и без изменения связывания на CDK5 и BDNF промоторы, предполагая, что это не общий механизм, при котором ΔFosB в краткосрочной перспективе регулирует экспрессию гена. Мы были удивлены и заинтересованы в том, что мы не обнаружили различий в наших анализах по ХИП, которые могли бы объяснить увеличение ССК мРНК у мышей 11A после 2 недель экспрессии ΔFosB и решил исследовать этот механизм дальше.

Краткосрочный ΔFosB увеличивается ССК выражение в нескольких системах

Характеристика микроматрицы би-трансгенных мышей 11A, сверхэкспрессирующих ΔFosB в полосатом теле, обнаружила, что ССК уровни экспрессии увеличиваются после 2 недель избыточной экспрессии, а затем постепенно уменьшаются с более длительными периодами экспрессии ΔFosB (Рисунок 2A, n = 3). Мы подтвердили этот эффект для ССК используя ПЦР в реальном времени на отдельной группе животных на 2 и 8 неделях и обнаружил, что результаты в двух временных точках будут похожи на анализ микрочипов (данные не показаны).

Рисунок 2

Кратковременное избыточное выражение ΔFosB увеличивается ССК гена. (A) ССК экспрессию мРНК в полосатом теле с последующей избыточной экспрессией ΔFosB у мышей 11A для 1, 2, 4 или 8 недель. Анализ микроматрицы проводили на полосатых образцах и ССК уровни ...

Чтобы дополнительно исследовать способность ΔFosB регулировать ССК мы использовали клетки PC12, временно трансфицированные ССК-лицерозную репортерную плазмиду и либо плазмиду экспрессии ΔFosB, либо равное количество pCDNA. Оба двух (n = 5-9) и три (n = 11-13) дня избыточной экспрессии ΔFosB привели к значительному увеличению ССК- люциферазы. Кроме того, три дня избыточной экспрессии ΔFosB привели к значительному увеличению ССК-луциферазы по сравнению с двумя днями избыточной экспрессии (Рисунок 2B). Сверхэкспрессия ΔFosB не индуцировала экспрессию промоторной конструкции люциферазы (данные не показаны). В условиях отсутствия лечения было отмечено снижение ССКактивность люциферазы. Эти результаты показывают, что кратковременная экспрессия ΔFosB увеличивает активность ССК промотора и оставляет без ответа механизм, с помощью которого подавляется избыточная экспрессия ΔFosB ССК выражение.

Избыточная экспрессия ΔFosB увеличивает связывание на предполагаемом сайте связывания CREB в ССК промоутер

Наши анализы показали, что ССК экспрессия возрастает после краткосрочной экспрессии ΔFosB, однако наши анализы ChIP показали, что ни CREB, ни ΔFosB не связываются с ССК промоутер. Чтобы определить, имеются ли какие-либо изменения в связывании белка в ССК промотора после сверхэкспрессии ΔFosB, мы использовали тесты сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) с зондом, содержащим предполагаемый CRE-подобный сайт, присутствующий в ССК промоутер. Используя ядерные экстракты из стриаток мышей 11A, сверхэкспрессирующих ΔFosB для недель 2, мы обнаружили увеличение связывания с предполагаемым сайтом CRE в ССК промотор (Рисунок 3 A, C, n = 4). Интересно, что мыши 11A, сверхэкспрессирующие ΔFosB для 8 недель, которые показывают снижение ССК экспрессии, также показал увеличение связывания на этом сайте (Рисунок 3B, C, n = 4). В качестве сравнения мы исследовали связывание с консенсусным сайтом CRE у мышей, сверхэкспрессирующих ΔFosB для недель 2, и обнаружили надежное связывание CRE в стритальных экстрактах, но увеличение связывания после индукции ΔFosB (Рисунок 3F, n = 4). Таким образом, несмотря на индуцированное ΔFosB увеличение общих уровней CREB, наблюдаемое в этот момент времени, эти результаты согласуются с нашими анализами ChIP, которые обнаруживают, что повышенное CREB-связывание у промоторов после сверхэкспрессии ΔFosB специфично только для определенных генов и не является глобальным явлением , Чтобы определить, связан ли CREB с ССК промотора в нашем анализе EMSA, мы провели супершифтные анализы с CREB-специфическим антителом. По согласованию с нашими аналитиками ChIP мы не обнаружили привязки CREB к ССК зонд, содержащий предполагаемый сайт CRE, в тестах EMSA, в то время как CREB значительно связывает и перевыполняет консенсусный сайт CRE (Рисунок 3D, E, n = 4). Активность связывания ДНК на ССК промотор также не влиял на антитело к ΔFosB (данные не показаны) в условиях, показанных в нескольких предыдущих исследованиях, для блокирования связывания ΔFosB с доброкачественными сайтами AP-1 (Hope et al., 1994a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi и др., 1998). Мы также проводили тесты ChIP на стриатах животных 11A после 8 недель экспрессии ΔFosB и до сих пор не обнаружили связывания CREB или ΔFosB на ССК промотор (данные не показаны). Таким образом, экспрессия ΔFosB приводит к увеличению связывания белка в ССК промотор после обеих недель экспрессии 2 и 8; однако идентичность этих факторов остается неизвестной.

Рисунок 3

Связывание белков на ССК промоутер. (A, B) Анализ сдвига электрофоретической подвижности с использованием ССК CRE-подобный сайт с полосатой тканью от животных, сверхэкспрессирующих ΔFosB для недель 2 (A) или 8 недель (B). В (A) конкуренция с избытком немеченого конкурента ...

Предполагаемый сайт CRE в ССК промотор не несет ответственности за повышенную активность промотора

Поскольку мы обнаружили увеличение связывания белка с использованием фрагмента ССК промотор, который содержит предполагаемый сайт CRE, после сверхэкспрессии ΔFosB, мы хотели определить, необходим ли этот сайт для увеличения ССК выражение после сверхэкспрессии ΔFosB. Чтобы проверить эту возможность, мы трансфицировали клетки PC12 ССК-луциферазной плазмиды, содержащей ее неповрежденный CRE-подобный сайт или один, содержащий мутацию в сайте, которая отменяет любое взаимодействие с CREB. Интересно, что мутация CRE-подобного сайта уменьшилась ССК активность промотора 32% (Рисунок 4A, n = 9), но не повлияли на ССК индукция промотора сверхэкспрессией ΔFosB (Рисунок 4B, n = 11-13). Это говорит о том, что, хотя ССК промотор требует интактного CRE-подобного сайта для полной базальной активности, повышенная активность промотора, вызванная избыточной экспрессией ΔFosB, не требует CRE-подобной последовательности.

Рисунок 4

Ассоциация ССКподобный сайт CRE не нужен для ССК индукция по ΔFosB. (A) ССКактивность люциферазы измеряли через 2 дней после трансфекции либо с нормальной ССК-люцифераза или та, в которой произошла мутация CRE-подобного сайта. * р <0.05 (B) ССК-luciferase ...

cFos привязывается к ССК промоутер

Предыдущие исследования показали, что финансовые директора мРНК увеличивается с кратковременной экспрессией ΔFosB, однако после продолжительной экспрессии ΔFosB способность кокаина обрабатывать индуцировать cFos в полосатом суставе снижается (McClung и Nestler, 2003; Рентхал и др., 2008). Поэтому возможно, что cFos способствует увеличению ССК выражение после кратковременной экспрессии ΔFosB. Мы проводили анализы ChIP с антителом, специфичным для cFos, и измеряли связывание cFos на ССК промотор с кратковременной экспрессией ΔFosB и без нее. Хотя мы обнаружили, что cFos связывается с ССК промотор, это связывание существенно не увеличивалось после сверхэкспрессии ΔFosB (Рисунок 5, n = 5). Это говорит о том, что поскольку cFos связывает ССК промоутер, он может способствовать общему регулированию ССК но он, вероятно, не участвует в регулировании ССК промотор ΔFosB.

Рисунок 5

cFos привязывается к ССК промоутер. Анализы иммунопреципитации хроматина проводились с помощью специфического антитела для cFos, использующего полосатую ткань у сверхэкспрессирующих мышей с ΔFosB либо на доксе, либо после 2 недель удаления dox. Анализ ПЦР в реальном времени был ...

Перейти к:

ОБСУЖДЕНИЕ

Это исследование подтверждает и расширяет предыдущие результаты, показывающие, что ΔFosB регулирует экспрессию гена в полосатом теле, и мы обнаруживаем, что он делает это через множественные механизмы после кратковременного выражения. Мы показываем, что после 2 недель избыточной экспрессии ΔFosB связывается непосредственно с промоторами в определенных генах, что приводит к изменениям экспрессии (т.е. CDK5). Кроме того, он увеличивает уровни белка CREB, эффект, наблюдаемый в культивируемых клетках, а также в полосатом теле, что приводит к увеличению связывания CREB у других промоторов гена (т. Е. динорфин и BDNF). В предыдущем исследовании мы обнаружили, что кратковременная избыточная экспрессия ΔFosB в полосатом теле приводит к многим из тех же изменений экспрессии генов, которые обнаруживаются при сверхэкспрессии CREB и приводят к подобным поведенческим реакциям в показателях предпочтения кокаина (McClung и Nestler, 2003). Таким образом, настоящий вывод о том, что ΔFosB приводит к индукции CREB, а также связывание CREB с некоторыми промоторами генов, помогает объяснить, почему так много изменений генной экспрессии были разделены этими двумя факторами транскрипции.

Индукция CREB по ΔFosB интересна тем, что было показано, что препараты злоупотребления индуцируют изменения в уровнях CREB серинового 133-фосфорилированного CREB (Mattson et al., 2005) и увеличивают CRE-опосредованную транскрипцию (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman и др., 2002, 2003), без изменения общих уровней CREB. Возможно, изменения в уровнях CREB могут быть временными и, следовательно, легко пропущены в других исследованиях. В наших руках мы наблюдали увеличение кокаина в мРНК CREB в конкретных экспериментах, однако этот эффект сильно варьируется (неопубликованное наблюдение). Поскольку и трансгенные мыши 11A, и клетки PC-12 демонстрируют индукцию CREB после кратковременной сверхэкспрессии ΔFosB, это говорит о том, что CREB действительно индуцируется ΔFosB (или мишенью ΔFosB), обеспечивая еще один механизм для объяснения индуцированных лекарственными средствами изменений в гене выражение.

Удивительно, но мы обнаружили, что ни CREB, ни ΔFosB не связываются с ССК промоутера, хотя ССК экспрессия явно повышается после кратковременной экспрессии ΔFosB. Cck представляет собой обильный нейропептид, экспрессируемый как в VTA, так и в NAc (Hokfelt и др., 1980) и, вероятно, участвует в поведенческих реакциях на наркотики злоупотребления (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld и др., 2002; Rotzinger и др., 2002). В анализах клеточной культуры ССК промоутер был широко охарактеризован и, как было показано, реагирует на членов семьи CREB и AP-1 (см. Хансен, 2001). Хаун и Диксон (1990) показали, что комплексы AP-1 могут связываться с ССК CRE-подобный сайт в пробирке, и позже было показано, используя клетки нейробластомы SK-N-MC, что мутация CRE-подобного сайта уменьшала способность промотора к сверхэкспрессированному cFos / cJun (Rourke et al., 1999). Действительно, мы также ССК промоторной активности (Рисунок 2) и связывание в CRE-подобном элементе (или вокруг него)Рисунок 3) при сверхэкспрессии ΔFosB, другого члена семейства AP-1, но мы не обнаруживаем прямого связывания ΔFosB с ССК промоутер в естественных условиях or в пробирке, даже при его сверхэкспрессии.

Большая работа продемонстрировала роль CREB в регулировании ССК промоторной активности. ССК CRE-подобный сайт сохраняется у позвоночных (Хансен, 2001), и в некоторых анализах клеточной культуры оба комплекса CREB и AP-1 связываются с этим сайтом и необходимы для ССК промоторной активности (Хаун и Диксон, 1990; Deavall и др., 2000; Хансен, 2001). Кроме того, несколько известных активаторов ССК Было показано, что выражение (включая bFGF, PACAP, пептоны и деполяризацию) действует через CREB (Hansen, et al., 1999; Deavall и др., 2000; Bernard, et al., 2001; Gevrey и др., 2002; Hansen, et al., 2004). наш ССКДанные репортерного гена-люциферазы поддерживают важную роль CRE-подобного сайта в регуляции ССК промоторной активности, поскольку мутация этого сайта уменьшает базальную ССК промоторной активности и ССК-луциферазы, индуцированной VP16-CREB, конститутивно активной формой CREB, теряется, когда этот сайт мутирован (неопубликованное наблюдение). Таким образом, мы с удивлением обнаружили, что CREB, похоже, не связывается с ССК промотор в стритальных экстрактах либо на исходном уровне, либо при кратковременном избыточном выражении ΔFosB, когда уровни CREB увеличиваются. Это утверждает, что уровни CREB сам по себе не являются единственным фактором при определении суммы привязки на этом сайте, и это подтверждается работой других (Cha-Molstad, et al., 2004). Поскольку промоторы других ранее идентифицированных генов-мишеней CREB, таких как BDNF и prodynorphin, связали CREB, мы уверены в нашем нахождении, что CREB не является обязательным для ССК промотор в стриатальных ядерных экстрактах. Кроме того, индукция ССКактивность люциферазы ΔFosB не зависела от интактного CRE-подобного сайта, что указывает на то, что ΔFosB не регулирует ССК выражения путем регулирования прямого связывания CREB с ССК промоутер.

Наша неспособность обнаружить CREB, взаимодействующую с ССК промоутер поддерживается Renthal et al. (2009), которые использовали подход Chip-chip для изучения глобальных изменений фосфорилированного связывания CREB (pCREB) и ΔFosB в полосатом теле после хронического воздействия кокаина. В этих экспериментах ДНК-белковые комплексы иммунопреципитировали антителами ΔFosB или pCREB, и осажденная ДНК после маркировки была гибридизована с промотором-микрочипом. В то время как многие ранее охарактеризованные целевые гены CREB были идентифицированы с помощью этого подхода (например, BDNF, продинорфин), ССК не было идентифицировано. Кроме того, было продемонстрировано, что связывание CREB с консенсусным сайтом CRE сильно варьирует между культивируемыми клеточными линиями (Cha-Molstad, et al., 2004). Все предыдущие исследования, в которых обнаружены взаимодействия CREB с ССК промотор осуществляли в культуре клеток (не мозг, из которого были получены наши образцы EMSA и ChIP), и использовали анализы смены геля для исследования взаимодействий белок-ДНК. Хотя EMSA может оценить потенциал фактора для связывания с ДНК-последовательностью, анализы ChIP обеспечивают новый взгляд на эти взаимодействия в естественных условиях, Кроме того, большая часть данных, демонстрирующих либо индукцию ССК промоторной активности или связывание CREB с ССК промотора были получены из клеток, которые были стимулированы такими факторами, как пептоны (Бернар и др., 2001), деполяризация (Hansen, et al., 2004) или различные активаторы внутриклеточных сигнальных каскадов, включая цАМФ и ERK (Hansen et al., 1999). В наших экспериментах единственным используемым «стимулом» была сверхэкспрессия ΔFosB, которая достаточна для индукции ССК выражение. В совокупности это говорит о том, что способность CREB связываться с (и потенциально регулировать) ССК промотор сильно зависит от типа клетки и активации конкретных сигнальных путей. Кроме того, ССК CRE-подобный промоторный элемент (по крайней мере в неиндуцированных клетках PC12 и в полосатом мозге) не является прямой мишенью как CREB, так и ΔFosB. Интересно, что регулирование FosB экспрессия CREB также специфична для типа клеток и типа стимуляции. Исследование Андерсона и др., обнаружили, что инъекция антисмысловых олигонуклеотидов CREB в стриатум мышей частично ингибировала индукцию FosB после введения кокаина (Andersson et al., 2001). Однако они также обнаружили, что способность L-Dopa индуцировать FosB экспрессия в стриатуме, поврежденном 6-OHDA, не зависела от присутствия CREB-антисмысловых олигонуклеотидов.

Поскольку CREB и ΔFosB, по-видимому, косвенно регулируют ССК промотор и изменения структуры хроматина были зарегистрированы в ответ на различные стимулы, которые индуцируют ΔFosB (Цанкова и др., 2004; Kumar et al., 2005; Рентхал и др., 2008), мы предположили, что ΔFosB может косвенно модулировать активность промотора, изменяя структуру хроматина. Однако у мышей, сверхэкспрессирующих ΔFosB для 2 недель, не было изменений в ацетилировании гистонов H3 на ССК промотор (Таблица 1). Это поддерживается чип-чипом данных Renthal et al. (2009), который не сообщил об изменении ацетилированного связывания H3 на ССК промотор у мышей, подвергшихся воздействию хронического кокаина. Поскольку ССК промотор активен в стриатуме, не ожидалось или не наблюдалось репрессивного метилированного гистона H3. Интересно отметить, что мы также не обнаружили изменений из-за избыточной экспрессии ΔFosB в ацетилированном связывании H3 на BDNF промотор (который показал увеличение связывания CREB) или на CDK5 и prodynorphin промоторы (которые показали увеличение связывания ΔFosB). Поскольку существует множество изменений гистонов, связанных с изменениями активности промотора (см. Рэндо и Чанг, 2009), возможны и другие модификации хроматина, которые ассоциируются с индукцией этих генов. Любая модификация одного хроматина, хотя и часто предсказывает уровень активности промотора, не может изменяться во время активации определенного гена. В будущей работе было бы интересно посмотреть на другие потенциальные изменения структуры хроматина вокруг ССК промотор после сверхэкспрессии ΔFosB. Интересно, что хронический кокаин (вероятно с помощью Показано, что индукция ΔFosB индуцирует экспрессию сирутина 1 и 2, деконцелазы III класса гистонов, которые, по-видимому, изменяют физиологию нейронов, сигнализацию ERK и поведенческие реакции на кокаин (Рентхал и др., 2009). Индукция гистондезацетилазы могла бы одновременно регулировать экспрессию большого числа генов с помощью глобальные изменения структуры хроматина.

Один из возможных кандидатов, участвующих в ССК регулирование после избыточной экспрессии ΔFosB было членом семейства AP-1 cFos. Выражение cFos регулируется CREB (Sheng et al., 1990; Impey et al., 2004), а сверхэкспрессия cFos (в соответствии с избыточной экспрессией ее связывающего партнера cJun) увеличивается ССК промоторной активности (Rourke et al., 1999). Таким образом, повышенные уровни CREB из-за кратковременной сверхэкспрессии ΔFosB могут увеличить уровни cFos и привести к увеличению связывания с ССК CRE-подобный сайт. ОБЫЧНЫЙ мРНК индуцируют у мышей после двух недель избыточной экспрессии ΔFosB (McClung и Nestler, 2003) и уменьшалось у мышей, подвергшихся воздействию хронического кокаина или долгосрочной избыточной экспрессии FFB (Рентхал и др., 2008). Здесь мы находим, что cFos связывается непосредственно с ССК промотор в полосатой ткани, однако избыточная экспрессия ΔFosB не приводит к значительному увеличению связывания. Это говорит о том, что, хотя cFos может участвовать в регулировании ССК как правило, изменение связывания только cFos маловероятно, механизм, с помощью которого ΔFosB регулирует ССК выражение. Возможно, однако, что ΔFosB может индуцировать либо посттрансляционные изменения в cFos (например, измененное фосфорилирование), либо индуцировать экспрессию связывающего партнера (такого как cJun) или белка-со-активатора. Однако, поскольку неповрежденный CRE-подобный сайт (ранее показанный как сайт связывания для комплексов AP-1, см. Хаун и Диксон, 1990) не требуется для увеличения ССК активности промотора, наблюдаемой при сверхэкспрессии ΔFosB (как оценивается в наших экспериментах с репортерным геном), можно предположить, что другие транс-действующие факторы также регулируются ΔFosB.

Ассоциация ССК фрагмент промотора, используемый в наших экспериментах гена репортерного люцифераза, содержит сохраненный сайт связывания Sp1 и E-box (рассмотрен Hansen, 2002). В частности, показано, что последовательности E-box связывают многочисленные факторы транскрипции (см. Форрест и Макнамара, 2004). Используя ячейки PC12, мы видели, что мутация E-box уменьшается ССК промотор, но не изменяет реакцию промотора на ΔFosB (данные не показаны). Интересно, что ССК-луцифераза, содержащая мутации как на сайте CRE, так и на E-box, не обнаруживает базальной активности и не реагирует на избыточную экспрессию ΔFosB (неопубликованное наблюдение). Другой потенциальный медиатор действия ΔFosB на ССК промотором являются АТФ, некоторые формы которых, как известно, индуцируются в полосатом теле при воздействии хронического психостимулятора (Green et al., 2008). Однако мы не обнаружили никаких доказательств индукции ΔFosB этих АТФ (данные не показаны), и, как ожидается, АТФ не будут связываться с мутированным CRE-подобным сайтом на ССК промоутер.

Одно из предостережений этого исследования заключается в том, что мы используем би-трансгенную систему для сверхэкспрессии ΔFosB, и поэтому нужно быть консервативным в проведении параллелей между этой парадигмой и введением хронического кокаина. Однако трансгенные мыши 11A действительно дают уникальную возможность посмотреть на специфические эффекты ΔFosB в полосатом теле, поскольку сверхэкспрессия ограничена этой областью мозга (Chen et al., 1998), тогда как введение кокаина вызывает изменения в широком спектре других областей мозга, которые затем могут косвенно влиять на полосатое тело. Кроме того, в нескольких исследованиях были зарегистрированы аналогичные поведенческие и молекулярные фенотипы у мышей 11A по сравнению с не трансгенными животными, которых лечили хроническим кокаином (Kelz et al., 1999; McClung и Nestler, 2003; Рентхал и др., 2009). Дополнительно, Bibb et al. (2001) сообщили о сходных уровнях полосатого Cdk5 мРНК и протеина в этом же штамме 11A по сравнению с обработанными кокаином, не трансгенными однопометниками, а также с аналогичными изменениями в целях CDK5, p35 и DARPP-32.

В заключение мы обнаруживаем, что кратковременная экспрессия ΔFosB приводит к индукции генов в полосатом теле через многочисленные механизмы. Они включают прямое связывание с промотором, индукцию белка CREB и активность, модификацию хроматина, в дополнение к пути, которые еще предстоит определить.

Перейти к:

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ

Животные

В этом исследовании использовали мужские би-трансгенные животные 11A (NSE-tTA x TetOP-ΔFosB) и характеризуются Kelz et al., 1999, Для сверхэкспрессии ΔFosB мышей удаляли из доксициклина между 3 и 6 неделями недели, тогда как контрольные мыши поддерживались на доксициклине. Все мыши были размещены в группах и поддерживались в цикле 12: 12 свет / темнота, загорается на 7 am и загорается на 7 PM, с ad lib доступ к продовольствию и воде. Все эксперименты с мышью соответствовали протоколам, утвержденным комитетом по уходу и использованию животных в Юго-западном медицинском центре Университета Техаса в Далласе.

Репортер и экспрессионные плазмиды

Дикий тип (WT) ССК промотор-люциферазы получали путем вставки фрагмента ПЦР приблизительно 200 bp в вектор pGL3-luc (Promega). Этот фрагмент был получен из геномной ДНК мыши (праймеры: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' вверх и 5 'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' вниз по течению) и первоначально вставлен в вектор pGEM-T Easy (Promega, #A1360). Затем промоторный фрагмент клонировали в сайты рестрикционных ферментов Kpn1 / Xho1 pGL3-luc.

Чтобы создать мутацию CRE point в ССК промотор, мутагенный праймер, направленный против ранее описанного CRE-подобного сайта (смысловой праймер: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', антисмысловой праймер: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGCAGGACACG 3'), в инструкции по производству мутагена Quarter II (инструкция по изменению Staggen) использовалась в инструкции по производству мутагена Quarter II (инструкция по изменению Staggen). . Это преобразует указанный CRE-подобный сайт (ACTGCGTCAGC) в ACTGAGCTCC. Все репортерные плазмиды были подтверждены секвенированием ДНК. Плазмида экспрессии ΔFosB содержит полноразмерную последовательность ΔFosB, вставленную в сайт множественного клонирования pCDNA 3.1, и была описана ранее (Ульри и Нестлер, 2007).

Клеточная культура и трансфекции ДНК

Клетки феохромоцитомы крысы (PC12) поддерживали в среде Игла F-12, модифицированной Дульбекко, с добавлением 10% лошадиной сыворотки, 5% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина / стрептомицина при 37 ° C и 5% CO.₂. Клетки трансфицировали электропорацией с использованием электропоратора BTX 360 (350 В, 0 Ом и 850 мкФ) в 800 мкл фосфатно-солевого буфера Дульбекко в кюветах с зазором 4 мм с 10 мкг репортера и 5 мкг экспрессионной конструкции. Пустую векторную плазмиду (pCDNA) использовали для нормализации общего количества ДНК. После трансфекции клетки выращивали на чашках диаметром 35 мм, покрытых коллагеном, в течение указанного периода времени.

Анализы люциферазы

Через два или три дня после трансфекции клетки промывали 3 раза забуференным фосфатом физиологическим раствором Дульбекко, лизировали (с использованием 25 мМ глицилглицина, 15 мМ MgSO₄, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 мМ DTT), собирали и очищали центрифугированием. 30 мкл лизата объединяли с буфером для анализа люциферазы 140 мкл (25 мМ глицилглицина, 15 мМ MgSO₄, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 мМ фосфат калия, 1 mM кофермент A, pH 7.8). Активность люминесценции измеряли с использованием флуоресцентного считывателя флуоресценции FLx-800 после автоматической инъекции 40 мкл 1 мМ люциферина на лунку. Активность люциферазы была нормализована до общего содержания белка, как определено белковым анализом BioRad.

Анализ сдвига электрофоретической подвижности

Ядерные экстракты из двусторонних срезов стриатума из двухтранспирированных мышей 11A (которые поддерживаются на или без доксициклина для 2 или 8 недель) (McClung и Nestler, 2003) получали согласно Хуан и Уолтерс (1996). ³²Р-меченые двухцепочечные олигонуклеотидные зонды были получены с использованием протокола системы Promega Gel Shift Assay (#E3300), и зонды очищали с использованием скользящих столбцов Roche Quick Spin. Консенсусные последовательности CRE и AP-1 были получены от Promega (#E328A и E320B, соответственно), и ССК Последовательности CRE (Cck-CRE sense: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGGGCG; Cck-CRE antisense: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Реакции связывания и электрофорез проводились с использованием модификаций процедуры системы Promega Gel Shift Assay (#E3300). 50,000 CPM меченого зонда объединяли с 10 мкг стриатального ядерного экстракта. Перед введением зондов с радиоактивной меткой добавляли ДНК или антитела против холодного конкурента. Для суперсдвиговых экспериментов использовали 2 мкг CREB-антитела (Upstate Biotechnology # 06-083). Реакции подвергали электрофорезу на гелях 4% полиакриламида, высушивали и подвергали воздействию пленки (с использованием усиливающих экранов для 1 час до 2 дней).

иммуноблоттинг

Для клеток PC12 35 мм планшеты с трансфицированными клетками промывали ледяным фосфатно-солевым буфером Дульбекко, а лизаты получали ледяным буфером для лизиса RIPA (50 мМ Трис, pH 7.4, 5 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 1% дезоксихолата, 1 % Triton X-100, 0.1% додецилсульфат натрия), содержащий ингибиторы протеаз. После обработки ультразвуком, очистки и анализа белка Брэдфорда лизаты были полностью денатурированы, и 50 мкг каждого образца подвергали электрофорезу в 10% полиакриламидных гелях SDS. Белки переносили на PVDF-мембрану, блокировали в течение 1 часа в 3% обезжиренном сухом молоке в трис-буферном физиологическом растворе, содержащем 0.1% Твин-20 (молоко TBS-T), и зондировали в течение ночи при 4 ° C с помощью первичных антител (CREB- Upstate Biotechnology # 06-083, использованный в соотношении 1: 1,000; GAPDH-Sigma # G8795, используемый в соотношении 1: 80,000 1), разведенный в молоке TBS-T. После многократных промывок в TBS-T блоты исследовали в течение одного часа при комнатной температуре с использованием вторичных антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой (Sigma), разведенных 5,000: 170 в молоке TBS-T. После многократных промывок в трис-буферном физиологическом растворе цветную реакцию проводили в соответствии с инструкциями BioRad (# 6432-XNUMX). Мембраны сушили в течение ночи, сканировали на планшетном сканере и проводили денситометрию с помощью ImageJ (см. Ниже).

Для полосатых экстрактов вестерн-блот-анализы проводили, как было опубликовано ранее (Хоуп и др., 1994). Ткань удаляли из обезглавленных мышей, помещали на лед и разделяли на матрицу головного мозга с толщиной 1 мм. Затем удаляли тканевые пуансоны и замораживали при -80 ° C до использования. Ткане обрабатывали ультразвуком на льду в модифицированном буфере на основе моющего средства, содержащем как ингибиторы фосфатазы, так и протеазы (Roche, Sigma). После обработки ультразвуком образцы денатурировали в кипящей воде и центрифугировали при 15,000xg в течение 15 минут; супернатант затем собирали и обрабатывали; Затем количество количеств белка затем определяли количественно с использованием анализа Брэдфорда (Bio-Rad). Образцы проводили на 10% акриламидном / бисакриламидном геле, переносили на мембрану PVDF, блокировали в молоке 5% и инкубировали с первичными антителами (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Затем кляксы были визуализированы с использованием хемилюминесцентной системы (Pierce). Все образцы были нормированы на GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Были выполнены стандартные кривые, чтобы гарантировать, что мы находимся в линейном диапазоне анализа.

Денситометрический анализ

Для иммуноблотов PC12 анализ денситометрии проводили с использованием ImageJ с калибровкой rodbard. Из каждого измерения вычитали средний фоновый сигнал, и для каждого образца рассчитывали отношение сигнала CREB к GAPDH. Для полосатых иммуноблотов и анализа EMSA использовалось Scion Image 1.62c с вычитанием фона.

Иммунопреципитация хроматина (ChIP)

Анализ ChIP проводили в соответствии с методами Tsankova et al. (2004) и Kumar et al. (2005). Вкратце, двусторонние образцы полосатого тела от мышей 11А, которые содержали или не содержали доксициклин, сшивали 1% формальдегидом, и сшивание гасили глицином (конечная концентрация 0.125 М). Эти образцы были взяты из целых срезов головного мозга, взятых на уровне прилежащего ядра с удаленной корой. Хроматин был разрезан на фрагменты размером примерно от 0.2 до 1 т.п.н. с помощью обработки ультразвуком, очищен с помощью шариков с протеином G (Thermo Scientific # 22852) и введенные образцы заморожены при -80 ° C. Для каждого преципитации использовали от 60 до 100 мкг хроматина. Использовали 5-10 мкг каждого первичного антитела (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, ацетилированный H3: Upstate Biotechnology # 06-599, метилированный H3 (LYS9): Cell Signaling Technology, cFos: Santa Cruz Biotechnology № SC-7202x). Комплексы антитело-хроматин подвергали иммунопреципитации с помощью гранул Protein G plus в соответствии с инструкциями производителя (Thermo Scientific # 22852). После обратного сшивания исходных и осажденных образцов каждый образец подвергали количественной ПЦР (qPCR). Использование всех этих антител для ChIP было всесторонне подтверждено (Цанкова и др., 2004; Kumar et al., 2005; Рентхал и др., 2009).

Уровни связывания белка у каждого представляющего интерес промотора гена определяли путем измерения количества связанной ДНК с помощью qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA). Входную или общую ДНК (неиммунопреципитированную) и иммунопреципитированную ДНК амплифицировали в трех повторностях в присутствии SYBR Green (Applied Biosystems, CA). Значения Ct из каждого образца были получены с использованием программного обеспечения Sequence Detector 1.1. Относительное количественное определение матричной ДНК проводили с использованием метода ΔΔCt (Цанкова и др., 2004). Используемые праймеры: промотор BDNF 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5 промотор: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck промотор: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Продинорфиновый промотор: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

статистический анализ

Все данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего. Статистическую разницу определяли с помощью двустороннего t-критерия Стьюдента (p <0.05). При проведении множественных сравнений значения p корректировались с использованием поправки Бонферрони.

Перейти к:

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Will Renthal и Arvind Kumar за полезные обсуждения. Мы также хотели бы поблагодарить NIDA за финансирование этих экспериментов.

Перейти к:

Сноски

Отказ от ответственности издателя: Это файл PDF из неотредактированной рукописи, который был принят для публикации. В качестве сервиса для наших клиентов мы предоставляем эту раннюю версию рукописи. Рукопись будет подвергаться копированию, набору и обзору полученного доказательства до его публикации в его окончательной форме. Обратите внимание, что во время производственного процесса могут быть обнаружены ошибки, которые могут повлиять на содержимое, и все юридические заявления об отказе от ответственности, которые применяются к журналу.

Классификация терминов:

Раздел: #1 Сотовая и молекулярная биология нервных систем

Перейти к:

Рекомендации

1. Андерссон М., Конради C, Ценси М.А. Связывающий белок cAMP-связывающий белок необходим для экспрессии гена, зависимого от допамина, в интактном, но не в дофамин-денервированном полосатом теле. J Neurosci. 2001; 21: 9930-43. [PubMed]
2. Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. Активность CREB в оболочке ядра accumbens контролирует строение поведенческих реакций на эмоциональные раздражители. Proc Natl Acad Sci US A. 2002; 99: 11435-40. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
3. Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. Обработка кокаина увеличивает внеклеточный холецистокинин (CCK) в раковине accumbens бодрствующих, свободно движущихся крыс, эффект, который усиливается у крыс, которые поведенчески чувствительны к кокаину. J Neurochem. 2002; 81: 1021-7. [PubMed]
4. Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptones стимулируют транскрипцию гена холецистокинина кишечника с помощью циклических факторов, связывающих элемент аденозинмонофосфата. Эндокринологии. 2001; 142: 721-9. [PubMed]
5. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Последствия хронического воздействия кокаина регулируются белком нейронов Cdk5. Природа. 2001; 410: 376-80. [PubMed]
6. Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Клеточно-специфическое связывание фактора транскрипции CREB с элементом cAMP-response. Proc Natl Acad Sci US A. 2004; 101: 13572-7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
7. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ. Регулирование дельта FosB и FosB-подобных белков путем электросудорожного захвата и лечения кокаином. Mol Pharmacol. 1995; 48: 880-9. [PubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shookt PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Трансгенные животные с индуцируемой, целевой экспрессией генов в мозге. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
9. Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Индукция циклинзависимой киназы 5 в гиппокампе при хронических электросудорожных судорогах: роль ΔFosB. J Neurosci. 2000; 20: 8965-71. [PubMed]
10. Чиненов Ю., Керппола Т.К. Близкие столкновения многих видов: взаимодействия Fos-Jun, которые опосредуют регуляторную специфичность транскрипции. Онкогенов. 2001; 20: 2438-52. [PubMed]
11. Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Нейронная адаптация к амфетамину и дофамину: молекулярные механизмы регуляции гена продинорфина в стриатуме крысы. Neuron. 1995; 14: 813-23. [PubMed]
12. Deavall DG, Raychowdhury R, ​​Dockray GJ, Dimaline R. Контроль транскрипции гена CCK с помощью PACAP в клетках STC-1. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2000; 279: G605-12. [PubMed]
13. Ding XZ, Mocchetti I. Допаминергическая регуляция содержания мРНК холецистокинина в стриатуме крысы. Мозг Res Mol Brain Res. 1992; 12: 77-83. [PubMed]
14. Forrest S, McNamara C. Семейство факторов транскрипции и образования сосудистых поражений. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004; 24: 2014-20. [PubMed]
15. Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Сосуществование циклических AMP- и кальцийзависимых протеинкиназ для транскрипционной активации гена холецистокинина белковыми гидролизатами. J Biol Chem. 2002; 277: 22407-13. [PubMed]
16. Green TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Индукция активирующих транскрипционных факторов (АТФ) ATF2, ATF3 и ATF4 в ядре accumbens и их регуляция эмоционального поведения. J Neurosci. 2008; 28: 2025-32. [PubMed]
17. Гамильтон М.Е., Редондо Дж. Л., Фримен А.С. Переполнение допамина и холецистокинина в ядре крысы в ​​ответ на острое введение лекарственного средства. Synapse. 2000; 38: 238-42. [PubMed]
18. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Сигнальные пути активируемой митогеном протеинкиназы и протеинкиназы А стимулируют транскрипцию холецистокинина через активацию белка, связывающего элемент циклического аденозин-3 ', 5'-монофосфатного ответа. Мол Эндокринол. 1999; 13: 466–75. [PubMed]
19. Hansen TV, Nielsen FC. Регулирование транскрипции гена холецистокинина нейронов. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2001; 234: 61-7. [PubMed]
20. Хансен ТВ. Транскрипция гена холецистокинина: промоторные элементы, транскрипционные факторы и сигнальные пути. Пептиды. 2001; 22: 1201-11. [PubMed]
21. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. KCl и форсколин синергически повышают регуляцию экспрессии гена холецистокинина посредством координированной активации CREB и co-активатора CBP. J Neurochem. 2004; 89: 15-23. [PubMed]
22. Haun RS, Dixon JE. Усилитель транскрипции, необходимый для экспрессии гена холецистокинина крысы, содержит последовательность, идентичную элементу -296 гена человека c-fos. J Biol Chem. 1990; 265: 15455-63. [PubMed]
23. Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. Существенная роль гена fosB в молекулярных, клеточных и поведенческих действиях хронических электросудорожных судорог. J Neurosci 1998. 1998; 18: 6952-62. [PubMed]
24. Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Доказательства сосуществования допамина и CCK в мезо-лимбических нейронах. Природа. 1980; 285: 476-8. [PubMed]
25. Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Обработка хронического электросудорожного захвата (ECS) приводит к выражению долговременного комплекса AP-1 в головном мозге с измененным составом и характеристиками. J Neurosci. 1994; 14: 4318-28. [PubMed]
26. Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Индукция долговременного комплекса AP-1, состоящего из измененных Fos-подобных белков в головном мозге при хроническом кокаине и других хронических методах лечения. Neuron. 1994; 13: 1235-44. [PubMed]
27. Huang KX, Walters JR. Допаминергическая регуляция активности ДНК-транскрипции AP-1 в стриатуме крысы. Neuroscience. 1996; 75: 757-75. [PubMed]
28. Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. Определение регулятора CREB: анализ генома во всех регуляторных регионах транскрипционного фактора. Cell. 2004; 119: 1041-54. [PubMed]
29. Johannessen M, Делганди, Моенс У. Что включает CREB? Сотовый сигнал. 2004; 16: 1211-27. [PubMed]
30. Josselyn SA, Vaccarino FJ. Противоположные эффекты антагонистов CCK (A) и CCK (B) на развитие условной активности у крыс. Behav Pharmacol. 1996; 7: 505-512. [PubMed]
31. Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Доказательства участия рецептора CCK (A) в приобретении условной активности, вырабатываемой кокаином у крыс. Brain Res. 1997; 763: 93-102. [PubMed]
32. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Выражение фактора транскрипции deltaFosB в мозге контролирует чувствительность к кокаину. Природа. 1999; 401: 272-6. [PubMed]
33. Кумар А., Чой Х.Х., Рентхал В., Цанкова Н.М., Теобальд Д.Э., Труонг Х.Т., Руссо С.Я., Лаплант В., Сасаки Т.С., Уистлер К.Н., Неве Р.Л., Self DW, Nestler EJ. Ремоделирование хроматина является ключевым механизмом, лежащим в основе кокаин-индуцированной пластичности в полосатом теле. Neuron. 2005; 48: 303-14. [PubMed]
34. Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT. Кокоин-индуцированное фосфорилирование CREB в прилежащих ядрах крыс, сенсибилизированных кокаином, обеспечивается усиленной активацией внеклеточной сигнальной киназы, но не протеинкиназы A. J Neurochem. 2005; 95: 1481-94. [PubMed]
35. McClung CA, Nestler EJ. Регулирование экспрессии генов и вознаграждение кокаина CREB и DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-15. [PubMed]
36. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: молекулярный переключатель для долговременной адаптации в мозге. Мозг Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146-54. [PubMed]
37. Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: молекулярный медиатор долговременной нейронной и поведенческой пластичности. Brain Res. 1999; 835: 10-17. [PubMed]
38. Nestler EJ. Существует ли общий молекулярный путь для наркомании? Nat Neurosci. 2005; 8: 1445-9. [PubMed]
39. Nestler EJ. Транскрипционные механизмы зависимости: роль DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245-55. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
40. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Отличительные закономерности индукции DeltaFosB в головном мозге наркотиками. Synapse. 2008; 62: 358-69. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
41. Rando OJ, Chang HY. Геномные взгляды на структуру хроматина. Annu Rev Biochem. 2009; 78: 245-71. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
42. Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB опосредует эпигенетическую десенситизацию гена c-fos после хронического воздействия амфетамина. J Neurosci. 2008; 28: 7344-9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
43. Рентхал У, Кумар А, Сяо Г, Уилкинсон М, Ковингтон ОН, 3rd, Лабиринт I, Сикдер Д, Робинсон А.Д., ЛаПлант Q, Диц Дз, Руссо Сьюз, Виалу В., Чакраварти С., Кодадек Т.Дж., Стек А, Каббадж М, Nestler EJ. Геномный анализ регуляции хроматина кокаином показывает роль сиртуинов. Neuron. 2009; 62: 335-48. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
44. Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Холецистокининовая модуляция функции мезолимбического дофамина: регуляция мотивированного поведения. Фармакол Токсикол. 2002; 91: 404-13. [PubMed]
45. Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Отрицательная кооперативность между сопоставленными E-box и cAMP / TPA-чувствительными элементами в промоторе гена холецистокинина. FEBS Lett. 1999; 448: 15-8. [PubMed]
46. Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Storm D, Nestler EJ. Региональное и клеточное картирование CRE-опосредованной транскрипции при выпадении морфина, осажденного налтрексоном. J Neurosci. 2002; 22: 3663-3672. [PubMed]
47. Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Storm D, Nestler EJ. Регулирование CRE-опосредованной транскрипции в мозге мыши амфетамином. Synapse. 2003; 48: 10-7. [PubMed]
48. Шэн М, Макфадден Г, Гринберг М.Э. Деполяризация мембран и кальция индуцируют транскрипцию c-fos через фосфорилирование транскрипционного фактора CREB. Neuron. 1990; 4: 571-82. [PubMed]
49. Цанкова Н.М., Кумар А., Нестлер Е.Ю. Гистонные модификации в областях промотора гена в гиппокампе крысы после острых и хронических электросудорожных судорог. J Neurosci. 2004; 24: 5603-10. [PubMed]
50. Ulery PG, Nestler EJ. Регулирование транскрипционной активности DeltaFosB фосфорилированием Ser27. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-30. [PubMed]
51. Vaccarino FJ. Nucleus accumbens dopamine-CCK-взаимодействия в вознаграждении психостимулятора и связанных с ним поведениях. Neurosci Biobehav Rev. 1992; 18: 207-14. [PubMed]
52. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: Существенная роль ΔFosB в прилежании ядра при действии морфина. Природа Neurosci. 2006; 9: 205-11. [PubMed]