Наркотиков опыт эпигенетически primes Fosb индуцируемости гена в крысе ядра accumbens (2012)

Абстрактные

Введение

Наркомания характеризуется компульсивным поиском наркотиков и их применением, несмотря на серьезные неблагоприятные последствия (Kalivas et al., 2005; Hyman и др., 2006). Хроническое воздействие лекарственного средства вызывает постоянные изменения экспрессии генов в брюшном полосатом (или ядре accumbens, NAc) и дорсальном полосатом (или хвостатом куренте, CPu), полосатые структуры, участвующие в вознаграждении за наркотики и зависимости (Freeman и др., 2001; Робинсон и Колб, 2004; Шахам и Надежда, 2005; Лабиринт и Нестлер, 2011). ΔFosB, усеченный и стабильный белок, кодируемый непосредственным ранним геном, Fosb, является хорошо охарактеризованным фактором транскрипции, индуцированным в NAc и CPu, путем хронического воздействия практически всех наркотических средств, где он опосредует сенсибилизированные поведенческие реакции на повторное введение лекарственного средства (Nestler, 2008). Тем не менее, неизвестно, является ли предыдущее хроническое воздействие на наркотик злоупотребления последующей индукцией ΔFosB.

Недавно мы предположили, что модификации хроматина в ответ на хроническое лекарственное воздействие могут влиять на индуцируемость специфических генов в целевых областях мозга (Robison и Nestler, 2011). Увеличение доказательств показало, что наркотики злоупотребления после хронического введения изменяют структуру и доступность транскрипции хроматина посредством многочисленных модификаций, включая фосфорилирование, ацетилирование и метилирование хвостов гистонов. Более поздняя работа в системах клеточной культуры была сосредоточена на вербовке РНК-полимеразы II (Pol II) на промотор «индуцируемых» генов до их экспрессии, причем Pol II постоянно связывался с проксимальными промоторными областями и вокруг сайта начала транскрипции (TSS ) в «застопоренном» состоянии (Core и Lis, 2008; Нечаев и Адельман, 2008). Считается, что активация запертого Pol II ответственна за ее выход из зоны промотора и TSS и ее транскрипцию этих «праймированных» генов (Zeitlinger и др., 2007; Saha и др., 2011; Bataille et al., 2012).

Здесь мы показываем, что предыдущее хроническое воздействие кокаина, за которым следует расширенный период отмены, изменяет индуцируемость Fosb ген к последующему введению кокаина, причем NAc загрунтован для индукции, а CPu - нет. Затем мы идентифицируем отдельные сигнатуры хроматина на Fosb гена в NAc и CPu, которые связаны с такой аберрантной индуцибе- Fosb ген, включая вербовку застопоренного Pol II на Fosb проксимальный промотор в NAc, а также изменения в нескольких активационных или репрессивных модификациях гистонов в обеих областях мозга. Эти результаты дают новое представление о динамике хроматина на Fosb промотора гена и впервые указывают на механизм, посредством которого застопоривание Pol II простых чисел Fosb для большей активации в NAc при повторном контакте с кокаином.

Материалы и методы

Итоги

Большой Фосб-индуцибельность в NAc, но не CPu, у крыс с кокаином

Изучить влияние предшествующего хронического курса кокаина, за которым следует длительный период отмены, на индуцируемость Fosb гена в ответ на последующую кокаиновую пробу, крысам, которые ранее вводили ip два раза в день физиологическим раствором или кокаином (15 мг / кг) в течение дней 10, были назначены контрольные дозы препарата после 28 дней отмены (Рис. 1A). Мы впервые измерили локомоторные ответы у одной группы животных, чтобы подтвердить индукцию двигательной сенсибилизации с помощью предварительного воздействия кокаина, что является ожидаемым последним результатом введения лекарственного средства. Кокаин-опытные и здоровые крысы проявляли эквивалентную исходную локомоторную активность, при этом кокаин вызывал у наркоманов наивных животных, увеличивая их передвижение (Рис. 1B, Повторные измерения двухсторонний ANOVA, лечение: F_1,66 = 30.42, р <0.0001; кокаиновый вызов: F_2,66= 58.39, р <0.0001; лечение x кокаиновая проблема: F_2,66= 8.56, p = 0.0005, пост-тесты Bonferroni ^{^}р <0.001). Эта кокаиновая провокация вызвала значительно большую двигательную активность, т. Е. Сенсибилизацию, у крыс, переживших кокаин (пост-тесты Бонферрони * p <0.001).

  

Рисунок 1

Влияние предшествующего хронического воздействия кокаина на локомоторную активность и Fosb индукция в NAc и CPu при повторном воздействии препарата

Чтобы оценить влияние этого режима лечения кокаина на экспрессию ΔFosB в NAc и CPu, мы измерили белок FosB с иммуногистохимическими методами 24 hr после того, как кокаин-наивные и кокаиновые опытные животные получали 0, 1, 3 или 6 ежедневно кокаин инъекции (15 мг / кг; см. Рис. 1A). Как ранее было установлено (Nye et al., 1995), Инъекции кокаина 3 были достаточными для значительного индуцирования белка ΔFosB в NAc и CPu у наименее опасных животных, и его накопление оставалось значительным после 6 дней инъекций кокаина (Рис. 1C, Повторные измерения двухстороннего ANOVA, NAc сердечника, обработка: F_1,28= 23.5, р <0.0001; кокаиновый вызов: F_3,28= 49.16, р <0.0001; лечение x кокаиновая проблема: F_3,28= 6.83, p = 0.0014; NAc оболочка, лечение: F_1,28= 18.69, р <0.0001; кокаиновый вызов: F_3,28= 31.52, р <0.0001; лечение x кокаиновая проблема: F_3,28= 3.21, p <0.05; CPu, обработка: F_1,28= 9.47, р <0.001; кокаиновый вызов: F_3,28= 19.74, р <0.0001; лечение x кокаиновая проблема: F_3,28= 0.94, p> 0.05. В ядре NAc, оболочке и CPu пост-тесты Бонферрони ^{^}р <0.05). У животных, употреблявших кокаин, не было доказательств стойкой индукции ΔFosB в NAc или CPu после 28 дней отмены, что согласуется с предыдущими сообщениями о том, что сигнал ΔFosB полностью исчезает к этому моменту времени (Nye et al., 1995), причина этого момента времени была использована в этом исследовании. Однако поразительно, что опытные крысы с кокаином, которые получали инъекции кокаина 3 или 6, показали значительно большую индукцию белка ΔFosB в NAc, что проявляется как в субрегионах ядра, так и в оболочке (Рис. 1C. Пост-тесты Бонферрони * p <0.05). Напротив, такой большей индукции белка ΔFosB в CPu не наблюдалось; вместо этого эквивалентная индукция ΔFosB наблюдалась в этой области через 3 или 6 дней инъекций кокаиновой контрольной группы у крыс, не получавших кокаин, и крыс с опытом (Рис. 1C).

Чтобы получить представление об изменениях транскрипции, происходящих в NAc и CPu в ответ на вызов кокаина, мы изучили временной ход (45, 90 и 180 мин) индуцибельности транскриптов MFNA FOSB и FosB при использовании одного кокаина или инъекции солевого раствора кокаин-наивным и -опытным крысам после 28 дней отмены (см. Рис. 1A). По сравнению с проблемой солевого раствора проблема кокаина вызывала быстрое увеличение уровней мРНК ΔFosB и FosB во всех трех временных точках как у NAc, так и у CPu у кокаина-наивных животных (Рис. 1D, Повторяющиеся меры в один конец ANOVA за точку времени; Пост-тесты Бонферрони ^{^}р <0.05). В NAc мы наблюдали большую индукцию мРНК ΔFosB и FosB у животных, принимавших кокаин, по сравнению с животными, не получавшими кокаин, после провокации кокаином, причем эффект был значительным через 90 мин, в то время как, напротив, индуцируемость мРНК ΔFosB и FosB в CPu была значительно снизился у животных, употреблявших кокаин (Рис. 1D, Пост-тесты Бонферрони ^%р = 0.08, * р <0.05).

Характеристика восходящих сигнальных путей в NAc и CPu кокаиновых опытных крыс

Одно из возможных объяснений измененной индуци- Fosb ген в NAc и CPu после предшествующего хронического курса кокаина заключается в том, что отдаленная история воздействия кокаина может вызывать длительные изменения в сигнальных путях, которые находятся выше по течению от Fosb генную индукцию, так что кокаин-вызов затем индуцирует ген с аберрантной степенью. Для изучения этой гипотезы мы проанализировали два транскрипционных фактора, SRF и CREB, которые недавно были показаны для индукции кокаина ΔFosB в этих областях мозга (Vialou et al., 2012) вместе с протеинкиназами вверх, ERK и AKT, также участвуют в действии кокаина (Valjent и др., 2000; Lu et al., 2006; Boudreau et al., 2009). Нам не удалось обнаружить каких-либо изменений общего или фосфорилированного уровней этих различных белков, которые могли бы объяснить измененную индуктивность Fosb , в том числе без изменений в SRF, CREB или AKT (Рис. 2B, C). Отсутствие изменений в pSRF и pCREB в NAc в ответ на вызов кокаина согласуется с недавним отчетом, который обнаружил, что оба они были вызваны значительно только хроническим кокаином (Vialou et al., 2012).

  

Рисунок 2

Влияние предшествующего хронического воздействия кокаина на восходящие молекулярные сигнальные каскады в NAc и CPu

В NAc и CPu наименее опасных животных, 20 мин после первоначального воздействия препарата (Рис. 2A), одна проблема кокаина уменьшала уровни pERK42 / 44 (Рис. 2B, C. Двусторонний t-критерий Стьюдента: * p <0.05). Имеются предыдущие сообщения о повышении уровней pERK в этих регионах после острого приема кокаина (Valjent и др., 2000). Это трудно сравнить с другими документами, изучающими фосфорилирование ERK в NAc во время выхода из повторных инъекций кокаина (Boudreau et al., 2007; Shen et al., 2009), так как в нашем исследовании pERK определяли количественно после 28 дней отмены и после кокаина или солевого раствора. По сравнению с наркотическими животными, впервые испытывающими кокаин, повторное заражение кокаином у крыс, подвергнутых кокаину, после 28 дней отмены привело к значительному увеличению уровней pERK42 / 44 в CPu (Рис. 2B, C. Двухсторонний t-критерий Стьюдента: * p <0.05).

Хроматин Промотор гена Fosb в NAc и CPu кокаиновых опытных крыс

Далее мы исследовали, Fosb индуцируемость гена связаны с изменениями в его структуре хроматина. ChIP проводили на NAc и CPu с использованием антител, направленных против трех хорошо охарактеризованных форм модификаций гистонов: триметилирование Lys4 гистона H3 (H3K4me3), связанное с активацией гена, и H3K27me3 и H3K9me2, связанные с репрессией генов. Мы проанализировали кокаин-наивных и -опытных крыс после 28 дней изъятия либо без, либо с вызовом инъекции кокаина, с животными, осмотренными 1 hr позже (Рис. 3A). В NAc мы не обнаружили существенных изменений в привязке любой из этих трех модификаций гистонов к Fosb гена в отсутствие кокаиновой пробы, хотя была тенденция к снижению уровней H3K9me2 (Рис. 3B-D, Два хвостатых t-теста. ^#p = 0.2 по сравнению с соответствующими контрольными препаратами Naivve). Этот эффект стал значимым после вызова кокаина и был специфичен для проксимальной промоторной области гена (Рис. 3C. * р <0.05). Хотя уровни H3K9me2 в некоторых генах очень низкие, Fosb ген-промотор показывает заметные уровни этой метки в NAc в условиях контроля (Maze et al., 2010, данные не показаны). Напротив, в CPu мы обнаружили небольшое, но значительное уменьшение связывания H3K4me3 и увеличение связывания H3K27me3 на Fosb промотор в отсутствие кокаина, последствия, утраченные после заражения (Рис. 3D. * р <0.05).

  

Рисунок 3

Влияние предшествующего хронического воздействия кокаина на эпигенетическое праймирование Fosb ген в NAc и CPu

Затем мы исследовали связь Pol II с Fosb ген, основанный на недавних результатах в культуре клеток, что остановка Pol II в TSS, которая характеризуется своим фосфорилированием в Ser 5 в ее области повторения CTD, связана с праймированием генов (см. Введение). Таким образом, мы проанализировали связь Pol II-pSer5 с Fosb в четырех различных областях гена (Рис. 3B). Этот анализ показал значительное обогащение Pol II-pSer5 на Fosb гена в его проксимальной области промотора и вокруг его TSS в NAc кокаиновых опытных животных после длительного изъятия при отсутствии кокаиновой пробы по сравнению с контрольными (Рис. 3E. * р <0.05). Это обогащение не было очевидным в двух областях тела гена Fosb, что согласуется с остановкой Pol II, описанной в более простых экспериментальных системах. Интересно отметить, что после заражения кокаином Pol II-pSer5-связывание по-прежнему демонстрирует признаки обогащения, хотя и не значительно, Fosb проксимальная область промотора (Рис. 3E. ^%p = 0.1), но вернулся к контрольным уровням в TSS. Выводы в CPu были более переменными, при этом не наблюдалось четкой картины связывания Pol II-pSer5.

Обсуждение

Настоящее исследование дает новое представление о устойчивом регулировании Fosb недель после прекращения повторного воздействия кокаина. Мы показываем, что предыдущее хроническое введение кокаина оказывает Fosb ген, более индуцируемый в NAc, что приводит к более быстрому накоплению ΔFosB при повторном воздействии препарата. Учитывая преобладание доказательств того, что индукция ΔFosB в NAc опосредует сенсибилизированные поведенческие реакции на кокаин (Nestler, 2008), наши результаты показывают новый механизм для более быстрого восстановления таких сенсибилизированных реакций после длительного изъятия.

Мы демонстрируем, что усиленная индукция ΔFosB в NAc связана с изменениями хроматина на Fosb ген, который, как ожидается, будет заправлять его для большей индукции. Таким образом, мы показываем увеличенное связывание Pol II с проксимальным промотором и областями TSS гена, которые присутствуют после 4 недель отмены из предыдущего хронического введения кокаина. Такое обогащение Pol II в TSS быстро теряется при вызове кокаина и Fosb индукция, согласующаяся с моделью в клеточной культуре, которая задерживает Pol II, высвобождается из TSS при активации гена (см. Введение). Проблема кокаина также вызывает быстрое снижение связывания H3K9me2 - признака репрессии генов - к Fosb промоутер. Напротив, мы не обнаружили длительной индукции нескольких факторов транскрипции или их восходящих киназ, которые, как известно, опосредуют Fosb индукция кокаином. Эти результаты подтверждают нашу гипотезу о том, что усиленная индукция ΔFosB в NAc опосредуется эпигенетическим праймированием Fosb ген, а не путем активизации восходящих событий.

Для CPu были получены очень разные результаты. Не было доказательств того, что Пол II Fosb у кокаиновых крыс до заражения кокаином, хотя были небольшие, но значительные модификации гистонов, согласующиеся с репрессией гена: увеличенное связывание H3K27me3 и снижение связывания H3K4me3. Также не было изменений в факторах транскрипции в верхнем течении или киназах, соответствующих уменьшенным Fosb индукция. Эти данные показывают, что после хронического введения кокаина эпигенетические модификации служат для гашения Fosb индуцируемость гена в CPu, в отличие от прайминга, наблюдаемого в NAc. Однако, хотя эти эффекты подавляют индукцию мРНК ΔFosB после повторного воздействия на кокаин, нет никакой потери в накоплении белка FOSB. Механизм, лежащий в основе этого парадокса, теперь требует дальнейшего изучения.

В более общем плане наши результаты поддерживают модель, в которой изменения в ландшафте хроматина у конкретных генов в ответ на хроническое введение кокаина служат для простого или тупого гена для последующей индукции после повторного воздействия препарата. Такие изменения хроматина, которые можно рассматривать как «эпигенетические шрамы», были бы упущены при анализе уровней генов мРНК в установившемся состоянии. Таким образом, характеристика эпигенома наркомании обещает выявить свежую информацию о молекулярном патогенезе расстройства, который можно добыть для разработки новых методов лечения.

Благодарности

Рекомендации