Влияние избыточной экспрессии ΔFosB на опосредованную опиоидом и каннабиноидным рецептором сигнализацию в ядре accumbens (2011)

Нейрофармакология. 2011 Dec;61(8):1470-6. doi: 10.1016/j.neuropharm.2011.08.046.

Sim-Selley LJ, Кэссиди М.П., Спарта А, Захариу V, Nestler EJ, Selley DE.

Источник

Отделение фармакологии и токсикологии и Институт исследований наркотиков и алкоголя, Медицинская школа Университета штата Вирджиния, Ричмонд, VA 23298, США.

Абстрактные

Стабильный транскрипционный фактор ΔFosB индуцируется в ядре accumbens (NAc) при хроническом воздействии нескольких наркотических средств, а трансгенная экспрессия ΔFosB в полосатом теле улучшает полезные свойства морфина и кокаинае. Однако механистическая основа этих наблюдений не полностью понята. Мы использовали модель битрансгенной мыши с индуцибельной экспрессией ΔFosB в допамин D (1) рецептор / диорфин-содержащие полосатые нейроны для определения влияния экспрессии ΔFosB на сигналы опиоида и каннабиноидного рецептора в NAc. Результаты показали, что активность M-опиоид-опосредованного G-белка и ингибирование аденилатциклазы были усилены в NAc мышей, которые выражали ΔFosB. Аналогично, ингибирование аданилилциклазы каппи-опиоидом усиливалось у экспрессирующих ΔFosB мышей. Напротив, сигнализация, опосредованная каннабиноидным рецептором, не отличалась между мышами, сверхэкспрессирующими ΔFosB и контрольными мышами. TЭти данные показывают, что сигнализация опиоидов и каннабиноидных рецепторов дифференциально модулируется экспрессией ΔFosB и указывает, что экспрессия ΔFosB может приводить к некоторым ее эффектам с помощью усиленной сигнализации о млекопитающих и каппа-опиоидных рецепторов в NAc.

Ключевые слова: G-белок, аденилилциклаза, стриатум
Перейти к:

1. Введение

Опиоидные рецепторы и каннабиноидный CB1 рецепторы (CB1R) являются нейробиологическими мишенями для двух широко используемых классов лекарств, которые включают морфины, героины и опиоиды по рецепту и марихуану (Δ9-тетрагидроканнабинол (ТГК)), соответственно. Острые эффекты опиоидов и каннабиноидов опосредуются рецепторами, связанными с G-белком, которые активируют главным образом GI / O белков и продуцировать последующие эффекторные реакции, такие как ингибирование аденилатциклазы (Childers, 1991, Чайлдерс и др., 1992, Howlett, et al., 2002). Мотор, ухудшение памяти и психоактивные эффекты Δ9-THC производятся CB1Р (Huestis и др., 2001, Zimmer, et al., 1999), которые широко распространены в головном мозге, с высокими уровнями в базальных ганглиях, гиппокампе и мозжечке (Herkenham, et al., 1991). Обезболивающее и полезное действие большинства клинически значимых и злоупотребляемых опиоидных препаратов опосредовано в основном му опиоидными рецепторами (MOR) (Matthes, et al., 1996), которые обогащены лимбической системой и мозговым стволом (Mansour, et al., 1994). Мезолимбическая система, состоящая из дофаминергических проекций от брюшной тегментальной области (VTA) до ядра accumbens (NAc), играет важную роль в положительном эффекте опиоидов и каннабиноидов (Bozarth and Wise, 1984, Vaccarino, et al., 1985, Zangen, et al., 2006), а также другие наркотические средства (Кооб и Волков, 2010). Кроме того, эндогенные опиоидные и каннабиноидные системы вовлечены в полезное действие нескольких классов психоактивных препаратов (Maldonado, et al., 2006, Trigo, et al., 2010). Таким образом, важно выяснить механизмы, с помощью которых опиоид и CB1R сигнализируются в NAc.

Центральным вопросом в области злоупотребления наркотиками было выявление белков, которые опосредуют переход от острого к долгосрочному воздействию психоактивных препаратов. Фактор транскрипции AP-1 ΔFosB особенно интересен, поскольку он является стабильным усеченным вариантом сплайсинга fosb гена, который накапливается при повторном воздействии на наркотики злоупотребления или естественные награды (McClung и др., 2004, Nestler, 2008, Nestler, et al., 1999). Мы обнаружили, что ΔFosB индуцируется в мозге после многократного воздействия морфина, Δ9-THC, кокаин или этанол, причем каждый препарат дает уникальный региональный образец экспрессии ΔFosB (Perrotti, et al., 2008). Последовательное обнаружение лекарств заключалось в том, что ΔFosB был сильно индуцирован в полосатом теле, где все четыре препарата индуцировали ΔFosB в ядре NAc и все, кроме Δ9-THC значительно индуцировала экспрессию в оболочке NAc и хвоято-путамен.

Фармакологические исследования показали, что совместное введение допамина D1 рецептор (D1R) SCH 23390 блокировал индукцию ΔFosB в NAc и каудат-путамене после прерывистого введения кокаина или морфина, что указывает на потенциальную важность D1R-экспрессирующие нейроны (Мюллер и Унтервальд, 2005, Nye, et al., 1995). Влияние индукции ΔFosB на лекарственное опосредованное поведение было исследовано с использованием битрансгенных мышей, которые экспрессируют ΔFosB в специфических нейронных популяциях NAc и дорзальной полосатой (Chen, et al., 1998). Мыши, которые экспрессируют ΔFosB в динорфине / D1R положительных нейронов в NAc и дорзальном полосатом (линия 11A) показывают измененные ответы на наркотики, особенно повышенную чувствительность к полезным эффектам кокаина или морфина (Colby, et al., 2003, Kelz и др., 1999, Zachariou, et al., 2006). Эти изменения произошли в отсутствие изменений уровней MOR или различных субъединиц G-белка. Тем не менее, уровни мРНК диорфина были снижены в NAc мыши, экспрессирующих ΔFosB (Zachariou, et al., 2006), предполагая, что одна мишень ΔFosB представляет собой ген, кодирующий эндогенный опиоидный пептид. Индукция ΔFosB также может приводить к поведенческим изменениям, регулируя рецепторную сигнализацию в NAc, но эта возможность не исследовалась. Поэтому в настоящих исследованиях использовалась модель битрансгенной мыши, чтобы определить, является ли сверхэкспрессия ΔFosB в динорфине / D1R, содержащие стриатальные нейроны, изменяет активность M-опосредованного G-белка и MOR- и KOR-опосредованное ингибирование аденилилциклазы в NAc. Эффект ΔFosB на CB1R-опосредованную активность G-белка также оценивали, поскольку Δ9-THC индуцирует ΔFosB в NAc (Perrotti, et al., 2008) и эндоканнабиноидная система, как известно, регулирует цепи вознаграждения мозга (Гарднер, 2005, Maldonado, et al., 2006), но эффект ΔFosB на эндоканнабиноидную систему не исследовался.

Перейти к:

2. Материалы и методы

2.1. Реактивы

[35S] GTPγS (1250 Ci / ммоль), [α-32P] ATP (800 Ci / ммоль) и [3H] cAMP (26.4 Ci / ммоль) были приобретены у PerkinElmer (Shelton, CT). ATP, GTP, GDP, cAMP, бычий сывороточный альбумин, креатинфосфокиназа, папаверин, имидазол и WIN-55212-2, были приобретены у Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури). GTPγS был приобретен у Roche Diagnostic Corporation (Чикаго, Иллинойс). DAMGO была предоставлена ​​Программой поставок наркотиков Национального института по злоупотреблению наркотиками (Rockville, MD). Сцинтилляционная жидкость Econo-1 была получена от Fisher Scientific (Norcross, GA). Эколитная сцинтилляционная жидкость была получена от ICN (Costa Mesa, CA). Все остальные химикаты были получены от Sigma Aldrich или Fisher Scientific.

2.2. мышей

Самцы битрансгенных мышей, полученных из NSE-tTA (линия A) × TetOp-ΔFosB (строка 11), были получены, как описано в Kelz et al. (Kelz и др., 1999). Битрансгенные мыши были задуманы и подняты на доксициклин (100 мкг в питьевой воде) для подавления экспрессии трансгена. В возрасте 8 недель доксициклин был исключен из воды для половины мышей, чтобы обеспечить трансгенную экспрессию, тогда как оставшиеся мыши поддерживали на доксициклине для подавления трансгена. Мозги были собраны спустя 8, время, когда транскрипционные эффекты ΔFosB максимальны (McClung и Nestler, 2003). Использовали вторую линию трансгенных мышей, в которой Δc-Jun, доминантный отрицательный антагонист c-Jun, экспрессируется в D1R / динорфин и D2R / энкефалиновые клетки полосатого тела, гиппокампа и теменной коры (Peakman, et al., 2003). C-Jun и родственные белки семейства Jun димеризуются с белками семейства Fos и связываются с сайтом-мишенью AP-1 для регулирования транскрипции. Однако усечение N-конца c-Jun (Δc-Jun) делает сложным транскрипционно неактивным и способным препятствовать связыванию ДНК активных комплексов AP-1. Самцы битрансгенных мышей, полученных из NSE-tTA (линия A) × TetOp-FLAG-Δc-Jun (линия E), были получены, как описано в Peakman et al. (Peakman, et al., 2003). Битрансгенные мыши были задуманы и подняты на доксициклин (100 мкг в питьевой воде) для подавления экспрессии трансгена. Щенков отнимали от груди в течение 3 недель, генотипировали и разделяли на группы, наполовину поддерживали на воде, содержащей доксициклин, и наполовину на обычной питьевой воде, чтобы вызвать экспрессию FLAG-Δc-Jun. Мозги были собраны спустя 6, время, в течение которого измерялись максимальные уровни FLAG-Δc-Jun (Peakman, et al., 2003). Все процедуры для животных проводились в соответствии с Руководством Национального института здоровья для ухода и использования лабораторных животных.

2.3. Подготовка мембран

Мозги хранились при -80 ° C до дня анализа. Перед анализом каждый мозг оттаивали, а NAc рассекали на льду. Каждый образец гомогенизировали в 50 мМ Трис-HCl, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 7.4 (мембранный буфер) с ходами 20 из стеклянного гомогенизатора при 4 ° C. Гомогенат центрифугировали при 48,000 × g при 4 ° C для 10 мин, ресуспендировали в мембранном буфере, снова центрифугировали при 48,000 × g при 4 ° C для 10 мин и ресуспендировали в 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl2, 0.2 mM EGTA, 100 мМ NaCl, pH 7.4 (буфер для анализа). Уровни белка определяли по методу Брэдфорда (Брэдфорд, 1976) с использованием бычьего сывороточного альбумина (BSA) в качестве стандарта.

2.4. Агонист-стимулированный [35S] GTPγS Binding

Мембраны предварительно инкубировали в течение 10 минут при 30 ° C с аденозиндезаминазой (3 mU / мл) в аналитическом буфере. Мембраны (белок 5-10 мкг) затем инкубировали в течение 2 hr при 30 ° C в буфере для анализа, содержащем 0.1% (мас. / Об.) BSA, 0.1 nM [35S] GTPγS, 30 мкМ ВВП и аденозиндезаминазы (3 мU / мл) с соответствующими концентрациями DAMGO или WIN55,212-2 и без них. Неспецифическое связывание измеряли с помощью 20 μM GTPγS. Инкубацию прекращали фильтрованием через фильтры из стекловолокна GF / B, затем промывали 3 с помощью 3 мл охлажденного льдом 50 мМ Трис-HCl, pH 7.4. Связанная радиоактивность определялась с помощью жидкостной сцинтилляционной спектрофотометрии после ночной экстракции фильтров в сцинтилляционной жидкости Econo-1.

2.5. Анализ аденилилциклазы

Мембраны (белок 5-25 мкг) предварительно инкубировали с аденозиндезаминазой, как описано выше, затем инкубировали в течение 15 мин при 30 ° C в присутствии или в отсутствие 1 мкМ форсколина с или без DAMGO, U50,488H или WIN55,212-2 в буфере для анализа, содержащем 50 мкМ АТФ, [α-32P] ATP (1.5 μCi), 0.2 мМ DTT, 0.1% (мас. / Об.) BSA, 50 мкМ циклический AMP, 50 мкМ GTP, 0.2 мМ папаверин, 5 мМ фосфокреатин, 20 единиц / мл креатинфосфокиназы и аденозиндезаминазы (3 mU / мл) в конечном объеме 100 мкл. В этих условиях общее количество [α-32P] цАМФ, как правило, меньше, чем 1% от общего количества добавленного [α-32P] ATP в каждом образце. Реакцию прекращали кипячением в течение 3 мин и [32P] Циклический AMP выделяли методом двойного столбца (Dowex и оксид алюминия) Саломона (Salomon, 1979). [3H] cAMP (10,000 dpm) добавляли к каждой пробирке до колоночной хроматографии в качестве внутреннего стандарта. Радиоактивность определяли с помощью жидкостной сцинтилляционной спектрофотометрии (КПД 45% для 3H) после того, как 4.5 мл элюата растворяют в 14.5 мл сцинтилляционной жидкости Ecolite.

2.6. Анализ данных

Если не указано иное, данные сообщаются как средние значения ± SE отдельных экспериментов 4-8, каждый из которых выполнялся в трех экземплярах. Чистая стимуляция [35S] GTPγS рассчитывается как связанное с агонистом связывание минус базальное связывание. Чистая форсколин-стимулированная аденилатциклазная активность определяется как форсколин-стимулированная активность - базальная активность (пмоль / мг / мин). Процент ингибирования активности, индуцированной форсколином аденилилциклазы, определяется как (чистая форсколин-стимулированная активность в отсутствие агонистической сетчатой ​​форсколин-стимулированной активности в присутствии агониста / чистой форсколино-стимулированной активности в отсутствие агониста) × 100. Все кривые и статистические анализы были выполнены с использованием Prism 4.0c (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Кривые концентрационного эффекта анализировали с помощью итеративной нелинейной регрессии для получения EC50 и EМакс ценности. Статистическая значимость данных о концентрационном эффекте определялась путем двухстороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием дозы агониста и индукции гена (вкл. Или выкл.) В качестве основных факторов. Статистическая значимость значений соответствия кривой (EМакс или ЕС50) был определен с помощью непарного двустороннего t-критерия Стьюдента с использованием поправки Велча или преобразования квадратного корня из данных, где необходимо исправить неравные дисперсии (обнаруженные с помощью F-критерия) в ЭК.50 значения.

Перейти к:

3. Результаты

3.1. Влияние экспрессии ΔFosB на опиоидную и каннабиноидную рецепторную активацию G-белка

Чтобы определить, MOR- или CB1R-опосредованная активация G-белка была изменена индуцируемой трансгенной экспрессией ΔFosB в NAc, стимулированной агонистом [35S] GTPγS исследовали в изолированных мембранах, полученных из этой области битрансгенных мышей, условно экспрессирующих (ΔFosB on) или не экспрессирующих (ΔFosB off) ΔFosB-трансген. MOR-селективный энкефалиновый аналог DAMGO использовали для активации MOR, а аминоалкилиндол каннабиноида WIN55,212-2 использовался для активации CB1R. Эти лиганды ранее были показаны как полные агонисты в MOR и CB1R, соответственно (Breivogel и др., 1998, Selley, et al., 1997). Невозможно было исследовать активность, связанную с KOR-G-белком, потому что сигнал слишком мал в мозге грызунов (Чайлдерс и др., 1998). Результаты показали концентрационно-зависимую стимуляцию активности G-белка как DAMGO, так и WIN55,122-2 в NAc от ΔFosB и ΔFosB на мышах (Рисунок 1). Для стимулированной ДАМГО активности (Рисунок 1A), двухфакторный дисперсионный анализ данных концентрация-эффект выявил существенные основные эффекты статуса ΔFosB (p <0.0001, F = 22.12, df = 1) и концентрации DAMGO (p <0.0001, F = 29.65, df = 5) без значимое взаимодействие (p = 0.857, F = 0.387, df = 5). Нелинейный регрессионный анализ кривых концентрация-эффект показал значительно большее значение DAMGO EМакс значение в ΔFosB на мышах (EМакс = 73 ± 5.2%) по сравнению с ΔFosB у мышей (EМакс = 56 ± 4.1% стимуляции; p <0.05 отличается от ΔFosB на мышах по t-критерию Стьюдента). ДАМГО ЭК50 значения не различались между ΔFosB on и ΔFosB у мышей (302 ± 72 nM в сравнении с 212 ± 56 nM, соответственно, p = 0.346).

Рисунок 1 

Влияние экспрессии ΔFosB на стимулированный агонистом [35S] GTPγS в NAc. Мембраны из экспрессирующих ΔFosB (ΔFosB on) или контрольных (ΔFosB off) мышей анализировали, как описано в Методах с использованием различных концентраций ...

В отличие от результатов, полученных с агонистом MOR DAMGO, не наблюдалось зависимых от FSB различий в активации G-белка с агонистом каннабиноидов WIN55,212-2 (Рисунок 1B). Двусторонний дисперсионный анализ данных концентрация-эффект WIN55,212-2 выявил значительный основной эффект концентрации WIN55,212-2 (p <0.0001, F = 112.4, df = 7), но не статуса ΔFosB (p = 0.172). , F = 1.90, df = 1) и взаимодействия не было (p = 0.930, F = 0.346, df = 7). Точно так же не было эффекта от статуса ΔFosB на WIN55,212-2 EМакс значения (103 ± 6% против стимуляции 108 ± 8% у мышей FOSB и у мышей, соответственно, p = 0.813 по t-критерию Стьюдента) или EC50 значения (103 ± 20 nM в сравнении с 170 ± 23 nM у мышей FOSB и, соответственно, p = 0.123).

Исходя из формы кривых и того факта, что наши предыдущие исследования показали двухфазные кривые концентрационного эффекта WIN55,212-2 в головном мозге (Breivogel и др., 1999, Breivogel и др., 1998), кривые WIN55,212-2 также анализировали с использованием двухсайтовой модели. Анализ усредненных данных показал небольшое улучшение в отношении пригодности с использованием двухсайтовой модели (R2 = 0.933 и 0.914, сумма квадратов = 3644 и 5463 в мышах FOSB и вне их соответственно) по сравнению с моделью с одним участком (R2 = 0.891 и 0.879, сумма квадратов = 6561 и 6628 в мышах FFB и соответственно). Однако никаких существенных различий между ΔFosB на мышах и вне мышей в EМакс или ЕС50 значения сайтов с высокой или низкой эффективностью (Дополнительный стол 1), хотя была тенденция к снижению ЕС50 значение на сайте с высокой эффективностью у мышей с ΔFosB on (EC50высокая = 28.0 ± 10.6 nM) по сравнению с таковыми с ΔFosB off (EC50высокая = 71.5 ± 20.2 nM; p = 0.094). Более того, не было никакого эффекта состояния ΔFosB на базальном [35S] GTPγS в NAc-мембранах (253-14 в сравнении с 226-14 fmol / мг у мышей FOSB и мышей, соответственно, p = 0.188). Эти данные показывают, что индуцибельная трансгенная экспрессия ΔFosB в NAc мышей увеличивала активацию M-опосредованного G-белка без существенного влияния на CB1R-опосредованная или базальная активность G-белка.

3.2. Влияние ΔFosB на опосредованное опиоидом и каннабиноидным рецептором ингибирование аденилатциклазы

Для оценки влияния индуцируемой трансгенной экспрессии ΔFosB на модуляцию последующей эффекторной активности MOR и CB1R, ингибирование 1 мкМ индуцированной форсколином аденилатциклазной активности исследовали в мембранах NAc. В дополнение к MOR- и CB1R-опосредованное ингибирование активности аденилатциклазы, эффекты активности KOR также изучали с использованием KOR-селективного полного агониста U50,488 (Zhu, et al., 1997), поскольку предыдущие результаты показали, что мРНК диорфина была мишенью ΔFosB в битрансгенной модели (Zachariou, et al., 2006). Результаты показали, что каждый из DAMGO, U50,488 и WIN55,212-2 вызывал зависящее от концентрации ингибирование активности аденилилциклазы как у ΔFosB, так и ΔFosB на мышах (Рисунок 2). Двунаправленная ANOVA данных о концентрационном эффекте DAMGO (Рисунок 2A) выявили значимые основные эффекты статуса ΔFosB (p = 0.0012, F = 11.34, df = 1) и концентрации DAMGO (p <0.0001, F = 29.61, df = 6), но не обнаружили значимого взаимодействия (p = 0.441, F = 0.986 , df = 6). Нелинейный регрессионный анализ кривых концентрация-эффект DAMGO выявил значительно более низкую EC DAMGO.50 значение ΔFosB у мышей (101 ± 11 нМ) по сравнению с ΔFosB у мышей (510 ± 182 нМ, p <0.05 по t-критерию Стьюдента). Однако существенной разницы в DAMGO E не было.Макс значения (20.9 ± 1.26% против 19.8 ± 1.27% торможения у мышей FOSB и выкл., соответственно, p = 0.534).

Рисунок 2 

Влияние экспрессии ΔFosB на ингибирование активности аденилилциклазы в NAc. Мембраны из экспрессирующих ΔFosB (ΔFosB on) или контрольных (ΔFosB off) мышей анализировали, как описано в Методах в присутствии 1 мкМ ...

KOR-опосредованное ингибирование аденилатциклазы также различалось как функция индуцируемой трансгенной экспрессии ΔFosB (Рисунок 2B). Двусторонний дисперсионный анализ данных концентрация-эффект U50,488 0.0006 показал значительные основные эффекты статуса ΔFosB (p = 14.53, F = 1, df = 50,488) и концентрации U0.0001 (p <26.48, F = 3, df = 0.833) , без значимого взаимодействия (p = 0.289, F = 3, df = 50,488). Нелинейный регрессионный анализ кривых «концентрация-эффект» выявил большее значение UXNUMX EМакс значение ΔFosB на мышах (18.3 ± 1.14% ингибирования) по сравнению с ΔFosB у мышей (ингибирование 12.5 ± 2.03%; p <0.05 отличается от ΔFosB по t-критерию Стьюдента), без существенной разницы в U50,488 XNUMX EC50 значения (310 ± 172 nM в сравнении с 225 ± 48 nM у мышей FOSB и, соответственно, p = 0.324).

В отличие от эффектов, наблюдаемых с MOR и KOR, существенного влияния индуцируемой трансгенной экспрессии ΔFosB на ингибирование аденилатциклазы каннабиноидным агонистом WIN55212-2 (Рисунок 2C). Двусторонний дисперсионный анализ данных концентрация-эффект WIN55,212-2 показал значительный эффект концентрации лекарственного средства (p <0.0001, F = 23.6, df = 2), но не статуса ΔFosB (p = 0.735, F = 0.118, df = 1) и не было значимого взаимодействия (p = 0.714, F = 0.343, df = 2). Более того, не наблюдалось влияния статуса ΔFosB на базальную или стимулируемую форсколином активность аденилатциклазы в отсутствие какого-либо агониста. Базальная активность аденилатциклазы составляла 491 ± 35 пмоль / мг / мин в ΔFosB у мышей по сравнению с 546 ± 44 у мышей ΔFosB вне (p = 0.346 по t-критерию Стьюдента). Аналогично, активность аденилатциклазы в присутствии 1 мкМ форсколина составляла 2244 ± 163 пмоль / мг / мин в ΔFosB у мышей по сравнению с 2372 ± 138 пмоль / мг / мин у мышей, не содержащих ΔFosB (p = 0.555).

3.3. Влияние ΔcJun на опосредованное опиоидом и каннабиноидным рецептором ингибирование аденилатциклазы

Поскольку индуцибельная трансгенная экспрессия ΔFosB усиливала ингибирующую сигнальную трансдукцию от MOR и KOR до аденилилциклазы в NAc, было интересно определить, будет ли доминирующий отрицательный ингибитор ΔSosB-опосредованной транскрипции модулировать сигнализацию опиоидных рецепторов противоположным образом. Для решения этого вопроса ингибирование форсколин-стимулированной аденилатциклазной активности с помощью DAMGO и U50,488 исследовали в мембранах, полученных из NAc битрансгенных мышей, условно экспрессирующих ΔcJun. Результаты не показали значительного влияния экспрессии ΔcJun на ингибирование активности аденилилциклазы MOR или KOR (Рисунок 3). Двусторонний дисперсионный анализ кривых концентрация-эффект DAMGO показал значительный основной эффект концентрации DAMGO (p <0.0001, F = 20.26, df = 6), но не статуса ΔcJun (p = 0.840, F = 0.041, df = 1) и не было значимого взаимодействия (p = 0.982, F = 0.176, df = 6). Точно так же не было значительной разницы в EМакс или ЕС50 значения между мышами с ΔcJun on (EМакс = 23.6 ± 2.6%; ЕС50 = 304 ± 43 nM) или ΔcJun off (EМакс = 26.1 ± 2.5%, p = 0.508; ЕС50 = 611 ± 176 нМ, p = 0.129). Аналогичные результаты были получены для U50,488, так что двухфакторный дисперсионный анализ кривых концентрация-эффект показал значительный эффект концентрации (p <0.0001, F = 11.94, df = 6), но не статуса ΔcJun (p = 0.127 , F = 2.391, df = 1) и не было значимого взаимодействия (p = 0.978, F = 0.190, df = 6). Точно так же не было значительных различий в EМакс или ЕС50 значения между мышами с ΔcJun on (EМакс = 14.8 ± 2.9%; ЕС50 = 211 ± 81 nM) или off (EМакс = 16.7 ± 1.8%, p = 0.597; ЕС50 = 360 ± 151 nM, p = 0.411).

Рисунок 3 

Влияние экспрессии ΔcJun на ингибирование активности аденилатциклазы в NAc. Мембраны из мышей с ΔcJun-экспрессией (ΔcJun on) или контрольной (ΔcJun off) инкубировали в присутствии DAMGO (A), U50,488H (B) или WIN55,212-2 ...

Экспрессия ΔcJun также не оказывала значительного влияния на ингибирование аденилатциклазы в NAc каннабиноидным агонистом. Двусторонний дисперсионный анализ кривых влияния концентрации WIN55,212-2 показал значительный основной эффект концентрации WIN55,212-2 (p <0.0001, F = 15.53, df = 6), но не генотипа (p = 0.066, F = 3.472, df = 1) и значимого взаимодействия не было (p = 0.973, F = 0.208, df = 6). Точно так же не было значительных различий в WIN55,212-2 EМакс значения (13.0 ± 2.3% и 13.6 ± 0.9% ингибирования в ΔcJun против против мышей, соответственно, p = 0.821) и или EC50 значения (208 ± 120 nM и 417 ± 130 nM в ΔcJun против против мышей, соответственно, p = 0.270). Таким образом, несмотря на небольшую тенденцию к снижению активности WIN55,212-2 у мышей, экспрессирующих ΔcJun, трансген не оказывал существенного влияния на ингибирование каннабиноидом аденилатциклазы. Кроме того, не было никакого влияния статуса ΔcJun на базальную или форсколин-стимулированную активность аденилилциклазы. Активность базальной аденилатциклазы составляла 1095 ± 71 пмоль / мг / мин и 1007 ± 77 пмоль / мг / мин (p = 0.403) у мышей с ΔcJun вкл. Или выкл. Соответственно. Активность аденилилциклазы, стимулированная 1 мкМ форсколином, составляла 4185 ± 293 пмоль / мг / мин против 4032 ± 273 пмоль / мг / мин (p = 0.706) у мышей с ΔcJun вкл. Или выкл. Соответственно.

3.4. обсуждение

Результаты этого исследования показали усиленную MOR-опосредованную активацию G-белка и ингибирование аденилилциклазы в NAc мышей с индуцируемой трансгенной экспрессией ΔFosB в диорфине / D1R, содержащие нейроны. KOR-опосредованное ингибирование активности аденилилцилазы также усиливалось у NAc экспрессирующих мышей ΔFosB, предполагая, что ΔFosB регулирует эндогенную опиоидную систему в NAc. DAMGO EМакс значение было больше для стимуляции MOR [35S] GTPγS, и его EC50 значение было ниже для ингибирования аденилилциклазы у мышей, экспрессирующих ΔFosB, по сравнению с контрольными мышами. Эти данные свидетельствуют о возможности наличия рецепторного резерва для эффекторной модуляции, но не активации G-белка в условиях исследования. Обнаружение того, что максимальное ингибирование аденилатциклазы агонистом KOR было затронуто экспрессией ΔFosB, предполагает низкий запас рецепторов для KOR-опосредованного ответа, согласующийся с низкими уровнями сайтов связывания KOR в мозге мыши (Унтервальд и др., 1991). Напротив, CB1R-опосредованная активность G-белка и ингибирование аденилатциклазы не влияли на экспрессию ΔFosB, предполагая, что опиоидные и каннабиноидные системы отличаются в своем ответе на ΔFosB в этих NAc нейронах.

Эффект ΔFosB на опосредованную опиоидным рецептором сигнализацию согласуется с нашим предыдущим сообщением о том, что экспрессия ΔFosB в полосатом теле изменила острые и хронические эффекты морфина (Zachariou, et al., 2006). Одним из результатов этого исследования было то, что мыши с трансгенной экспрессией ΔFosB в динорфине / D1R-полосатые нейроны были более чувствительны к морфину, чем к контрольным. Кроме того, этот эффект был имитирован вирально опосредованной экспрессией ΔFosB с помощью специфичной для сайта инъекции в NAc. Эти наблюдения согласуются с текущими результатами, которые показывают усиленную сигнализацию MOR в NAc.

Ранее мы идентифицировали кодирование генов динорфина в качестве мишени ΔFosB, и предложил, чтобы уменьшенный динорфин соответствовал улучшенным полезным свойствам морфина у бифрангенных мышей ΔFosB (Zachariou, et al., 2006). Настоящие результаты показывают, что KOR-опосредованное ингибирование аденилатциклазы в NAc усиливается у мышей, экспрессирующих ΔFosB, что может отражать компенсаторное увеличение чувствительности KOR после уменьшения диморфина. Предыдущие исследования показали, что KOR был активирован в определенных областях мозга нокаутных мышей prodynorphin, включая NAc (Clarke и др., 2003).

В отличие от ΔFosB, индуцибельной трансгенной экспрессии ΔcJun, доминантный отрицательный усеченный мутант связывающего партнера ΔFosB cJun, не изменял ингибирование аденилилциклазы агонистами MOR или KOR. Эти результаты показывают, что базальные уровни экспрессии ΔFosB, которые являются относительно низкими, не играют существенной роли в поддержании сигнализации опиоидных рецепторов на этом уровне трансдукции сигнала в NAc. Тот факт, что условный полезный эффект морфина был уменьшен выражением ΔcJun в нашем предыдущем исследовании (Zachariou, et al., 2006) предполагает либо, что индукция морфина ΔFosB во время процедуры кондиционирования имеет важное значение для регулирования поведенческих реакций на препарат или что транскрипционные эффекты ΔFosB, отличные от тех, которые влияют на проксимальную сигнализацию опиоидными рецепторами, могут влиять на опиоидную награду. В любом случае результаты настоящего исследования ясно показывают, что, когда экспрессия ΔFosB повышается выше базальных уровней в полосатом динорфине / D1R-экспрессирующие нейроны, происходит устойчивое увеличение связи MOR и KOR с ингибированием аденилилциклазы в NAc.

Механизмы, с помощью которых MOR- и KOR-опосредованная сигнализация усиливаются сверхэкспрессией ΔFosB, неясны, но мы ранее показали, что уровни MOR, оцененные [3H] налоксона, не различаются в NAc ΔFosB у мышей против мышей (Zachariou, et al., 2006). В том же исследовании было установлено, что GαiУровни белка 1 и 2 не были затронуты в этой области выражением ΔFosB. Однако предыдущие анализы массивов экспрессии генов показали, что Gαo мРНК была активирована в NAc ΔFosB на мышах (McClung и Nestler, 2003). В будущих исследованиях будет интересен всесторонний анализ влияния трансгенной экспрессии ΔFosB на экспрессию субъединицы G-белка на уровне белка, а также на экспрессию многих модулирующих белков G-белка.

Интересно, что выражение ΔFosB не улучшало CB1R-опосредованная сигнализация в NAc. Возможно, что изменения в CB1R сигнализация происходит в дискретной популяции нейронов, которая скрыта во всем препарате NAc. Например, введение Δ9- THC значительно индуцировал ΔFosB в ядре, но не в оболочке NAc (Perrotti, et al., 2008). ЯБыло показано, что задача с Δ9-THC после повторного введения Δ9-THC увеличивало высвобождение дофамина в ядре NAc, но уменьшалось высвобождение в оболочке (Cadoni и др., 2008). Также важно отметить, что линия 11A битрансгенных мышей выражает ΔFosB только в динорфине / D1R положительные средние колючие нейроны полосатого тела, но CB1R выражены как в динорфине / D1R и энкефалин / D2R положительных полосатых нейронов (Хохманн и Херкенхем, 2000), а также на терминалах корковых афферентов (Robbe, et al., 2001). Экспрессия доминантного отрицательного регулятора ΔSosB-опосредованной транскрипции ΔcJun также не оказывала существенного влияния на сигнализацию каннабиноидного рецептора, хотя ΔcJun индуцибельно экспрессируется в обеих D1 и D2-содержащие популяции средних колючих нейронов у этих мышей (Peakman, et al., 2003). Возможно, однако, что базальная экспрессия ΔFosB достаточно низка, что ΔcJun не влияет на сигнализацию рецептора, как это было предложено по результатам с MOR и KOR. Возможно также, что CB1R сигнализируется незначительно с помощью базальной экспрессии ΔFosB, так что дальнейшее увеличение экспрессии ΔFosB или блокирование его действий с ΔcJun имеет лишь незначительные эффекты, которые не достигают уровня статистической значимости. Косвенную поддержку этой интерпретации можно увидеть, сравнив WIN55,212-2 EC50 значения между мышами, выражающими ΔcJun по сравнению с ΔFosB. Отношение WIN55,212-2 EC50 значение для ингибирования аденилилциклазы у мышей с индуцированной экспрессией ΔcJun в ее EC50 значение для активации G-белка у мышей с индуцированной экспрессией ΔFosB было 4.0, тогда как одинаковое соотношение у мышей без индукции либо трансгена было 1.2.

Альтернативно, каннабиноиды могут индуцировать экспрессию ΔFosB без какого-либо прямого воздействия на CB1R. В этом случае каннабиноиды могут модулировать реакцию на психоактивные эффекты других лекарств посредством регуляции транскрипции, опосредованной ΔFosB. яn факт, введение Δ9-THC производит кросс-сенсибилизацию к опиоидам и амфетамину (Cadoni и др., 2001, Lamarque, et al., 2001), что согласуется с этой гипотезой. Более того, сообщалось, что повторное введение агониста каннабиноидов CP55,940 увеличивает активацию G-белка, опосредованного MOR, в NAc, аналогично мышам, индуцируемым экспрессией ΔFosB в настоящем исследовании (Vigano и др., 2005). Эффект экспрессии ΔFosB на Δ9-THC-опосредованное поведение не оценивалось, но настоящие результаты не исключают взаимодействия. Результаты этого и нашего предыдущего исследования (Zachariou, et al., 2006) показывают ΔFosB-индуцированные изменения в MOR и KOR / dynorphin в полосатом теле. Благоприятные эффекты Δ9-THC, измеренные по предпочтению места, отменяются у нулевых мышей MOR, тогда как удаление KOR аттенуированных Δ9-THC отвращение и выявлено Δ9-THC место предпочтение (Ghozland, et al., 2002). Аналогично, условное отвращение места к Δ9-THC отсутствует в нокауте про-динорфина по сравнению с мышами дикого типа (Zimmer, et al., 2001). Эти данные показывают, что Δ9-THC может быть более полезным после индукции ΔFosB и последующей индукции передачи сигналов MOR с уменьшением экспрессии динорфина.

В резюмеy, результаты этого исследования показали, что выражение ΔFosB в D1R / dynorphin положительные полосатые нейроны усиливали опосредованную MOR- и KOR-сигнализацию на уровне опосредуемого G-белком ингибирования активности аденилилциклазы в NAc. Этот вывод согласуется с исследованиями, которые продемонстрировали роль эндогенной опиоидной системы в вознаграждении (Trigo, et al., 2010) и обеспечивают потенциальный механизм опосредованного ΔFosB эффектов на вознаграждение, Напротив, CB1R-опосредованная сигнализация в NAc не была в значительной степени подвержена влиянию полосатой ΔFosB в условиях исследования, хотя необходимы дальнейшие исследования для определения влияния индукции ΔFosB на эндоканнабиноидную систему.

Основные результаты исследований

  • Передача сигналов MOR усиливается в ядрах мышей, которые экспрессируют ΔFosB
  • KOR-ингибирование аденилатциклазы также усиливается у мышей, экспрессирующих ΔFosB
  • Выражение ΔFosB не изменяет CB1R-сигнализация в ядре accumbens
Перейти к:

Дополнительный материал

Перейти к:

Благодарности

Авторы благодарят Hengjun He, Jordan Cox и Aaron Tomarchio за техническую помощь с [35S] GTPγS. Это исследование было поддержано грантами USPHS DA014277 (LJS), DA10770 (DES) и P01 DA08227 (EJN).

Перейти к:

Сноски

Отказ от ответственности издателя: Это файл PDF из неотредактированной рукописи, который был принят для публикации. В качестве сервиса для наших клиентов мы предоставляем эту раннюю версию рукописи. Рукопись будет подвергаться копированию, набору и обзору полученного доказательства до его публикации в его окончательной форме. Обратите внимание, что во время производственного процесса могут быть обнаружены ошибки, которые могут повлиять на содержимое, и все юридические заявления об отказе от ответственности, которые применяются к журналу.

Перейти к:

Рекомендации

  • Бозарт М.А., Мудрый Р.А. Анатомически различные опиатные рецепторные поля опосредуют вознаграждение и физическую зависимость. Наука. 1984;224: 516-517. [PubMed]
  • Брэдфорд М.М. Быстрый и чувствительный метод количественного определения количества микрограмм белка с использованием принципа связывания белка с красителем. Анальный. Biochem. 1976;72: 248-254. [PubMed]
  • Breivogel CS, Childers SR, Deadwyler SA, Hampson RE, Vogt LJ, Sim-Selley LJ. Хроническая дельта9-тетрагидроканнабинол приводит к зависящей от времени потере активированных каннабиноидным рецептором G-белков в головном мозге. J. Neurochem. 1999;73: 2447-2459. [PubMed]
  • Breivogel CS, Selley DE, Childers SR. Эффективность агониста каннабиноидного рецептора для стимуляции [35S] GTPγS с мембранами мозжечка крысы коррелирует с агонистическим снижением сродства к ВВП. J. Biol. Химреагент 1998;273: 16865-16873. [PubMed]
  • Cadoni C, Pisanu A, Solinas M, Acquas E, Di Chiara G. Поведенческая сенсибилизация после многократного воздействия Delta 9-тетрагидроканнабинола и кросс-сенсибилизации морфином. Психофармакология (Berl) 2001;158: 259-266. [PubMed]
  • Cadoni C, Valentini V, Di Chiara G. Поведенческая сенсибилизация к дельта 9-тетрагидроканнабинолу и кросс-сенсибилизация с морфином: дифференциальные изменения в аккремальной оболочке и передаче дофамина в сердцевине. J. Neurochem. 2008;106: 1586-1593. [PubMed]
  • Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shookt PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Трансгенные животные с индуцируемой, целевой экспрессией генов в мозге. Mol. Pharmacol. 1998;54: 495-503. [PubMed]
  • Childers SR. Вторичные мессенджеры, связанные с опиоидным рецептором. Life Sci. 1991;48: 1991-2003. [PubMed]
  • Childers SR, Fleming L, Konkoy C, Marckel D, Pacheco M, Sexton T, Ward S. Опиоид и ингибирование каннабиноидного рецептора аденилатциклазы в головном мозге. Энн. NY Acad. Научно. 1992;654: 33-51. [PubMed]
  • Childers SR, Xiao R, Vogt LJ, Sim-Selley LJ. Стимулирование опиоидного рецептора каппа [35S] GTPγS в мозге морской свинки: отсутствие доказательств для каппа2-селективная активация G-белков. Biochem. Pharmacol. 1998;56: 113-120. [PubMed]
  • Clarke S, Zimmer A, Zimmer AM, Hill RG, Kitchen I. Областная избирательная регуляция микро-, дельта- и каппа-опиоидных рецепторов, но не рецептор-рецепторы 1, подобные опиоидным рецепторам, в мозге мышей с энкефалином и динорфином. Neuroscience. 2003;122: 479-489. [PubMed]
  • Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Струйная клеточная специфическая избыточная экспрессия DeltaFosB усиливает стимул для кокаина. J. Neurosci. 2003;23: 2488-2493. [PubMed]
  • Гарднер Э.Л. Эндоканнабиноидная сигнальная система и мозговая награда: акцент на допамин. Pharmacol. Biochem. Behav. 2005;81: 263-284. [PubMed]
  • Ghozland S, Matthes HW, Simonin F, Filliol D, Kieffer BL, Maldonado R. Мотивационные эффекты каннабиноидов опосредуются му-опиоидными и каппа-опиоидными рецепторами. J. Neurosci. 2002;22: 1146-1154. [PubMed]
  • Herkenham M, Lynn AB, Johnson MR, Melvin LS, de Costa BR, Rice KC. Характеризация и локализация каннабиноидных рецепторов в мозге крыс: количественное аурадиографическое исследование in vitro. J. Neurosci. 1991;11: 563-583. [PubMed]
  • Hohmann AG, Herkenham M. Локализация мРНК рецептора каннабиноидной CB (1) в нейронных субпопуляциях стриатума крысы: двухмерное исследование гибридизации in situ. Synapse. 2000;37: 71-80. [PubMed]
  • Howlett AC, Barth F, Bonner TI, Cabral G, Casellas P, Devane WA, Felder CC, Herkenham M, Mackie K, Martin BR, Mechoulam R, Pertwee RG. Международный союз фармакологии. XXVII. Классификация каннабиноидных рецепторов. Фармакологическое обозрение. 2002;54: 161-202.
  • Хуэстис М.А., Горелик Д.А., Хейшман С.Я., Престон К.Л., Нельсон Р.А., Мулчан Э.Т., Франк Р.А. Блокада эффектов копченой марихуаны с помощью CB1-селективного антагониста каннабиноидных рецепторов SR141716. Архипелаг Ген. Психиатрия. 2001;58: 322-328. [PubMed]
  • Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Выражение фактора транскрипции deltaFosB в мозге контролирует чувствительность к кокаину. Природа. 1999;401: 272-276. [PubMed]
  • Кооб Г.Ф., Волков Н.Д. Нейроциркуляция наркомании. Neuropsychopharmacology. 2010;35: 217-238. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Lamarque S, Taghzouti K, Simon H. Хроническое лечение Delta (9) -тетрагидроканнабинолом усиливает локомоторный ответ на амфетамин и героин. Последствия для уязвимости к наркомании. Нейрофармакология. 2001;41: 118-129. [PubMed]
  • Maldonado R, Valverde O, Berrendero F. Вовлечение эндоканнабиноидной системы в наркоманию. Тенденции Neurosci. 2006;29: 225-232. [PubMed]
  • Mansour A, Fox CA, Thompson RC, Akil H, Watson SJ. экспрессию мРНК мю-опиоидных рецепторов в ЦНС крысы: сравнение с связыванием му-рецептора. Brain Res. 1994;643: 245-265. [PubMed]
  • Matthes HWD, Maldonado R, Simonin F, Valverde O, Slowe S, кухня I, Befort K, Dierich A, LeMeur M, Dolle P, Tzavara E, Hanoune J, Roques BP, Kieffer BL. Потеря индуцированной морфином аналгезии, эффекта вознаграждения и симптомов отмены у мышей, у которых отсутствует ген μ-опиоидного рецептора. Природа. 1996;383: 819-823. [PubMed]
  • McClung CA, Nestler EJ. Регулирование экспрессии генов и вознаграждение кокаина CREB и DeltaFosB. Туземный Neurosci. 2003;6: 1208-1215. [PubMed]
  • McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: молекулярный переключатель для долговременной адаптации в мозге. Brain Res. Mol. Brain Res. 2004;132: 146-154. [PubMed]
  • Мюллер Д.Л., Унтервальд Э.М. D1-дофаминовые рецепторы модулируют дельта-FosB-индукцию в стриатуме крысы после прерывистого введения морфина. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005;314: 148-154. [PubMed]
  • Nestler EJ. Обзор. Транскрипционные механизмы зависимости: роль DeltaFosB. Philos. Сделка R. Soc. Лонд. B. Biol. Sci. 2008;363: 3245-3255. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Nestler EJ, Kelz MB, Chen J. DeltaFosB: молекулярный медиатор долговременной нейронной и поведенческой пластичности. Brain Res. 1999;835: 10-17. [PubMed]
  • Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Фармакологические исследования регуляции хронической FOS-связанной антигенной индукции кокаином в стриатуме и ядре accumbens. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1995;275: 1671-1680. [PubMed]
  • Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Индуцибельная экспрессия доминантного отрицательного мутанта c-Jun у трансгенных мышей снижает чувствительность к кокаину. Brain Res. 2003;970: 73-86. [PubMed]
  • Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Отличительные закономерности индукции DeltaFosB в головном мозге наркотиками. Synapse. 2008;62: 358-369. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Robbe D, Alonso G, Duchamp F, Bockaert J, Manzoni OJ. Локализация и механизмы действия каннабиноидных рецепторов в глутаматергических синапсах ядра ядра мыши. J. Neurosci. 2001;21: 109-116. [PubMed]
  • Саломон Y. Аденилатциклазный анализ. Adv. Cyclic Nucleotide Res. 1979;10: 35-55. [PubMed]
  • Selley DE, Sim LJ, Xiao R, Liu Q, Childers SR. Му опиоидный рецептор-стимулированный [35S] GTPγS в таламусе крыс и культивируемых клеточных линиях: механизмы трансдукции сигналов, влияющие на эффективность агониста. Mol. Pharmacol. 1997;51: 87-96. [PubMed]
  • Trigo JM, Martin-Garcia E, Berrendero F, Robledo P, Maldonado R. Эндогенная опиоидная система: общий субстрат при наркомании. Наркотик Алкоголь. 2010;108: 183-194. [PubMed]
  • Унтервальд Е.М., Кнапп С., Зукин Р.С. Нейроанатомическая локализация опиоидных рецепторов κ1 и κ2 в головном мозге крысы и морской свинки. Brain Res. 1991;562: 57-65. [PubMed]
  • Vaccarino FJ, Bloom FE, Koob GF. Блокада ядовитых опиатных рецепторов ослабляет внутривенное назначение героина у крысы. Психофармакология (Berl) 1985;86: 37-42. [PubMed]
  • Vigano D, Rubino T, Vaccani A, Bianchessi S, Marmorato P, Castiglioni C, Parolaro D. Молекулярные механизмы, участвующие в асимметричном взаимодействии между каннабиноидной и опиоидной системами. Психофармакология (Berl) 2005;182: 527-536. [PubMed]
  • Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Существенная роль DeltaFosB в прилежании ядра при действии морфина. Туземный Neurosci. 2006;9: 205-211. [PubMed]
  • Zangen A, Solinas M, Ikemoto S, Goldberg SR, Wise RA. Два участка мозга для награды каннабиноидами. J. Neurosci. 2006;26: 4901-4907. [PubMed]
  • Zhu J, Luo LY, Li JG, Chen C, Liu-Chen LY. Активация клонированного человеческого каппа-опиоидного рецептора агонистами усиливает связь [35S] GTPγS с мембранами: определение потенций и эффективности лигандов. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997;282: 676-684. [PubMed]
  • Zimmer A, Valjent E, Konig M, Zimmer AM, Robledo P, Hahn H, Valverde O, Maldonado R. Отсутствие дельта-9-тетрагидроканнабиноловых дисфорических эффектов у мышей с дефицитом диорфина. J. Neurosci. 2001;21: 9499-9505. [PubMed]
  • Циммер А, Циммер А.М., Хохманн А.Г., Херкенхам М., Боннер Т.И. Повышенная смертность, гипоактивность и гипоальгезия у мышей с нокаутом рецептора CBNNUMX cannabinoid. Труды. Natl. Акад. Научно. США 1999;96: 5780-5785. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]