Влияние избыточной экспрессии ΔFosB на опосредованную опиоидом и каннабиноидным рецептором сигнализацию в ядре accumbens (2011)

Нейрофармакология. 2011 дек;61(8):1470-6. doi: 10.1016/j.neuropharm.2011.08.046.

Сим-Селли Л.Дж. , Кэссиди М.П. , ​​Спарта А. , Захариу В. , Нестлер Э.Дж. , Селли Д.Э.

Источник

Отделение фармакологии и токсикологии и Институт исследований наркотиков и алкоголя, Медицинская школа Университета штата Вирджиния, Ричмонд, VA 23298, США.

Резюме

Стабильный транскрипционный фактор ΔFosB индуцируется в прилежащем ядре (NAc) при хроническом воздействии нескольких наркотических веществ, а трансгенная экспрессия ΔFosB в полосатом теле усиливает вознаграждающие свойства морфина и кокаина . Однако механистическая основа этих наблюдений изучена не полностью. Мы использовали битрансгенную модель мышей с индуцируемой экспрессией ΔFosB в нейронах полосатого тела, содержащих дофаминовый рецептор D(1)/динорфин, чтобы определить влияние экспрессии ΔFosB на передачу сигналов опиоидных и каннабиноидных рецепторов в NAc. Результаты показали, что активность G-белка, опосредованная μ-опиоидами, и ингибирование аденилатциклазы были усилены в NAc мышей, экспрессирующих ΔFosB. Аналогично, ингибирование аденилатциклазы κ-опиоидами было усилено у мышей, экспрессирующих ΔFosB . Напротив, передача сигналов, опосредованная каннабиноидными рецепторами, не различалась между мышами с избыточной экспрессией ΔFosB и контрольными мышами. Эти результаты свидетельствуют о том, что передача сигналов опиоидными и каннабиноидными рецепторами модулируется экспрессией ΔFosB по-разному, и указывают на то, что экспрессия ΔFosB может оказывать некоторые из своих эффектов посредством усиления передачи сигналов мю- и каппа-опиоидных рецепторов в прилежащем ядре.

Ключевые слова: G-белок, аденилилциклаза, стриатум
Перейти к:

1. Введение

Опиоидные рецепторы и каннабиноидный CB1 рецепторы (CB1R) являются нейробиологическими мишенями для двух широко используемых классов лекарств, которые включают морфины, героины и опиоиды по рецепту и марихуану (Δ9-тетрагидроканнабинол (ТГК)), соответственно. Острые эффекты опиоидов и каннабиноидов опосредуются рецепторами, связанными с G-белком, которые активируют главным образом GI / O белков и продуцировать последующие эффекторные реакции, такие как ингибирование аденилатциклазы (Childers, 1991, Чайлдерс и др., 1992, Howlett, et al., 2002). Мотор, ухудшение памяти и психоактивные эффекты Δ9-THC производятся CB1Р (Huestis и др., 2001, Zimmer, et al., 1999), которые широко распространены в головном мозге, с высокими уровнями в базальных ганглиях, гиппокампе и мозжечке (Herkenham, et al., 1991). Обезболивающее и полезное действие большинства клинически значимых и злоупотребляемых опиоидных препаратов опосредовано в основном му опиоидными рецепторами (MOR) (Matthes, et al., 1996), которые обогащены лимбической системой и мозговым стволом (Mansour, et al., 1994). Мезолимбическая система, состоящая из дофаминергических проекций от брюшной тегментальной области (VTA) до ядра accumbens (NAc), играет важную роль в положительном эффекте опиоидов и каннабиноидов (Bozarth and Wise, 1984, Vaccarino, et al., 1985, Zangen, et al., 2006), а также другие наркотические средства (Кооб и Волков, 2010). Кроме того, эндогенные опиоидные и каннабиноидные системы вовлечены в полезное действие нескольких классов психоактивных препаратов (Maldonado, et al., 2006, Trigo, et al., 2010). Таким образом, важно выяснить механизмы, с помощью которых опиоид и CB1R сигнализируются в NAc.

В центре внимания в области изучения наркомании находится вопрос идентификации белков, опосредующих переход от острых к долговременным эффектам психоактивных веществ. Транскрипционный фактор AP-1 ΔFosB представляет особый интерес, поскольку это стабильный усеченный сплайс-вариант продукта гена fosb , который накапливается при повторном воздействии наркотических веществ или естественных вознаграждений ( McClung et al., 2004 , Nestler, 2008 , Nestler et al., 1999 ). Мы обнаружили, что ΔFosB индуцируется в мозге после повторного воздействия морфина, Δ9 - THC, кокаина или этанола, причем каждый препарат вызывает уникальный региональный паттерн экспрессии ΔFosB ( Perrotti et al., 2008 ). В ходе исследования было установлено, что экспрессия ΔFosB значительно усиливалась в полосатом теле, при этом все четыре препарата индуцировали экспрессию ΔFosB в ядре прилежащего ядра, а все, кроме Δ9 - THC, значительно усиливали экспрессию в оболочке прилежащего ядра и хвостатом ядре и скорлупе.

Фармакологические исследования показали, что совместное введение допамина D1 рецептор (D1R) SCH 23390 блокировал индукцию ΔFosB в NAc и каудат-путамене после прерывистого введения кокаина или морфина, что указывает на потенциальную важность D1R-экспрессирующие нейроны (Мюллер и Унтервальд, 2005, Nye, et al., 1995). Влияние индукции ΔFosB на лекарственное опосредованное поведение было исследовано с использованием битрансгенных мышей, которые экспрессируют ΔFosB в специфических нейронных популяциях NAc и дорзальной полосатой (Chen, et al., 1998). Мыши, которые экспрессируют ΔFosB в динорфине / D1R положительных нейронов в NAc и дорзальном полосатом (линия 11A) показывают измененные ответы на наркотики, особенно повышенную чувствительность к полезным эффектам кокаина или морфина (Colby, et al., 2003, Kelz и др., 1999, Zachariou, et al., 2006). Эти изменения произошли в отсутствие изменений уровней MOR или различных субъединиц G-белка. Тем не менее, уровни мРНК диорфина были снижены в NAc мыши, экспрессирующих ΔFosB (Zachariou, et al., 2006), предполагая, что одна мишень ΔFosB представляет собой ген, кодирующий эндогенный опиоидный пептид. Индукция ΔFosB также может приводить к поведенческим изменениям, регулируя рецепторную сигнализацию в NAc, но эта возможность не исследовалась. Поэтому в настоящих исследованиях использовалась модель битрансгенной мыши, чтобы определить, является ли сверхэкспрессия ΔFosB в динорфине / D1R, содержащие стриатальные нейроны, изменяет активность M-опосредованного G-белка и MOR- и KOR-опосредованное ингибирование аденилилциклазы в NAc. Эффект ΔFosB на CB1R-опосредованную активность G-белка также оценивали, поскольку Δ9-THC индуцирует ΔFosB в NAc (Perrotti, et al., 2008) и эндоканнабиноидная система, как известно, регулирует цепи вознаграждения мозга (Гарднер, 2005, Maldonado, et al., 2006), но эффект ΔFosB на эндоканнабиноидную систему не исследовался.

Перейти к:

2. Материалы и методы

2.1. Реактивы

[ 35S ]GTPγS (1250 Ки/ммоль), [α- 32P ]ATP (800 Ки/ммоль) и [ 3H ]cAMP (26.4 Ки/ммоль) были приобретены у компании PerkinElmer (Шелтон, Коннектикут). АТФ, ГТФ, ГДФ, цАМФ, бычий сывороточный альбумин, креатинфосфокиназа, папаверин, имидазол и WIN-55212-2 были приобретены у компании Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури). GTPγS был приобретен у компании Roche Diagnostic Corporation (Чикаго, Иллинойс). DAMGO был предоставлен Программой снабжения лекарственными средствами Национального института по борьбе со злоупотреблением наркотиками (Роквилл, Мэриленд). Сцинтилляционная жидкость Econo-1 была получена от компании Fisher Scientific (Норкросс, Джорджия). Сцинтилляционная жидкость Ecolite была получена от компании ICN (Коста-Меса, Калифорния). Все остальные химические реактивы были получены от компаний Sigma Aldrich или Fisher Scientific.

2.2. мышей

Самцы битрансгенных мышей, полученные из NSE-tTA (линия A) × TetOp-ΔFosB (линия 11), были созданы, как описано в работе Kelz et al. ( Kelz, et al., 1999 ). Битрансгенные мыши были зачаты и выращены на доксициклине (100 мкг в питьевой воде) для подавления экспрессии трансгена. В возрасте 8 недель доксициклин был исключен из воды для половины мышей, чтобы обеспечить экспрессию трансгена, тогда как оставшиеся мыши продолжали получать доксициклин для подавления трансгена. Мозг был собран через 8 недель, в то время, когда транскрипционные эффекты ΔFosB достигают максимума ( McClung и Nestler, 2003 ). Была использована вторая трансгенная линия мышей, в которой Δc-Jun, доминантный негативный антагонист c-Jun, экспрессируется в клетках D1R /динорфин и D2R / энкефалин полосатого тела, гиппокампа и теменной коры ( Peakman et al., 2003 ). c-Jun и родственные белки семейства Jun димеризуются с белками семейства Fos и связываются с сайтом AP-1 целевых генов, регулируя транскрипцию. Однако усечение N-конца c-Jun (Δc-Jun) делает комплекс транскрипционно неактивным и способным препятствовать связыванию ДНК активных комплексов AP-1. Самцы битрансгенных мышей, полученные из NSE-tTA (линия A) × TetOp-FLAG-Δc-Jun (линия E), были созданы, как описано в работе Peakman et al. ( Peakman et al., 2003 ). Битрансгенные мыши были зачаты и выращены на доксициклине (100 мкг в питьевой воде) для подавления экспрессии трансгена. Щенков отнимали от матери в возрасте 3 недель, проводили генотипирование и разделяли на группы: половина получала воду, содержащую доксициклин, а половина — обычную питьевую воду для индукции экспрессии FLAG-Δc-Jun. Мозг собирали через 6 недель, когда были измерены максимальные уровни FLAG-Δc-Jun ( Peakman et al., 2003 ). Все процедуры с животными проводились в соответствии с Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных.

2.3. Подготовка мембран

Мозги хранились при −80°C до дня проведения анализа. Перед анализом каждый мозг размораживали, а прилежащее ядро ​​(NAc) выделяли на льду. Каждый образец гомогенизировали в 50 мМ Трис-HCl, 3 мМ MgCl₂ , 1 мМ EGTA, pH 7.4 (мембранный буфер) 20 раз стеклянным гомогенизатором при 4°C. Гомогенат центрифугировали при 2 48,000 × g при 4°C в течение 10 мин, ресуспендировали в мембранном буфере, снова центрифугировали при 48,000 2 × g при 4°C в течение 10 мин и ресуспендировали в 50 мМ Трис-HCl, 3 мМ MgCl₂ , 0.2 мМ EGTA, 100 мМ NaCl, pH 7.4 (буфер для анализа). Уровень белка определяли методом Брэдфорда ( Bradford, 1976 ) с использованием бычьего сывороточного альбумина (BSA) в качестве стандарта.

2.4. Агонист-стимулированный [35S] GTPγS Binding

Мембраны предварительно инкубировали в течение 10 минут при 30°C с аденозин-дезаминазой (3 мЕд/мл) в буфере для анализа. Затем мембраны (5–10 мкг белка) инкубировали в течение 2 часов при 30°C в буфере для анализа, содержащем 0.1% (вес/объем) БСА, 0.1 нМ [ 35S ]GTPγS, 30 мкМ ГДФ и аденозин-дезаминазу (3 мЕд/мл) с соответствующими концентрациями DAMGO или WIN55,212-2 и без них. Неспецифическое связывание измеряли с помощью 20 мкМ GTPγS. Инкубацию прекращали фильтрацией через стекловолоконные фильтры GF/B, после чего проводили 3 промывки 3 мл ледяного 50 мМ Трис-HCl, pH 7.4. Связанная радиоактивность определялась методом жидкостной сцинтилляционной спектрофотометрии после ночной экстракции фильтров в сцинтилляционной жидкости Econo-1.

2.5. Анализ аденилилциклазы

Мембраны (5–25 мкг белка) предварительно инкубировали с аденозин-дезаминазой, как описано выше, затем инкубировали в течение 15 мин при 30°C в присутствии или отсутствии 1 мкМ форсколина, с или без DAMGO, U50,488H или WIN55,212-2, в буфере для анализа, содержащем 50 мкМ АТФ, [α- 32P ]АТФ (1.5 мкКи), 0.2 мМ ДТТ, 0.1% (вес/объем) БСА, 50 мкМ циклического АМФ, 50 мкМ ГТФ, 0.2 мМ папаверина, 5 мМ фосфокреатина, 20 ед/мл креатинфосфокиназы и аденозин-дезаминазу (3 мЕд/мл) в конечном объеме 100 мкл. В этих условиях общее количество [α- 32P ]цАМФ, как правило, составляло менее 1% от общего количества добавленного [α- 32P ]АТФ в каждом образце. Реакцию останавливали кипячением в течение 3 минут, а [ 32P ]циклический АМФ выделяли методом двухколоночной хроматографии (Dowex и оксид алюминия) по Саломону ( Salomon, 1979 ). [ 3H ]цАМФ (10 000 дпм) добавляли в каждую пробирку перед колоночной хроматографией в качестве внутреннего стандарта. Радиоактивность определяли методом жидкостной сцинтилляционной спектрофотометрии (эффективность 45% для 3H ) после растворения 4.5 мл элюата в 14.5 мл сцинтилляционной жидкости Ecolite.

2.6. Анализ данных

Если не указано иное, данные представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка по результатам 4–8 отдельных экспериментов, каждый из которых проводился в трех повторениях. Чистое стимулированное связывание [ 35S ]GTPγS рассчитывается как связывание, стимулированное агонистом, минус базальное связывание. Чистая активность аденилатциклазы, стимулированная форсколином, определяется как активность, стимулированная форсколином, – базальная активность (пмоль/мг/мин). Процент ингибирования активности аденилатциклазы, стимулированной форсколином, определяется как (чистая активность, стимулированная форсколином, в отсутствие агониста – чистая активность, стимулированная форсколином, в присутствии агониста / чистая активность, стимулированная форсколином, в отсутствие агониста) × 100. Все аппроксимации кривых и статистический анализ проводились с использованием Prism 4.0c (GraphPad Software, Inc., Сан-Диего, Калифорния). Кривые зависимости концентрация-эффект анализировались с помощью итеративной нелинейной регрессии для получения значений EC50 и Emax . Статистическая значимость данных зависимости концентрация-эффект определялась с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA), используя дозу агониста и индукцию гена (включено или выключено) в качестве основных факторов. Статистическая значимость значений аппроксимации кривой (Emax или EC50 ) определялась с помощью непарного двухстороннего t-критерия Стьюдента, используя поправку Уэлча или преобразование квадратного корня данных, где это необходимо для коррекции неравных дисперсий (выявленных с помощью F-критерия) в значениях EC50.

Перейти к:

3. Результаты

3.1. Влияние экспрессии ΔFosB на опиоидную и каннабиноидную рецепторную активацию G-белка

Чтобы определить, изменяется ли активация G-белка, опосредованная MOR или CB1R, при индуцируемой трансгенной экспрессии ΔFosB в NAc, было исследовано связывание [35S]GTPγS, стимулированное агонистом, в изолированных мембранах, приготовленных из этой области битрансгенных мышей, условно экспрессирующих (ΔFosB включен) или не экспрессирующих (ΔFosB выключен) трансген ΔFosB. Для активации MOR использовали селективный аналог энкефалина DAMGO, а для активации CB1R — каннабиноидный аминоалкилиндол WIN55,212-2. Ранее было показано, что эти лиганды являются полными агонистами MOR и CB1R соответственно ( Breivogel et al., 1998 , Selley et al., 1997 ). Было невозможно исследовать активность G-белка, опосредованную KOR, поскольку сигнал слишком слаб в мозге грызунов ( Childers et al., 1998 ). Результаты показали зависимую от концентрации стимуляцию активности G-белка как DAMGO, так и WIN55,122-2 в NAc у мышей с ΔFosB off и ΔFosB on ( рис. 1 ). Для активности, стимулированной DAMGO ( рис. 1A ), двухфакторный дисперсионный анализ данных о зависимости эффекта от концентрации выявил значимые основные эффекты статуса ΔFosB (p<0.0001, F=22.12, df=1) и концентрации DAMGO (p<0.0001, F=29.65, df=5) без значимого взаимодействия (p=0.857, F=0.387, df=5). Нелинейный регрессионный анализ кривых зависимости эффекта от концентрации выявил значительно большее значение Emax DAMGO у мышей с ΔFosB (Emax = 73 ± 5.2% стимуляции) по сравнению с мышами без ΔFosB (Emax = 56 ± 4.1% стимуляции; p<0.05, отличается от мышей с ΔFosB по t-критерию Стьюдента). Значения EC50 DAMGO не отличались у мышей с ΔFosB и без ΔFosB (302 ± 72 нМ против 212 ± 56 нМ соответственно, p = 0.346).

Рисунок 1 

Влияние экспрессии ΔFosB на стимулированный агонистом [35S] GTPγS в NAc. Мембраны из экспрессирующих ΔFosB (ΔFosB on) или контрольных (ΔFosB off) мышей анализировали, как описано в Методах с использованием различных концентраций ...

В отличие от результатов, полученных с агонистом MOR DAMGO, при использовании каннабиноидного агониста WIN55,212-2 не наблюдалось различий в активации G-белка, зависящих от статуса ΔFosB ( рис. 1B ). Двухфакторный дисперсионный анализ данных о зависимости эффекта от концентрации WIN55,212-2 выявил значимый основной эффект концентрации WIN55,212-2 (p < 0.0001, F = 112.4, df = 7), но не статуса ΔFosB (p = 0.172, F = 1.90, df = 1), и не было взаимодействия (p = 0.930, F = 0.346, df = 7). Аналогично, статус ΔFosB не оказывал влияния на значения E max WIN55,212-2 (103 ± 6% против 108 ± 8% стимуляции у мышей с ΔFosB и без него соответственно, p = 0.813 по t-критерию Стьюдента) или значения EC50 ( 103 ± 20 нМ против 170 ± 23 нМ у мышей с ΔFosB и без него соответственно, p = 0.123).

На основании формы кривых и того факта, что наши предыдущие исследования показали двухфазные кривые зависимости концентрации WIN55,212-2 от эффекта в головном мозге ( Breivogel et al., 1999 , Breivogel et al., 1998 ), кривые WIN55,212-2 также были проанализированы с использованием двухсайтовой модели. Анализ усредненных данных показал небольшое улучшение качества подгонки при использовании двухсайтовой модели (R² = 0.933 и 0.914, сумма квадратов = 3644 и 5463 у мышей с ΔFosB на и без него, соответственно) по сравнению с односайтовой моделью (R² = 0.891 и 0.879, сумма квадратов = 6561 и 6628 у мышей с ΔFosB на и без него, соответственно). Однако существенных различий между мышами с активированным и неактивным ΔFosB обнаружено не было ни по значениям E max , ни по значениям EC 50 для участков высокой и низкой активности ( дополнительная таблица 1 ), хотя наблюдалась тенденция к более низкому значению EC 50 для участка высокой активности у мышей с активированным ΔFosB (EC 50 high = 28.0 ± 10.6 нМ) по сравнению с мышами с неактивным ΔFosB (EC 50 high = 71.5 ± 20.2 нМ; p = 0.094). Более того, статус ΔFosB не влиял на базальное связывание [ 35S ]GTPγS в мембранах NAc (253 ± 14 против 226 ± 14 фмоль/мг у мышей с активированным и неактивным ΔFosB соответственно, p = 0.188). Эти данные указывают на то, что индуцируемая трансгенная экспрессия ΔFosB в прилежащем ядре мышей увеличивала активацию G-белка, опосредованную MOR, без существенного влияния на активность G-белка , опосредованную CB1R, или на базальную активность G-белка.

3.2. Влияние ΔFosB на опосредованное опиоидом и каннабиноидным рецептором ингибирование аденилатциклазы

Для оценки влияния индуцируемой трансгенной экспрессии ΔFosB на модуляцию активности нижестоящих эффекторов MOR и CB1R было исследовано ингибирование активности аденилатциклазы, стимулированной 1 мкМ форсколином, в мембранах NAc. В дополнение к ингибированию активности аденилатциклазы, опосредованному MOR и CB1R , были также изучены эффекты активности KOR с использованием селективного полного агониста KOR U50,488 ( Zhu et al., 1997 ), поскольку предыдущие результаты показали, что мРНК динорфина является мишенью ΔFosB в битрансгенной модели ( Zachariou et al., 2006 ). Результаты показали, что DAMGO, U50,488 и WIN55,212-2 вызывали зависимое от концентрации ингибирование активности аденилатциклазы как у мышей с отключенным ΔFosB, так и у мышей с включенным ΔFosB ( рис. 2 ). Двухфакторный дисперсионный анализ данных о зависимости эффекта от концентрации DAMGO ( рис. 2A ) выявил значимые основные эффекты статуса ΔFosB (p = 0.0012, F = 11.34, df = 1) и концентрации DAMGO (p < 0.0001, F = 29.61, df = 6), но не выявил значимого взаимодействия (p = 0.441, F = 0.986, df = 6). Нелинейный регрессионный анализ кривых зависимости эффекта от концентрации DAMGO выявил значительно более низкое значение EC50 DAMGO у мышей с ΔFosB (101 ± 11 нМ) по сравнению с мышами без ΔFosB (510 ± 182 нМ, p < 0.05 по t-критерию Стьюдента). Однако не было существенной разницы в значениях Emax DAMGO (20.9 ± 1.26% против 19.8 ± 1.27% ингибирования у мышей с ΔFosB и без ΔFosB соответственно, p = 0.534).

Рисунок 2 

Влияние экспрессии ΔFosB на ингибирование активности аденилилциклазы в NAc. Мембраны из экспрессирующих ΔFosB (ΔFosB on) или контрольных (ΔFosB off) мышей анализировали, как описано в Методах в присутствии 1 мкМ ...

Ингибирование аденилатциклазы, опосредованное KOR, также различалось в зависимости от индуцируемой трансгенной экспрессии ΔFosB ( рис. 2B ). Двухфакторный дисперсионный анализ данных о зависимости эффекта от концентрации U50,488 показал значимые основные эффекты статуса ΔFosB (p = 0.0006, F = 14.53, df = 1) и концентрации U50,488 (p < 0.0001, F = 26.48, df = 3), без значимого взаимодействия (p = 0.833, F = 0.289, df = 3). Нелинейный регрессионный анализ кривых зависимости эффекта от концентрации выявил более высокое значение Emax U50,488 у мышей с ΔFosB (18.3 ± 1.14% ингибирования) по сравнению с мышами без ΔFosB (12.5 ± 2.03% ингибирования; p < 0.05, отличается от ΔFosB у мышей с ΔFosB по t-критерию Стьюдента), при этом не было существенной разницы в значениях EC50 U50,488 ( 310 ± 172 нМ против 225 ± 48 нМ у мышей с ΔFosB и без ΔFosB соответственно, p = 0.324).

В отличие от эффектов, наблюдаемых с MOR и KOR, не было обнаружено значимого влияния индуцируемой трансгенной экспрессии ΔFosB на ингибирование аденилатциклазы каннабиноидным агонистом WIN55212-2 ( рис. 2C ). Двухфакторный дисперсионный анализ данных о зависимости эффекта от концентрации WIN55,212-2 показал значимое влияние концентрации препарата (p < 0.0001, F = 23.6, df = 2), но не статуса ΔFosB (p = 0.735, F = 0.118, df = 1), а также не было обнаружено значимого взаимодействия (p = 0.714, F = 0.343, df = 2). Кроме того, не было обнаружено влияния статуса ΔFosB на базальную или стимулированную форсколином активность аденилатциклазы в отсутствие какого-либо агониста. Базовая активность аденилатциклазы составляла 491 ± 35 пмоль/мг/мин у мышей с дефицитом ΔFosB по сравнению с 546 ± 44 пмоль/мг/мин у мышей без дефицита ΔFosB (p = 0.346 по t-критерию Стьюдента). Аналогично, активность аденилатциклазы в присутствии 1 мкМ форсколина составляла 2244 ± 163 пмоль/мг/мин у мышей с дефицитом ΔFosB против 2372 ± 138 пмоль/мг/мин у мышей без дефицита ΔFosB (p = 0.555).

3.3. Влияние ΔcJun на опосредованное опиоидом и каннабиноидным рецептором ингибирование аденилатциклазы

Поскольку индуцируемая трансгенная экспрессия ΔFosB усиливала ингибирующую передачу сигнала от MOR и KOR к аденилатциклазе в прилежащем ядре, было интересно определить, будет ли доминантный негативный ингибитор транскрипции, опосредованной ΔFosB, модулировать передачу сигнала опиоидных рецепторов противоположным образом. Для решения этого вопроса было исследовано ингибирование активности аденилатциклазы, стимулированной форсколином, с помощью DAMGO и U50,488 в мембранах, приготовленных из прилежащего ядра битрансгенных мышей, условно экспрессирующих ΔcJun. Результаты показали отсутствие значительного влияния экспрессии ΔcJun на ингибирование активности аденилатциклазы MOR или KOR ( рис. 3 ). Двухфакторный дисперсионный анализ кривых зависимости эффекта от концентрации DAMGO показал значимый основной эффект концентрации DAMGO (p < 0.0001, F = 20.26, df = 6), но не статуса ΔcJun (p = 0.840, F = 0.041, df = 1), и не было значимого взаимодействия (p = 0.982, F = 0.176, df = 6). Аналогично, не было значимой разницы в значениях E max или EC 50 между мышами с включенным ΔcJun (E max = 23.6 ± 2.6%; EC 50 = 304 ± 43 нМ) или выключенным ΔcJun (E max = 26.1 ± 2.5%, p = 0.508; EC 50 = 611 ± 176 нМ, p = 0.129). Аналогичные результаты наблюдались и с U50,488: двухфакторный дисперсионный анализ кривых зависимости эффекта от концентрации показал значительный эффект концентрации (p < 0.0001, F = 11.94, df = 6), но не статуса ΔcJun (p = 0.127, F = 2.391, df = 1), и не было значимого взаимодействия (p = 0.978, F = 0.190, df = 6). Аналогично, не было существенных различий в значениях E max или EC 50 между мышами с включенным ΔcJun (E max = 14.8 ± 2.9%; EC 50 = 211 ± 81 нМ) и выключенным (E max = 16.7 ± 1.8%, p = 0.597; EC 50 = 360 ± 151 нМ, p = 0.411).

Рисунок 3 

Влияние экспрессии ΔcJun на ингибирование активности аденилатциклазы в NAc. Мембраны из мышей с ΔcJun-экспрессией (ΔcJun on) или контрольной (ΔcJun off) инкубировали в присутствии DAMGO (A), U50,488H (B) или WIN55,212-2 ...

Экспрессия ΔcJun также не оказала существенного влияния на ингибирование аденилатциклазы в прилежащем ядре каннабиноидным агонистом. Двухфакторный дисперсионный анализ кривых зависимости эффекта от концентрации WIN55,212-2 показал значительный основной эффект концентрации WIN55,212-2 (p < 0.0001, F = 15.53, df = 6), но не генотипа (p = 0.066, F = 3.472, df = 1), и не было значимого взаимодействия (p = 0.973, F = 0.208, df = 6). Аналогично, не было существенных различий в значениях E max WIN55,212-2 (13.0 ± 2.3% и 13.6 ± 0.9% ингибирования у мышей с ΔcJun и без него соответственно, p = 0.821) и/или значениях EC50 ( 208 ± 120 нМ и 417 ± 130 нМ у мышей с ΔcJun и без него соответственно, p = 0.270). Таким образом, хотя наблюдалась небольшая тенденция к снижению эффективности WIN55,212-2 у мышей, экспрессирующих ΔcJun, трансген не оказал существенного влияния на ингибирование аденилатциклазы каннабиноидами. Более того, статус ΔcJun не влиял на базальную или стимулированную форсколином активность аденилатциклазы. Базовая активность аденилатциклазы составляла 1095 ± 71 пмоль/мг/мин и 1007 ± 77 пмоль/мг/мин (p = 0.403) у мышей с включенным и выключенным ΔcJun соответственно. Активность аденилатциклазы, стимулированная 1 мкМ форсколина, составляла 4185 ± 293 пмоль/мг/мин против 4032 ± 273 пмоль/мг/мин (p = 0.706) у мышей с включенным и выключенным ΔcJun соответственно.

3.4. обсуждение

Результаты данного исследования выявили усиление MOR-опосредованной активации G-белка и ингибирование аденилатциклазы в прилежащем ядре (NAc) мышей с индуцируемой трансгенной экспрессией ΔFosB в нейронах, содержащих динорфин/ D1R . Ингибирование активности аденилатциклазы, опосредованное KOR, также было усилено в NAc мышей, экспрессирующих ΔFosB, что предполагает, что ΔFosB регулирует эндогенную опиоидную систему в NAc. Значение Emax DAMGO было выше для MOR-стимулированного связывания [ 35S ]GTPγS, а его значение EC50 было ниже для ингибирования аденилатциклазы у мышей с гиперэкспрессией ΔFosB по сравнению с контрольными мышами. Эти данные предполагают возможность резерва рецепторов для модуляции эффекторов, но не для активации G-белка в условиях проведенного анализа. Тот факт, что максимальное ингибирование аденилатциклазы агонистом KOR зависело от экспрессии ΔFosB, указывает на низкий резерв рецепторов для KOR-опосредованного ответа, что согласуется с низким уровнем сайтов связывания KOR в мозге мыши ( Unterwald et al., 1991 ). В отличие от этого, активность G-белка, опосредованная CB1R , и ингибирование аденилатциклазы не зависели от экспрессии ΔFosB, что предполагает, что опиоидная и каннабиноидная системы различаются по своей реакции на ΔFosB в этих нейронах прилежащего ядра.

Влияние ΔFosB на передачу сигналов, опосредованную опиоидными рецепторами, согласуется с нашим предыдущим сообщением о том, что экспрессия ΔFosB в полосатом теле изменяет острые и хронические эффекты морфина ( Zachariou et al., 2006 ). Одним из результатов этого исследования было то, что мыши с трансгенной экспрессией ΔFosB в нейронах полосатого тела, кодирующих динорфин/D1R , были более чувствительны к морфину в условиях условного рефлекса на место, чем контрольные мыши. Кроме того, этот эффект был воспроизведен с помощью вирусной экспрессии ΔFosB путем направленной инъекции в прилежащее ядро. Эти наблюдения согласуются с текущими результатами, которые показывают усиление передачи сигналов MOR в прилежащем ядре.

Ранее мы идентифицировали ген, кодирующий динорфин, как мишень ΔFosB, и предположили, что снижение уровня динорфина будет соответствовать усилению вознаграждающих свойств морфина у битрансгенных мышей ΔFosB ( Zachariou et al., 2006 ). Настоящие результаты показывают, что опосредованное KOR ингибирование аденилатциклазы в прилежащем ядре усиливается у мышей, экспрессирующих ΔFosB, что может отражать компенсаторное повышение чувствительности KOR после снижения уровня динорфина. Предыдущие исследования показали, что KOR был повышен в определенных областях мозга мышей с нокаутом продинорфина, включая прилежащее ядро ​​( Clarke et al., 2003 ).

В отличие от ΔFosB, индуцируемая трансгенная экспрессия ΔcJun, доминантного негативного усеченного мутанта связывающего партнера ΔFosB cJun, не изменяла ингибирование аденилатциклазы агонистами MOR или KOR. Эти результаты предполагают, что базальные уровни экспрессии ΔFosB, которые относительно низки, не играют существенной роли в поддержании сигнализации опиоидных рецепторов на этом уровне передачи сигнала в NAc. Тот факт, что условный вознаграждающий эффект морфина снижался при экспрессии ΔcJun в нашем предыдущем исследовании ( Zachariou et al., 2006 ), предполагает либо то, что индукция ΔFosB морфином во время процедуры кондиционирования важна для регулирования поведенческих реакций на препарат, либо то, что транскрипционные эффекты ΔFosB, отличные от тех, которые влияют на проксимальную сигнализацию опиоидными рецепторами, могут влиять на опиоидное вознаграждение. В любом случае, результаты настоящего исследования ясно показывают, что при повышении экспрессии ΔFosB выше базального уровня в нейронах стриатума, экспрессирующих динорфин/D1R , наблюдается значительное усиление связи MOR и KOR с ингибированием аденилатциклазы в прилежащем ядре.

Механизмы, посредством которых MOR- и KOR-опосредованная передача сигналов усиливается при сверхэкспрессии ΔFosB, остаются неясными, но ранее мы показали, что уровни MOR, оцениваемые по связыванию [ 3H ]налоксона, не различаются в прилежащем ядре (NAc) мышей с экспрессией ΔFosB и без нее ( Zachariou et al., 2006 ). В том же исследовании было обнаружено, что уровни белков Gαi1 и 2 в этом регионе не изменяются при экспрессии ΔFosB. Однако предыдущие анализы экспрессии генов показали, что мРНК Gαo повышается в NAc мышей с экспрессией ΔFosB ( McClung and Nestler, 2003 ). В будущих исследованиях будет интересно всесторонне изучить влияние трансгенной экспрессии ΔFosB на экспрессию субъединиц G-белка на белковом уровне, а также на экспрессию многих белков, модулирующих G-белки.

Интересно, что выражение ΔFosB не улучшало CB1R-опосредованная сигнализация в NAc. Возможно, что изменения в CB1R сигнализация происходит в дискретной популяции нейронов, которая скрыта во всем препарате NAc. Например, введение Δ9- THC значительно индуцировал ΔFosB в ядре, но не в оболочке NAc (Perrotti, et al., 2008). ЯБыло показано, что задача с Δ9-THC после повторного введения Δ9-THC увеличивало высвобождение дофамина в ядре NAc, но уменьшалось высвобождение в оболочке (Cadoni и др., 2008). Также важно отметить, что линия 11A битрансгенных мышей выражает ΔFosB только в динорфине / D1R положительные средние колючие нейроны полосатого тела, но CB1R выражены как в динорфине / D1R и энкефалин / D2R положительных полосатых нейронов (Хохманн и Херкенхем, 2000), а также на терминалах корковых афферентов (Robbe, et al., 2001). Экспрессия доминантного отрицательного регулятора ΔSosB-опосредованной транскрипции ΔcJun также не оказывала существенного влияния на сигнализацию каннабиноидного рецептора, хотя ΔcJun индуцибельно экспрессируется в обеих D1 и D2-содержащие популяции средних колючих нейронов у этих мышей (Peakman, et al., 2003). Возможно, однако, что базальная экспрессия ΔFosB достаточно низка, что ΔcJun не влияет на сигнализацию рецептора, как это было предложено по результатам с MOR и KOR. Возможно также, что CB1R сигнализируется незначительно с помощью базальной экспрессии ΔFosB, так что дальнейшее увеличение экспрессии ΔFosB или блокирование его действий с ΔcJun имеет лишь незначительные эффекты, которые не достигают уровня статистической значимости. Косвенную поддержку этой интерпретации можно увидеть, сравнив WIN55,212-2 EC50 значения между мышами, выражающими ΔcJun по сравнению с ΔFosB. Отношение WIN55,212-2 EC50 значение для ингибирования аденилилциклазы у мышей с индуцированной экспрессией ΔcJun в ее EC50 значение для активации G-белка у мышей с индуцированной экспрессией ΔFosB было 4.0, тогда как одинаковое соотношение у мышей без индукции либо трансгена было 1.2.

В качестве альтернативы, каннабиноиды могут индуцировать экспрессию ΔFosB без какого-либо прямого воздействия на сигнализацию CB1R . В этом сценарии каннабиноиды могут модулировать чувствительность к психоактивным эффектам других наркотиков посредством опосредованной ΔFosB транскрипционной регуляции. В самом деле, введение Δ9 - THC вызывает перекрестную сенсибилизацию к опиоидам и амфетамину ( Cadoni et al., 2001 , Lamarque et al., 2001 ), что согласуется с этой гипотезой. Более того, сообщалось, что повторное введение агониста каннабиноидов CP55,940 увеличивает опосредованную MOR активацию G-белка в прилежащем ядре, аналогично мышам, у которых в настоящем исследовании индуцибельно экспрессировался ΔFosB ( Vigano et al., 2005 ). Влияние экспрессии ΔFosB на поведение, опосредованное Δ9 - THC, не оценивалось, но полученные результаты не исключают взаимодействия. Результаты этого и нашего предыдущего исследования ( Zachariou et al., 2006 ) показывают вызванные ΔFosB изменения в MOR и KOR/динорфине в полосатом теле. Вознаграждающие эффекты Δ9 - THC, измеренные по предпочтению места, исчезают у мышей с нокаутом гена MOR, тогда как удаление гена KOR ослабляет отвращение к месту, вызванное Δ9 - THC, и выявляет предпочтение места, вызванное Δ9 - THC ( Ghozland et al., 2002 ). Аналогично, условное отвращение к месту, вызванному Δ9 - THC, отсутствует у мышей с нокаутом гена про-динорфина по сравнению с мышами дикого типа ( Zimmer et al., 2001 ). Эти данные позволяют предположить, что Δ9 - THC может оказывать более благоприятное воздействие после индукции ΔFosB и последующей индукции MOR-сигнализации с уменьшением экспрессии динорфина.

В заключение, результаты данного исследования показали, что экспрессия ΔFosB в стриатальных нейронах, положительных по D1R /динорфину, усиливает MOR- и KOR-опосредованную передачу сигналов на уровне G-белково-опосредованного ингибирования активности аденилатциклазы в прилежащем ядре (NAc). Этот вывод согласуется с исследованиями, продемонстрировавшими роль эндогенной опиоидной системы в системе вознаграждения ( Trigo et al., 2010 ), и предоставляет потенциальный механизм ΔFosB-опосредованного воздействия на систему вознаграждения . В отличие от этого, CB1R - опосредованная передача сигналов в NAc не была существенно затронута экспрессией ΔFosB в стриатуме в исследованных условиях, хотя необходимы дальнейшие исследования для определения влияния индукции ΔFosB на эндоканнабиноидную систему.

Основные результаты исследований

  • Передача сигналов MOR усиливается в ядрах мышей, которые экспрессируют ΔFosB
  • KOR-ингибирование аденилатциклазы также усиливается у мышей, экспрессирующих ΔFosB
  • Выражение ΔFosB не изменяет CB1R-сигнализация в ядре accumbens
Перейти к:

Дополнительный материал

Перейти к:

Благодарности

Авторы благодарят Хенгджуна Хе, Джордана Кокса и Аарона Томаркио за техническую помощь в проведении анализов связывания [ 35S ]GTPγS. Данное исследование было поддержано грантами USPHS DA014277 (LJS), DA10770 (DES) и P01 DA08227 (EJN).

Перейти к:

Сноски

Предупреждение издателя: Это PDF-файл неотредактированной рукописи, принятой к публикации. В качестве услуги для наших клиентов мы предоставляем эту предварительную версию рукописи. Перед публикацией в окончательном цитируемом виде рукопись пройдет корректуру, верстку и проверку корректуры. Обратите внимание, что в процессе подготовки могут быть обнаружены ошибки, которые могут повлиять на содержание, и все применимые к журналу юридические оговорки остаются в силе.

Перейти к:

Референсы

  • Бозарт М.А., Мудрый Р.А. Анатомически различные опиатные рецепторные поля опосредуют вознаграждение и физическую зависимость. Наука. 1984;224: 516-517. [PubMed]
  • Брэдфорд М.М. Быстрый и чувствительный метод количественного определения количества микрограмм белка с использованием принципа связывания белка с красителем. Анальный. Biochem. 1976;72: 248-254. [PubMed]
  • Breivogel CS, Childers SR, Deadwyler SA, Hampson RE, Vogt LJ, Sim-Selley LJ. Хроническая дельта9-тетрагидроканнабинол приводит к зависящей от времени потере активированных каннабиноидным рецептором G-белков в головном мозге. J. Neurochem. 1999;73: 2447-2459. [PubMed]
  • Breivogel CS, Selley DE, Childers SR. Эффективность агониста каннабиноидного рецептора для стимуляции [35S] GTPγS с мембранами мозжечка крысы коррелирует с агонистическим снижением сродства к ВВП. J. Biol. Химреагент 1998;273: 16865-16873. [PubMed]
  • Cadoni C, Pisanu A, Solinas M, Acquas E, Di Chiara G. Поведенческая сенсибилизация после многократного воздействия Delta 9-тетрагидроканнабинола и кросс-сенсибилизации морфином. Психофармакология (Berl) 2001;158: 259-266. [PubMed]
  • Cadoni C, Valentini V, Di Chiara G. Поведенческая сенсибилизация к дельта 9-тетрагидроканнабинолу и кросс-сенсибилизация с морфином: дифференциальные изменения в аккремальной оболочке и передаче дофамина в сердцевине. J. Neurochem. 2008;106: 1586-1593. [PubMed]
  • Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shookt PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Трансгенные животные с индуцируемой, целевой экспрессией генов в мозге. Mol. Pharmacol. 1998;54: 495-503. [PubMed]
  • Childers SR. Вторичные мессенджеры, связанные с опиоидным рецептором. Life Sci. 1991;48: 1991-2003. [PubMed]
  • Childers SR, Fleming L, Konkoy C, Marckel D, Pacheco M, Sexton T, Ward S. Опиоид и ингибирование каннабиноидного рецептора аденилатциклазы в головном мозге. Энн. NY Acad. Научно. 1992;654: 33-51. [PubMed]
  • Childers SR, Xiao R, Vogt LJ, Sim-Selley LJ. Стимулирование опиоидного рецептора каппа [35S] GTPγS в мозге морской свинки: отсутствие доказательств для каппа2-селективная активация G-белков. Biochem. Pharmacol. 1998;56: 113-120. [PubMed]
  • Clarke S, Zimmer A, Zimmer AM, Hill RG, Kitchen I. Областная избирательная регуляция микро-, дельта- и каппа-опиоидных рецепторов, но не рецептор-рецепторы 1, подобные опиоидным рецепторам, в мозге мышей с энкефалином и динорфином. Neuroscience. 2003;122: 479-489. [PubMed]
  • Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Струйная клеточная специфическая избыточная экспрессия DeltaFosB усиливает стимул для кокаина. J. Neurosci. 2003;23: 2488-2493. [PubMed]
  • Гарднер Э.Л. Эндоканнабиноидная сигнальная система и мозговая награда: акцент на допамин. Pharmacol. Biochem. Behav. 2005;81: 263-284. [PubMed]
  • Ghozland S, Matthes HW, Simonin F, Filliol D, Kieffer BL, Maldonado R. Мотивационные эффекты каннабиноидов опосредуются му-опиоидными и каппа-опиоидными рецепторами. J. Neurosci. 2002;22: 1146-1154. [PubMed]
  • Herkenham M, Lynn AB, Johnson MR, Melvin LS, de Costa BR, Rice KC. Характеризация и локализация каннабиноидных рецепторов в мозге крыс: количественное аурадиографическое исследование in vitro. J. Neurosci. 1991;11: 563-583. [PubMed]
  • Hohmann AG, Herkenham M. Локализация мРНК рецептора каннабиноидной CB (1) в нейронных субпопуляциях стриатума крысы: двухмерное исследование гибридизации in situ. Synapse. 2000;37: 71-80. [PubMed]
  • Howlett AC, Barth F, Bonner TI, Cabral G, Casellas P, Devane WA, Felder CC, Herkenham M, Mackie K, Martin BR, Mechoulam R, Pertwee RG. Международный союз фармакологии. XXVII. Классификация каннабиноидных рецепторов. Фармакологическое обозрение. 2002;54: 161-202.
  • Хуэстис М.А., Горелик Д.А., Хейшман С.Я., Престон К.Л., Нельсон Р.А., Мулчан Э.Т., Франк Р.А. Блокада эффектов копченой марихуаны с помощью CB1-селективного антагониста каннабиноидных рецепторов SR141716. Архипелаг Ген. Психиатрия. 2001;58: 322-328. [PubMed]
  • Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Выражение фактора транскрипции deltaFosB в мозге контролирует чувствительность к кокаину. Природа. 1999;401: 272-276. [PubMed]
  • Кооб Г.Ф., Волков Н.Д. Нейроциркуляция наркомании. Neuropsychopharmacology. 2010;35: 217-238. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Lamarque S, Taghzouti K, Simon H. Хроническое лечение Delta (9) -тетрагидроканнабинолом усиливает локомоторный ответ на амфетамин и героин. Последствия для уязвимости к наркомании. Нейрофармакология. 2001;41: 118-129. [PubMed]
  • Maldonado R, Valverde O, Berrendero F. Вовлечение эндоканнабиноидной системы в наркоманию. Тенденции Neurosci. 2006;29: 225-232. [PubMed]
  • Mansour A, Fox CA, Thompson RC, Akil H, Watson SJ. экспрессию мРНК мю-опиоидных рецепторов в ЦНС крысы: сравнение с связыванием му-рецептора. Brain Res. 1994;643: 245-265. [PubMed]
  • Matthes HWD, Maldonado R, Simonin F, Valverde O, Slowe S, кухня I, Befort K, Dierich A, LeMeur M, Dolle P, Tzavara E, Hanoune J, Roques BP, Kieffer BL. Потеря индуцированной морфином аналгезии, эффекта вознаграждения и симптомов отмены у мышей, у которых отсутствует ген μ-опиоидного рецептора. Природа. 1996;383: 819-823. [PubMed]
  • McClung CA, Nestler EJ. Регулирование экспрессии генов и вознаграждение кокаина CREB и DeltaFosB. Туземный Neurosci. 2003;6: 1208-1215. [PubMed]
  • McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: молекулярный переключатель для долговременной адаптации в мозге. Brain Res. Mol. Brain Res. 2004;132: 146-154. [PubMed]
  • Мюллер Д.Л., Унтервальд Э.М. D1-дофаминовые рецепторы модулируют дельта-FosB-индукцию в стриатуме крысы после прерывистого введения морфина. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005;314: 148-154. [PubMed]
  • Nestler EJ. Обзор. Транскрипционные механизмы зависимости: роль DeltaFosB. Philos. Сделка R. Soc. Лонд. B. Biol. Sci. 2008;363: 3245-3255. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Nestler EJ, Kelz MB, Chen J. DeltaFosB: молекулярный медиатор долговременной нейронной и поведенческой пластичности. Brain Res. 1999;835: 10-17. [PubMed]
  • Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Фармакологические исследования регуляции хронической FOS-связанной антигенной индукции кокаином в стриатуме и ядре accumbens. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1995;275: 1671-1680. [PubMed]
  • Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Индуцибельная экспрессия доминантного отрицательного мутанта c-Jun у трансгенных мышей снижает чувствительность к кокаину. Brain Res. 2003;970: 73-86. [PubMed]
  • Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Отличительные закономерности индукции DeltaFosB в головном мозге наркотиками. Synapse. 2008;62: 358-369. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Robbe D, Alonso G, Duchamp F, Bockaert J, Manzoni OJ. Локализация и механизмы действия каннабиноидных рецепторов в глутаматергических синапсах ядра ядра мыши. J. Neurosci. 2001;21: 109-116. [PubMed]
  • Саломон Y. Аденилатциклазный анализ. Adv. Cyclic Nucleotide Res. 1979;10: 35-55. [PubMed]
  • Selley DE, Sim LJ, Xiao R, Liu Q, Childers SR. Му опиоидный рецептор-стимулированный [35S] GTPγS в таламусе крыс и культивируемых клеточных линиях: механизмы трансдукции сигналов, влияющие на эффективность агониста. Mol. Pharmacol. 1997;51: 87-96. [PubMed]
  • Trigo JM, Martin-Garcia E, Berrendero F, Robledo P, Maldonado R. Эндогенная опиоидная система: общий субстрат при наркомании. Наркотик Алкоголь. 2010;108: 183-194. [PubMed]
  • Унтервальд Е.М., Кнапп С., Зукин Р.С. Нейроанатомическая локализация опиоидных рецепторов κ1 и κ2 в головном мозге крысы и морской свинки. Brain Res. 1991;562: 57-65. [PubMed]
  • Vaccarino FJ, Bloom FE, Koob GF. Блокада ядовитых опиатных рецепторов ослабляет внутривенное назначение героина у крысы. Психофармакология (Berl) 1985;86: 37-42. [PubMed]
  • Vigano D, Rubino T, Vaccani A, Bianchessi S, Marmorato P, Castiglioni C, Parolaro D. Молекулярные механизмы, участвующие в асимметричном взаимодействии между каннабиноидной и опиоидной системами. Психофармакология (Berl) 2005;182: 527-536. [PubMed]
  • Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Существенная роль DeltaFosB в прилежании ядра при действии морфина. Туземный Neurosci. 2006;9: 205-211. [PubMed]
  • Zangen A, Solinas M, Ikemoto S, Goldberg SR, Wise RA. Два участка мозга для награды каннабиноидами. J. Neurosci. 2006;26: 4901-4907. [PubMed]
  • Zhu J, Luo LY, Li JG, Chen C, Liu-Chen LY. Активация клонированного человеческого каппа-опиоидного рецептора агонистами усиливает связь [35S] GTPγS с мембранами: определение потенций и эффективности лигандов. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997;282: 676-684. [PubMed]
  • Zimmer A, Valjent E, Konig M, Zimmer AM, Robledo P, Hahn H, Valverde O, Maldonado R. Отсутствие дельта-9-тетрагидроканнабиноловых дисфорических эффектов у мышей с дефицитом диорфина. J. Neurosci. 2001;21: 9499-9505. [PubMed]
  • Циммер А, Циммер А.М., Хохманн А.Г., Херкенхам М., Боннер Т.И. Повышенная смертность, гипоактивность и гипоальгезия у мышей с нокаутом рецептора CBNNUMX cannabinoid. Труды. Natl. Акад. Научно. США 1999;96: 5780-5785. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]