PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Абстрактные
Индуцированные кокаином изменения в экспрессии генов вызывают изменения в морфологии и поведении нейронов, которые могут лежать в основе кокаиновой зависимости. Мы определили существенную роль диметилирования лизина 3 (H9K3) гистона 9 и диметилтрансферазы лизина G9a в кокаин-индуцированной структурной и поведенческой пластичности. Повторное введение кокаина снижало глобальные уровни диметилирования H3K9 в прилежащем ядре. Tего снижение метилирования гистонов было опосредовано репрессией G9a в этой области мозга, которая регулировалась кокаиновым фактором транскрипции FosB. Используя условный мутагенез и вирус-опосредованный перенос генов, мы обнаружили, что подавление G9a повышает пластичность дендритного отдела позвоночника в прилежащих нейронах ядра и повышает предпочтение кокаина, тем самым устанавливая решающую роль в метилировании гистонов в длительных действиях кокаина.
Введение
Повторное воздействие кокаина характеризуется постоянными изменениями в экспрессии генов и измененной морфологией нейронов в пределах ядра accumbens (NAc), ключевого компонента схемы вознаграждения мозга (1–2). Ремоделирование хроматина важно для аберрантных транскрипционных изменений в этой области мозга, которые могут лежать в основе кокаиновой зависимости (3–9). Кокаиновая регуляция структуры хроматина в NAc частично обусловлена прямыми кокаиновыми модификациями ферментативного механизма хроматина, что приводит к изменениям в ацетилировании и фосфорилировании гистонов (4, 7–9); однако роли ферментов, контролирующих метилирование гистонов, еще не исследованы.
Недавний анализ промотора генома с помощью иммунопреципитации хроматина, соединенной с микрочипами (чип-чип), определенных измененных образцы репрессивной гистона H3 лизина 9 (H3K9) и 27 (H3K27) метилирование в специфических промоторах генов в NAc в результате многократного лечения кокаина (6). Поэтому мы профилировали многочисленные лизин метилтрансферазы (KMT) и деметилазы (KDM), которые, как известно, контролируют метилирование H3K9 или H3K27 (Рис. 1A). Только два фермента, G9a и GLP, демонстрировали стойкую транскрипционную регуляцию 24 через несколько часов после многократного введения кокаина, когда экспрессия обоих генов была значительно снижена. Поскольку G9a и GLP специфически катализируют диметилирование H3K9 (H3K9me2), их подавление кокаином согласуется со снижением глобальных уровней эухроматического H3K9me2, наблюдаемым в этот момент времени (1B). Напротив, глобальные уровни гетерохроматического метилирования H3K27 оставались неизменными при повторном воздействии кокаина (Рис. S1 в поддержку онлайн-материала). Из-за высокого уровня каталитической активности в пробирке и в естественных условиях (10), мы решили продолжить изучение функциональной значимости репрессии G9a после повторного воздействия кокаина в NAc. Уровни белка G9a, как и уровни его мРНК, были значительно снижены через 24 через несколько часов после повторного введения кокаина (Рис. S2). Хотя экспрессия мРНК G9a была снижена на 35% в NAc, иммуногистохимический анализ выявил более скромное снижение уровней белка G15a на 9%, что согласуется с наблюдаемым снижением на 21% H3K9me2 после повторного введения кокаина (1B). Экспрессия мРНК G9a была также подавлена в этой области мозга на 20% после повторного самостоятельного введения кокаина (Рис. S3).
Чтобы определить, коррелируют ли изменения в эухроматическом H3K9me2 с изменениями в геноме экспрессии генов в NAc, мы использовали анализ микрочипов для изучения профилей экспрессии генов, вызванных контрольной дозой кокаина у животных с историей предшествующего воздействия кокаина или без нее (см. Дополнительную информацию). генные списки в Таблицы S1 – S3). Животные, которые получали повторный кокаин, демонстрировали резко повышенную экспрессию гена 1 через час после введения кокаина по сравнению с остро обработанными животными (Рис. 1C). Это усиление экспрессии генов все еще происходило в ответ на провокацию кокаином, полученную после 1-недели отмены повторного кокаина. В соответствии с предыдущими сообщениями, небольшой процент генов (~ 10%) демонстрировал десенсибилизированные транскрипционные ответы после повторного введения кокаина (Рис. 1C; увидеть Таблица S1) (5). Для непосредственного исследования роли подавления G9a в усилении экспрессии генов, наблюдаемой после повторного кокаина, мышам вводили внутри-NAc-инъекции векторов вируса простого герпеса (HSV), экспрессирующих либо GFP, либо G9a, и обрабатывали физиологическим раствором или повторным кокаином, чтобы определить, является ли избыточная экспрессия G9a было достаточно, чтобы заблокировать повторное усиление экспрессии генов, вызванное кокаином. Из набора случайно выбранных генов 12, демонстрирующих повышенные уровни экспрессии после повторного приема кокаина, мы обнаружили, что G9a значительно снижает повышенную экспрессию% этих генов 50 (Таблица S4).
Чтобы идентифицировать транскрипционные события в восходящем направлении, которые опосредуют повторную кокаиновую репрессию экспрессии G9a, мы исследовали возможную роль ΔFosB, высокостабильного продукта сплайсинга непосредственно раннего гена. fosB, ΔFosB накапливается в NAc после многократного воздействия кокаина, где он был связан с повышенным вознаграждением кокаина (11). ΔFosB может действовать как активатор транскрипции или репрессор в зависимости от вовлеченного целевого гена (3, 5, 6, 12). Использование битрансгенных NSE-TTA × tetOP-ΔFosB мыши, у которых экспрессия ΔFosB может быть селективно индуцирована в NAc и дорсальном стриатуме взрослых животных (13), мы исследовали влияние экспрессии ΔFosB на кокаиновую регуляцию H3K9me2 и KMTs в NAc. Сверхэкспрессия ΔFosB была достаточной для снижения уровней обоих H3K9me2 (Рис. 1D) и выражение G9a (Рис. 1E), тем самым имитируя эффекты повторного кокаина. Напротив, ΔFosB не снижал экспрессию GLP в этой области мозга и не влиял на SUV39H1 и EZH2, основные триметилирующие ферменты для H3K9 и H3K27, соответственно (Рис. S4). Для подтверждения этих данных с использованием независимой системы избыточной экспрессии ΔFosB взрослые мыши дикого типа получали двусторонние внутриклеточные инъекции векторов аденоассоциированного вируса (AAV), экспрессирующих либо GFP, либо ΔFosB. Вирус-опосредованная избыточная экспрессия ΔFosB снижала уровни экспрессии G9a в этой области мозга (Рис. 1E).
Такая выраженная и специфическая регуляция G9a побудила нас исследовать, регулирует ли изменение экспрессии G9a специфически в нейронах NAc поведенческие реакции на кокаин. Мыши дикого типа получали внутриклеточные инъекции HSV-векторов, экспрессирующих GFP или G9a, и затем анализировались с использованием беспристрастной парадигмы предпочтительного места в условиях кокаина, которая обеспечивает косвенную меру вознаграждения за лекарства. Вирусная гиперэкспрессия G9a в нейронах NAc была подтверждена после поведенческого тестирования (Рис. 2A). Сверхэкспрессия G9a значительно снижала предпочтение кокаина по сравнению с животными с избыточной экспрессией GFP (2B) и повышенные уровни H3K9me2 в NAc (Рис. 2C). Сверхэкспрессия каталитически мертвого мутанта G9a (G9aH1093K) (14) не влияет на предпочтения кокаина (2B) и не влиял на уровни H3K9me2 в этой области мозга (Рис. 2C).
Для дальнейшего изучения роли G9a в поведенческих эффектах кокаина и, в частности, для имитации повторяющейся кокаин-индуцированной репрессии экспрессии G9a в NAc у взрослых G9a.П / П мышей (14) получали внутривенные инъекции векторов AAV, экспрессирующих Cre рекомбиназу или GFP в качестве контроля. AAV-Cre нокдаун G9a в NAc, что было подтверждено иммуногистохимически (Рис. S5), значительно увеличил эффекты кокаина в экспериментах по кондиционированию места и снизил уровни H3K9me2 в NAc (Рис. 2D, E). Коммерчески доступный фармакологический ингибитор G9a и GLP, BIX01294 (15–16), был использован для определения того, влияет ли ингибирование ферментов на поведенческие реакции на кокаин. Действительно, фармакологическое ингибирование G9a и GLP значительно увеличивало предпочтение кокаина и уменьшало H3K9me2 в NAc (Рис. 2F, G).
Повторное введение кокаина увеличивает плотность дендритных шипов на NAc средних колючих нейронов (17), процесс, связанный с функциональными изменениями при возбуждающих глутаматергических синапсах на эти нейроны (18–19) и сенсибилизированные поведенческие реакции на препарат (17, 20). Таким образом, мы предположили, что подавление активности G9a в NAc с помощью повторного кокаина может опосредовать способность кокаина регулировать плотность дендритных отделов позвоночника нейронов NAc. Используя иммунопреципитацию хроматина (ChIP) с анти-G9a антителом, мы идентифицировали несколько предполагаемых мишеней гена G9a в NAc, каждая из которых ранее была вовлечена в вызванную кокаином дендритную пластичность (Рис. 3A) (20–26). Мы обнаружили, что повторное введение кокаина значительно снижало связывание G9a, а также уровни H3K9me2 на этих промоторах гена (3B). Напротив, острое введение кокаина быстро привлекало G9a к некоторым из этих же промоторов генов, что согласуется с повышенной экспрессией G9a, наблюдаемой в NAc 1 через час после острой дозы кокаина (Рис. S6). Хотя связывание G9a со специфическими промоторами гена коррелирует с изменениями в его экспрессии, остается неясным, связаны ли такие события с измененными глобальными уровнями G9a в NAc и / или с различиями в рекрутировании G9a после острого против повторное введение кокаина.
Основываясь на регуляции G9a многочисленных генов, связанных с пластичностью в NAc, мы непосредственно исследовали, было ли поддержание экспрессии G9a в этой области мозга после повторной обработки кокаином достаточным для блокирования индуцированного кокаином формирования дендритного отдела позвоночника. Использование протокола лечения кокаином, ранее продемонстрированного, чтобы способствовать индукции дендритного отдела позвоночника в NAc (20), мы исследовали плотность позвоночника у животных, которым вводили либо HSV-GFP, либо HSV-G9a. В соответствии с предыдущими данными, мы наблюдали значительное увеличение плотности дендритного отдела позвоночника в NAc после обработки кокаином, эффект, который полностью блокировался избыточной экспрессией G9a (Рис. 3C). Одной сверхэкспрессии G9a было недостаточно для снижения плотности дендритного отдела позвоночника NAc в отсутствие кокаина. Чтобы дополнить эти данные, G9aП / П мыши получали внутривенные инъекции HSV-Cre, и плотность позвоночника определяли количественно и сравнивали с животными, получавшими HSV-GFP в отсутствие кокаина. Нокдаун экспрессии G9a значительно увеличивал плотность позвоночника на спинальных нейронах со средним NAc (Рис. 3C).
Учитывая доказательства того, что подавление G9a в NAc после повторного кокаина опосредовано ΔFosB, мы затем изучили, участвует ли этот фактор транскрипции в регуляции дендритных шипов NAc. Хотя ΔFosB ранее не был связан причинно с такой дендритной пластичностью, некоторые из его целей, включая субъединицы Cdk5 и NFκB, были настолько вовлечены (20–23), и постоянная экспрессия ΔFosB в нейронах NAc коррелирует с повышенной плотностью дендритного отдела позвоночника после повторной обработки кокаином (27). Во-первых, мы обнаружили, что индукция ΔFosB у битрансгенных мышей в отсутствие кокаина снижала экспрессию G9a и H3K9me2 (Рис. 1D, E), снижение связывания G9a с многочисленными генами, связанными с пластичностью, многие из которых, как было показано, также являются прямыми мишенями для самого ΔFosB (Рис. 3D) (3, 6). Затем мы показали, что избыточная экспрессия вируса ΔFosB в NAc значительно увеличивает плотность дендритного отдела позвоночника в базальных условиях, похоже на то, что наблюдается после повторного введения кокаина (Рис. 3E). Наоборот, избыточная экспрессия в NAc ΔJunD, доминантно-негативного мутантного белка, который противодействует транскрипционной активности ΔFosB, блокировала способность повторного кокаина увеличивать образование дендритного отдела позвоночника в NAc. (Рис. 3C).
Наше наблюдение, что FosB регулирует экспрессию G9a в NAc, и что FosB и G9a регулируют некоторые из тех же генов-мишеней, привело нас к изучению других взаимодействий между ΔFosB и G9a. После острого кокаина, когда уровни G9a были повышены, связывание G9a с fosB ген был увеличен, в то время как после повторного приема кокаина, когда экспрессия G9a была подавлена, связывание G9a с fosB ген был уменьшен (Рис. 3A). Такое снижение связывания G9a после повторного приема кокаина не наблюдалось для с-FOS, где связывание G9a увеличивается повторным кокаином (Рис. S7). Это согласуется с тем, что, в отличие от fosB, с-FOS подавляется, а не индуцируется хроническим воздействием психостимуляторов (5). Сверхэкспрессия ΔFosB у битрансгенных мышей была достаточной для значительного уменьшения связывания G9a с fosb ген (Рис. 3D). Кроме того, избыточная экспрессия G9a была достаточной для снижения повышенной экспрессии ΔFosB после повторного введения кокаина (Таблица S4). Эти данные предполагают ауторегуляторную петлю, посредством которой G9a первоначально ограничивает индукцию ΔFosB при остром введении кокаина. Однако, поскольку FosB накапливается при повторном воздействии лекарственного средства, он подавляет G9a и тем самым усиливает его собственную дальнейшую индукцию.
В заключение, мы продемонстрировали, что метилирование гистона лизина в NAc критически участвует в регуляции экспрессии нейрональных генов в ответ на кокаин. Репрессия G9a и H3K9me2 после повторного введения кокаина способствует предпочтению кокаина, в частности, благодаря транскрипционной активации многочисленных генов, которые, как известно, регулируют аберрантные формы дендритной пластичности. Получение лучшего понимания генов, регулируемых с помощью таких механизмов, улучшит наши знания о сложной биологической основе наркомании и может помочь в разработке более эффективных методов лечения зависимостей.
Материалы и методы
Животные и лечение
Если не указано иное, мышей содержали от четырех до пяти на клетку в колонии с циклом часового освещения / темноты 12 (свет включается от 7: 00 AM до 7: 00 PM) при постоянной температуре (23 ° C) с вволю доступ к воде и еде. Все протоколы на животных были одобрены IACUC как в Юго-Западном медицинском центре ЮТ, так и в Медицинской школе Маунт-Синай.
Для экспериментов с кокаином [иммуногистохимитрия, вестерн-блоттинг, количественная ПЦР (КПЦР), анализ с использованием микрочипов и иммунопреципитация хроматина (ChIP)] использовали самцов мышей C8BL / 10J в возрасте от 57 до 6. Животные получали ежедневные инъекции либо «физиологического раствора» (физиологический раствор 7, внутрибрюшинно), «острого» кокаина (физиологический раствор 6 + один курс лечения 20 мг / кг кокаин-HCl, внутрибрюшинно), либо «повторного» кокаина (7 лечение 20 мг / кг). кокаин-HCl, внутрибрюшинно). Мышей умерщвляли либо в час 1, либо в часы 24 после последней обработки. Для исследований на микрочипах животных ежедневно обрабатывали либо «физиологическим раствором» (15 физиологический раствор, внутрибрюшинно), «острым» кокаином (14 физиологический раствор + 1 обработка 20 мг / кг кокаин-HCl, ip), «повторный + острый» кокаин ( Обработка 7 физиологическим раствором + Обработка 8 20 мг / кг кокаин-HCl, внутрибрюшинно или кокаин «многократная абстиненция + острый» (7 Обработка 20 мг / кг кокаин-HCl + Обработка 7 физиологическим раствором + Обработка 1 20 мг / кг кокаин-HCl, ip) и были принесены в жертву 1 через час после окончательной обработки. В поведенческих экспериментах мышей помещали в одиночку после операции и обрабатывали 10 мг / кг кокаин-HCl, внутрибрюшинно, как описано ниже. Для дендритного анализа позвоночника и проверки микроматрицы после инфекции HSV-GFP и HSV-G9a-GFP мышей обрабатывали «физиологическим раствором» (5 физиологический раствор, внутрибрюшинно) или «повторным кокаином» (5 обработки 20 мг / кг кокаин-HCl, внутрибрюшинно ) в течение дней 3, так как ранее было продемонстрировано, что этот протокол инъекции увеличивает плотность позвоночника на нейронах ядра accumbens (NAc) в течение периода экспрессии трансгена вируса простого герпеса (HSV) (Дополнительная ссылка S1). Мышей, использованных для анализа дендритного отдела позвоночника, умерщвляли через 4 часов после последней обработки.
Чтобы вызвать локальную делецию транскрипта G9a, ограниченного нейронами NAc, мы использовали мутантных мышей, гомозиготных по аллелю G9a, который был подробно описан в другом месте (S2). Cre-индуцированная рекомбинация приводит к появлению внекадрового сплайсинга от экзона 22 до 25, что приводит к бессмысленному опосредованному распаду мутированного транскрипта. Мы использовали G9a мышей с флоксом, которые были полностью подвергнуты обратному скрещиванию с мышами C57BL / 6J. Мышей инъецировали стеротаксически в NAc с помощью векторов аденоассоциированного вируса (AAV) (серотип 2), экспрессирующих GFP или Cre-GFP между возрастом 7 и 10 недель. Иммуногистохимический анализ был использован для проверки эффективности Cre-опосредованной рекомбинации (см. Дополнительный рис. S5). Мы использовали животных с инъекцией AAV через 21 через несколько дней после операции, потому что рекомбинация у мышей с G9a была стабильной и максимальной в этот момент времени, что согласуется с опубликованными отчетами (S3–S4). Эксперименты по сверхэкспрессии G9a и ΔJunD проводили аналогичным образом, используя векторы вируса HSV, экспрессирующие либо GFP, G9a-GFP дикого типа, каталитически мертвый G9aH1093K-GFP или ΔJunD-GFP (см. S2 подробности, касающиеся разработки конструкций G9a). Сверхэкспрессирующих мышей HSV использовали через 3 через сутки после операции, поскольку сверхэкспрессия была максимальной в этот момент времени, что наблюдалось с помощью иммуногистохимии. Из-за временной природы экспрессии HSV и значительно более стабильной природы экспрессии AAV векторы HSV использовались в экспериментах, требующих быстрой кратковременной экспрессии трансгена, тогда как векторы AAV использовались в экспериментах, требующих длительных периодов экспрессии трансгена. В ходе обширных предыдущих исследований было показано, что оба вектора инфицируют только тела нейрональных клеток в области инъекции без какой-либо инфекции афферентных или эфферентных нейронов.
Для поведенческих экспериментов с использованием фармакологического ингибитора G9a / GLP, BIX01294 (25 нг / мкл), мышей имплантировали стеротаксически двумя подкожными мини-насосами, а также двусторонними направляющими канюлями в NAc. Мини-насосы активировали 12 за часы до имплантации, инициируя непрерывную доставку (0.25 мкл / час) либо носителя (5 гидроксипропил β-циклодекстрин), либо лекарственного средства в течение дней 14, в течение которых проводились оценки поведения.
Для экспериментов по сверхэкспрессии ΔFosB [вестерн-блоттинг, КПЦР и ChIP], мужской битрансгенный NSE-TTA × tetOP–ΔFosB были использованы мыши (неделя 10), в результате чего в отсутствие производного тетрациклина доксициклина (неделя 8 от доксициклина) животные демонстрировали устойчивую стриатальную ограниченную конститутивную экспрессию ΔFosB (S5). Сверхэкспрессия FosB у этих мышей была подтверждена с помощью КПЦР. Для подтверждения результатов с использованием NSE-TTA × tetOP–ΔFosB мышам, самцам мышей дикого типа 8-недели C57BL / 6J вводили стеротаксически внутри-NAc с векторами AAV, экспрессирующими либо GFP, либо ΔFosB-GFP. В данном случае векторы AAV использовались для обеспечения максимальной экспрессии ΔFosB через 8 недель после операции, что позволяло проводить прямое сравнение между вирусно инфицированными и битрансгенными мышами со сверхэкспрессией ΔFosB. Сверхэкспрессия вируса была подтверждена с использованием КПЦР через 8 недель после операции (удары 15-калибра NAc были вскрыты под местом инъекции). Мыши со сверхэкспрессией AAV-GFP и AAV-ΔFosB-GFP, которых не использовали для кПЦР, обрабатывали физиологическим раствором (14, физиологический раствор, внутрибрюшинно) или повторным кокаином (14, 30, мг / кг кокаин-HCl, внутрибрюшинно), начиная с 6 недель после хирургия. Через 4 дней после окончательной обработки мозг фиксировали 4% параформальдегидом, разрезали на вибратоме и использовали для анализа дендритного отдела позвоночника.
Вестерн-блот-анализ
Штампы NAc-калибра NAc были взяты из срезов короны 14 мм, полученных с использованием матрицы мозга мыши из нержавеющей стали, и обработаны ультразвуком в буфере для лизиса 1 M HEPES (1% SDS), содержащем ингибиторы протеазы и фосфатазы. 1–30 мкг образцы общего белка подвергали электрофорезу в гелях 18% SDS. Белки переносили на мембраны PVDF и инкубировали с анти-H3K9me2 (мышиные моноклональные, 1: 500), анти-β-тубулина (мышиные моноклональные, 1: 60,000), анти-тотальный гистон H3 (кроличьи поликлональные, XNUM): анти-GFP (используется для проверки равной вирусной экспрессии в перфорированной ткани) (кроличьи поликлональные, 1: 5,000), анти-H1K1000me3 (кроличьи поликлональные, 27: 3) или анти-актиновые антитела (мышиные моноклональные, 1: 500) в течение ночи в течение ночи 1 ° C (все мембраны были заблокированы в 60,000% молоке или 4% бычьем сывороточном альбумине). Затем мембраны инкубировали с меченными пероксидазой вторичными антителами (5: 5–1: 60,000 в зависимости от используемого первичного антитела) и полосы визуализировали с использованием субстрата SuperSignal West Dura. Полосы количественно определяли с помощью программного обеспечения NIH Image J, а полосы H3K9me2 были нормализованы либо для актина, либо для β-тубулина, а также для общего гистона H3, чтобы контролировать равную нагрузку. Повторный кокаин не влиял на уровень актина (Рис. S8) или общий гистон 3 (Рис. S1) в сс. Кроме того, инфекции HSV-G9a-GFP и HSV-G9aH1093K-GFP не влияли на общие уровни β-тубулина в NAc (Рис. S8).
Иммуногистохимия
Мышей успокаивали летальной дозой хлоралгидрата и перфузировали 4% параформальдегидом перед анализом с помощью одно- или двукратной иммуногистохимии, как описано ранее (S6). Вкратце, после фиксации мозг инкубировали при комнатной температуре в течение ночи в 30% -ной сахарозе перед разрезанием на 35 мкм (мозг, используемый для анализа дендритного отдела позвоночника, разрезали на вибратоме на срезах 100 мкм в отсутствие 30% -ной сахарозы). Свободно плавающие срезы NAc промывали PBS 1X, блокировали (3% нормальная сыворотка осла, 0.1% tritonX, PBS 1X) и затем инкубировали с анти-GFP (куриный поликлональный, 1: 8000) и / или анти-G9a (поликлональный кролик) , 1: 500) антитела в блокирующем растворе. Срезы, проанализированные на наличие дендритных шипов, инкубировали с кроличьим поликлональным анти-GFP-антителом в 1: 200. После инкубации в течение ночи срезы NAc промывали 3 раз в течение 10 минут PBS 1X с последующей инкубацией с флуоресцентно-связанными вторичными антителами Cy2 и / или Cy3 в блокирующем растворе 1X PBS в течение часов 2. Срезы, используемые для морфологических исследований, инкубировали во вторичном антителе в течение ночи при комнатной температуре. Ядерное совместное окрашивание было достигнуто путем инкубации срезов в 1X PBS, содержащем DAPI (1: 50,000), в течение минут 10. Срезы еще раз промывали с последующей дегидратацией этанола и закреплением DPX. Все срезы были получены с помощью конфокальной микроскопии.
Выделение РНК и КПЦР
Двусторонние штампы NAc 14-го калибра гомогенизировали в Trizol и обрабатывали в соответствии с инструкциями производителя. РНК очищали с помощью колонок RNAesy Micro, и спектроскопия подтвердила, что рационы РНК 260/280 и 260/230 были> 1.8. Затем РНК подвергали обратной транскрипции с использованием набора Bio-Rad iScript. кДНК определяли количественно с помощью кПЦР с использованием SYBR Green. Каждую реакцию проводили в двух или трех повторностях и анализировали, следуя методу ΔΔCt, как описано ранее, с использованием глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) в качестве контроля нормализации (S7). Увидеть дополнительная таблица S5 для последовательностей праймеров мРНК.
Анализ микроматрицы ДНК
Четыре группы (3 независимые биологические повторы на группу) были использованы для исследования микроматрицы, в общей сложности микрочипы 12. Через час после последней инъекции кокаина животных быстро декапитировали, а мозг удаляли и помещали на лед. Диссекции NAc выполняли с использованием игольчатого пуансона 1 и быстро замораживали на сухом льду до экстракции РНК. Двусторонние удары объединяли от четырех животных на повторность, всего мышей 15 на группу. Выделение РНК, обработку микрочипов и анализ данных проводили, как описано ранее (S8). Вкратце, РНК выделяли и очищали, как описано выше, и проверяли ее качество с помощью биоанализатора Agilent. Обратную транскрипцию, амплификацию, маркировку и гибридизацию с матрицами Illumina MouseWG-6 v2.0 проводили с использованием стандартных процедур с помощью ядра микрочипа UT Southwestern. Исходные данные были вычтены из фона и нормализованы по количеству с использованием программного обеспечения Beadstudio. Нормализованные данные были проанализированы с использованием программного обеспечения GeneSpring, и были созданы списки генов с использованием критериев значимости 1.3-кратного отсечения изменения в сочетании с нестрогим отсечением значения p p <0.05.
Мы сохраняем высокую степень доверия к этим данным по нескольким причинам. Во-первых, все животные были обработаны, обработаны и убиты в одно и то же время в одинаковых условиях. Кроме того, вся обработка РНК и массива была выполнена одновременно. Во-вторых, мы выполнили три повторных массива и объединили несколько животных на выборку массива, тем самым минимизируя различия из-за индивидуальной изменчивости и увеличивая статистическую мощностьS9). В-третьих, критерии анализа данных, используемые для нашего исследования, рекомендованы проектом контроля качества MicroArray, поскольку эти критерии были подтверждены для обеспечения высокой степени межсайтовой воспроизводимости и меж- и внутриплатформенной воспроизводимости (S10–S11).
Конструирование вирусных векторов
Из-за ограничений по размеру вставки вирусного вектора кодирующие последовательности для G9a дикого типа (G9a) или мертвой каталитической G9a (G9aH1093K) были субклонированы в бикистроновую плазмиду, экспрессирующую плазмиду p1005 + HSV, под контролем промотора немедленного раннего цитомегаловируса (CMXNUM) GFP человека (CMC). размер вставки составлял ~ 9 кб, что превышает максимальный размер вставки для векторов AAV-3.96). Промотор IE2 / 4 управляет выражением G5a. Фрагменты субклонировали в бицистронную плазмиду p9 + HSV посредством лигирования тупым концом с обработанным Klenow PmeI и EcoX G1005a (от pcDNA9) и обработанным CIP p3.1 + после EcoRI расщепления. Для получения HSV-ΔJunD-GFP кодирующую последовательность ΔJunD, фланкированную сайтами рестрикции EcoRI, генерировали с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов праймера, содержащих сайт EcoRI. Затем продукт ПЦР лигировали в сайт EcoRI вектора p1005 +. Локальная экспрессия Cre рекомбиназы в нейронах NAc была достигнута с помощью вирус-опосредованной доставки генов с использованием вектора AAV, как описано (S12). GFP или N-концевое слияние GFP с Cre субклонировали в рекомбинантный вектор AAV-2, содержащий промотор CMV с донорной акцепторной последовательностью сплайсинга и сигналом полиаденилирования. Все вставки вектора были подтверждены дидезокси-секвенированием. Вирусные векторы получали с использованием метода тройной трансфекции, без хелпера, как описано ранее (S13). Очищенный вирус хранили при -80 ° C. Качество вируса оценивали по инфекционному титру в клетках HEK293. Вирусы AAV-ΔFosB-GFP получали аналогичным образом. Для HSV-Cre экспрессия Cre управлялась промотором IRES, в отличие от промотора IE4 / 5, чтобы минимизировать экспрессию Cre и предотвратить нейрональную токсичность (см. S14 для вирусного строительства). Во всех случаях была подтверждена избыточная экспрессия вируса, как в пробирке и in vivo, с помощью КПЦР, и вирусы были иммуногистохимически подтверждены, чтобы показать ограниченную экспрессию NAc после операции.
Стереотаксическая хирургия
Под наркозом кетамин (100 мг / кг) / ксилазин (10 мг / кг) мышей помещали в стереотаксический инструмент для мелких животных и подвергали воздействию поверхность черепа. Шприцевые иглы тридцать три калибра использовали для двустороннего введения 0.5 мкл вируса в NAc под углом 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) со скоростью 0.1 мкл / мин. Животным, получавшим инъекции HSV, давали возможность восстановиться в течение дней 2 после операции, в то время как мышам, использованным для поведенческого тестирования, получающим векторы AAV, позволяли восстанавливаться в течение дней 20 перед тем, как подвергнуть кондиционированию на месте. Эти времена согласуются с периодами максимальной вирус-опосредованной экспрессии трансгена для двух векторов. Для инфузий BIX01294 каждый из двух мини-насосов располагался подкожно на спине мыши. Размещение канюль было достигнуто путем сверления двух небольших черепных отверстий над NAc и путем доставки канюли от bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Мышам давали возможность восстановиться после операции от 4 до 5 за сутки до начала процедуры кондиционирования места для кокаина, как описано ниже.
Условное расположение места
Процедура подготовки места была проведена, как описано ранее, со следующими изменениями (S7). Вкратце, через 3 дня после инфузии внутри NAc HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP или HSV-GFP мышей помещали в камеры кондиционирования, которые состоят из трех различных сред. Мыши, которые проявили значительное предпочтение любой из двух камер кондиционирования, были исключены из исследования (<10% всех животных). Затем группы кондиционирования были сбалансированы, чтобы учесть любое возможное смещение камеры. В последующие дни животным вводили физиологический раствор и помещали в одну камеру во второй половине дня на 30 минут, а затем вводили кокаин (10 мг / кг, внутрибрюшинно) и помещали в другую камеру вечером на 30 минут на 2 дня (два физиологический раствор и две пары кокаина). В день испытания мышей помещали обратно в устройство без лечения на 20 минут и тестировали, чтобы оценить, какую сторону они предпочитают. Двигательные реакции на кокаин оценивались с помощью разрыва луча в камерах, соединенных с кокаином, чтобы гарантировать эффективность лечения наркотиками. Для экспериментов AAV и BIX01294 CPP использовался слегка измененный протокол. Животным снова вводили физиологический раствор или кокаин (10 мг / кг, внутрибрюшинно) и помещали в определенные камеры на 30-минутные сеансы, но вместо этого проводили кондиционирование только один раз в день в течение 4 дней с последующим тестом на 5 день (животных кондиционировали вечером чередовали и кондиционирующие процедуры). Для всех групп оценивали исходную локомоцию в ответ на физиологический раствор, чтобы убедиться, что на локомоцию не повлияло лечение вирусами или ингибиторами.
Внутривенное введение кокаина
Самцов крыс Лонг-Эванса-самцов, весивших 230 – 250 г в начале эксперимента, не получали. Они были размещены в среде с контролируемой влажностью и температурой в обратном цикле часов / света 12 (свет выключен в 9: 00 am) с вволю доступ к еде и воде. Крысам позволяли акклиматизироваться в их новой среде, и их обрабатывали ежедневно в течение недели 1 перед началом эксперимента. Все процедуры проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здравоохранения и были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Mount Sinai. Оборудование для самоуправления было оснащено инфракрасными лучами для измерения двигательного поведения. Самостоятельное введение осуществлялось, как описано ранее (S15-S16) с катетерами, имплантированными в правую яремную вену под изофлурановой (2.4–2.7%) анестезией. Катетеры промывали 0.1 мл физиологического раствора, содержащего 10 ЕД гепарина и ампициллин (50 мг / кг). После недели восстановления после операции началось обучение самоуправлению во время темной фазы цикла свет / темнота. Животным позволяли 3-часовой ежедневный доступ к кокаину (0.75 мг / кг / инфузия) в соответствии с графиком подкрепления с фиксированным соотношением-1 (FR1), где 1 активное нажатие на рычаг приводило к однократной инфузии лекарства. Крысы стабилизировали потребление кокаина через 6 дней (<15% вариации в скорости ответа в течение 3 дней подряд, по крайней мере 75% ответили на усиленный рычаг). Через 24 часа после последнего сеанса самостоятельного введения крыс быстро обезглавили, мозг быстро удалили и обработали для выделения РНК и количественной ПЦР.
Иммунопреципитация хроматина (ChIP)
Свежие пуансоны NAc были сшиты формальдегидом и приготовлены для ChIP, как описано ранее (S17-S18) с небольшими изменениями. Вкратце, 4 14-меры NAc-пунши на животное (животные 5, объединенные на образец) собирали, сшивали с 1% формальдегидом и гасили глицином 2 M перед замораживанием при -80 ° C. За день до обработки ультразвуком образца 1 магнитные шарики IgG овец против кролика / мыши (в зависимости от осаждающего антитела) готовили путем инкубации соответствующих магнитных шариков либо с анти-G9a (кроличьи поликлональные сорта ChIP), либо с анти-H3K9me2 (мышиные моноклональные сорта ChIP) антитела в течение ночи при 4 ° C при постоянном вращении в блок-растворе. Обработка ультразвуком тканей и сдвиг хроматина проводились, как описано ранее (S17). После обработки ультразвуком равные концентрации хроматина были перенесены в новые пробирки, и ~ 5% конечных продуктов были сохранены для использования в качестве «входных» контролей. После тщательной промывки и ресуспендирования смесей гранул / антител, конъюгированных, к каждому образцу хроматина добавляли равные объемы смесей антитело / гранулы (~ 7.5 мкг антитело / образец) и инкубировали в течение ~ 16 часов при постоянном вращении при 4 ° C. Образцы дополнительно промывали и подвергали обратному сшиванию при 65 ° C в течение ночи перед очисткой ДНК с использованием набора для очистки ПЦР. После очистки ДНК образцы были подвергнуты КПЦР и нормализованы до соответствующих «входных» контролей, как описано ранее (S17). Иммунопреципитацию нормальных мышиных IgG с использованием мышиных поликлональных анти-IgG-антител также проводили для контроля соответствующего обогащения усиления сигнала. Аденинфосфорибозилтрансферазу (APRT) использовали в качестве отрицательного контроля в экспериментах по сверхэкспрессии кокаина и ΔFosB. Увидеть Дополнительная таблица S5 для последовательностей промоторных праймеров.
Дендритный анализ позвоночника
Для изучения роли G9a в регуляции морфологии нейронов in vivo мы использовали методы, ранее описанные со следующими модификациями (S1). Через три дня после инъекции HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (все вирусы были использованы у мышей дикого типа C57Bl / 6J) или HSV-Cre-GFP (использовалась в G9aП / П мышей), когда вирусная экспрессия была максимальной, мышей перфузировали, мозг подвергали криопротекции, а затем разрезали на 100 мкм на вибратоме. Затем срезы иммуноокрашивали с использованием антитела против GFP, как описано выше (см. Иммуногистохимия). Чтобы оценить влияние сверхэкспрессии и нокаута G9a на количество позвоночника, а также влияние избыточной экспрессии ΔJunD, мы измерили количество шипов приблизительно на нейронах 1 – 2 на нейрон, равное по меньшей мере 299 мкм вторичных дендритов из экспрессирующей GFP среды NAc колючие нейроны (MSNs). Учитывая, что MSNs морфологически отличаются от других нейрональных популяций в NAc, а также в предыдущих сообщениях, указывающих, что HSV преимущественно инфицирует экспрессирующие DARPP-32 нейроны в этой области мозга (S19), мы уверены, что MSN были оценены исключительно в этих исследованиях. Для каждого животного мы исследовали нейроны ~ 6-8 у животных 3-4 на группу (группы 7), после чего было получено среднее значение для каждого животного для статистического анализа. Эксперименты, предназначенные для изучения влияния избыточной экспрессии ΔFosB на плотность позвоночника NAc, проводились аналогично описанному выше, за исключением того, что векторы AAV использовались для экспрессии GFP или ΔFosB-GFP в течение продолжительных периодов времени (недели 8). Все изображения ВПГ были получены с использованием конфокального микроскопа с масляным иммерсионным объективом 100X (изображения AAV были получены с помощью масляного иммерсионного объектива 63X). Изображения были получены с использованием точечного отверстия с произвольной единицей 1 и размером кадра 1024 × 1024. Длина дендритов измерялась с помощью программного обеспечения NIH Image J, а числа позвоночника подсчитывались слепым первичным экспериментатором, так как слайды кодировались до экспериментального сканирования. Среднее число шипов на 10 мкм дендрита было рассчитано.
статистический анализ
Одно- и двухсторонние ANOVA были выполнены для определения значимости для условного предпочтения места и дендритного анализа позвоночника с более чем двумя группами. T-тесты Стьюдента использовались для других сравнений, включая КПЦР, вестерн-блоттинг, дендритный анализ позвоночника, сравнивающих HSV-GFP и HSV-Cre в G9a.П / П мышей, анализы микроматриц (см. выше) и эксперименты по иммунопреципитации хроматина. Запланированные t-тесты Стьюдента были использованы после двухфакторного анализа ANOVA плотности дендритных шипов после сверхэкспрессии ΔFosB с подтверждением значимых основных эффектов лекарственного лечения и вируса. Все значения, включенные в подписи к рисункам, представляют собой среднее значение ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Подробный статистический анализ для Рис. 1–3 в основном тексте даны в: Детальный рисунок Легенды, включая статистику.
Сноски
Я подтверждаю, что ни один из материалов, включенных в рукопись, озаглавленный Существенная роль гистонметилтрансферазы G9a в кокаин-индуцированной пластичности были ранее опубликованы или находятся на рассмотрении в других местах, в том числе в Интернете.
Все работы, связанные с использованием животных, проводились в соответствии с руководящими принципами учреждений и IACUC как в Юго-западном медицинском центре Техасского университета, так и в Медицинской школе Маунт-Синай.
Ссылки и примечания
;
