Функциональная роль N-концевого домена ΔFosB в ответ на стресс и наркотические вещества (2014)

Neuroscience. 2014 Oct 10. pii: S0306-4522(14)00856-2. doi: 10.1016/j.neuroscience.2014.10.002.

Ониши Ю.Н.¹, Ohnishi YH¹, Vialou V², Mouzon E², LaPlant Q², Ниши А³, Nestler EJ⁴.

Абстрактные

В предыдущей работе был задействован фактор транскрипции, ΔFosB, действующий в ядре accumbens, в опосредовании про-вознаграждающих эффектов наркотических средств, таких как кокаин, а также в обеспечении устойчивости к хроническому социальному стрессу. Однако трансгенные и вирусные модели переноса генов, используемые для установления этих фенотипов ΔFosB, экспрессируют в дополнение к ΔFosB альтернативный продукт трансляции мРНК ΔFosB, называемый Δ2ΔFosB, который не имеет N-концевого 78 aa, присутствующего в ΔFosB. Чтобы изучить возможный вклад Δ2ΔFosB в эти фенотипы лекарств и стрессов, мы подготовили вирусный вектор, который сверхэкспрессирует точечную мутантную форму мРНК ΔFosB, которая не может подвергаться альтернативному переносу, а также вектору, который сверхэкспрессирует только Δ2ΔFosB. Наши результаты показывают, что мутантная форма ΔFosB, когда сверхэкспрессируется в ядре accumbens, воспроизводит усиление вознаграждения и устойчивости, наблюдаемую с нашими более ранними моделями, без эффектов, наблюдаемых для Δ2ΔFosB. Сверхэкспрессия полной длины FosB, другого основного продукта гена FosB, также не имеет никакого эффекта. Эти данные подтверждают уникальную роль ΔFosB в ядре accumbens в контроле реакции на наркотики злоупотребления и стресса.

ВВЕДЕНИЕ

ΔFosB кодируется FosB ген и гомологии с другими факторами транскрипции семейства Fos, которые включают c-Fos, FosB, Fra1 и Fra2. Все белки семейства Fos вызываются быстро и временно в определенных областях мозга после острого введения многих наркотических средств [см. Nestler, 2008]. Эти ответы наиболее заметны в ядре accumbens (NAc) и дорсальном полосатом теле, которые являются важными медиаторами полезных и локомоторных действий лекарств. Однако все эти белки семейства Fos очень нестабильны и возвращаются к базальным уровням в течение нескольких часов после введения препарата. Напротив, ΔFosB, благодаря своей необычной стабильности in vitro и in vivo (Ulery и др., 2006; Carle et al., 2006; Ulery-Reynolds и др., 2009), накапливается однозначно в тех же областях мозга после повторного воздействия препарата (Хоуп и др., 1994; Hiroi и др., 1997; Perrotti et al., 2008). Более поздние исследования показали, что хроническое воздействие определенных форм стресса также вызывает накопление ΔFosB в NAc и что такая индукция происходит преимущественно у животных, которые относительно устойчивы к вредным последствиям стресса (то есть к эластичным животным) (Perrotti et al., 2004; Vialou и др., 2010a, 2010b).

Мы продемонстрировали, что чрезмерная экспрессия ΔFosB в NAc либо у индуцируемых битрансгенных мышей, либо путем локального переноса вируса, связанного с вирусом, увеличивает чувствительность животного к полезным и двигательно-стимулирующим эффектам кокаина и других наркотических средств (Kelz et al., 1999; Colby et al., 2003; Zachariou et al., 2006; Grueter и др., 2013; Robison и др., 2013). Такая индукция также повышает потребление и мотивацию естественных вознаграждений (Werme и др., 2002; Teegarden et al., 2007; Уоллес и др., 2008; Hedges и др., 2009; Been и др., 2013; Pitchers et al., 2009; 2013), повышает стимуляцию стимуляции мозга при внутричерепных парадигмах самостимуляции (Muschamps et al., 2012), и делает животных более устойчивыми к нескольким формам хронического стресса (Vialou и др., 2010a, 2010b). Аналогично, мышам, которые конститутивно не хватает полной длины FosB, но показывают увеличенное выражение ΔFosB, отображают уменьшенную чувствительность к стрессу (Ohnishi et al., 2011). Вместе эти результаты подтверждают мнение, что ΔFosB, действуя в NAc, повышает состояние награды, настроения и мотивации животного.

Однако основным предостережением этих исследований является то, что другой продукт FosB ген, называемый Δ2ΔFosB, также экспрессируется во всех этих генетических мутантных мышах и вирусных векторных системах, оставляя открытым возможный вклад Δ2ΔFosB в наблюдаемые поведенческие фенотипы. Δ2ΔFosB транслируется из альтернативного стартового кодона, расположенного внутри ΔFosB транскрипт мРНК (Chen et al., 1997). Этот альтернативный перевод приводит к образованию Δ2ΔFosB, в котором отсутствует X-NUMX N-терминал aa ΔFosB. В этом исследовании мы рассмотрели роль Δ78ΔFosB в моделях злоупотребления наркотиками и стресса путем их сверхэкспрессии или ΔFosB или FosB с векторами AAV (аденоассоциированных вирусов); мы использовали мутантную форму ΔFosB мРНК, которая не может пройти этот альтернативный механизм перевода. Наши результаты подтверждают, что про-награда и про-эластичные действия, наблюдаемые в более ранних исследованиях, действительно опосредованы через ΔFosB, а не двумя другими протонными продуктами FosB ген, полноразмерный FosB или Δ2ΔFosB.

Перейти к:

МЕТОДЫ

Животные

Перед экспериментом мышам 9-11-57BL / 6J (Лаборатория Джексона, Бар-Харбор, ME, США), группа была размещена по пять на клетку в комнате колонии, установленной при постоянной температуре (23 ° C) на цикл 12 hr свет / темнота (загорается на 7 AM) с доступом ad libitum к еде и воде. В некоторых экспериментах использовали битрансгенные мыши, в которых избыточная экспрессия ΔFosB находится под контролем системы регуляции гена тетрациклинов, как описано (Kelz et al., 1999). Мышей использовали на доксициклине (для поддержания экспрессии генов) или без доксициклина, что позволяет экспрессию ΔFosB. Все протоколы были одобрены Институтом по уходу и использованию животных (IACUC) на горе Синай.

AAV векторы

Мы использовали серотип AAV2 для упаковки векторов AAV, экспрессирующих полноразмерный FosB, ΔFosB или Δ2ΔFosB под промотором раннего раннего цитомегаловируса (CMV) человека с флуоресцентным белком Venus, кодированным после промежуточного IRES2 (внутренний сайт повторной регистрации рибосом 2). Конструкция AAV-ΔFosB выражала мутантную форму ΔFosB мРНК, где кодон, представляющий Met79, был мутирован в Leu, чтобы уничтожить альтернативный сайт начала трансляции, который генерирует Δ2ΔFosB.

Вирусно-опосредованный перенос генов

Мышей помещали в небольшие стереотаксические инструменты животных под кетамином (100 мг / кг) и ксилазином (10 мг / кг), а их черепные поверхности подвергались воздействию. Тридцать три калибровочных иглы шприца были двунаправленно опущены в NAc, чтобы влить 0.5 мкл вектора AAV с углом 10 ° (передний / задний + 1.6, медиальный / боковой + 1.5, дорсальный / вентральный - 4.4 мм). Вливания происходили со скоростью 0.1 мкл / мин. Животным, получающим инъекции AAV, было позволено выздоравливать, по крайней мере, за 24 hr после операции. Для подтверждения экспрессии мышей анестезировали и перфузировали внутрисердечно с помощью 4% параформальдегида / PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор). Мозги подвергали криозащите с помощью 30% сахарозы, а затем замораживали и хранили при -80 ° C до использования. Корональные срезы (40 мкм) разрезали на криостате и обрабатывали для сканирования с помощью конфокальной микроскопии.

Поведенческое тестирование

Мышей изучали с помощью нескольких стандартных поведенческих анализов в соответствии с опубликованными протоколами следующим образом:

Хронический (10 дней) социальное поражение выполняли точно так, как описано (Berton и др., 2006; Vialou и др., 2010a). Вкратце, одна экспериментальная мышь и один агрессор CD1 были собраны для 5 min в домашней клетке мыши CD1. Затем их разделили пластиковым разделителем, который был перфорирован, чтобы обеспечить сенсорный контакт для напоминания дня. Каждое утро в течение 10 дней экспериментальная мышь переносилась в другую клетку мыши-агрессора. Непреодолимые контрольные мыши подвергались аналогичным воздействиям, но с другими мышами C57BL / 6J. Тесты для социальное взаимодействие были выполнены, как описано ранее (Berton и др., 2006; Vialou и др., 2010a). Вкратце, тестовая мышь была помещена в новую арену, которая включала небольшую клетку с одной стороны. Движение (например, пройденное расстояние, затраченное время в непосредственной близости от этой маленькой клетки) контролировалось первоначально для 150 сек, когда маленькая клетка была пуста, за которой следовала дополнительная 150 сек с мышью CD1 в этой клетке. Информация о движении была получена с использованием программного обеспечения EthoVision 5.0 (Noldus).

Мы использовали стандартный, беспристрастный предпочтительное место (CPP) (Kelz et al., 1999; Robison и др., 2013). Вкратце, животных подвергали предварительным испытаниям в течение 20 мин в трехкамерной коробке с контролируемым фотобаром с бесплатным доступом к экологически чистым боковым камерам. Мышей затем делили на контрольные и экспериментальные группы с эквивалентными показателями претеста. После экспериментальной манипуляции мышам было проведено четыре тренировочных занятия 30 (чередующиеся кокаины и солевые пары). В тестовый день мыши имели 20 мин неограниченного доступа ко всем камерам, а балльную оценку CPP рассчитывали путем вычитания времени, проведенного в кокаиновой парной, за вычетом времени, проведенного в солевой ячейке. Локомоторную активность, индуцированную кокаином, измеряли через разрывы фотоэлемента в ящике CPP для 30 мин после каждой тестовой инъекции.

Повышенный плюс лабиринт испытания проводились с использованием черного плексигласа, снабженного белыми нижними поверхностями, для обеспечения контрастности (Monteggia et al., 2007). Мышей помещали в центр плюшевого лабиринта и позволяли свободно исследовать лабиринт в течение 5 мин в условиях красного света. Положение каждой мыши с течением времени в открытом и закрытом плечах контролировалось с помощью оборудования для видеосъемки (Ethovision) и потолочной камеры.

Генеральный, амбулаторный локомоторная активность во время ночной фазы оценивали в домашних клетках с помощью сетчатого устройства фотоэлементов (Med Associates Inc., St. Albans, VT, США), которое подсчитывало количество прерываний в амбулаторном фотолучении в течение 12 hr-периода (Roybal и др., 2007).

Вестерн-блоттинг

Образцы NAc подвергали Вестерн-блоттингу, как описано (Vialou и др., 2010a, 2010b). Замороженные вскрытия NAc гомогенизировали в 100 мкл буфера, содержащего коктейли I и II ингибитора фосфатазы (Sigma, St. Louis, MO, USA) и ингибиторы протеазы (Roche, Basel, Switzerland) с использованием ультразвукового процессора (Cole Parmer, Vemon Hills, IL , СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ). Концентрации белка определяли с использованием анализа белка DC (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) и 10-30 мкг белка загружали на гексагликолидные гели 12.5% или 4% -15% для полиакриламидных гелей Tris-HCl для фракционирования электрофореза (Bio -Rad). После переноса белков в нитроцеллюлозные фильтры фильтры инкубировали с анти-FosB-антителом, которое распознает все FosB генных продуктов, затем вторичным антителом и, наконец, количественно определяли с использованием системы Odyssey (Li-Cor) в соответствии с протоколами производителя.

Показатели

Использовали ANOVA и t-критерии Стьюдента с поправкой на множественные сравнения со значимостью p <0.05.

Перейти к:

РЕЗУЛЬТАТЫ

Как показано в Рисунок 1A, FosB ген кодирует мРНК для полноразмерного FosB и для ΔFosB. ΔFosB мРНК генерируется из альтернативного события сплайсинга в Exon 4 FosB первичный транскрипт; это приводит к генерации преждевременного стоп-кодона и усеченного белка ΔFosB, который не имеет C-концевого 101 aa, присутствующего в FosB. FosB и ΔFosB мРНК используют один и тот же стартовый кодон ATG, расположенный к концу 3 Exon 1. Это было известно с момента первоначального клонирования FosB продукты, в которых две мРНК также используют альтернативные сайты начала трансляции в Exon 2, называемые ATX XXXX, Δ1 и Δ2. Предыдущие работы показали, что из продукта Δ генерируется незначительный белковый продуктFosB мРНК, но не FosB мРНК через Δ2 ATG; этот белок называется Δ2ΔFosB и не имеет 78 aa N-концевой области ΔFosB (Chen et al., 1997). Напротив, ATX XXXX и Δ1 кажутся бесшумными, поскольку нет доказательств их использования в переводе FosB или ΔFosB транскриптов.

Рисунок 1

Уровни выражений FosB генные продукты

Рисунок 1B иллюстрирует индукцию FosB генных продуктов в NAc после курса повторного введения кокаина, с животными, обследованными 2 hr после последней дозы кокаина. В этот момент обе белка ΔFosB и FosB показывают значительную индукцию кокаином, без последовательной индукции Δ2ΔFosB. Обратите внимание, что индукция как ΔFosB, так и FosB отличается от картины, наблюдаемой в 24 hr или более после последней дозы препарата, когда индуцируется только ΔFosB из-за уникальной стабильности белка FOSB (Хоуп и др., 1994; Chen et al., 1997; Perrotti et al., 2008). Однако, в отличие от отсутствия индукции Δ2ΔFosB при повторном введении кокаина, битрансгенной мышиной системы, которую мы использовали для сверхэкспрессии ΔFosB и, таким образом, изучали ее поведенческие последствия (Kelz et al., 1999; Colby et al., 2003; Zachariou et al., 2006) приводит к значительному, хотя и более низкому уровню, сверхэкспрессии Δ2ΔFosB в дополнение к ΔFosB (Рисунок 1C). Аналогичный уровень индукции Δ2ΔFosB наблюдается с нашими вирусными векторами, которые сверхэкспрессируют дикого типа ΔFosB (например, см. Рисунок 2). Эти наблюдения повышают вероятность того, что некоторые из предполагаемых действий ΔFosB, о которых сообщалось ранее, могут быть частично опосредованы через Δ2ΔFosB.

Рисунок 2

Выборочное выражение FosB продуктов гена с векторами AAV в клетках Neuro2A

Чтобы отличить дифференциальные роли ΔFosB от Δ2ΔFosB, мы создали вектор AAV, который сверхэкспрессирует только Δ2ΔFosB, а также новый вектор, который сверхэкспрессирует мутантную форму ΔFosB мРНК (mΔFosB мРНК), которые не могут быть подвергнуты альтернативному трансляции для генерации Δ2ΔFosB. Оба вектора также выражают Венеру как маркер выражения. Мы сравнили эффекты этих двух векторов с другими, которые выражают только FosB plus Venus или Venus в качестве контроля. Способность этих новых векторов AAV избирательно сверхэкспрессировать кодированные трансгены изображена в Рисунок 2.

Затем, чтобы проверить влияние каждого FosB гена, действующего в NAc. при комплексном поведении мы ввели каждый из этих AAV в эту область мозга в двухстороннем порядке из отдельных групп мышей, а через 3 через несколько недель, когда трансгенное выражение является максимальным (Рисунок 3A), провела батарею испытаний. Сначала мы оценили способность FosB генных продуктов, чтобы повлиять на фенотип про-эластичности, о котором сообщалось ранее для ΔFosB в парадигме социального поражения (Vialou и др., 2010a, 2010b), Как показано в Рисунок 3A, контрольные мыши, выражающие только Венеру, показали ожидаемый декремент поведения в социальном взаимодействии, хорошо зарекомендовавший себя поведенческий маркер восприимчивости (Berton и др., 2006; Vialou и др., 2010a). Сверхэкспрессия mΔFosB полностью изменила этот фенотип, в отличие от Δ2ΔFosB и FosB, которые не имели никакого эффекта.

Рисунок 3

Влияние FosB генных продуктов в NAc по поведенческим реакциям на кокаин или социальный стресс

Чтобы проверить относительный вклад каждого FosB гена к полезным эффектам кокаина, мы сверхэкспрессировали Δ2ΔFosB сам, mΔFosB или FosB на двусторонней основе в NAc и изучали животных в парадигме предпочтения условного места. Как показано в Рисунок 3B, двусторонняя избыточная экспрессия mΔFosB в NAc увеличивает эффект кондиционирования помещения пороговой дозы кокаина, который не дает значительного места предпочтения у экспрессирующих Венеры контрольных животных. Напротив, избыточная экспрессия Δ2ΔFosB или FosB не влияла на кондиционирование кокаина. Поскольку мы использовали пороговую дозу кокаина, которая не вызывала значительного предпочтения в контрольных животных, мы не можем исключать возможность того, что FosB или Δ2ΔFosB могут снизить полезность кокаина.

Наконец, чтобы оценить базовое поведение, мы рассмотрели локомоторную активность в домашней клетке животных, а также поведение, подобное тревоге, в лабиринте с повышенным плюсом. FosB, mΔFosB или избыточная экспрессия Δ2ΔFosB в NAc влияли на локомоторную активность, хотя FosB и Δ2ΔFosB, но не mΔFosB, вызвали небольшое, но значительное снижение тревожноподобного поведения в лабирине с повышенным плюсом (Рисунок 3D, E). Эти данные показывают, что FosB экспрессия гена существенно не изменяет поведение в нормальных условиях.

Перейти к:

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты настоящего исследования подтверждают, что фенотип, ранее описанный для ΔFosB, действительно опосредован через ΔFosB, а не Δ2ΔFosB, альтернативно переведенный продукт ΔFosB мРНК, которой не хватает N-конца ΔFosB. Хотя наши ранее используемые инструменты для сверхэкспрессии ΔFosB также приводят к генерации низких уровней Δ2ΔFosB, мы показываем здесь, что избыточная экспрессия в NAc мутированной формы ΔFosB мРНК, которая не может генерировать Δ2ΔFosB из-за мутации альтернативного стартового кодона, рекапилизует увеличение как в вознаграждении кокаина, так и в устойчивости к стрессу социального поражения, о котором сообщалось ранее для ΔFosB (Kelz et al., 1999; Vialou и др., 2010a). Более того, избыточная экспрессия Δ2ΔFosB сама по себе не влияет ни на реакцию кокаина, ни на стресс. Мы также впервые показываем, что сверхэкспрессия FosB полной длины в NAc также не влияет на поведенческие реакции на кокаин или стресс.

Хотя эти результаты не исключают возможности того, что Δ2ΔFosB, как незначительный белковый продукт FosB ген, могут оказывать функциональные эффекты в других областях мозга или в периферических тканях, наши результаты тем не менее подтверждают уникальный вклад ΔFosB, действующего в цепи вознаграждения NAc, в поощрении вознаграждения кокаина и устойчивости к стрессу.

Галерея

ΔFosB мРНК приводит к ΔFosB и к второстепенному альтернативному переводу Δ2ΔFosB.
Сверхэкспрессия только ΔFosB подтверждает его про-награду и про-эластичность фенотипа.
Напротив, Δ2ΔFosB не влияет на вознаграждение кокаина или стресс-уязвимость.
Полноразмерный FosB, закодированный FosB мРНК, также не влияет на награду или устойчивость.

Перейти к:

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального института психического здоровья и Национального института по борьбе со злоупотреблением наркотиками, а также Фондом Исибаши и Японским обществом содействия науке (JSPS KAKENHI numbers: 24591735).

Перейти к:

Сноски

Отказ от ответственности издателя: Это файл PDF из неотредактированной рукописи, который был принят для публикации. В качестве сервиса для наших клиентов мы предоставляем эту раннюю версию рукописи. Рукопись будет подвергаться копированию, набору и обзору полученного доказательства до его публикации в его окончательной форме. Обратите внимание, что во время производственного процесса могут быть обнаружены ошибки, которые могут повлиять на содержимое, и все юридические заявления об отказе от ответственности, которые применяются к журналу.

Перейти к:

Функциональная роль N-терминального домена ΔFosB в ответ на стресс и наркотики от злоупотребления (2014)

Абстрактные

ВВЕДЕНИЕ

МЕТОДЫ

Животные

AAV векторы

Вирусно-опосредованный перенос генов

Поведенческое тестирование

Вестерн-блоттинг

Показатели

РЕЗУЛЬТАТЫ

ОБСУЖДЕНИЕ

Галерея

Благодарности

Сноски

Рекомендации

Полезное