(ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ) Поведенческие и структурные ответы на хронический кокаин требуют, чтобы петля с обратной связью, включающая ΔFosB и кальций / кальмодулин-зависимую протеинкиназу II в оболочке Nucleus Accumbens (2013)

Фактор транскрипции ΔFosB и обогащенная мозгом кальция / кальмодулинзависимая протеинкиназа II (CaMKIIα) индуцируются в ядре accumbens (NAc) при хроническом воздействии кокаина или других психотимуляторных препаратов, злоупотребляющих, в которых два белка опосредуют сенсибилизированные лекарственные ответы , Хотя ΔFosB и CaMKIIα регулируют экспрессию и функцию рецептора глутамата AMPA в NAc, образование дендритного позвоночника на средних колючих нейронах NAc (MSN) и локомоторную сенсибилизацию к кокаину, до настоящего времени не было обнаружено прямой связи между этими молекулами. Здесь мы демонстрируем, что ΔFosB фосфорилируется CaMKIIα на стабилизирующем белок Ser27 и что CaMKII является необходимых для опосредованного кокаином накопления ΔFosB в крысах NAc.

И наоборот, мы показываем, что ΔFosB является необходимым и достаточным для индукции кокаина экспрессии гена CaMKIIα in vivo, эффект, избирательный для D₁-типы MSN в субрегионе оболочки NAc.

Кроме того, индукция дендритных шипов на NAc MSN и повышенная поведенческая реакция на кокаин после сверхэкспрессии NAc ΔFosB являются зависимыми от CaMKII.

Важно отметить, что впервые продемонстрирована индукция ΔFosB и CaMKII в NAc кокаиновые наркоманы, предполагая возможные цели для будущего терапевтического вмешательства. Эти данные свидетельствуют о том, что ΔFosB и CaMKII участвуют в позитивном цикле обратной связи в клеточном типе и области мозга в качестве ключевого механизма для регулирования схемы вознаграждения головного мозга в ответ на хронический кокаин.

Введение

Увеличение доказательств подтверждает мнение о том, что изменения в экспрессии генов вносят вклад в механизмы наркомании (Robison и Nestler, 2011). Одним из важных посредников этих изменений является ΔFosB, фактор транскрипции семейства Fos (Nestler, 2008). Хроническое применение практически любого препарата злоупотребления вызывает длительное накопление ΔFosB в ядре accumbens (NAc), лимбической области, необходимой для поведения награды. SИндукция, по-видимому, относится к классу среднего колючего нейрона (МС) NAc, который экспрессирует рецепторы дофамина D1. Индуцируемая избыточная экспрессия ΔFosB в этих DcNUMX-типах NAc MSN увеличивает локомоторные и полезные ответы на кокаин и морфин (Kelz et al., 1999; Zachariou et al., 2006), включая повышенное самообслуживание кокаина (Colby et al., 2003). Кроме того, генетическая или вирусная блокада транскрипционной активности ΔFosB снижает полезность этих препаратов (Zachariou et al., 2006), что указывает на то, что эта устойчивая индукция ΔFosB является критическим медиатором длительных изменений, индуцированных в NAc, с помощью хронического введения лекарственного средства.

Необычная стабильность ΔFosB (по сравнению со всеми другими белками семейства Fos) является одновременно свойством молекулы из-за усечения доменов деграна, присутствующих в полноразмерном FosB (Карл и др., 2007) и регулируемый процесс. ΔFosB фосфорилируют в пробирке и в естественных условиях в Ser27, и эта реакция дополнительно стабилизирует ΔFosB, ~ 10-fold, в культуре клеток и NAc в естественных условиях (Ulery-Reynolds и др., 2009). Хотя было показано, что Ser27-ΔFosB является субстратом для казеин-киназы-2 в пробирке (Ulery и др., 2006), его механизм в естественных условиях фосфорилирование остается неизвестным.

Кальций / кальмодулинзависимая протеинкиназа II (CaMKII) представляет собой высоко экспрессированную серин / треонинкиназу, α и β-изоформы которой образуют додекамерные гомо- и гетероолоензимы в естественных условиях, и необходимы для множественных форм нейропластичности (Lisman и др., 2002; Colbran и Brown, 2004). CaMKIIα индуцируется селективно в оболочке NAc хроническим амфетамином (Loweth и др., 2010), а фармакологическая блокада активности CaMKII в оболочке NAc снижает поведенческую чувствительность к амфетамину (Loweth и др., 2008) и кокаина (Pierce et al., 1998), в то время как вирусная сверхэкспрессия CaMKIIα в этой субрегионе NAc усиливает локомоторную сенсибилизацию и самолечение амфетамина (Loweth и др., 2010). CaMKIIα может влиять на поведение вознаграждения посредством модуляции субъединиц рецептора глутамата AMPA (Pierce et al., 1998), так как активность CaMKIIα уже давно связана с рецепторной функцией AMPA и синаптическим нацеливанием в нескольких формах нейропластичности (Малинов и Маленка, 2002).

Эта литература демонстрирует несколько параллелей между ΔFosB и CaMKII: оба они необходимы и достаточны для множественных поведенческих эффектов наркотических средств, как повышают регуляцию дендритных шипов в различных типах нейронов в естественных условиях (Jourdain и др., 2003; Maze et al., 2010) и оба проявляют по меньшей мере некоторые из их поведенческих эффектов посредством модуляции рецепторов AMPA (Kelz et al., 1999; Малинов и Маленка, 2002; Vialou et al., 2010). Несмотря на эти параллели, функциональная связь между ΔFosB и CaMKII не известна. Здесь мы устанавливаем взаимное регулирование между ΔFosB и CaMKII и демонстрируем, что два белка образуют контур прямой конъюнкции типа ДНК D1 в оболочке NAc, который индуцируется кокаином и регулирует диапазон ответов кокаина в естественных условиях.

Перейти к:

Материалы и методы

Эксперимент 1: iTRAQ Протеомический анализ оболочки и ядра NAc после лечения кокаином (Рис. 1A)

Взрослым (8 неделям) самцам крыс вводили 20 мг / кг кокаина или солевого носителя IP один раз в день в течение семи дней. 24 hr после последней инъекции, оболочка NAc и сердцевина были микродиссифицированы (Рис. 1A) и вспышка заморожена. Анализ iTRAQ проводили, как описано ранее (Ross et al., 2004; Davalos и др., 2010).

Рисунок 1

Специфическая для Shell индуцирование CaMKII в NAc кокаином

Эксперимент 2: количественное определение изменений белка в крысе NAc и оболочке после лечения кокаином (Рис. 1B-D)

Взрослым (8 неделям) самцам крыс вводили 10 мг / кг кокаина или солевого носителя IP один раз в день в течение семи дней в локомоторных камерах. Локомоторные ответы на одну инъекцию кокаина (5 мг / кг IP) регистрировали у тех животных, которые ранее получали кокаин (так называемый «хронический»), и часть пациентов, получавших физиологический раствор (так называемый «острый»), и локомоторные реакции на физиологический раствор один был зарегистрирован у оставшихся хронически обработанных физиологическим раствором животных (так называемый «физиологический раствор»). Анализ локомоторной активности проводили, как описано (Hiroi и др., 1997). Вкратце, взрослые самцы крыс помещали в 18 «× 24» PAS с открытыми полями для записи (инструменты Сан-Диего) для 30 мин для привыкания, получали однократную инъекцию солевого раствора и контролировали на дополнительный 30 мин и получали единичный IP-инъекция кокаина 5 мг / кг и контролируется на 30 мин.

24 hr после этой конечной инъекции, крыс обезглавливали без анестезии, чтобы избежать эффектов анестетиков на уровни белка нейронов и фосфо-состояния. Мозги были серийно отрезаны в матрице размером 1.2 (Braintree Scientific), а ткань-мишень удалялась в ингибиторах фосфатно-буферного солевого раствора протеазы (Roche) и фосфатазы (Sigma Aldrich) с использованием калибровочного пуансона 14 для ядра NAc и калибровочного пуансона 12 оставшегося ткани для оболочки NAc (см. Рис. 1A) и немедленно замораживают на сухом льду. Образцы гомогенизировали световой обработкой ультразвуком в модифицированном буфере RIPA: основание 10 mM Tris, 150 мМ хлорид натрия, 1 мМ EDTA, 0.1% додецилсульфат натрия, 1% Triton X-100, 1% дезоксихолат натрия, pH 7.4, ингибиторы протеазы и фосфатазы как указано выше. После добавления буфера Laemmli белки отделяли на градиентных гелях 4-15% полиакриламида (Criterion System, BioRad) и вестерн-блоттинг проводили с использованием системы Odyssey (Li-Cor) в соответствии с протоколами производителя.

Эксперимент 3: количественное определение изменений белка в крысе NAc и оболочке после выведения кокаина (Рис. 1E)

Взрослым (8 неделям) самцам крыс вводили 10 мг / кг кокаина или солевого носителя IP один раз в день в течение семи дней. Через 14 после окончательной инъекции животным, которым проводили физиологический раствор, вводили еще одну физиологическую пробу (называли «физиологический раствор»), а животным, получавшим кокаин, вводили еще одну инъекцию солевого раствора (например, день отмены 14 или «14d WD») или одну инъекцию кокаина ( называемый «14d WD Chal» для вызова). Через час после окончательной инъекции животных обезглавливали, а вестерн-блоттинг выполняли, как в Experiment 2.

Эксперимент 4: количественное определение изменений белка в сердечнике крысы NAc и оболочке после самообследования кокаина (Рис. 2A-C)

Крыс обучали самостоятельно вводить 0.5 мг / кг / вливание кокаина в течение 1 часа в соответствии с графиком 1 с фиксированным отношением в течение девяти дней. После девяти исходных сеансов крысы были разделены на две группы, сбалансированные по потреблению кокаина на последних двух сеансах. Одной группе крыс было позволено самостоятельно вводить кокаин (0.5 мг / кг / инфузия) в течение одного часа (короткий доступ, ShA), в то время как другая группа крыс самостоятельно вводила кокаин в течение шести часов (длинный доступ, LgA ) в течение десяти дополнительных дней (сеансы эскалации).

Секции головного мозга обрабатывали для иммуногистохимии, как описано (Perrotti et al., 2004). Мозги были перфузированы 18-24 hr после последнего воздействия препарата, что привело к деградации любого остаточного полноразмерного белка FosB, так что вся оставшаяся иммунореактивность отражает ΔFosB. Эта деградация была подтверждена Вестерн-блоттингом, который не показал значительного окрашивания антителом, направленным против С-конца полноразмерного FosB, который не распознает ΔFosB (данные не показаны). После разрезания на секции 35 мкм количество иммуноположительных клеток ΔFosB определяли количественно ослепленным наблюдателем в двух срезах через NAc каждой крысы, а средние значения на поле 40 × затем вычисляли по регионам для каждого животного. Каждое животное считалось отдельным наблюдением для статистического анализа. Регионы, представляющие интерес, были идентифицированы с использованием Paxinos и Watson (Паксинос и Ватсон, 2007).

Количественную оценку иммунореактивности CaMKIIα проводили с использованием системы Licor, как описано (Covington и др., 2009). Интегрированные интенсивности CaMKII и GAPDH определялись с помощью программного обеспечения Odyssey. Результаты представлены как интегрированные значения интенсивности на мм² и представлены как средство ± sem (n = 4-10 на группу). Значения для GAPDH использовались в качестве ссылки для нормализации интенсивности CaMKII для толщины и условий среза.

Рисунок 2

Индукция CaMKII в оболочке NAc самоуправляющихся крыс и людей-кокаиновых наркоманов

Эксперимент 5: количественное определение уровней белка у зависимых от кокаина людей (Рис. 2D)

Процедура

Посмертные ткани человеческого мозга были получены из Квебекского суицидального мозгового банка (Дугласский институт психического здоровья, Монреаль, Квебек, Канада). Сохранение ткани происходило по существу так, как описано (Quirion et al., 1987). Вкратце, когда он был извлечен, мозг помещается на мокрый лед в коробке из пенополистирола и бросился в Квебекский центр суицидального мозга. Полусферы немедленно разделяются сагиттальным срезом в середине мозга, ствола мозга и мозжечка. Кровеносные сосуды, шишковидная железа, сосудистое сплетение, половина мозжечка и половина ствола мозга обычно рассекаются из левого полушария, которое затем разрезается коронально на кусочки толщиной 1 см до замораживания. Последняя половина мозжечка разрезается сагиттально на кусочки толщиной 1cm до замерзания. Ткани замораживают в 2-метилбутане при -40 ° C в течение ~ 60 сек. Все замороженные ткани хранятся отдельно в пластиковых пакетах при -80 ° C для длительного хранения. Конкретные области головного мозга рассекаются от замороженных коронарных ломтиков на пластине из нержавеющей стали с сухим льдом вокруг, чтобы контролировать температуру окружающей среды. Вестерн-блоттинг проводили, как описано в Experiment 2.

когорта

Когорта была составлена ​​из женщин 37 и женщин 3, начиная с возраста 15-66 лет. Все предметы внезапно погибали без продолжительного агонального состояния или затянувшегося заболевания. В каждом случае причина смерти была установлена ​​в офисе коронера Квебека, а токсикологический экран был проведен с образцами тканей для получения информации о медикаментах и ​​употреблении запрещенных веществ во время смерти. Тематическая группа состояла из лиц 20, которые соответствовали критериям SCID-I для зависимости от кокаина. Контрольная группа состояла из субъектов 20 без истории кокаиновой зависимости и серьезных психиатрических диагнозов. Все испытуемые внезапно погибли от причин, которые не оказывали прямого влияния на мозговую ткань. Группы были сопоставлены для среднего субъектного возраста, задержки охлаждения и рН. Для всех испытуемых психологические аутопсии выполнялись, как описано ранее (Dumais et al., 2005), что позволяет нам иметь доступ к подробной информации о случаях заболевания в психиатрической и медицинской истории, а также к другим соответствующим клиническим и социально-демографическим данным. Вкратце, обученный интервьюер провел Структурированное клиническое интервью для DSM-IV Психиатрические расстройства (SCID-I) с одним или несколькими информантами умершего. Группа клиницистов рассмотрела оценки SCID-I, отчеты о случаях заболевания, записки коронера и медицинские записи для получения консенсусных психиатрических диагнозов.

Эксперимент 6: Иммунопреципитация хроматина для крысы NAc (Рис. 3A-C)

Взрослым (8 неделям) самцам крыс вводили 10 мг / кг кокаина или солевого носителя IP один раз в день в течение семи дней. 24 hr после последней инъекции, оболочка NAc и сердцевина были микродиссифицированы. Проводили иммунопреципитацию хроматина (ChIP), объединяли двусторонние NAc-пуансоны оболочки или сердечника из семи крыс на группу в группе общего количества 14 (общее количество животных 98, кокаиновые пулы 7, солевые пулы 7). Ткани сшивали, промывали и хранили при -80 ° C до тех пор, пока полоскание хроматина обработкой ультразвуком. Обрезанный хроматин инкубировали в течение ночи с антителами, ранее связанными с магнитными гранулами (Dynabeads M-280, Invitrogen). В качестве контроля использовали неиммунный IgG. После обратного сшивания и очистки ДНК qPCR использовали для измерения уровней промоторной ДНК CaMKII. Праймеры были сконструированы для усиления области, содержащей консенсусную последовательность AP-1, расположенную ~ 450 bp до сайта начала транскрипции (Forward: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverse: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Рисунок 3

Специфическая индукция CaMKIIα по типу и региону клеток в естественных условиях

Эксперимент 7: Измерение транскрипции CaMKII и экспрессии белка с избыточной экспрессией ΔFosB типа Cell-Type (Рис. 3D)

Мужские мышечные мыши, полученные из NSE-TTA (строка A) × TetOp-ΔfosB (строка 11) и NSE-TTA (строка B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (линия 11) мышей (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme и др., 2002; Zachariou et al., 2006) были задуманы и увеличены на доксициклин 100 мкг / мл для подавления экспрессии ΔFosB во время развития. Однопометники были разделены на отъема: половина оставалась на доксициклине, а половина была переключена на воду, а животных использовали 8 до 11 недель спустя, когда транскрипционные эффекты ΔFosB максимальны (Kelz et al., 1999; McClung и Nestler, 2003). Для анализа транскрипции мышей быстро обезглавливали, а мозг удаляли и помещали на лед. Диссекции NAc брали с помощью иглопробивного устройства 14 и быстро замораживали на сухом льду до тех пор, пока РНК не экстрагировалась. Выделение РНК, qPCR и анализ данных выполняли, как описано ранее (LaPlant et al., 2009). Вкратце, РНК выделяли реагентом TriZol (Invitrogen), дополнительно очищали микрокомпьютером RNAeasy от Qiagen и проверяли на качество с помощью биоанализатора Agilent. Обратную транскрипцию выполняли с использованием iScript (BioRad). qPCR проводили с помощью ПЦР Applied Biosystems 7900HT RT со следующими параметрами цикла: 10 min при 95 ° C; 40 циклов 95 ° C для 1 min, 60 ° C для 30 сек, 72 ° C для 30 сек; градуированного нагрева до 95 ° C для получения кривых диссоциации для подтверждения одиночных продуктов ПЦР. Иммуногистохимический анализ экспрессии белка FOSB и CaMKIIα проводили, как описано в Experiment 4.

Эксперимент 8: эффекты антагонистов рецепторов дофаминового ряда Intra-NAc D1 на кокаин-опосредованные изменения белка (Рис. 3H)

Взрослым (8 неделям) самцам крыс вводили 10 мг / кг кокаина или физиологического раствора (группа «транспортное средство») IP один раз в день в течение семи дней. 30 мин до каждой инъекции кокаина крысам вводили IP либо антагонистом рецептора D1 SCH 23390 (0.5 мг / кг, группой D1 Ant), либо антоганистом рецептора D2 (0.5 мг / кг, группой D2 Ant) , или контрольной инъекцией солевого раствора (группа «кокаин»). 24 hr после окончательной инъекции животных обезглавливали и белки определяли количественно путем Вестерн-блоттинга в соответствии с Experiment 2.

Эксперимент 9: Воздействие AER-опосредованной избыточной экспрессии FOSB на экспрессию белка (Рис. 4 A-C)

Стереотаксическую операцию проводили на взрослых самцах крыс (8 недель) для инъекции AAV-GFP (зеленый флуоресцентный белок) или AAV-GFP-ΔFosB (Maze et al., 2010). Иглы калибра 33 (Гамильтон) использовались для всех операций, в течение которых 0.5 мкл очищенного вируса с высоким титром вводили на билатеральном уровне в течение периода времени 5, после чего добавляли дополнительный период остаточного времени инфузии 5. Все расстояния измеряются относительно Bregma: угол 10 °, AP = + 1.7 мм, Lat = 2.5 мм, DV = -6.7 мм. Через 14 после операции животным была назначена одна инъекция IP кокаина 10 мг / кг в локомоторных камерах мониторинга для оценки поведенческих эффектов избыточной экспрессии ΔFosB. Через 24 через эту конечную инъекцию крысам обезглавили в соответствии с Experiment 2, и микродиссекция ткани проводилась под микроскопом флуоресценции для получения GFP-положительной ткани NAc. Вестерн-блоттинг затем выполняли согласно Эксперимент 2.

Рисунок 4

ΔFosB является одновременно необходимым и достаточным для опосредованной кокаином индукции CaMKIIα, связанной с рецептором D1, в оболочке NAc

Эксперимент 10: эффекты AER-опосредованной избыточной экспрессии JJD на экспрессию белка, зависящей от кокаина (Рис. 4 D-F)

Стереотаксическую инъекцию AAV-GFP или AAV-GFP-ΔJunD проводили согласно Эксперимент 8. Через 14 после операции животным вводили 10 мг / кг кокаина или солевого носителя IP один раз в день в течение семи дней в локомоторных камерах. Были зарегистрированы локомоторные ответы на одну инъекцию кокаина (5 мг / кг IP) или физиологический раствор. 24 час после этой конечной инъекции крыс обезглавливали, собирали ткани и вестерн-блоттинги выполняли, как в Эксперимент 9.

Эксперимент 11: В пробирке Протеин-киназные анализы (Рис. 5A-D)

Рекомбинантные CaMKIIα и ΔFosB очищали от клеток насекомых (Brickey и др., 1990; Jorissen et al., 2007) и анализы протеинкиназы (Colbran, 1993), как описано выше. Вкратце, CaMKII предварительно инкубировали на льду с помощью 2.5 мкМ (или указанной концентрации) ΔFosB, 1 mM Ca²⁺, 40 мМ Mg²⁺, 15 мкМ кальмодулина и 200 мМ HEPES pH 7.5. Фосфорилирование инициировали добавлением 200 мкМ АТФ с или без [γ-³²P] ATP и оставляют для продолжения в течение 10 мин при комнатной температуре (Рис. 5A и B) или 2 min на льду (Рис. 5C и D). Продукты были разрешены вестерн-блоттингом (Рис. 5A и B) или путем авторадиограммы и подсчета сцинтилляции (рис. B-D).

Рисунок 5

ΔFosB является мощным субстратом для CaMKIIα

Эксперимент 12: Идентификация фосфорилирования Ser27 ΔFosB (Рис. 5E)

В пробирке киназные анализы проводили согласно Experiment 11, белки разделяли SDS-PAGE, и полосы, соответствующие ΔFosB, вырезали и подвергали тандемной масс-спектрометрии. Значения m / z соответствующих ионных фрагментов во всех панелях помечены поверх ионных пиков. Не все фрагмент-ионы маркируются из-за ограничений пространства. Как правило, текст для меток-меток-ярлыков окрашен в черный цвет, за исключением случаев, когда они непосредственно подтверждают или добавляют доказательства в присутствие интересующих фосфорилирующих сайтов, и в этом случае они отмечены красным. Доказательства для продуктов фрагментации позвоночника представлены в считывании последовательности фосфопептида с обнаруженным участком остатка фосфорилирования, обозначенным красным, с обозначением одной аминокислотной буквы. Численное описание наблюдаемых фрагментных ионов также отмечено на пептидной последовательности в виде ионов b и y. Коэффициенты масштабирования для участков оси m / z для отображения ионов с меньшей интенсивностью фрагмента отмечены в верхней части каждого фрагментного масс-спектров. Ионы фрагментов, показанные на панели H, подтверждают присутствие фосфорилированной изоформы Ser27, однако, в смеси других фосфорилированных изоформ на сайтах Ser28, Ser31, Ser34 и Thr37. Наличие ионов pa5, pa5-P, pb5 и pb5-P однозначно подтверждает фосфорилирование остатка Ser27.

Эксперимент 13: Количественное определение фосфорилирования Ser27 (Рис. 5F)

Стандартные пептиды были спроектированы, имитируя фосфо- и нефосфорные формы Ser27 ΔFosB. После синтеза и очистки каждый «тяжелый» идиотипический пептид растворяли в буфере ацетонитрил / вода 50 / 50 и отправляли для анализа аминокислот для определения абсолютной концентрации на синтетическом пептидном исходном растворе. Каждый «тяжелый» пептид затем непосредственно вводили в масс-спектрометр 4000 QTRAP (MS) для определения наилучшей энергии столкновения для фрагментации MS / MS и двух-четырех переходов MRM. Затем аккуратные «тяжелые» пептиды подвергали LCMS на 4000 QTRAP для обеспечения разделения пептидов. Инструмент запускался в трехкратном квадрупольном режиме, при этом Q1 устанавливался на конкретном значении m / z прекурсора (Q1 не сканирует), а Q3 устанавливается на конкретное значение m / z, соответствующее конкретному фрагменту этого пептида. В режиме MRM последовательно последовательно измеряли серию отдельных реакций (переходы ионов-предшественников / фрагментов, где энергия столкновения настраивалась для оптимизации интенсивности интересующих фрагментных ионов), и цикл (обычно 1-2 сек) все время разделения ВЭЖХ. Переходы MRM определяли по спектрам MS / MS существующих пептидов. Затем были выбраны два перехода на пептид, соответствующие высокоинтенсивным фрагментовым ионам, и энергия столкновения оптимизирована для максимизации мощности сигналов MRM-переходов с использованием программного обеспечения автоматизации. Затем сравнивали пики, полученные в результате стандартных пептидов и образцов ΔFosB, подвергнутых воздействию CaMKII или контрольного, для определения абсолютного содержания каждой пептидной формы в реакции. Анализ данных по данным LC-MRM выполняется с использованием программного обеспечения AB Multiquant 1.1.

Эксперимент 14: индукция ΔFosB в сверхэкспрессирующих мышах CaMKII (Рис. 5G и H)

Трансгенные мыши, сверхэкспрессирующие T286D CaMKII (Mayford et al., 1996; Kourrich и др., 2012) и однопометников дикого типа были подняты в отсутствие доксициклина, чтобы обеспечить трансгенную экспрессию. Взрослым мышам вводили 20 мг / кг кокаина или солевого раствора IP один раз в день в течение 14 дней. 24 hr после окончательной инъекции животных обезглавливали, а иммуногистохимию и количественную оценку экспрессии ΔFosB выполняли, как в Experiment 4.

Эксперимент 15: эффекты HSV-опосредованной гиперэкспрессии ΔFosB и ингибирования CaMKII на NAc дендритных шипах (Рис. 6A-E)

Взрослых самцов мышей (8 недель) стереотаксически вводили в NAc с HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB (Olausson и др., 2006), HSV-GFPAC3I или HSV-GFPAC3I-ΔFosB. В этих конструкциях AC3I, ингибитор активности CaMKII на основе пептидов, слит с C-концом GFP. GFPAC3I клонировали с помощью ПЦР с использованием вектора pMM400, содержащего GFPAC3I, в качестве матрицы со следующими праймерами: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' (clampNheIKozakmet); GFP-AC3I-R: 5 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). Полученный продукт ПЦР вставляли в векторы p1005 + и p1005 + -Δ FosB с использованием сайтов NheI и BspEI. Конструкция была подтверждена секвенированием. Стереотаксические координаты: угол 10 °, AP = + 1.6 мм, Lat = + 1.5 мм, DV = -4.4 мм (Barrot et al., 2002). Перфузию и разделение мозга выполняли согласно Experiment 4.

Анализ позвоночника выполнялся, как описано (Christoffel и др., 2011). Вкратце, дендритные сегменты 50-150 мкм от сомы были случайным образом выбраны из инфицированных HSV клеток, которые экспрессируют GFP. Изображения были получены на конфокальном LSM 710 (Carl Zeiss) для морфологического анализа с использованием NeuronStudio с алгоритмом лучей. NeuronStudio классифицирует шипы как тонкие, грибные или колючие на основе следующих значений: (1) соотношение сторон (2) от головы до шеи и (3) диаметр головки. Шипы с шеей можно классифицировать как тонкие или грибы, а те, у кого нет значительной шеи, классифицируются как короткие. Шипы с шеей обозначены как тонкие или грибы на основе диаметра головы.

Рисунок 6

Блокада активности CaMKII предотвращает морфологические и поведенческие эффекты ΔFosB в NAc

Эксперимент 16: эффекты HSV-опосредованной гиперэкспрессии ΔFosB и ингибирования CaMKII на реакции кокаина (Рис. 6F)

Взрослым самцам мышей вводили вирусы согласно Experiment 15, а локомоторные ответы на одну инъекцию кокаина 5 мг / кг измеряли согласно Эксперимент 9. Локомоторные данные выражаются как суммарные разрывы пучка через 30 мин после инъекции кокаина.

Дополнительная информация

Жилье для животных

Самцы крыс Sprague Dawley (250-275 g, Charles River Laboratories) были в паре. Восемь недельных самцов мышей C57BL / 6J (Лаборатория Джексона) были группами, в которых содержалось максимум пять животных на клетку. Все животные были приучены к животному объекту за ≥1 неделю до экспериментальных манипуляций и размещались в комнатах с контролируемым климатом (23-25 ° C) в цикле света / темноты 12 hr (загорается на 7: 00 AM) с доступом к пище и вода вволю, Эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Общества нейронауки и комитета по институциональному уходу и использованию животных (IACUC) на горе Синай.

Наркотики

Препараты вводили в виде IP и растворяли в стерильном физиологическом растворе, включая кокаин (5-20 мг / кг на 10 мкл для мышей, на 1 мл для крыс, NIDA) и SCH 23390 или этиклопрадь гидрохлорид (0.5 мг / кг на 1 мл, Tocris) , Для стереотаксической хирургии мышей анестезировали «коктейлем» кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) (Генри Шейн) в стерильном физиологическом растворе.

Антитела

CaMKIIα (всего): Upstate 05-532, 1: 5,000

CaMKII phospho-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (всего): Cell Signaling 5G4, 1: 250

ΔFosB phospho-Ser27: фосфосоединения, 1: 500

GluA1 (всего): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07-598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Статистический анализ

Все статистические анализы были выполнены с использованием программного пакета Prism 6 (GraphPad). Студенческие t-тесты использовались для всех парных сравнений (указано в результатах, где указано значение t), а однонаправленные ANOVA использовались для всех множественных сравнений (указано в разделе результатов, где указано значение F).

Перейти к:

Итоги

Хронический кокаин вызывает CaMKII в оболочке NAc

Многие исследования показали, что у MSN в оболочке и сердечнике NAc разные биохимические и физиологические реакции на хроническое воздействие наркотических средств (Kourrich и Thomas, 2009; Loweth и др., 2010) и что две подобласти по-разному регулируют поведение, связанное с наркотиками (Ito et al., 2004). Чтобы определить дифференциальные эффекты кокаина на белковые составляющие оболочки NAc против ядро, мы использовали мультиплексную изобарическую метку (iTRAQ) и тандемную масс-спектроскопию (MS / MS). Взрослым самцам крыс вводили ИП кокаином (20 мг / кг) или физиологическим раствором ежедневно в течение 7 дней; 24 hr после последней инъекции, оболочка NAc и сердцевина были микродиссифицированы (Рис. 1A) и вспышка заморожена. Затем белки в этих образцах определяли количественно с использованием iTRAQ. Все четыре изоформы CaMKII демонстрировали значительное увеличение экспрессии после лечения кокаином, которые были специфичны для оболочки NAc по сравнению с сердечником. Несколько белковых фосфатаз, включая каталитические и регуляторные субъединицы PP1 и PP2A, которые ранее были связаны с различными субстратами CaMKII в других системах (Colbran, 2004), следуют аналогичной схеме. Эти данные предоставили новое, беспристрастное доказательство того, что сигнальный путь CaMKII заметно регулируется кокаином в NAc специфичным для оболочки образом.

Чтобы подтвердить это обнаружение более количественно, мы лечили крыс, как указано выше, с кокаином (в разных дозах) или физиологическим раствором и измеренными локомоторными ответами на кокаин (5 мг / кг) или дозу солевого раствора. Повторное воздействие кокаина 10 мг / кг приводило к типичной модели локомоторной сенсибилизации (Рис. 1B). Дальнейшие исследования с этим режимом дозирования показали, с помощью Вестерн-блоттинга, что повторный кокаин селективно избирает CaMKIIα в оболочке NAc 24 hr после окончательной инъекции кокаина (Рис. 1C и D; р = 0.0019; F = 7.943; DF = 29). Кроме того, фосфорилирование канонического субстрата CaMKII Ser831 субъединицы GluA1 рецептора AMPA было значительно увеличено в оболочке NAc, а не в сердечнике (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), тогда как автофосфорилирование CaMKIIα Thr286 имело сильный, но не значительная тенденция к индукции только в оболочке (Рис. 1D). Несколько других глутаматных рецепторов не были затронуты. В отличие от этих мер CaMKII, те же образцы тканей отображали индукцию ΔFosB в обеих оболочках (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) и сердцевина (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) NAc (Рис. 1C и D), что согласуется с предыдущими результатами (Perrotti et al., 2008).

Поскольку несколько предшествующих исследований регуляции кокаина рецепторов AMPA анализировали животных после ~ 14 дней отхода от хронического кокаина (см. Обсуждение), мы повторили эти биохимические анализы в этот момент времени. Мы обнаружили, что через 14 дней после окончательной инъекции кокаина ΔFosB остается повышенным в NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), в то время как ни CaMKII, ни фосфорилирование GluA1 Ser831 не увеличиваются (Рис. 1E). Тем не менее, 1 hr после однократной дозы кокаина 10 мг / кг, уровни общего CaMKII (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) и GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) фосфорилирование повышается до такой же степени, как и при первоначальном хроническом воздействии кокаина (Рис. 1E). Эти данные показывают, что нейроны оболочки NAc заправлены для индукции CaMKII в течение длительных периодов воздержания, возможно, путем прямого праймирования промотора гена CaMKII (см. Обсуждение). Более того, тот факт, что индукция ΔFosB более устойчива, чем индукция CaMKII, предполагает существование дополнительных механизмов, основанных на хроматине или иным образом, которые оказывают «тормоз» на регулирование CaMKII, как описано в обсуждении.

Для дальнейшего укрепления этих наблюдений мы изучили модели самообслуживания кокаина, которые включают волевое употребление наркотиков. Взрослым самцам крыс давали короткий или длинный доступ к кокаину; как и ожидалось (Ахмед и Кооб, 1998), только условия длительного доступа привели к эскалации самолечения препарата (Рис. 2A). ΔFosB в большей степени индуцировали против короткий доступ к кокаину в обеих оболочках NAc (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) и ядро ​​(p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). Напротив, CaMKIIα индуцировали в оболочке NAc только путем длительного доступа к кокаину (Рис. 2B и C; р = 0.0236; F = 4.957; DF = 16). Интересно сравнить среднее ежедневное потребление кокаина у короткоходных животных (~ 12 мг / кг IV), животных с длинным доступом (~ 70 мг / кг IV) и животных, которым управляют экспериментаторы (10 мг / кг), и спросите, почему последний вызывает надежную индукцию ΔFosB и CaMKII, тогда как короткого доступа нет. Это расхождение, вероятно, связано с различиями в пиковых уровнях кокаина (кокаин, вводимый экспериментатором, вводится в виде единого болюсного ИП, тогда как кокаин вводится через несколько доз IV) или путем различия в длительности воздействия лекарственного средства (дни 7 для экспериментатора администрирование, дни 19 для самостоятельного администрирования).

Несмотря на большую литературу по ΔFosB и CaMKII в действии кокаина, исследования этих белков у людей кокаина отсутствуют. Здесь мы представляем первое доказательство того, что уровни NAFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) и CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) увеличиваются в NAc кокаин-зависимых людей (Рис. 2D, Таблица 1). Эти данные показывают, что наше исследование индукции ΔFosB и CaMKII кокаином в грызуне NAc клинически имеет отношение к наркомании кокаина.

Таблица 1

Характеристика образцов у людей-кокаиновых наркоманов и контрольной группы

ΔFosB регулирует транскрипцию CaMKII выборочно в D1-типах MSN из NAc Shell

Вывод о том, что оба CaMKII и ΔFosB активизированы кокаином в грызуне NAc, заставили нас определить, может ли ΔFosB регулировать транскрипцию гена CaMKII. Ранее мы сообщали о CaMKIIα в качестве возможной цели для ΔFosB в беспристрастном анализе микрочипов NAc (McClung и Nestler, 2003), но этот вывод еще не был подтвержден в этом исследовании. Сначала мы использовали количественный ChIP (qChIP-ChIP с последующей количественной ПЦР), чтобы определить, связывается ли ΔFosB с промотором гена CaMKIIα у NAc взрослых самцов крыс и обнаружил поразительно, что это связывание значительно увеличивается при хроническом введении кокаина в оболочке ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), но не ядро, субрегион (Рис. 3A). Для дальнейшего понимания механизмов, связанных с этой специфической субрегионовой разницей в связывании ΔFosB с промотором CaMKIIα, мы использовали qChIP для характеристики состояния модификаций гистонов в этой геномной области. В предыдущих исследованиях продемонстрирована индукция кокаина ацетилирования H3 на промоторе CaMKIIα в общей мышиной NAc (Wang et al., 2010). Напротив, мы обнаружили, что кокаин селективно выделяет ацетилирование H3 на промоторе CaMKIIα в ядре NAc (Рис. 3B; р = 0.0213; т = 2.726; df = 10), без изменений, видимых в оболочке, в соответствии с изменениями хроматина, специфичными для субрегиона, за пределами привязки ΔFosB. qChIP для репрессивной метки, диметилированный H3-лизин 9 (H3K9me2), выявил тенденции снижения как в оболочках, так и в субрегионах ядра (Рис. 3C).

Чтобы определить, регулирует ли ΔFosB транскрипцию CaMKIIα в естественных условиях, мы использовали две линии битрансгенных мышей, которые индуцивно сверхэкспрессируют ΔFosB, в частности, в D1 против D2-типа MSNs способом, контролируемым доксициклином в питьевой воде (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme и др., 2002). Взрослые самцы мышей, сверхэкспрессирующие ΔFosB исключительно в D1-типах MSN, имели значительно повышенный уровень мРНК CaMKIIα в NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), эффект, который не наблюдается у мышей, сверхэкспрессирующих ΔFosB преимущественно у MSN-типа D2 (Рис. 3D). Увеличение мРНК CaMKIIα, индуцированное экспрессией ΔFosB в ДНК MSN D1, сопровождалось сопутствующим увеличением белка CaMKIIα в обеих оболочках NAc (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) и сердцевине (p = 0.0392; t = 2.275; df = 14; Рис. 3E и F). Эти данные демонстрируют, что ΔFosB способен управлять экспрессией гена CaMKIIα в MSN-типах D1 в обеих субрегионах, хотя Рисунок 3B предполагает, что кокаино-опосредованные изменения хроматина на промоторе CaMKII (например, уменьшенное ацетилирование) не позволяют ΔFosB активировать CaMKII в основной субрегионе после кокаина.

Поскольку наши данные о трансгенных мышах показали, что ΔFosB-индукция экспрессии гена CaMKII специфична для MSN типа D1 в NAc, мы затем попытались определить, требует ли кокаин-зависимая повышающая регуляция CaMKII активации дофаминового рецептора D1. Взрослым самцам крыс вводили хронический кокаин или физиологический раствор, как и раньше, но за 30 минут до каждой инъекции крысам в группе кокаина вводили внутрибрюшинную инъекцию физиологического раствора, антагониста D1 SCH 23390 (0.5 мг / кг) или антагониста рецептора D2 этиклоприда. (0.5 мг / кг). Животных анализировали через 24 часа после последней инъекции кокаина. Вестерн-блоттинг показал, что антагонист D1, но не D2, полностью блокировал опосредованное кокаином увеличение ΔFosB (p <0.0001; F = 18.96; df = 18), как сообщалось ранее (Nye et al., 1995), а также в CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Рис. 3G и H). Эти данные подтверждают гипотезу о том, что кокаин взаимодействует с ΔFosB-опосредованным увеличением экспрессии гена CaMKII, особенно у DsNUMX-типа MSNs оболочки NAc. В будущих исследованиях было бы важно продемонстрировать непосредственно этот специфический эффект клеточного типа кокаина на экспрессию CaMKII в этой области мозга.

ΔFosB является необходимым и достаточным для индукции кокаина CaMKII в оболочке NAc

В дополнение к использованию битрансгенных мышей мы изучили роль ΔFosB в опосредовании индукции кокаина CaMKIIα с помощью вирусного опосредованного переноса генов у крыс. Мы вводили на двусторонней основе аденоассоциированные вирусные (AAV) частицы в оболочку NAc взрослых самцов крыс (где оболочка может быть выборочно нацелена) для сверхэкспрессии только ΔFosB плюс GFP или GFP. Затем животным давали одну инъекцию IP кокаина 10 мг / кг. У животных, сверхэкспрессирующих ΔFosB / GFP, наблюдался повышенный локомоторный ответ по сравнению с животными, сверхэкспрессирующими только GFP (Рис. 4A). Через 24 через одну инъекцию кокаина GFP-положительная ткань NAc была вырезана у этих животных путем вскрытия под флуоресцентным источником света. Вестерн-блоттинг этой ткани (Рис. 4B и C) показали сильную избыточную экспрессию ΔFosB, а также значительное увеличение общего белка CaMKIIα по сравнению с животными GFP (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), аналогично индукции, наблюдаемой при хроническом введении кокаина. Кроме того, аутофосфорилирование CaMKIIα в Thr286 (указывающее на активацию фермента) было увеличено сверхвыражением ΔFosB (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), как и фосфорилирование субстрата CaMKII, Ser831 GluA1 (p = 0.0540; t = 2.012; df = 28), снова имитируя действия хронического кокаина (Рис. 1C и D). TЭти данные дают еще одно доказательство того, что экспрессия ΔFosB в оболочке NAc достаточна для локомоторной сенсибилизации кокаину и индукции и активации CaMKII в этой субрегионе.

Мы использовали аналогичный подход, чтобы определить, необходим ли ΔFosB для опосредованной кокаином индукции CaMKIIα в оболочке NAc. AAV использовали для сверхэкспрессии усеченного JunD-белка, называемого ΔJunD, который является отрицательным регулятором активации транскрипции ΔFosB (Winstanley и др., 2007) плюс GFP или GFP. Две недели спустя, когда экспрессия трансгена максимальна, животным давали кокаин (10 мг / кг) или физиологического раствора ежедневно в течение 7 дней, и проверены на локомоторных ответов на кокаин вызов (5 мг / кг) 24 ч после последнего хронического введения (Рис. 4D). Сверхэкспрессия ΔJunD предотвращала сенсибилизацию локомотора кокаину, а также предотвращала индукцию и активацию CaMKIIα в оболочке NAc (Рис. 4E и F; р = 0.0437; F = 2.997; общий df = 38), что указывает на то, что активность транскрипции ΔFosB необходима для опосредованной кокаином индукции CaMKIIα в этой субрегионе. Интересно, что мы обнаружили, что ΔJunD уменьшает уровни ΔFosB при обоих состояниях, вызванных физиологическим раствором и кокаином (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), что повышает новую возможность того, что ΔFosB зависит от активности AP-1 для собственных уровней экспрессии.

CaMKII Фосфорилаты ΔFosB в Ser27

. в пробирке протеинкиназ, мы определили, что очищенный ΔFosB является надежным субстратом для CaMKIIα. Инкубация Его₆-ΔFosB с CaMKIIα и АТФ вызывали восходящий сдвиг в электрофоретической подвижности ΔFosB (Рис. 5A); несколько результирующих полос предложили несколько участков фосфорилирования. Аналогичный в пробирке киназы с использованием [γ-³²P] ATP показал включение радиоактивно меченного фосфата в сдвинутые полосы ΔFosB (Рис. 5B), демонстрируя прямое фосфорилирование белка. Мы создали фосфоспецифическое антитело к ранее описанному Ser27 ΔFosB (Ulery и др., 2006). Хотя это антитело не продуцирует сигнал против мозговых экстрактов, которые содержат Ser27-фосфорилированный ΔFosB (данные не показаны), мы смогли обнаружить фосфорилирование Ser27 в в пробирке киназы с использованием CaMKII (Рис. 5B). Кинетический анализ фосфорилирования CaMKII ΔFosB указывает на то, что он является мощным субстратом для киназы (Рис. 5C), с кажущимся K_M 5.7 ± 2.0μM и K_КПП 2.3 ± 0.3min^-1, Эти результаты сопоставимы со многими хорошо охарактеризованными в естественных условиях субстраты CaMKII (Colbran и Brown, 2004). Кроме того, мы определили, что CaMKII фосфорилирует ΔFosB со стехиометрией 2.27-0.07 моль / моль (Рис. 5D), что указывает на наличие по меньшей мере трех участков фосфорилирования CaMKII в пределах His₆-ΔFosB, в соответствии с Рис. 5A.

Чтобы исследовать отдельные участки фосфорилирования, мы использовали MS-анализ образцов из нашего в пробирке киназных анализов. Рис. 5E демонстрирует фосфорилирование ΔFosB в ранее описанном Ser27 и на нескольких дополнительных сайтах (данные не показаны). Учитывая предшествующую функциональную характеристику Ser27, мы сосредоточились на этом сайте, создав меченые синтетические пептиды, имитирующие фосфо- и нефосфосостояния Ser27, а затем использовали известные количества этих пептидов в качестве стандартов в МРМ-анализе ΔFosB до и после в пробирке фосфорилирование CaMKII. Последующее количественное определение (Рис. 5F) подтверждает, что Ser27 является мощным субстратом для CaMKII. Эти результаты показывают, что среди многочисленных фосфорилированных остатков в ΔFosB Ser27 является особенно эффективным субстратом для CaMKII.

CaMKII опосредует накопление кокаина ΔFosB в оболочке NAc

Поскольку CaMKII может фосфорилировать ΔFosB в пробирке на сайте, который значительно повышает его стабильность в пробирке и в естественных условиях (Ulery и др., 2006; Ulery-Reynolds и др., 2009), мы определили, контролирует ли активность CaMKII уровни ΔFosB в NAc в естественных условиях, Для решения этого вопроса мы впервые использовали линию мыши, сверхэкспрессирующую кальций-независимый мутант CaMKIIα (T286D) в нескольких областях мозга, включая NAc (Mayford et al., 1996; Kourrich и др., 2012). Мы инъецировали мутант взрослого самца мужского мутанта и мутантов дикого типа с 20 мг / кг кокаина или физиологического раствора один раз в день в течение 14 дней, а затем проанализировали животных через один день после окончательной инъекции. Мы обнаружили, что базальные уровни ΔFosB были увеличены у мутантных животных в оболочке NAc (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), но не ядро ​​(Рис. 5G и H). Удивительно, но кокаин-зависимая индукция ΔFosB была блокирована у мутантных животных как в оболочке, так и в сердечнике, что указывает на то, что хотя CaMKII может непосредственно регулировать стабильность ΔFosB в оболочке NAc, он также может находиться выше по течению от ΔFosB в кокаино-активированных путях в обеих субрегионах NAc ,

Активность CaMKII необходима для структурной и поведенческой пластичности, опосредованной ΔFosB

Индукция кокаина дендритных шипов на NAc MSNs является одной из наиболее эффективных рецептурных адаптаций в этой области мозга, и такая индукция позвоночника коррелирует с сенсибилизированными поведенческими реакциями на препарат (Робинсон и Колб, 2004; Russo и др., 2010) и сообщается, что он является избирательным для MSN типа D1 (Lee et al., 2006). Недавно мы продемонстрировали, что индукция кокаина дендритных шипов в NAc зависит от ΔFosB и его транскрипционной программы ниже по течению (Maze et al., 2010). Хотя имеется обширная литература об участии CaMKII в морфологии дендритных позвонков и индукции в других областях мозга и экспериментальных системах (Jourdain и др., 2003; Penzes и др., 2008; Окамото и др., 2009), его роль в формировании позвоночника NAc MSN не изучалась. Таким образом, мы определили, требуется ли активность CaMKII для опосредованной ΔFosB индукции дендритных шипов MSN, используя HSV-опосредованную сверхэкспрессию пептида ингибитора CaMKII AC3I, слитого с GFP, конструкцию, которая ранее была показана для ингибирования активности CaMKII в естественных условиях (Чжан и др.., 2005; Klug et al., 2012). Вирусная сверхэкспрессия ΔFosB в оболочке NAc взрослых мышей вызвала значительное увеличение плотности дендритных шипов MSN (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Рис. 6A и B), как сообщалось ранее (Maze et al., 2010), и это увеличение было обусловлено прежде всего тонким (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) и коротким (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) типом позвонков (оба считались незрелыми шипами) (Рис. 6C-E). Никакого эффекта не наблюдалось на более зрелых грибных шипах. Однако, когда GFP-AC3I был коэкспрессирован, ΔFosB индукция шипов была полностью отменена (Рис. 6A-E), что указывает на то, что активность CaMKII необходима для индукции ΔFosB дендритных шипов в оболочке NAc.

Затем мы использовали одни и те же вирусные инструменты, чтобы определить, требуется ли действие CaMKII для воздействия ΔFosB на поведенческую чувствительность к кокаину. 72 hr после инъекции вируса в оболочку NAc животным давали одну инъекцию кокаина 5 мг / кг и регистрировали их локомоторную активность. Как показано ранее с более расширенной сверхэкспрессией AAV ΔFosB (Рис. 4A), HSV-опосредованная избыточная экспрессия ΔFosB повышает локомоторную чувствительность к кокаину (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Рис. 6F). Как и при индукции дендритных шипов, ингибирование активности CaMKII путем коэкспрессии GFP-AC3I полностью блокировало опосредованное ΔSosB увеличение чувствительности кокаина, указывая на то, что активность CaMKII необходима для индуцированных ΔFosB изменений в поведенческих эффектах кокаина.

Перейти к:

Обсуждение

В настоящем исследовании описывается новый механизм подачи вперед, когда кокаин индуцирует ΔFosB в NAc, который избирательно регулирует транскрипцию гена CaMKIIα в оболочке NAc. CaMKIIα впоследствии фосфорилирует и стабилизирует ΔFosB, приводя к большему накоплению ΔFosB, и к дальнейшей индукции CaMKIIα (Рис. 6G). Соэкскалирующие уровни двух белков при хроническом воздействии кокаина затем вносят существенный вклад в сенсибилизированные поведенческие реакции на препарат. Это особенно привлекательная гипотеза о том, что как ΔFosB, так и CaMKII были продемонстрированы ранее, чтобы потребоваться для повышения поведенческих реакций на кокаин (Pierce et al., 1998; Peakman и др., 2003), и мы повторяем этот вывод для ΔFosB в оболочке NAc, специально используя вирусный подход (Рис. 4 и and66).

Хотя трансгенная избыточная экспрессия ΔFosB у MSN D1 может приводить к индукции CaMKII как в оболочке NAc, так и в ядре кокаиновых наивных животных, в контексте кокаина накопление эндогенного ΔFosB, которое происходит в обеих субрегионах, приводит к индукции CaMKII, в частности, в оболочке NAc , Это различие может относиться к более высоким уровням ΔFosB, индуцированным в нашей битрансгенной модели, однако это может также отражать способность кокаина дифференцировать альфа-промотор CaMKIIα в оболочке против чтобы либо способствовать связыванию ΔFosB в первом, либо исключить его в последнем субрегионе. Фактически, наши данные ChIP, которые показывают опосредованное кокаином деацетилирование гистонов в промоторе гена CaMKIIα только в ядре NAc, подтверждают возможное участие механизма хроматина. В соответствии с этой гипотезой избыточная экспрессия ΔFosB в MSN-типах D1 была способна индуцировать индукцию CaMKIIα в ядре NAc в отсутствие кокаина (Рис. 3F), предполагая, что существуют активные модификации промотора CaMKIIα, которые предотвращают эту индукцию при хроническом воздействии кокаина. Регулирование ландшафта хроматина на промоторе CaMKII может также объяснить, почему CaMKII индуцируется пробной дозой кокаина в оболочке NAc хронических кокаин-выводящих крыс (Рис. 1E), но не у наивных животных,Рис. 1D). Это может представлять собой эпигенетический эффект «гель-прайминга» ΔFosB (Robison и Nestler, 2011) и, таким образом, может быть одним молекулярным механизмом инкубации кокаиновой тяги (Pickens и др., 2011). Однако, поскольку это изменение хроматина должно быть причинно связано с инкубацией жажды, оно со временем должно увеличиваться. Будет интересно определить, если это так, и изучить, показывают ли другие гены зависимую от FSB зависимую субрегионную регулировку кокаином. Также важно отметить, что описанная нами петля обратной связи не приводит к бесконечному накоплению CaMKII или ΔFosB (Рис. 1E); раскрытие молекулярного «тормоза», ответственного за это, является важной целью будущих исследований.

Известные функции ΔFosB и CaMKII в нескольких экспериментальных системах и областях мозга сходятся на многих уровнях (Рис. 6F). Обе молекулы тесно связаны с ростом дендритного позвоночника: CaMKII взаимодействует с актиновым цитоскелетом (Окамото и др., 2009), регулирует размер головки позвоночника (Мацузаки и др., 2004) и является необходимым и достаточным для индуцированного пластичностью увеличения филоподии и числа синапсов в органотипических культурах гиппокампа (например,Jourdain и др., 2003) Вhile ΔFosB является необходимым и достаточным для образования коллагена дендритного позвоночника в NAc MSNs (Maze et al., 2010). Кроме того, обе молекулы были связаны с регуляцией рецепторов глутамата AMPA. CaMKII не регулирует полные уровни субъединиц рецептора AMPA, но приводит к введению рецепторов AMPA в синапсы и увеличивает проводимость канала AMPA путем фосфорилирования GluA1 в Ser831 в пирамидальных нейронах гиппокампа в культуре и в естественных условиях (рассмотрено в (Малинов и Маленка, 2002; Colbran и Brown, 2004)). Такой рост незаконного проникновения GluA1 в синапс также замешан в хроническом действии кокаина (Будро и Вольф, 2005). Более того, поведенческие реакции на активацию АМРА-рецептора в NAc усиливаются сверхэкспрессией CaMKIIα в зависимом от рецептора D1 рецепторах (Сингер и др., 2010). Показано, что долгосрочная D1-избыточная экспрессия ΔFosB индуцирует транскрипцию GluA2 в NAc (Kelz et al., 1999), который ослабляет реакции AMPA, опосредованные через GluA1, в то время как мы показываем здесь, что более короткая избыточная экспрессия ΔFosB, а также более короткое воздействие на кокаин - не влияют на эту субъединицу (рис 1). Тем не менее, мы недавно обнаружили, что кратковременное избыточное экспрессия ΔFosB, тем не менее, уменьшает ответы AMPA у MSN-типа D1 в NAc (Grueter и др., 2013). Эти данные указывают на временные механизмы, которые могут представлять собой зависящую от времени серию нейроадаптаций к кокаину, которые лежат в основе различных аспектов прогрессирования наркомании, еще недостаточно изученных. На поведенческом уровне, как CaMKII, так и ΔFosB необходимы для локомоторной сенсибилизации кокаину (см. Выше), и оба они необходимы для устойчивого самоконтроля кокаина у грызунов (Colby et al., 2003; Wang et al., 2010), предполагая, что эти два белка важны как для краткосрочных, так и для долгосрочных поведенческих адаптаций к воздействию лекарственного средства, хотя и через частично различные основные механизмы. Предположительно, ΔFosB и CaMKII регулируют такие сложные поведенческие адаптации посредством изменений в синаптической функции NAc, хотя требуется гораздо больше работы, чтобы напрямую связать синаптические явления с поведенческими изменениями.

Голофермент CaMKII одновременно взаимодействует с целым рядом ассоциированных с синапсом белков (Robison и др., 2005), которые, как считается, регулируют его нацеливание на постсинаптическая плотность (PSD), явление, которое, как предполагается, важно для синаптической пластичности. В частности, недавно было показано, что взаимодействие CaMKII с субъединицей GluN2B рецептора глутамата NMDA-типа регулирует как синаптическую пластичность, так и обучение (Halt и др., 2012). Хотя пептид AC3I имитирует аутоингибирующий домен CaMKII и, таким образом, ингибирует каталитическую активность фермента, он также блокирует множественные белково-белковые взаимодействия (Strack et al., 2000; Robison и др., 2005). Таким образом, поведенческие и морфологические эффекты HSV-GFP-AC3I, описанные здесь, могут возникать за счет снижения фосфорилирования белков CaMKII-мишени, изменений в нацеливании CaMKII или изменения предложенной структурной роли CaMKII в синапсах (Lisman и др., 2002).

Ограничение предлагаемой петли ΔFosB-CaMKII на оболочку NAc особенно важно, поскольку недавняя работа продемонстрировала несколько физиологических различий между оболочкой NAc и сердечником в ответ на введение кокаина, что подтверждается нашими объективными данными iTRAQ (Table S1) , У MSNs в оболочке NAc наблюдается депрессия в огневой способности после хронического кокаина, который сохраняется в течение нескольких недель, в то время как у основных MSN с одних и тех же животных наблюдается переходный (1-3 день) рост мощности стрельбы, который возвращается к базальным уровням в течение 2 недель (Kourrich и Thomas, 2009). Кроме того, многочисленные синаптические белки дифференцированно регулируются в оболочке NAc против ядро животных, подвергнутых воздействию хронического кокаина, включая GluA2 (Knackstedt и др., 2010). Поскольку хронический амфетамин индуцирует CaMKIIα, в частности, в оболочке NAc (Loweth и др., 2010), неудивительно, что мы находим аналогичный эффект с кокаином. Однако, поскольку ΔFosB индуцируется как в оболочке NAc, так и в сердечнике с помощью хронического кокаина (Perrotti et al., 2008), и поскольку мы показываем, что индукция CaMKIIα в оболочке является зависимой от ΔFosB, наши результаты дают новые данные для различных механизмов транскрипции на промоторе CaMKIIα между этими двумя подобластями, которые ответственны за селективную индукцию CaMKIIα в оболочке.

Большая часть последних работ была посвящена разграничению различий между D1- и D2-типами NAc MSN. Хотя оба рецептора D1 и D2 участвуют в полезных эффектах кокаина (Self, 2010), недавняя работа демонстрирует, что оптогенетическая активация MSN-типа D1 увеличивает поведенческие реакции на кокаин, тогда как активация MSN типа D2 имеет противоположный эффект (Lobo и др., 2010). В соответствии с этими выводами мышей с нокаутом D1-рецепторов недостаточно для приобретения самообслуживания кокаина (Caine и др., 2007), в то время как нокауты D2 не (Caine и др., 2002). Администрирование агонистов D1 непосредственно в NAc вызывает кокаиновое поведение при восстановлении парадигм (Self, 2010). Интересно, что этот эффект требует зависимого от D1-рецептора увеличения активности CaMKII в оболочке NAc, но не ядра (Андерсон и др., 2008), результат, который хорошо согласуется с предложенной здесь D1- и оболочечной решеткой ΔFosB-CaMKII.

Ранее сообщалось, что Ser27 в ΔFosB можно фосфорилировать казеин-киназой-2 (Ulery и др., 2006), однако мы устанавливаем здесь, что CaMKII фосфорилирует ΔFosB в этом и других местах с гораздо большей кинетикой и стехиометрией и может реплицировать более высокое кажущееся M_r наблюдаемый для ΔFosB (Рис. 5A) с воздействием кокаина в естественных условиях (Nestler, 2008). Мы уже знаем, что фосфорилирование Ser27 увеличивает стабильность FOSB и активность транскрипции (Ulery и др., 2006; Ульри и Нестлер, 2007; Ulery-Reynolds и др., 2009). Будущая работа будет теперь сосредоточена на идентификации и функциональных последствиях новых сайтов фосфорилирования ΔFosB, указанных в настоящем исследовании.

Цикл подачи вперед, описанный здесь, обеспечивает правдоподобный новый механизм, посредством которого повторное введение кокаина приводит к прогрессирующим отклонениям в NAc. Таким образом, этот биохимический путь может стать важной мишенью для будущего терапевтического вмешательства в аддиктивных расстройствах. Поскольку CaMKII является вездесущим и необходим для многих основных нейронных и поведенческих функций, прямое использование ингибиторов CaMKII было предотвращено как лечение зависимости. Наши данные свидетельствуют о том, что более тонкое нацеливание механизма индукции CaMKII, которое специфично для индивидуального типа клеток и субрегиона схемы вознаграждения мозга, может обеспечить терапевтическую цель, которая позволит избежать осложнений системного ингибирования CaMKII.

Перейти к:

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального института по борьбе со злоупотреблением наркотиками (EJN), NIDA-Yale Proteomics Center DA018343 (AJR и EJN) и Фонда Хартвелла (AJR). Авторы хотели бы поблагодарить Габби Рунденко за щедрый дар очищенного ΔFosB и Роджера Колбрана за щедрый дар очищенного CaMKIIα.

Перейти к:

Рекомендации

1. Ахмед Ш., Кооб Г.Ф. Переход от умеренного к чрезмерному употреблению наркотиков: изменение гедонистической уставки. Наука. 1998; 282: 298-300. [PubMed]
2. Андерсон С.М., Известный К.Р., Садри-Вакили Г., Кумарешан В., Шмидт Х.Д., Басс Э.С., Тервиллигер Э.Ф., Ча Дж. Х., Пирс Р.К. CaMKII: биохимический мост, соединяющий системы дофамина и глутамата в кокаине. Nat Neurosci. 2008; 11: 344-353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Wolf ME. Поведенческая сенсибилизация к кокаину связана с увеличением экспрессии поверхности рецептора AMPA в ядре accumbens. J Neurosci. 2005; 25: 9144-9151. [PubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Экспрессия и характеристика альфа-субъединицы Ca2 + / кальмодулин-зависимой протеинкиназы II с использованием системы экспрессии бакуловируса. Biochem Biophys Res Commun. 1990; 173: 578-584. [PubMed]
5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Роль дофаминовых D2-подобных рецепторов в самообмене кокаина: исследования с мутантными мышами-рецепторами D2 и новым рецептором D2 антагонисты. J Neurosci. 2002; 22: 2977-2988. [PubMed]
6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Gold LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Отсутствие самоконтроля кокаина в дофаминовых D1-рецепторах нокаутных мышах. J Neurosci. 2007; 27: 13140-13150. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Протеазомозависимые и независимые механизмы дестабилизации FosB: идентификация доменов FosB degron и их влияние на стабильность DeltaFosB. Eur J Neurosci. 2007; 25: 3009-3019. [PubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shookt PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Трансгенные животные с индуцируемой, целевой экспрессией генов в мозге. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
9. Кристоффел DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. Киказа IkappaB регулирует социальное поражение, вызванное стрессом, синаптическую и поведенческую пластичность. J Neurosci. 2011; 31: 314-321. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
10. Colbran RJ. Инактивация Ca2 + / кальмодулин-зависимой протеинкиназы II путем базального аутофосфорилирования. J Biol Chem. 1993; 268: 7163-7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Протеиновые фосфатазы и кальций / кальмодулинзависимая протеинкиназа II-зависимая синаптическая пластичность. J Neurosci. 2004; 24: 8404-8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Brown AM. Кальций / кальмодулинзависимая протеинкиназа II и синаптическая пластичность. Curr Opin Neurobiol. 2004; 14: 318-327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Струйная клеточная специфическая избыточная экспрессия DeltaFosB усиливает стимул для кокаина. J Neurosci. 2003; 23: 2488-2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Антидепрессивное действие ингибиторов гистондезацетилазы. J Neurosci. 2009; 29: 11451-11460. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
15. Давалос А, Фернандес-Эрнандо С, Сова Г, Дерахшан Б, Линь М.И., Ли Цзи, Чжао Х, Лоо, Коланджело С, Сесса WC. Количественная протеомика белков, регулируемых кавеолином-1: характеристика полимеразы i и фактора высвобождения транскрипта / CAVIN-1 IN в эндотелиальных клетках. Mol Cell Proteomics. 2010; 9: 2109-2124. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Факторы риска для завершения суицида в большой депрессии: случайное исследование импульсивного и агрессивного поведения в люди. Am J Psychiatry. 2005; 162: 2116-2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. ΔFosB дифференциально модулирует прямую и непрямую траекторию ядра. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 в прессе. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
18. Halt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. Связывание CaMKII с GluN2B имеет решающее значение при консолидации памяти. EMBO J. 2012; 31: 1203-1216. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. Мыши с мутантом FosB: потеря хронической кокаиновой индукции белков, связанных с Fos, и повышенная чувствительность к психомоторным и положительным эффектам кокаина. Proc Natl Acad Sci US A. 1997; 94: 10397–10402. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
20. Ито Р, Роббинс Т.В., Эверитт БД. Дифференциальный контроль над кокаиноподобным поведением ядра и оболочки ядра. Nat Neurosci. 2004; 7: 389-397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Димеризация и ДНК-связывающие свойства транскрипционного фактора DeltaFosB. Биохимия. 2007; 46: 8360-8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Кальций / кальмодулин-зависимая протеинкиназа II способствует активности зависящим от активности росту филоподий и развитию позвоночника. J Neurosci. 2003; 23: 10645-10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Выражение фактора транскрипции deltaFosB в мозге контролирует чувствительность к кокаину. Природа. 1999; 401: 272-276. [PubMed]
24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Генетическое ингибирование CaMKII в спинной стриатальной среде Колючие нейроны уменьшают функциональные возбуждающие синапсы и усиливают внутреннюю возбудимость. PLoS One. 2012; 7: e45323. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Обучение вымиранию после самоубийства кокаина вызывает глутаматергическую пластичность, чтобы препятствовать поиску кокаина. J Neurosci. 2010; 30: 7984-7992. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Подобные нейроны, противоположные адаптации: опыт психостимулятора дифференциально изменяет свойства обжига в ядре accumbens против оболочки. J Neurosci. 2009; 29: 12275-12283. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. AMPAR-независимый эффект Striatal alphaCaMKII способствует повышению чувствительности кокаина. J Neurosci. 2012; 32: 6578-6586. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ , Роль ядерного фактора kappaB в опосредованной овариальным гормоном гиперчувствительности стресса у самок мышей. Biol Psychiatry. 2009; 65: 874-880. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Формирование коллайновского дендритного позвоночника в D1 и D2, содержащих дофаминовые рецепторы, спинные нейроны в ядре accumbens. Proc Natl Acad Sci US A. 2006; 103: 3399-3404. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. Молекулярная основа функции CaMKII в синаптической и поведенческой памяти. Nat Rev Neurosci. 2002; 3: 175-190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. Снижение типа BDNF по типу сотового типа имитирует оптогенетический контроль вознаграждения кокаина. Наука. 2010; 330: 385-390. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. Ингибирование CaMKII в оболочке acumbens ядра уменьшает усиление приема амфетамина у сенсибилизированных крыс. Neurosci Lett. 2008; 444: 157-160. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
33. Loweth JA, Singer BF, Baker LK, Wilke G, Inamine H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Переходная сверхэкспрессия альфа-Ca2 + / кальмодулин-зависимой протеинкиназы II в оболочке ядра улучшает поведенческие реакции на амфетамин. J Neurosci. 2010; 30: 939-949. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. AMPA-рецептор и синаптическая пластичность. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 103-126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Структурная основа долгосрочного потенцирования в одиночных дендритных шипах. Природа. 2004; 429: 761-766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Контроль формирования памяти посредством регулируемой экспрессии трансгена CaMKII. Наука. 1996; 274: 1678-1683. [PubMed]
37. Maze I, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mechanic M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. Существенная роль гистон-метилтрансферазы G9a в кокаино-индуцированной пластичности. Наука. 2010; 327: 213-216. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. Регулирование экспрессии генов и вознаграждение кокаина CREB и DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Обзор. Транскрипционные механизмы зависимости: роль DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245-3255. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Фармакологические исследования регуляции хронической FOS-связанной антигенной индукции кокаином в стриатуме и ядре accumbens. J Pharmacol Exp Ther. 1995; 275: 1671-1680. [PubMed]
41. Окамото К., Бош М., Хаяши Ю. Роль CaMKII и F-актина в структурной пластичности дендритных шипов: потенциальная молекулярная идентичность синаптической метки? Физиология (Bethesda) 2009; 24: 357-366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB в ядре accumbens регулирует усиленное питание инструментальное поведение и мотивацию. J Neurosci. 2006; 26: 9196-9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. Мозг крысы в ​​стереотаксических координатах. 6th Edition. Амстердам; Бостон: Academic Press / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Индуцибельная экспрессия доминантного отрицательного мутанта c-Jun у трансгенных мышей снижает чувствительность к кокаину. Brain Res. 2003; 970: 73-86. [PubMed]
45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Конвергентные сигналы CaMK и RacGEF контролируют дендритную структуру и функцию. Тенденции Cell Biol. 2008; 18: 405-413. [PubMed]
46. Перротти Л.И., Хадеиши Й, Ульри П.Г., Барро М., Монтеггия Л., Думан Р.С., Нестлер Е.Ю. Индукция дельтаFosB в структурах головного мозга, связанных с повреждением после хронического стресса. J Neurosci. 2004; 24: 10594-10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Отличительные закономерности индукции DeltaFosB в головном мозге наркотиками. Synapse. 2008; 62: 358-369. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. Нейробиология инкубации тяги к наркотикам. Тенденции Neurosci. 2011; 34: 411-420. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Кальций-опосредованные вторичные мессенджеры модулируют экспрессию поведенческой сенсибилизации кокаину. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 286: 1171-1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Авторадиография рецептора мозга человека с использованием целых полусферных участков: общий метод, который минимизирует тканевые артефакты. Synapse. 1987; 1: 446-454. [PubMed]
51. Робинсон Т.Э., Колб Б. Структурная пластичность, связанная с воздействием наркотиков. Нейрофармакология. 2004; 47 (Suppl 1): 33-46. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Транскрипционные и эпигенетические механизмы зависимости. Nat Rev Neurosci. 2011; 12: 623-637. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Многовалентные взаимодействия кальций / калмодулинзависимая протеинкиназа II с постсинаптическими белками плотности NR2B, densin-180 и альфа-актинином-2. J Biol Chem. 2005; 280: 35329-35336. [PubMed]
54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ. Количественное определение мультиплексированного белка в Saccharomyces cerevisiae с использованием реагентов с изобариновой мечение с амином. Mol Cell Proteomics. 2004; 3: 1154-1169. [PubMed]
55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. Зависимый синапс: механизмы синаптической и структурной пластичности в прилежащих ядрах. Тенденции Neurosci. 2010; 33: 267-276. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
56. Self DW. В: Допамин-рецепторы. Неве К.А., редактор. Нью-Йорк: Humana Press; 2010. pp. 479-524.
57. Singer BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Преходящая вирусная гиперэкспрессия альфа-кальций / калмодулин-зависимая протеинкиназа II в оболочке оккумсена ядра приводит к длительной функциональной регуляции альфа-амино-3-гидроксил-5 -метил-4-изоксазол-пропионат: рецептор допамина типа 1 и зависимость протеинкиназы А. Eur J Neurosci. 2010; 31: 1243-1251. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Механизм и регуляция кальций / калмодулинзависимая протеинкиназа II, нацеленная на субъединицу NR2B рецептора N-метил-D-аспартата. J Biol Chem. 2000; 275: 23798-23806. [PubMed]
59. Ulery-Reynolds PG, Кастильо М.А., Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. Фосфорилирование DeltaFosB обеспечивает его устойчивость in vivo. Neuroscience. 2009; 158: 369-372. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. Регулирование транскрипционной активности DeltaFosB фосфорилированием Ser27. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-230. [PubMed]
61. Ульри П.Г., Руденко Г., Нестлер Е.Ю. Регулирование стабильности DeltaFosB путем фосфорилирования. J Neurosci. 2006; 26: 5131-5142. [PubMed]
62. Vialou V, et al. DeltaFosB в цепях вознаграждения мозга опосредует устойчивость к стрессам и антидепрессантам. Nat Neurosci. 2010; 13: 745-752. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. Хроническое индуцированное кокаином ацетилирование H3 и активация транскрипции CaMKIIalpha в ядре accumbens имеет решающее значение для мотивации для усиления лекарственного средства. Neuropsychopharmacology. 2010; 35: 913-928. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB регулирует работу колеса. J Neurosci. 2002; 22: 8133-8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. Индукция DeltaFosB в орбитофронтальной коре опосредует толерантность кокаин-индуцированной когнитивной дисфункции. J Neurosci. 2007; 27: 10497-10507. [PubMed]
66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Существенная роль DeltaFosB в прилежании ядра при действии морфина. Nat Neurosci. 2006; 9: 205-211. [PubMed]
67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, Price EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Song LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Ингибирование кальмодулин-киназы II защищает от структурной болезни сердца. Nat Med. 2005; 11: 409-417. [PubMed]