Proc Natl Acad Sci US A. 2005 Февраль 1; 102(5): 1737-1742.
Абстрактные
Кокаин, злоупотребление наркотиками, увеличивает уровни синаптического дофамина в полосатом теле, блокируя обратный захват дофамина на терминалах аксона. Было обнаружено, что циклон-зависимая киназа 5 (Cdk5) и ее активатор p35, белки, участвующие в фосфорилировании субстратов в постмитотических нейронах, были отрегулированы после хронического воздействия на кокаин. Для дальнейшего изучения влияния индукции Cdk5 и p35 на трансагнетризацию дофамина мы получили две независимые линии трансгенных мышей, в которых Cdk5 или p35 были сверхэкспрессированы именно в нейронах. Мы сообщаем здесь, что повышенная активность Cdk5 в результате p35, но не избыточной экспрессии Cdk5, приводит к ослаблению опосредованной кокаином сигнальной дозы допамина. Повышенное Cdk5-опосредованное фосфорилирование допамина и cAMP-регулируемого фосфопротеина, молекулярная масса 32 кДа (DARPP-32) в Thr-75, сопровождалось уменьшением фосфорилирования DARPP-32 на Thr-34. Повышенное Cdk5-опосредованное фосфорилирование внеклеточной сигнально-регулируемой киназы киназы 1 в Thr-286 сопровождалось снижением активации внеклеточной сигнально-регулируемой киназы 1 / 2. Эти эффекты способствовали ослаблению кокаин-индуцированного фосфорилирования связывающего белка, связанного с цАМФ, а также меньшей индукции c-fos в полосатом теле. Эти результаты подтверждают идею о том, что активность Cdk5 связана с измененной экспрессией генов после хронического воздействия на кокаин и, следовательно, влияет на длительные изменения в нейронной функции, лежащей в основе зависимости от кокаина.
Кокаин увеличивает уровни синаптического дофамина в полосатом теле и изменяет экспрессию генов в допаминоцептивных нейронах, активируя внутриклеточные пути, которые распространяют исходный сигнал от рецептора дофамина D1 на ядро (1). Хроническое воздействие кокаина регулирует несколько факторов транскрипции, что приводит к долговременным изменениям в экспрессии генов, которые, как полагают, лежат в основе нейронных адаптаций в зависимости от кокаина (2). ΔFosB, идентифицированный как такой транскрипционный фактор (3), было показано, что улучшает поведенческую реакцию животных на кокаин (4, 5). Поэтому идентификация генов-мишеней, которые регулируются индукцией ΔFosB, как ожидается, будет способствовать более глубокому пониманию молекулярного механизма, лежащего в основе зависимости от кокаина. Было показано, что в последнее время хроническая обработка животных кокаином повышала регуляцию экспрессии циклинзависимой киназы 5 (Cdk5) и ее активатора p35 в полосатом теле с помощью индукции ΔFosB (6, 7).
Cdk5 является членом семейства Cdk сериновых / треонин-киназ. В отличие от других Cdks, которые являются основными регуляторами прогрессирования клеточного цикла, Cdk5 в основном участвует в фосфорилировании субстратов в постмитотических нейронах (8). Специфичность нейронов активности Cdk5 достигается за счет ассоциации с ее активаторами: p35 или p39, которые преимущественно экспрессируются в постмитотических нейронах (8). В дополнение к существенной роли Cdk5 в развитии мозга (9, 10), it также участвовал в дофаминергической передаче в постнатальном мозге (11, 12). Ингибирование активности Cdk5 приводит к увеличению высвобождения дофамина в полосатом теле, что указывает на пресинаптическую функцию Cdk5 как отрицательного регулятора высвобождения дофамина (11). Кроме того, Cdk5 модулирует эффективность постсинаптической передачи допамина путем фосфорилирования дофаминового и cAMP-регулируемого фосфопротеина, молекулярной массы 32 кДа (DARPP-32) в Thr-75, которая превращает DARPP-32 в ингибитор цАМФ-зависимой киназы (PKA) (12).
Эти наблюдения свидетельствуют о том, что Cdk5 и p35 являются регуляторами, расположенными ниже по течению, продолжительная активация сигналов допамина после хронического воздействия кокаина и, следовательно, на зависимость от кокаина. Чтобы дополнительно рассмотреть роль Cdk5 в отношении передачи полосатого дофамина, мы создали две линии трансгенных мышей, в которых Cdk5 или p35 были сверхэкспрессированы конкретно в нейронах под контролем промотора p35. Наши результаты показали, что активность Cdk5 регулируется повышенными уровнями белка p35, но не белка Cdk5, что указывает на то, что уровень белка p35 является ограничивающим скорость для активности Cdk5. Мы предоставляем здесь в естественных условиях свидетельствует о том, что повышенная активность Cdk5 в результате избыточной экспрессии p35 приводит к ослаблению сигнальной связи дофамина, опосредованной кокаином, к ядру за счет ингибирования каскадов PKA и внеклеточного сигнально-регулируемого киназа (ERK).
Материалы и методы
Антитела. Поликлональные антитела к Cdk5 (C-8) и p35 (C-19) были приобретены у Santa Cruz Biotechnology. Зависимые от фосфорилирования и -независимые антитела к ERK-киназе (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 и cAMP-response-связывающему белку (CREB) были получены из технологии Cell Signaling (Беверли, Массачусетс). Антитела к фосфо-Thr-34 DARPP 32 (13), фосфо-трет-75 DARPP-32 (12), общее количество DARPP-32 (12) и c-fos (14) использовали, как описано. Антитело к актину было приобретено у Sigma.
Экспериментальные животные. Ранее мы клонировали ген мыши p35 Cdk5r1, который кодирует белок p35 и характеризует его геномную структуру (15). Для генерации трансгенной мыши с сверхэкспрессией нейронов p35 (Tgp35), 6-kb EcoRI-EcoФрагмент RI, содержащий промоторную область 1.2-kb, субклонировали в плазмиду pGEM9Z (-), и тег 45-bp, полученный из SV40, был вставлен в крпI сайт ниже по потоку от поли (A+) сигнала (Рис 1A). Тег содержал SpeЯ сайт для генотипирования животных. Фрагмент 6-kb вырезали из плазмиды и очищали с последующей пронуклеарной инъекцией трансгена с образованием трансгенных мышей. Изучить профиль экспрессии трансгена при регулятивном контроле промотора 1.2-kb p35 в естественных условиях, двойную трансгенную мышь (Tgp35; p35 - / -) дополнительно генерировали с использованием двухступенчатой стратегии разведения, с помощью которой мышь Tgp35 регенерировалась в эндогенном фоне p35-нуль. Другие модели мыши, используемые в этом исследовании, включали p35 +/-, p35 - / -, Cdk5 +/- и трансгенную мышь с сверхэкспрессией нейронов Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Генотипы этих мышей определяли путем проведения Саузерн-блот-анализа или ПЦР на геномной ДНК, выделенной из биопсий хвоста. Мыши размещались под темным циклом 12-h light / 12-h. Вся забота была дана в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных и экспериментальных животных.
Южный блот-анализ. Геномную ДНК, извлеченную из биопсий хвоста, расщепляли EcoRI и SpeI, подвергают электрофорезу на геле Агарозы 0.9% и переносят на нейлоновую мембрану. Мембрану гибридизовали со случайным грунтом 32P-меченый зонд при 42 ° C в течение ночи. Пробник 485-bp для генотипирования мышей p35 (p35 - / -) и Tgp35 генерировали с помощью ПЦР с использованием следующих праймеров: 5'-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 'и 5'-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3'. Гибридизованную мембрану промывали два раза в 2 × SSC / 0.1% SDS при 42 ° C для 10 мин и два раза в 0.1 × SSC / 0.1% SDS при 65 ° C для 20 мин и подвергали воздействию рентгеновской пленки.
Лекарственное лечение. Кокаин (Sigma) растворяли в стерильном физиологическом растворе. Животным вводили ip-инъекцию кокаина (15 мг / кг) или равный объем физиологического раствора в возрасте 3 месяцев и убивали обезглавливанием в разные моменты времени (15, 30, 60 и 120 мин) после инъекции. Мозги быстро удаляли и охлаждали в ледяной PBS. Затем стриату расщепляли и подвергали анализу в Северной или Западной блоттинге. Для иммуногистохимического анализа полосатые участки были получены у мышей 2 h после инъекции.
Северный блот-анализ. Общая РНК экстрагировалась из стриата реагентом TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) и подвергалась нозерн-блот-анализу, как описано (18). Для обнаружения мРНК c-fos в качестве зонда, как описано, использовали фрагмент 189-bp кДНК мышиной c-fos в качестве зонда (19). Уровни мРНК c-fos определяли количественно путем измерения оптической плотности конкретной полосы с использованием системы анализа изображений с программным обеспечением nih image, версия 1.62.
Вестерн-блот-анализ. Стройные ткани обрабатывали ультразвуком в SDN 1% и кипятили в течение 10 мин. Концентрация белка в каждом образце определяли с помощью анализа белка BCA (Pierce). Равные количества белка разделяли SDS / PAGE перед переносом на нитроцеллюлозную мембрану. Мембраны блокировали в 1 × PBS, содержащем 5% обезжиренного молока и 0.05% Tween 20, и инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 ° C. Инкубацию с конъюгированным с пероксидазой антимышиным или кроличьим IgG (Sigma) проводили при комнатной температуре для 60 мин. Сигнал был обнаружен усиленной хемилюминесценцией (Pierce), а оптические плотности зон были количественно определены, как описано выше.
Анализ киназы Cdk5. Литаты стриатата были приготовлены с помощью буфера для лизиса, состоящего из 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 мМ NaCl / 5 мМ ЭДТА / 1% Тритон X-100 / 1mMDTT / 1 мМ фенилметилсульфонилфторид / 1 мкг / мл апротинин / 1 мкг / мл ингибиторов лейпептина / фосфатазы (смесь ингибиторов фосфатазы I и II, Sigma). Лизаты иммунопреципитировали либо антителами против Cdk5 (C-8), либо анти-p35 (C-19). Иммунопреципитаты Cdk5 получали инкубацией 300 мкл лизата (соответствующего 300 мкг белка) с антителом против Cdk5 (3 мкг) в течение ночи при 4 ° C с последующей дополнительной инкубацией с 25 мкл белков A-агарозы белка (50 % суспензии в буфере для лизиса, Santa Cruz Biotechnology) для 3 h при 4 ° C. Для получения иммунопреципитатов p35 500 мкл лизата (соответствующего 1 мг белка) инкубировали с антителом против p35 (3 мкг), как описано выше. Иммунопреципитаты дважды промывали буфером для лизиса и дважды киназным буфером, состоящим из 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 5 мМ MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, ресуспендировали в 60 мкл киназного буфера. Активность киназы измеряли с использованием гистона H1 в качестве субстрата (18).
Immunohistochemistry. Мышей анестезировали инъекциями авертина (250 мг / кг, Fluka) и перфузировали транскрипционно с помощью фосфатного буфера 0.1 M, pH 7.4, а затем Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), не сшивающего фиксатора. Рассеянные мозги далее фиксировали в том же фиксирующем значении в течение ночи при 37 ° C. Затем мозг вставляли в парафин, разрезали на коронарные секции толщиной 5-мкм и подвергали иммуногистохимии с использованием метода комплекса авидин-биотин-пероксидаза (Vector Laboratories) с диаминобензидином в качестве субстрата. Секции инкубировали с аффинно-очищенным поликлональным антителом против c-fos в течение ночи при 4 ° C. Специфичность окрашивания оценивали путем пропуска первичного антитела.
Итоги
Генерация трансгенных мышей с нейронной сверхэкспрессией p35. Трансген, используемый для увеличения экспрессии нейронов p35, содержал фрагмент 6-kb клонированного гена мыши p35, содержащий промотор 1.2-kb и всю кодирующую последовательность p35 (Рис 1 A). Генотопы мышей определяли по Саузерн-блот-анализу с использованием зонда, который был предназначен для выделения мышей p35 - / - и Tgp35 у мышей дикого типа (Рис 1 A и B), Чтобы исследовать трансгенную экспрессию под контролем промотора 1.2-kb p35, мы создали двойных трансгенных мышей (Tgp35; p35 - / -), в которых экспрессия p35 приводилась только из трансгена. Экспрессия p35 у мышей Tgp35; p35 - / - наблюдалась только в головном мозге (Рис 1C), где картина пространственного экспрессии была аналогична картинке у мышей дикого типа (Рис 1D). Показано, что отсутствие p35 приводит к аномальной структуре слоев в коре головного мозга и гиппокампе мышей (10). Однако мыши Tgp35; p35 - / - продемонстрировали полное спасение фенотипа p35 - / - мозга (Рис 1E). Эти данные показали, что промотор 1.2-kb p35 контролировал экспрессию трансгена с аналогичным профилем экспрессии с показателем p35 от эндогенного гена p35.
Уровень протеина p35 - это ограничение по скорости для Up-регулирования активности Cdk5. Мы исследовали генно-дозировочные эффекты генов, кодирующих p35 и Cdk5, на экспрессию белка в стриатальных экстрактах из мышей p35 - / -, p35 +/-, дикого типа, Tgp35, Cdk5 +/- и TgCdk5 в возрасте 3 месяцев. Уровни белка p35 и Cdk5 хорошо коррелировали с дозами генов соответственно (Рис 2 A и B). Мыши Tgp35 показали увеличение уровня белка p1.6 ≈35-кратное по сравнению с мышами дикого типа, тогда как уровни белка Cdk5 не влияли на различные уровни белка p35. Мыши TgCdk5 показали увеличение уровня белка Cdk1.9 ≈5-fold по сравнению с мышами дикого типа, тогда как уровни белка p35 не влияли на различные уровни белка Cdk5. Чтобы исследовать влияние различных количеств белка p35 на активность Cdk5, Cdk5 иммунопреципитировали из полосатых экстрактов антителом против Cdk5 и измеряли активность киназы. Аналогично, для изучения влияния различных количеств белка Cdk5 на киназную активность p35 иммунопреципитировали из полосатых экстрактов анти-p35-антителом и измеряли активность киназы. Активность Cdk5 хорошо коррелировала с уровнем белка p35, но не с уровнем белка Cdk5 (Рис 2 C и D). Эти результаты показали, что количество белка p35 является фактором, ограничивающим скорость для активности Cdk5. Поэтому мы использовали мышей Tgp35 для исследования эффектов повышенной активности Cdk5 на передачу полосатого дофамина.
Кокаин-индуцированное фосфорилирование DARPP-32 на Thr-34 ослабляется у мышей Tgp35. Функция DARPP-32 зависит от состояния фосфорилирования на нескольких сайтах (20). PKA фосфорилирует DARPP-32 в Thr-34, тогда как Cdk5 фосфорилирует DARPP-32 в Thr-75. Таким образом, мы изучили состояние фосфорилирования DARPP-32 в стригальных экстрактах у мышей дикого типа и Tgp35. Уровень фосфо-Thr-75 DARPP-32 был выше у мышей Tgp35 (Рис 3A; 1.6 ± 0.2-fold выше значения мышей дикого типа). Затем мы оценили влияние увеличенной активности Cdk5 на передачу полосатого дофамина. Мы исследовали активацию PKA, индуцированную кокаином, у мышей Tgp35 путем анализа состояния фосфорилирования DARPP-32 на Thr-34. Уровень фосфо-Thr-34 DARPP-32 был увеличен у мышей дикого типа 15 мин после инъекции кокаина (Рис 3B; 1.8 ± 0.2-fold выше базального уровня). Однако эффект кокаина на фосфорилирование Thr-34 DARPP-32 был ослаблен у мышей Tgp35 (1.2 ± 0.3-fold выше базального уровня). Эти результаты показали, что увеличение активности Cdk5 ослабляет активацию PKA, индуцированную кокаином, вероятно, через фосфорилирование DARPP-32 в Thr-75 (6, 12). Также возможно, что увеличение пресинаптической активности Cdk5 приводит к уменьшению выделения дофамина и что это способствует уменьшенному эффекту кокаина. Примечательно, что одна инъекция кокаина не влияла на уровни белка p35 и Cdk5, а также активность киназы (Рис 3 C и D). Это противоречит предыдущему исследованию, в котором показано, что хроническое воздействие кокаина регулирует экспрессию p35 и Cdk5 (6).
Up-Регулирование активности Cdk5 ослабляет индуцированную кокаином активацию ERK1 / 2. Недавние данные показывают, что активация рецептора допамина в полосатом теле также активирует другие сигнальные каскады, включая путь ERK (21, 22), который играет важную роль в поведенческой реакции на кокаин (23). Поэтому мы исследовали, может ли активность Cdk5 влиять на активацию ERK-пути, вызванную кокаином. Активация ERK-пути наблюдалась после инъекции кокаина в стритальных экстрактах у мышей дикого типа, что было очевидно благодаря усиленному фосфорилированию MEK1 / 2 в Ser-217 и Ser-221 (1.5 ± 0.2-fold выше базального уровня) и ERK1 / 2 в Thr-202 и Tyr-204 (фосфорилирование ERK2: 1.5 ± 0.2-fold выше базального уровня) (Рис 4 A и B). Однако активация кокаина MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-fold над базальным уровнем) и ERK1 / 2 (фосфорилирование ERK2: 1.2 ± 0.2-fold выше базального уровня) ослаблялась у мышей Tgp35 (Рис 4 A и B). Более того, базальные уровни фосфо-ERK1 / 2 были ниже у мышей Tgp35 (0.8 ± 0.2-fold ниже значения мышей дикого типа), тогда как эта тенденция не была статистически значимой. Этот последний результат может быть отнесен к Cdk5-зависимому фосфорилированию MEK1 в Thr-286, что приводит к снижению каталитической активности (24). Чтобы оценить эту возможность, мы изучили состояние фосфорилирования MEK1 на Thr-286 и обнаружили, что более высокие уровни фосфо-Thr-286 MEK1 присутствуют в стриитальных экстрактах у мышей Tgp35 (Рис 4C; 1.3 ± 0.1-fold выше значения мышей дикого типа). Кроме того, состояние фосфорилирования MEK1 в Thr-286 не было изменено с помощью одной инъекции кокаина, что согласуется с обнаружением того, что обработка Cdk5 не была затронута обработкой (Рис 3D).
Распространение сигнатуры допамина на ядро ослабляется увеличением активности Cdk5. Кокаин-индуцированная активация множественных сигнальных каскадов с участием PKA и ERK приводит к последующей активации транскрипционного фактора CREB в ядре посредством его фосфорилирования в Ser-133 (22, 25). Чтобы исследовать, могут ли ингибирующие Cdk5 ингибирующие эффекты на каскады активации PKA и ERK сходятся на фосфорилировании CREB в ядре, мы исследовали состояние фосфорилирования CREB в Ser-133 в полосатых экстрактах у мышей дикого типа и Tgp35. Базовый уровень фосфо-CREB был ниже у мышей Tgp35 (0.7 ± 0.1-кратное значение мышей дикого типа) (Рис 5). В ответ на инъекцию кокаина уровень фосфо-CREB был увеличен в полосатом теле мышей дикого типа (1.5 ± 0.1-fold выше базального уровня), но этот ответ на кокаин был ослаблен у мышей Tgp35 (1.2 ± 0.1- выше базального уровня) (Рис 5).
Фосфорилирование CREB в Ser-133 увеличивает его транскрипционную активность через элемент ответа cAMP в промоторной области определенных генов, включая ген c-fos (26). Поэтому мы исследовали индукцию c-fos в полосатом теле ячеек дикого типа и Tgp35 после инъекции кокаина. У мышей дикого типа уровень мРНК c-fos увеличивался до максимального значения (1.8 ± 0.2-fold выше базального уровня) 30 мин после инъекции кокаина и затем возвращался на базальный уровень через 120 мин после инъекции (Рис 6 A и B). Однако уровни мРНК c-fos были на ≈30% ниже у мышей Tgp35, чем у мышей дикого типа до 30 мин после инъекции (Рис 6 A и B). Меньшая индукция c-fos у мышей Tgp35 была дополнительно подтверждена иммуногистохимией (Рис 6 C–F). Введение кокаина увеличивало иммунореактивность c-fos, сильно в дорсомедиально-дорсоральных частях полосатого тела и слабо в боковых частях, как у мышей дикого типа, так и у Tgp35. Однако кокаин-индуцированное увеличение числа c-fos-иммуноположительных клеток заметно ослаблялось в полосатом теле мышей Tgp35 (Рис 6G). Вместе эти результаты показали, что опосредованное кокаином усиление передачи полосатого дофамина в ядро ингибировалось у мышей Tgp35, что является вероятным результатом повышенной активности Cdk5.
Обсуждение
Cdk5 и его активатор p35 были идентифицированы как гены-мишени, которые регулируются хроническим воздействием кокаина (6). Мы сообщим здесь о том, что повышенная активность Cdk5 в результате повышения регуляции p35, а не Cdk5 повышающего регуляцию, приводит к ослаблению опосредованной кокаином сигнальной дозы допамина в полосатых нейронах. Чтобы исследовать последствия регулируемой экспрессии Cdk5 или p35 на полосальной дофаминовой сигнальной линии, были проанализированы две линии трансгенных мышей, мыши TgCdk5 и Tgp35. Мы обнаружили, что активность Cdk5 регулировалась пропорционально увеличению уровня белка p35, но на нее не влиял повышенный уровень белка Cdk5. Наш предыдущий отчет также продемонстрировал, что активность Cdk5 в мозге мыши TgCdk5 была ниже, чем в мозге головного мозга дикого типа, когда активность измеряли с использованием иммунопреципитатов Cdk5 (17), предполагая, что избыточная экспрессия Cdk5 приводит к увеличению уровня мономерного Cdk5, если уровень p35 не увеличивается. Эти результаты показали, что уровень белка p35 является фактором, ограничивающим скорость активности Cdk5.
Мыши Tgp35 проявляли меньшую индукцию как фосфорилирования CREB, так и c-fos в полосатом теле после острого введения кокаина, что указывает на то, что стриатальный ответ на кокаин ингибировался повышенной активностью Cdk5. Затухание опосредованной кокаином дофаминовой сигнализации у мышей Tgp35, вероятно, достигалось посредством опосредованного Cdk5 ингибирования множественных сигнальных каскадов с участием DARPP-32, PKA и ERK. Введение кокаина увеличивало PKA-фосфорилирование DARPP-32 на Thr-34 у мышей дикого типа, тогда как этот ответ был ослаблен у мышей Tgp35. Показано, что фосфорилирование PKA DARPP-32 в Thr-34 ингибирует активность протеинфосфатазы 1 (PP1), фермента, ответственного за дефосфорилирование Ser-133 CREB (27). Таким образом, активность PP1 не будет антагонизирована по пути DARPP-32 / PP1 у мышей Tgp35.
Активация кокаина ERK1 / 2 также была ослаблена у мышей Tgp35. Существует несколько различных механизмов, благодаря которым Cdk5 может ингибировать активацию ERK1 / 2, вызванную кокаином. Во-первых, Cdk5-зависимое фосфорилирование DARPP-32 в Thr-75 может ингибировать PKA, что приводит к последующему ингибированию любой PKA-опосредованной активации MEK1 / 2, необходимой для активации ERK1 / 2. Недавнее исследование также показало, что фосфорилирование DARPP-32 в Thr-34 требуется для опосредованной кокаином активации ERK1 / 2 несколькими путями с косвенной регуляцией активации MEK, а также с включением регуляции полосатой обогащенной фосфатазы, тирозина фосфатазы, которая действует непосредственно на ERK1 / 2 (28). Подтверждением этой возможности является вывод о том, что кокаин-индуцированное фосфорилирование MEK1 / 2 в Ser-217 и Ser-221 было отменено у мышей Tgp35. Другим вероятным путем является Cdk5-зависимое фосфорилирование MEK1 в Thr-286, что приведет к снижению его каталитической активности и приведет к ингибированию активности ERK1 / 2 (24).
Было показано, что ингибирование активности Cdk5 в стриатуме усиливает поведенческие эффекты хронической обработки кокаина у животных (6). В соответствии с гипотезой о том, что повышение активности Cdk5 может способствовать адаптации нейронов для противодействия эффектам повторного введения кокаина (6), мы обнаружили, что Cdk5-опосредованное фосфорилирование DARPP-32 и MEK1 способствовало ослаблению активации кокаина ERK1 / 2, что привело к меньшей индукции фосфорилирования CREB и c-fos в полосатом теле. Наши результаты подтверждают идею о том, что повышенная активность Cdk5 в результате регуляции p35 может изменить экспрессию генов в полосатом теле после хронического воздействия на кокаин. Это может происходить путем изменения активности транскрипционных факторов, таких как CREB и c-fos. Таким образом, активатор cdk5 p35 в силу своих ограничивающих скорость эффектов на активность Cdk5 может способствовать долговременным изменениям функции нейронов, лежащих в основе зависимости от кокаина.
Благодарности
Мы благодарим доктора. Мэри Джо Дантон, Филип Грант и Саши Кесавапаны за критическое чтение рукописи. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения Grant Z01DE00664-05 (до ABK), грантом DA10044 по общественному здравоохранению США и грантами Фонда Саймонса, Фонда Питера Дж. Шарпа и Фонда Пикауэра (до PG).
Заметки
Сокращения: Cdk5, циклинзависимая киназа 5; ERK, внеклеточная сигнально-регулируемая киназа; DARPP-32, допамин и cAMP-регулируемый фосфопротеин, молекулярная масса 32 кДа; PKA, цАМФ-зависимая киназа; MEK, ERK киназа; CREB, cAMP-ответный элемент-связывающий белок.
Рекомендации
;
