Proc Natl Acad Sci US A. 2005 February 1; 102 (5) : 1737–1742.
Резюме
Кокаин, злоупотребление наркотиками, увеличивает уровни синаптического дофамина в полосатом теле, блокируя обратный захват дофамина на терминалах аксона. Было обнаружено, что циклон-зависимая киназа 5 (Cdk5) и ее активатор p35, белки, участвующие в фосфорилировании субстратов в постмитотических нейронах, были отрегулированы после хронического воздействия на кокаин. Для дальнейшего изучения влияния индукции Cdk5 и p35 на трансагнетризацию дофамина мы получили две независимые линии трансгенных мышей, в которых Cdk5 или p35 были сверхэкспрессированы именно в нейронах. Мы сообщаем здесь, что повышенная активность Cdk5 в результате p35, но не избыточной экспрессии Cdk5, приводит к ослаблению опосредованной кокаином сигнальной дозы допамина. Повышенное Cdk5-опосредованное фосфорилирование допамина и cAMP-регулируемого фосфопротеина, молекулярная масса 32 кДа (DARPP-32) в Thr-75, сопровождалось уменьшением фосфорилирования DARPP-32 на Thr-34. Повышенное Cdk5-опосредованное фосфорилирование внеклеточной сигнально-регулируемой киназы киназы 1 в Thr-286 сопровождалось снижением активации внеклеточной сигнально-регулируемой киназы 1 / 2. Эти эффекты способствовали ослаблению кокаин-индуцированного фосфорилирования связывающего белка, связанного с цАМФ, а также меньшей индукции c-fos в полосатом теле. Эти результаты подтверждают идею о том, что активность Cdk5 связана с измененной экспрессией генов после хронического воздействия на кокаин и, следовательно, влияет на длительные изменения в нейронной функции, лежащей в основе зависимости от кокаина.
Кокаин повышает уровень синаптического дофамина в полосатом теле и изменяет экспрессию генов в дофаминорецепторных нейронах, активируя внутриклеточные пути, которые передают первоначальный сигнал от дофаминового рецептора D1 к ядру ( 1 ). Хроническое воздействие кокаина повышает экспрессию нескольких факторов транскрипции, что приводит к долговременным изменениям в экспрессии генов, которые, как считается, лежат в основе нейрональных адаптаций при кокаиновой зависимости ( 2 ). Было показано, что ΔFosB, идентифицированный как такой фактор транскрипции ( 3 ), усиливает поведенческую реакцию животных на кокаин ( 4 , 5 ). Поэтому идентификация целевых генов, регулируемых индукцией ΔFosB, как ожидается, будет способствовать лучшему пониманию молекулярного механизма, лежащего в основе кокаиновой зависимости. Недавно было показано, что хроническое лечение животных кокаином приводит к повышению экспрессии циклин-зависимой киназы 5 (Cdk5) и ее активатора p35 в полосатом теле посредством индукции ΔFosB ( 6 , 7 ).
Cdk5 является членом семейства серин/треонин-киназ Cdk. В отличие от других Cdk, которые являются основными регуляторами прогрессии клеточного цикла, Cdk5 в основном участвует в фосфорилировании субстратов в постмитотических нейронах ( 8 ). Нейрональная специфичность активности Cdk5 достигается за счет ассоциации с его активаторами, p35 или p39, которые преимущественно экспрессируются в постмитотических нейронах ( 8 ). В дополнение к важной роли Cdk5 в развитии мозга ( 9 , 10 ), он также участвует в дофаминергической передаче в постнатальном мозге ( 11 , 12 ). Ингибирование активности Cdk5 приводит к увеличению высвобождения дофамина в полосатом теле, что указывает на пресинаптическую функцию Cdk5 как негативного регулятора высвобождения дофамина ( 11 ). Кроме того, Cdk5 модулирует эффективность постсинаптической дофаминовой сигнализации путем фосфорилирования дофамин- и цАМФ-регулируемого фосфопротеина с молекулярной массой 32 кДа (DARPP-32) по остатку Thr-75, что превращает DARPP-32 в ингибитор цАМФ-зависимой киназы (PKA) ( 12 ).
Эти наблюдения позволяют предположить, что Cdk5 и p35 являются нижестоящими регуляторами длительной активации дофаминовой сигнализации после хронического воздействия кокаина и, следовательно, при кокаиновой зависимости. Для дальнейшего изучения роли Cdk5 в дофаминовой сигнализации стриатума мы создали две трансгенные линии мышей, в которых либо Cdk5, либо p35 были специфически сверхэкспрессированы в нейронах под контролем промотора p35. Наши результаты показали, что активность Cdk5 повышалась с увеличением уровня белка p35, но не белка Cdk5, что предполагает, что уровень белка p35 является лимитирующим фактором для активности Cdk5. Мы представляем здесь доказательства in vivo того, что повышенная активность Cdk5 в результате сверхэкспрессии p35 приводит к ослаблению опосредованной кокаином дофаминовой сигнализации в ядро посредством ингибирования каскадов PKA и внеклеточной сигнальной киназы (ERK).
Материалы и методы
Антитела. Поликлональные антитела к Cdk5 (C-8) и p35 (C-19) были приобретены у компании Santa Cruz Biotechnology. Фосфорилирование-зависимые и фосфорилирование-независимые антитела к киназе ERK (MEK) 1/2, ERK1/2 и белку, связывающему элемент ответа на цАМФ (CREB), были получены от компании Cell Signaling Technology (Беверли, Массачусетс). Антитела к фосфо-Thr-34 DARPP 32 ( 13 ), фосфо-Thr-75 DARPP-32 ( 12 ), общему DARPP-32 ( 12 ) и c-fos ( 14 ) использовались, как описано. Антитело к актину было приобретено у компании Sigma.
Экспериментальные животные. Ранее мы клонировали ген мышиного p35 Cdk5r1 , кодирующий белок p35, и охарактеризовали его геномную структуру ( 15 ). Для создания трансгенной мыши с нейрональной сверхэкспрессией p35 (Tgp35) 6-кб фрагмент Eco RI- Eco RI, содержащий 1.2-кб область промотора, был субклонирован в плазмиду pGEM9Z(–), а 45-bp метка, полученная из SV40, была вставлена в сайт Kpn I ниже сигнала поли(A + ) ( рис. 1А ) . Метка содержала сайт Spe I для генотипирования животных. 6-кб фрагмент был вырезан из плазмиды и очищен, после чего трансген был введен в пронуклеус для создания трансгенных мышей. Для изучения профиля экспрессии трансгена под регуляторным контролем промотора p35 размером 1.2 кб in vivo была дополнительно создана двойная трансгенная мышь (Tgp35;p35–/–) с использованием двухэтапной стратегии разведения, в рамках которой мышь Tgp35 была регенерирована на фоне эндогенного отсутствия p35. Другие модели мышей, использованные в этом исследовании, включали p35+/–, p35–/–, Cdk5+/– и трансгенную мышь с нейрональной сверхэкспрессией Cdk5 (TgCdk5) ( 9 , 16 , 17 ). Генотипы этих мышей определялись с помощью анализа Саузерн-блоттинга или ПЦР на геномной ДНК, выделенной из биопсий хвоста. Мыши содержались в условиях 12-часового светового/12-часового темного цикла. Все процедуры проводились в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных и экспериментальных животных.
Анализ методом Саузерн-блоттинга. Геномную ДНК, выделенную из биопсий хвоста, обрабатывали ферментами Eco RI и Spe I, подвергали электрофорезу на 0.9% агарозном геле и переносили на нейлоновую мембрану. Гибридизацию мембраны проводили с использованием меченого 32P зонда, полученного методом случайной затравки, при температуре 42°C в течение ночи. Зонд длиной 485 п.н. для генотипирования мышей с нокаутом гена p35 (p35–/–) и мышей Tgp35 получали методом ПЦР с использованием следующих праймеров: 5′-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3′ и 5′-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3′. Гибридизированную мембрану дважды промывали в растворе 2× SSC/0.1% SDS при 42°C в течение 10 мин, а затем дважды в растворе 0.1× SSC/0.1% SDS при 65°C в течение 20 мин, после чего экспонировали на рентгеновскую пленку.
Медикаментозное лечение. Кокаин (Sigma) растворяли в стерильном физиологическом растворе. Животным в возрасте 3 месяцев внутрибрюшинно вводили кокаин (15 мг/кг) или равный объем физиологического раствора, после чего их умерщвляли путем декапитации в разные моменты времени (15, 30, 60 и 120 мин) после инъекции. Мозг быстро извлекали и охлаждали в ледяном фосфатно-солевом буфере (PBS). Затем выделяли полосатое тело и подвергали его анализу методом Northern blot или Western blot. Для иммуногистохимического анализа срезы полосатого тела получали от мышей через 2 часа после инъекции.
Анализ методом Northern blot. Общая РНК была выделена из полосатого тела с помощью реагента TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) и подвергнута анализу методом Northern blot, как описано ( 18 ). Для обнаружения мРНК c-fos в качестве зонда использовали фрагмент кДНК мышиного c-fos длиной 189 п.н., как описано ( 19 ). Уровни мРНК c-fos количественно определяли путем измерения оптической плотности специфической полосы с помощью системы анализа изображений с программным обеспечением nih image, версия 1.62.
Вестерн-блот анализ. Ткани полосатого тела подвергали ультразвуковой обработке в 1% SDS и кипятили в течение 10 мин. Концентрацию белка в каждом образце определяли с помощью анализа белка BCA (Pierce). Равные количества белка разделяли методом SDS/PAGE перед переносом на нитроцеллюлозную мембрану. Мембраны блокировали в 1× PBS, содержащем 5% обезжиренного молока и 0.05% Tween 20, и инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4°C. Инкубацию с конъюгированными с пероксидазой антителами против мышиного или кроличьего IgG (Sigma) проводили при комнатной температуре в течение 60 мин. Сигнал детектировали с помощью усиленной хемилюминесценции (Pierce), а оптическую плотность полос количественно определяли, как описано выше.
Анализ активности киназы Cdk5. Лизаты полосатого тела готовили с использованием лизирующего буфера, состоящего из 50 мМ Трис-HCl, pH 7.4/50 мМ NaCl/5 мМ EDTA/1% Тритон X-100/1 мМ МДТТ/1 мМ фенилметилсульфонилфторида/1 мкг/мл апротинина/1 мкг/мл леупептина/ингибиторов фосфатаз (смесь ингибиторов фосфатаз I и II, Sigma). Лизаты подвергали иммунопреципитации с использованием антител к Cdk5 (C-8) или антител к p35 (C-19). Иммунопреципитаты Cdk5 получали путем инкубации 300 мкл лизата (что соответствует 300 мкг белка) с антителами к Cdk5 (3 мкг) в течение ночи при 4°C, после чего проводили дополнительную инкубацию с 25 мкл агарозных шариков Protein A (50% суспензия в лизисном буфере; Santa Cruz Biotechnology) в течение 3 часов при 4°C. Для получения иммунопреципитатов p35 500 мкл лизата (что соответствует 1 мг белка) инкубировали с антителами к p35 (3 мкг), как описано выше. Иммунопреципитаты дважды промывали лизисным буфером и дважды киназным буфером, состоящим из 50 мМ Трис·HCl, pH 7.4/5 мМ MgCl₂ / 1 мМ EDTA/1 мМ EGTA/1 мМ DTT, ресуспендированным в 60 мкл киназного буфера. Киназную активность измеряли с использованием гистона H1 в качестве субстрата ( 18 ).
Иммуногистохимическое исследование. Мышей анестезировали внутрибрюшинными инъекциями авертина (250 мг/кг, Fluka) и перфузировали транскардиально 0.1 М фосфатным буфером натрия, pH 7.4, с последующим применением фиксатора тканей Streck (Streck Laboratories, La Vista, NE), не образующего поперечных связей. Извлеченные головные мозги дополнительно фиксировали в том же фиксаторе в течение ночи при 37°C. Затем головные мозги заливали парафином, разрезали на корональные срезы толщиной 5 мкм и подвергали иммуногистохимическому исследованию с использованием авидин-биотин-пероксидазного комплекса (Vector Laboratories) с диаминобензидином в качестве субстрата. Срезы инкубировали с аффинно-очищенными поликлональными антителами против c-fos в течение ночи при 4°C. Специфичность окрашивания оценивали путем исключения первичных антител.
Результаты
Создание трансгенных мышей с нейрональной сверхэкспрессией p35. Трансген, используемый для достижения повышенной нейрональной экспрессии p35, включал 6-кб фрагмент клонированного гена p35 мыши, содержащий 1.2-кб промотор и всю кодирующую последовательность p35 ( рис. 1 А ). Генотипы мышей определяли методом Саузерн-блоттинга с использованием зонда, разработанного для различения мышей p35–/– и Tgp35 от мышей дикого типа ( рис. 1 А и В ) . Для изучения экспрессии трансгена под контролем 1.2-кб промотора p35 мы создали двойных трансгенных мышей (Tgp35;p35–/–), у которых экспрессия p35 определялась только трансгеном. Экспрессия p35 у мышей Tgp35;p35–/– наблюдалась только в головном мозге ( рис. 1 С ), где пространственная картина экспрессии была аналогична таковой у мышей дикого типа ( рис. 1 D ). Было показано, что отсутствие p35 приводит к аномальной слоистой структуре в коре головного мозга и гиппокампе мышей ( 10 ). Однако у мышей Tgp35;p35–/– наблюдалось полное восстановление фенотипа головного мозга, характерного для мышей p35–/– ( рис. 1 E ). Эти данные указывают на то, что 1.2-кб промотор p35 контролирует экспрессию трансгена с профилем экспрессии, аналогичным профилю экспрессии p35 из эндогенного гена p35.
Уровень белка p35 является лимитирующим фактором для повышения активности Cdk5. Мы исследовали влияние дозы генов, кодирующих p35 и Cdk5, на экспрессию белка в экстрактах полосатого тела мышей p35–/–, p35+/–, дикого типа, Tgp35, Cdk5+/– и TgCdk5 в возрасте 3 месяцев. Уровни белков p35 и Cdk5 хорошо коррелировали с дозами генов соответственно ( рис. 2 A и B ). У мышей Tgp35 наблюдалось приблизительно 1.6-кратное увеличение уровня белка p35 по сравнению с мышами дикого типа, тогда как уровни белка Cdk5 не зависели от различных уровней белка p35. У мышей TgCdk5 наблюдалось приблизительно 1.9-кратное увеличение уровня белка Cdk5 по сравнению с мышами дикого типа, тогда как уровень белка p35 не зависел от различных уровней белка Cdk5. Для изучения влияния различных количеств белка p35 на активность Cdk5, Cdk5 был иммунопреципитирован из экстрактов полосатого тела с помощью антител к Cdk5, и была измерена киназная активность. Аналогично, для изучения влияния различных количеств белка Cdk5 на киназную активность, p35 был иммунопреципитирован из экстрактов полосатого тела с помощью антител к p35, и была измерена киназная активность. Активность Cdk5 хорошо коррелировала с уровнем белка p35, но не с уровнем белка Cdk5 ( рис. 2 C и D ). Эти результаты показали, что количество белка p35 является лимитирующим фактором для активности Cdk5. Поэтому мы использовали мышей Tgp35 для исследования влияния повышенной активности Cdk5 на дофаминовую сигнализацию в полосатом теле.
Индуцированное кокаином фосфорилирование DARPP-32 по Thr-34 ослаблено у мышей Tgp35. Функция DARPP-32 зависит от состояния его фосфорилирования в нескольких сайтах ( 20 ). PKA фосфорилирует DARPP-32 по Thr-34, тогда как Cdk5 фосфорилирует DARPP-32 по Thr-75. Таким образом, мы исследовали состояние фосфорилирования DARPP-32 в экстрактах полосатого тела мышей дикого типа и мышей Tgp35. Уровень фосфорилированного по Thr-75 DARPP-32 был выше у мышей Tgp35 ( рис. 3А ; в 1.6 ± 0.2 раза выше, чем у мышей дикого типа). Далее мы оценили влияние повышенной активности Cdk5 на дофаминовую сигнализацию в полосатом теле. Мы исследовали вызванную кокаином активацию PKA у мышей Tgp35, анализируя состояние фосфорилирования DARPP-32 по Thr-34. Уровень фосфорилированного по Thr-34 DARPP-32 был повышен у мышей дикого типа через 15 мин после инъекции кокаина ( рис. 3 B ; в 1.8 ± 0.2 раза выше базального уровня). Однако эффект кокаина на фосфорилирование DARPP-32 по Thr-34 был ослаблен у мышей Tgp35 (в 1.2 ± 0.3 раза выше базального уровня). Эти результаты показали, что увеличение активности Cdk5 ослабляет вызванную кокаином активацию PKA, вероятно, через фосфорилирование DARPP-32 по Thr-75 ( 6 , 12 ). Также возможно, что увеличение пресинаптической активности Cdk5 приводит к снижению высвобождения дофамина, и это способствует уменьшению эффекта кокаина. Примечательно, что однократная инъекция кокаина не повлияла на уровни белков p35 и Cdk5, а также на активность киназы ( рис. 3 C и D ). Это противоречит результатам предыдущего исследования, в котором было показано, что хроническое воздействие кокаина повышает экспрессию p35 и Cdk5 ( 6 ).
Повышение активности Cdk5 ослабляет вызванную кокаином активацию ERK1/2. Недавние данные свидетельствуют о том, что активация дофаминовых рецепторов в полосатом теле также активирует другие сигнальные каскады, включая путь ERK ( 21 , 22 ), который играет важную роль в поведенческой реакции на кокаин ( 23 ). Поэтому мы исследовали, может ли активность Cdk5 влиять на вызванную кокаином активацию пути ERK. После инъекции кокаина в экстракты полосатого тела мышей дикого типа наблюдалась активация сигнального пути ERK, о чем свидетельствует повышенное фосфорилирование MEK1/2 по Ser-217 и Ser-221 (в 1.5 ± 0.2 раза выше базального уровня) и ERK1/2 по Thr-202 и Tyr-204 (фосфорилирование ERK2: в 1.5 ± 0.2 раза выше базального уровня) ( рис. 4 A и B ). Однако вызванная кокаином активация MEK1/2 (в 1.2 ± 0.2 раза выше базального уровня) и ERK1/2 (фосфорилирование ERK2: в 1.2 ± 0.2 раза выше базального уровня) была ослаблена у мышей Tgp35 ( рис. 4 A и B ). Более того, базальный уровень фосфо-ERK1/2 был ниже у мышей Tgp35 (в 0.8 ± 0.2 раза ниже, чем у мышей дикого типа), тогда как эта тенденция не была статистически значимой. Последний результат может быть связан с Cdk5-зависимым фосфорилированием MEK1 по Thr-286, что приводит к снижению каталитической активности ( 24 ). Чтобы оценить эту возможность, мы исследовали состояние фосфорилирования MEK1 по Thr-286 и обнаружили, что более высокие уровни фосфо-Thr-286 MEK1 присутствовали в экстрактах полосатого тела мышей Tgp35 ( рис. 4 C ; в 1.3 ± 0.1 раза выше, чем у мышей дикого типа). Кроме того, состояние фосфорилирования MEK1 по Thr-286 не изменялось после однократной инъекции кокаина, что согласуется с тем, что активность Cdk5 не изменялась под воздействием лечения ( рис. 3 D ).
Распространение дофаминовой сигнализации в ядро ослабляется при повышенной активности Cdk5. Индуцированная кокаином активация множественных сигнальных каскадов, включающих PKA и ERK, приводит к последующей активации транскрипционного фактора CREB в ядре посредством его фосфорилирования по Ser-133 ( 22 , 25 ). Чтобы исследовать, могут ли опосредованные Cdk5 ингибирующие эффекты на каскады активации PKA и ERK сходиться на фосфорилировании CREB в ядре, мы исследовали состояние фосфорилирования CREB по Ser-133 в экстрактах полосатого тела мышей дикого типа и мышей Tgp35. Базовый уровень фосфо-CREB был ниже у мышей Tgp35 (в 0.7 ± 0.1 раза ниже, чем у мышей дикого типа) ( рис. 5 ). В ответ на инъекцию кокаина уровень фосфорилированного CREB в полосатом теле мышей дикого типа повышался (в 1.5 ± 0.1 раза выше базального уровня), но эта реакция на кокаин ослаблялась у мышей Tgp35 (в 1.2 ± 0.1 раза выше базального уровня) ( рис. 5 ).
Фосфорилирование CREB по Ser-133 усиливает его транскрипционную активность через элемент ответа на цАМФ в промоторной области некоторых генов, включая ген c-fos ( 26 ). Поэтому мы исследовали индукцию c-fos в полосатом теле мышей дикого типа и мышей Tgp35 после инъекции кокаина. У мышей дикого типа уровень мРНК c-fos увеличился до пикового значения (в 1.8 ± 0.2 раза выше базального уровня) через 30 мин после инъекции кокаина, а затем вернулся к базальному уровню через 120 мин после инъекции ( рис. 6 A и B ). Однако уровни мРНК c-fos были примерно на 30% ниже у мышей Tgp35, чем у мышей дикого типа, до 30 мин после инъекции ( рис. 6 A и B ). Меньшая индукция c-fos у мышей Tgp35 была дополнительно подтверждена иммуногистохимическим анализом ( рис. 6 C – F ). Введение кокаина увеличивало иммунореактивность c-fos, сильно в дорсомедиально-дорсоцентральных частях полосатого тела и слабо в латеральных частях, как у мышей дикого типа, так и у мышей Tgp35. Однако вызванное кокаином увеличение числа c-fos-иммунопозитивных клеток было заметно ослаблено в полосатом теле мышей Tgp35 ( рис. 6 G ). В совокупности эти результаты показали, что опосредованное кокаином усиление дофаминовой сигнализации в полосатом теле к ядру было подавлено у мышей Tgp35, что, вероятно, является результатом повышенной активности Cdk5.
Обсуждение
Cdk5 и его активатор p35 были идентифицированы как целевые гены, которые активируются при хроническом воздействии кокаина ( 6 ). Мы представляем здесь доказательства того, что повышенная активность Cdk5, как результат активации p35, а не активации Cdk5, приводит к ослаблению опосредованной кокаином дофаминовой сигнализации в нейронах полосатого тела. Для изучения последствий повышенной экспрессии Cdk5 или p35 на дофаминовую сигнализацию в полосатом теле были проанализированы две трансгенные линии мышей: TgCdk5 и Tgp35. Мы обнаружили, что активность Cdk5 повышалась пропорционально увеличению уровня белка p35, но не зависела от увеличения уровня белка Cdk5. В нашем предыдущем отчете также было показано, что активность Cdk5 в мозге мышей TgCdk5 была ниже, чем в мозге мышей дикого типа, когда активность измерялась с помощью иммунопреципитатов Cdk5 ( 17 ), что предполагает, что сверхэкспрессия Cdk5 приводит к увеличению уровня мономерного Cdk5, если уровень p35 не увеличивается. Эти результаты показали, что уровень белка p35 является лимитирующим фактором для активности Cdk5.
У мышей Tgp35 наблюдалось меньшее увеличение как фосфорилирования CREB, так и c-fos в полосатом теле после острой инъекции кокаина, что предполагает, что реакция полосатого тела на кокаин была подавлена повышенной активностью Cdk5. Ослабление опосредованной кокаином дофаминовой сигнализации у мышей Tgp35, вероятно, было достигнуто за счет опосредованного Cdk5 ингибирования множественных сигнальных каскадов, включающих DARPP-32, PKA и ERK. Введение кокаина увеличивало фосфорилирование DARPP-32 по Thr-34 PKA у мышей дикого типа, тогда как эта реакция была ослаблена у мышей Tgp35. Было показано, что фосфорилирование DARPP-32 по Thr-34 PKA ингибирует активность протеинфосфатазы 1 (PP1), фермента, ответственного за дефосфорилирование Ser-133 CREB ( 27 ). Таким образом, активность PP1 не будет подавляться через путь DARPP-32/PP1 у мышей Tgp35.
Активация ERK1/2, вызванная кокаином, также ослаблялась у мышей Tgp35. Существует несколько различных механизмов, посредством которых Cdk5 может ингибировать активацию ERK1/2, вызванную кокаином. Во-первых, Cdk5-зависимое фосфорилирование DARPP-32 по Thr-75 может ингибировать PKA, что приводит к последующему ингибированию любой PKA-опосредованной активации MEK1/2, необходимой для активации ERK1/2. Недавнее исследование также показало, что фосфорилирование DARPP-32 по Thr-34 необходимо для опосредованной кокаином активации ERK1/2 посредством множественных путей, включающих непрямую регуляцию активации MEK, а также регуляцию обогащенной в полосатом теле фосфатазы, тирозиновой фосфатазы, которая действует непосредственно на ERK1/2 ( 28 ). Подтверждением этой возможности служит обнаружение того, что вызванное кокаином фосфорилирование MEK1/2 по Ser-217 и Ser-221 было подавлено у мышей Tgp35. Другой вероятный путь – это Cdk5-зависимое фосфорилирование MEK1 по Thr-286, что приведет к снижению его каталитической активности и ингибированию активности ERK1/2 ( 24 ).
Было показано, что ингибирование активности Cdk5 в полосатом теле усиливает поведенческие эффекты хронического лечения кокаином у животных ( 6 ). В соответствии с гипотезой о том, что повышение активности Cdk5 может способствовать нейронной адаптации для противодействия эффектам повторного введения кокаина ( 6 ), мы обнаружили, что опосредованное Cdk5 фосфорилирование DARPP-32 и MEK1 способствовало ослаблению вызванной кокаином активации ERK1/2, что приводило к меньшей индукции фосфорилирования CREB и c-fos в полосатом теле. Наши результаты подтверждают идею о том, что повышенная активность Cdk5 в результате повышения активности p35 может изменять экспрессию генов в полосатом теле после хронического воздействия кокаина. Это может происходить за счет изменений в активности факторов транскрипции, таких как CREB и c-fos. Таким образом, активатор Cdk5 p35, благодаря своему ограничивающему воздействию на активность Cdk5, может способствовать долговременным изменениям в нейронной функции, лежащим в основе кокаиновой зависимости.
Благодарности
Мы благодарим доктора. Мэри Джо Дантон, Филип Грант и Саши Кесавапаны за критическое чтение рукописи. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения Grant Z01DE00664-05 (до ABK), грантом DA10044 по общественному здравоохранению США и грантами Фонда Саймонса, Фонда Питера Дж. Шарпа и Фонда Пикауэра (до PG).
Заметки
Сокращения: Cdk5, циклинзависимая киназа 5; ERK, внеклеточная сигнально-регулируемая киназа; DARPP-32, допамин и cAMP-регулируемый фосфопротеин, молекулярная масса 32 кДа; PKA, цАМФ-зависимая киназа; MEK, ERK киназа; CREB, cAMP-ответный элемент-связывающий белок.
Референсы