PLoS One. 2013 Ноябрь 25; 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Нисидзима Т, Каваками М, Кита я.
Источник
Лаборатория поведенческой физиологии, Высшая школа наук о здоровье, Токийский столичный университет, Токио, Япония.
Абстрактные
Физические упражнения улучшают многие аспекты функции гиппокампа. В соответствии с представлением о том, что нейрональная активность является ключевой для стимулирования нейронных функций, в предшествующей литературе последовательно демонстрировалось, что острые приступы физических упражнений вызывают активацию нейронов в гиппокампе. Повторные активирующие стимулы приводят к накоплению транскрипционного фактора ΔFosB, который обеспечивает долговременную нервную пластичность.
В этом исследовании мы проверили гипотезу о том, что длительный произвольный ход колеса вызывает экспрессию ΔFosB в гиппокампе, и исследовали любые потенциальные специфические для региона эффекты в подполях гиппокампа вдоль дорсо-вентральной оси. Самцов мышей C57BL / 6 содержали с бегущим колесом или без него в течение недель 4. Длительный ход колес значительно увеличил иммунореактивность FosB / ΔFosB во всех измеренных областях гиппокампа (т.е. в подполях DG, CA1 и CA3 как дорсального, так и вентрального гиппокампа). Результаты подтвердили, что ход колеса вызывал специфическую для региона экспрессию иммунореактивности FosB / ΔFosB в коре, предполагая, что равномерное увеличение FosB / ΔFosB в гиппокампе не является неспецифическим следствием бега. Данные вестерн-блоттинга показали, что повышенная иммунореактивность FosB / ΔFosB в гиппокампе была обусловлена главным образом увеличением ΔFosB. Эти результаты свидетельствуют о том, что длительные физические упражнения являются мощным триггером индукции ΔFosB во всем гиппокампе, что объясняет, почему физические упражнения могут улучшать функции, связанные как с дорсальной, так и с вентральной частью гиппокампа. Интересно, что мы обнаружили, что экспрессия FosB / ΔFosB в DG была положительно коррелирована с количеством иммунореактивных (то есть незрелых) нейронов с двойным кортином.
Хотя механизмы, с помощью которых FosB опосредует индуцированный физическими упражнениями нейрогенез, все еще остаются неопределенными, эти данные предполагают, что индуцированный физическими упражнениями нейрогенез, по крайней мере, зависит от активности. Взятые вместе, наши текущие результаты показывают, что ΔFosB является новой молекулярной мишенью, участвующей в регуляции пластичности гиппокампа, вызванной физической нагрузкой.
Введение
Упражнения дают различные преимущества в отношении молекулярных, структурных и функциональных аспектов гиппокампа у грызунов [1,2], некоторые из которых были подтверждены исследованиями на людях [3,4]. Однако механизмы, лежащие в основе вызванных физической нагрузкой изменений в пластичности гиппокампа, недостаточно изучены. Предыдущая литература последовательно демонстрировала, что физические упражнения вызывают активацию нейронов гиппокампа у грызунов. Иммуногистохимические исследования с использованием c-Fos, маркера временной нейрональной активации, показали, что как принудительная, так и произвольная работа увеличивали экспрессию c-Fos в подполе зубчатой извилины (DG), CA1 и CA3 гиппокампа грызунов [5–7]. Кроме того, предыдущее исследование с использованием лазерной допплеровской флоуметрии (LDF) продемонстрировало, что умеренная беговая дорожка усиливает региональный мозговой кровоток (rCBF), альтернативный маркер нейрональной активации, в подполе CA1 у крыс [8]. Иммуногистохимические исследования позволяют проводить детальный специфический для региона анализ после прекращения тренировки, в то время как LDF обеспечивает мониторинг rCBF в реальном времени в локализованной области во время тренировки. Несмотря на преимущества и недостатки каждого исследования, эти исследования также продемонстрировали влияние острых приступов физических упражнений на активность нейронов гиппокампа. Эти результаты предполагают механизм, посредством которого длительные регулярные физические упражнения повышают пластичность гиппокампа, многократно вызывая активацию нейронов [9].
Фактор транскрипции FosB, усеченная сплайс-изоформа полноразмерного FosB, индуцируется различными типами повторных стимулов в определенных областях мозга, где он постепенно накапливается благодаря своей уникальной стабильности (период полураспада недель) [10–12]. Все больше фактов свидетельствует о том, что повышенные уровни ΔFosB обеспечивают длительную нейронную и поведенческую пластичность, связанную с конкретными стимулами [11,13]. Например, хроническое введение лекарств от злоупотребления, таких как кокаин и морфин, обычно увеличивает экспрессию ΔFosB в прилежащем ядре, представляя один из молекулярных механизмов, лежащих в основе повышенной чувствительности к этим препаратам. [11,14,15]. Sбезразлично к другим стимулам вознаграждения, включая диету с высоким содержанием жиров и сексуальный опыт [16,17], лдобровольное бегание колеса также увеличило иммунореактивность FosB / ΔFosB у прилежащего ядра крысы, что говорит о том, что добровольный бег является естественной наградой для грызунов [18,19]. Однако, насколько нам известно, ни в одной литературе не изучалось, вызывает ли повторное воздействие физических упражнений экспрессию ΔFosB в гиппокампе. Поскольку физические упражнения запускают активацию нейронов в гиппокампе, мы предположили, что длительный произвольный бег колеса также будет вызывать экспрессию ΔFosB в гиппокампе. Хотя точные механизмы, с помощью которых FosB регулирует пластичность гиппокампа, остаются неопределенными, исследования показали, что у мышей отсутствует fosB ген демонстрирует нарушение нейрогенеза гиппокампа и усиление депрессивного поведения [20,21]. яДействительно, физические упражнения усиливают нейрогенез и обладают антидепрессивными свойствами. [22–25]. яЕсли наша гипотеза верна, ΔFosB будет новой потенциальной молекулярной мишенью, обеспечивающей пластичность гиппокампа, вызванную физической нагрузкой.
Гиппокамп имеет анатомический и функциональный градиент вдоль продольной (дорсо-вентральной) оси [26]. Спинной гиппокамп играет ключевую роль в пространственном обучении и памяти [27,28], тогда как вентральный гиппокамп преимущественно участвует в регуляции эмоционального поведения [29,30]. Кроме того, исследования показали, что физиологические стимулы вызывают различные паттерны экспрессии c-Fos в дорсальной и вентральной частях гиппокампа [31–33]. Потому что упражнения улучшают как спинной34–37] и функции вентрального гиппокампа [24,25,38], важно изучить, вызывает ли длительный произвольный бег специфическую для региона экспрессию ΔFosB в гиппокампе.
Основная гипотеза этого исследования состояла в том, что длительный произвольный ход колеса будет вызывать экспрессию ΔFosB в гиппокампе мыши. Эта гипотеза была исследована с помощью иммуногистохимии FosB / ΔFosB в дорсальных и вентральных подполях гиппокампа, DG, CA1 и CA3, с дополнительным акцентом на выявление специфической для региона индукции. Результаты были подтверждены вестерн-блоттингом, который был использован для идентификации изоформы fosB генные продукты, индуцированные в гиппокампе. Мы также исследовали кору головного мозга на предмет специфической для региона индукции FosB / ΔFosB, чтобы исключить возможность того, что длительные физические нагрузки неспецифически повышают иммунореактивность FosB / ΔFosB в мозге. Наконец, корреляционная связь между экспрессией FosB / ΔFosB и нейрогенезом была исследована в качестве первого шага в поиске функциональных последствий индуцированной физической нагрузкой индукции FosB в регуляции пластичности гиппокампа.
Материалы и методы
1: заявление о животных и этике
Двадцать самцов мышей C57BL / 6 (недели 8 в возрасте) были приобретены у коммерческого заводчика (SLC, Shizuoka, Japan). Десять мышей были использованы для эксперимента 1, а остальные десять - для эксперимента 2. Мышей содержали в контролируемых условиях температуры (22 – 24 ° C) и света (цикл 12 / 12-h свет / темнота, свет включали в 0500), и им давали пищу и воду. вволю, Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по экспериментальной этике животных Токийского столичного университета.
В каждом эксперименте по прибытии мышей случайным образом распределяли по контрольной группе (контроль, n = 5) или бегущей группе (бегун, n = 5). В течение первой недели все мыши содержались в стандартных пластиковых клетках в группах (мыши 5 / клетка) для начальной акклиматизации. Затем мышей Runner переносили в клетку, оборудованную бегущим колесом (ENV-046, Med Associate Inc., Джорджия, VT, США). Поскольку социальная изоляция, как известно, подавляет вызванный физическими упражнениями нейрогенез в гиппокампе [39], Мышей Runner содержали в группе (мыши 5 / клетка) в течение дополнительных недель 4. Количество оборотов колеса регистрировали каждое утро, а массу тела (г) измеряли еженедельно.
2: Эксперимент 1. Иммуногистохимическое исследование экспрессии FosB / ΔFosB и нейрогенеза гиппокампа
2.1: перфузия и обработка тканей
Утром (0900 – 1100) после последнего дня бегового периода мышей глубоко анестезировали пентобарбиталом натрия и транскардиально перфузировали холодным физиологическим раствором. Мозг был быстро удален и после фиксации в 4% параформальдегиде в физиологическом растворе с фосфатным буфером 0.1 M (PBS, pH 7.4) в течение ночи. Затем мозг подвергали криопротекции в 30% сахарозе в PBS и замораживали до дальнейшей обработки. Корональные срезы мозга (40 мкм) полушария были получены с использованием замораживающего микротома и собраны в PBS с 0.01% азидом натрия.
2.2: иммуногистохимия
Одна из шести серий срезов была выбрана случайным образом для иммуноокрашивания FosB / ΔFosB. Смежную серию использовали для маркировки даблкортина (DCX), маркера незрелых нейронов, подтвержденного для оценки нейрогенеза [40,41]. После гашения активности эндогенной пероксидазы с помощью 1% H2O2 в PBS свободно плавающие срезы предварительно инкубировали с блокирующим раствором, содержащим 10% нормальной лошадиной сыворотки в PBS для 2 h. После промывания в PBS срезы инкубировали с кроличьими поликлональными пан-FosB антителами (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США), разведенными в PBS с 0.5% тритоном X-100 и 0.5% BSA (PBST -BSA) для 24 ч при 4 ° C. Еще одну серию срезов инкубировали с поликлональным антителом козы против DCX (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) в PBST-BSA для 48 h при 4 ° C. Затем срезы инкубировали с подходящим биотинилированным вторичным антителом (IgG против кролика, 1: 1000, AP182B; IgG против козы, 1: 1000, AP180B, оба антитела из EMD Millipore, Billerica, MA, USA) в PBST-BSA. для 2 ч при комнатной температуре. Затем срезы обрабатывали комплексом авидин-биотин-пероксидаза (набор пероксидазы Vectastain ABC, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, USA) в течение 90 min, следуя инструкциям производителя. Наконец, антигены визуализировали с помощью 0.02% 3,3-диаминобензидина (DAB) в 0.1 M Трис-HCl (pH 7.6), содержащем 0.01% H2O2, Для иммуноокрашивания FosB / ΔFosB реакцию усиливали сульфатом никеля-аммония. Для окрашивания DCX ядра клеток контрастировали окрашиванием Nissl. Срезы устанавливали на предметные стекла, покрытые желатином, и накладывали покровные стекла.
2.3: Количественная оценка иммунореактивности FosB / ΔFosB с использованием порога изображения
Антитело pan-FosB, используемое в этом исследовании, было выращено против внутренней области, общей для N-концевой области FosB и ΔFosB, так что не может различить две изоформы. Следовательно, иммуноокрашенные структуры были описаны как иммунореактивные (FosB / ΔFosB-ir) ядра FosB / ΔFosB. Для объективного слепого количественного анализа слайды были закодированы до анализа. Атлас мозга мыши [42] был использован для определения местоположения следующих областей интереса (ROI): слой гранулярных клеток (GCL) DG (срезы 3), слой пирамидальных клеток CA1 (срезы 3) и CA3 (срезы 2 – 3) в дорсальном гиппокампе (закрыто до -2.2 мм от брегмы); DG (срезы 2), CA1 (срезы 2) и CA3 (срезы 2) в вентральном гиппокампе (закрыты на -3.4 мм от брегмы) (Рисунок 4, оставил). Хвостовые отделы содержат как дорсальную, так и вентральную части гиппокампа, но вентральная часть была мишенью. В DG супрапирамидные (DGsp) и инфрапирамидальные (DGip) лопатки анализировали раздельно. Моторная кора (секции 2 – 3, закрытые до -0.6 мм от брегмы), соматосенсорная бочка (секции 2 – 3, закрытые до -0.6 мм от брегмы), зрительная кора (секции 3, закрытые до -2.9 мм от bregma), слуховой кортекс (срезы 3, закрытые до -2.9 мм от брегмы) и обонятельная луковица (срезы 3, закрытые до + 4.3 мм от брегмы) также были проанализированы (Рисунок 6, оставил).
Цифровые изображения (2070 × 1548 пикселей) каждой области исследования были получены с помощью оптического микроскопа (BX-51, Olympus, Токио, Япония), оборудованного CCD-камерой (DP-73, Olympus) и программного обеспечения для обработки изображений (cellSens, Olympus). увеличение объектива составляло 10 × для ROI гиппокампа и 4 × для ROI коры. Для выявления умеренно-сильной иммунореактивности FosB / ΔFosB (Рисунок 1D – G), с использованием нескольких разделов заранее, параметры захвата изображения (интенсивность света, размер остановки поля, время экспозиции и баланс белого) и пороговые уровни для каждого из компонентов RGB были оптимизированы для ROI гиппокампа и коры. Затем был проведен следующий анализ в оптимизированных условиях (1). РИ были выбраны с помощью многоугольника неправильной формы (Рисунок 1A, B) (2). Изображение было пороговым, что преобразовало ядра FosB / ΔFosB-ir в красный цвет (Рисунок 1C-G) (3). % ROI затем автоматически рассчитывался следующим образом:% ROI = (преобразованная площадь (красным цветом) / общая площадь ROI) × 100.
Чтобы подтвердить этот анализ порогового изображения, регионы 20 были случайно выбраны из разных областей мозга с разными размерами областей. В дополнение к количественному определению пороговых значений изображения число ядер FosB / ΔFosB-ir в выбранных областях было подсчитано вручную, а плотность ядер FosB / ΔFosB-ir была получена путем деления числа ядер FosB / ΔFosB-ir на измеренные площадь (мм2).
2.4: Количественная оценка незрелых нейронов DCX-ir в зубчатой извилине
Незрелые нейроны DCX-ir в DG мышей Runner были в изобилии и перекрывались, что затрудняло точный подсчет дискретного количества сомов DCX-ir с помощью оптического микроскопа. Однако в предыдущем исследовании анализ Шолля для морфологической оценки показал, что каждый нейрон DCX-ir имеет, в среднем, один дендрит при измерении в пределах 40 мкм сомы [43]. Таким образом, следующий оригинальный анализ был разработан для того, чтобы позволить специфическую для региона количественную оценку DCX-ir нейронов.
- (1) Изображение GCL проецировалось на дисплей компьютера с использованием программного обеспечения для обработки изображений и объектива 40 × (2). На живом изображении отрезок линии (150 ± 0.1 мкм) был проведен вдоль середины GCL (Рисунок 2) (3). При изменении глубины фокуса подсчитывалось количество раз, когда отрезок линии пересек DC-IR-дендриты (4). ROI (дорсальная DGsp, dDGsp; дорсальная DGip, dDGip; вентральная DGsp, vDGsp; вентральная DGip, vDGip) соответствовала областям, где анализировали иммунореактивность FosB / ΔFosB (5). В каждой области интереса сегменты линий 2 – 3 были нарисованы для каждой секции, а число пересечений было усреднено по секциям 2 – 3 для мыши. Поскольку толщина GCL составляет приблизительно 60 – 80 мкм, число пересечений должно отражать количество нейронов DCX-ir в анализируемой ограниченной области.
Репрезентативное изображение незрелых нейронов DCX-ir и отрезка линии (150 ± 0.1 мкм) наложено для подсчета количества скрещиваний с дендритами DCX-ir.
3. Эксперимент 2. Идентификация изоформы FosB / ΔFosB, вызванной ходом колеса
3.1: перфузия и обработка тканей
Дополнительную когорту мышей обрабатывали, как указано выше в эксперименте 1. После 4 недель непрерывного вмешательства мышей подвергали транскардиальной перфузии холодным физиологическим раствором под глубокой анестезией. Гиппокамп быстро рассекали и замораживали жидким азотом и хранили при -80 ° C. Гиппокампы каждой мыши гомогенизировали в буфере RIPA (150 мМ NaCl, 25 мМ Трис-HCl, рН 7.6, 1% NP-40, 1% дезоксихолат натрия, 0.1% SDS, #8990, Thermo Scientific, IL, USA), содержащая протеазу ингибиторы (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Германия). Лизаты центрифугировали в течение 15 мин при 5000 об / мин при 4 ° C и супернатанты собирали. Концентрации белка измеряли с помощью набора для анализа белка BCA (#23227, Thermo Scientific, IL, США).
3.2: Вестерн-блоттинг
Равные количества белка (30 мкг / полоса) подвергали электрофорезу в 10% полиакриламидном геле, а затем переносили на мембрану PVDF (Immun-Blot, 0.2 µm, Bio-Rad, MD, USA). Неспецифическое связывание блокировали путем предварительной инкубации мембраны для 1 h в TBST (0.5 М NaCl, 20 мМ Трис-HCl pH 7.5, 0.1% Tween-20), содержащего 3% BSA. Мембрану инкубировали с антителом против FosB (1: 1000), которое использовалось выше для иммуногистохимии, растворенным в TBST, содержащем 3% BSA. После промывки TBST мембрану инкубировали с HRP-конъюгированным анти-кроличьим IgG-антителом (1: 5000 в TBST, NA934, GE Healthcare, Бакингемшир, Великобритания) в течение 1 h при комнатной температуре. После промывки TBST белковые полосы визуализировали путем инкубации с усиленной хемилюминесценцией (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, США) и фиксировали с использованием изображения Quant LAS 4000 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Затем мембрану повторно обрабатывали антителом против глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) (#2275, 1: 5000 в TBS-T, Trevigen, MD, USA) в качестве контроля нагрузки. Оптическую плотность белковых полос количественно определяли с использованием Image-J и нормализовали до уровня GAPDH.
4: статистический анализ
Изменения массы тела мыши анализировали с помощью двухстороннего повторного измерения ANOVA (группа × время). Непарный t-критерий был использован для определения статистических различий между группами (контроль и бегун). Корреляционный анализ Пирсона был использован для проверки анализа иммунореактивности FosB / ΔFosB (ручной подсчет и определение порога изображения), а также для изучения связи между уровнем экспрессии FosB / ΔFosB и количеством пересечений DCX в DG. Данные были представлены как среднее ± SEM. Порог для статистической значимости был установлен на P <0.05.
Итоги
1: масса тела и пройденное расстояние в экспериментах 1 и 2
Изменения массы тела контрольной и бегущей мышей в экспериментах 1 и 2 объединены и показаны в Рисунок 3, Двухсторонние повторные измерения ANOVA показали значительное взаимодействие (группа × время, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) и основной эффект группы F(1, 18) = 6.07, P <0.05), что указывает на значительно меньшую массу тела у мышей Runner. Расстояние пробега на клетку показано в Таблица 1, Хотя точное расстояние бега каждой мыши было неопределенным, потому что мышей содержали вместе, регулярное наблюдение подтвердило, что все мыши часто выполняли бег колеса. Мыши Runner в эксперименте 2 работали дольше, чем мыши в эксперименте 1, но среднее расстояние бега (м / день / клетка) было одинаковым на протяжении каждого эксперимента.
2: проверка количественного определения иммунореактивности FosB / ΔFosB с использованием порога изображения
Наблюдалась значительная корреляция между площадью FosB / ΔFosB-ir, полученной с помощью порогового изображения, и плотностью ядер FosB / ΔFosB-ir, полученной путем ручного подсчета (r = 0.941, P <00001, Рисунок 4).
3: иммунореактивность FosB / ΔFosB в гиппокампе
Репрезентативные изображения иммуноокрашивания FosB / ΔFosB в дорсальном и вентральном подполях гиппокампа были показаны на Рисунок 5, Во всех проанализированных ROI иммунореактивность FosB / ΔFosB у мышей Runner (Рисунок 5справа) был качественно выше, чем у контрольных мышей (Рисунок 5, центр). У мышей Runner количественный анализ показал значительное увеличение площади FosB / ΔFosB-ir в обеих дорсальных областях (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) и вентральные подполя гиппокампа (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Рисунок 6).
4: иммунореактивность FosB / ΔFosB в коре
Репрезентативные изображения иммуноокрашивания FosB / ΔFosB в кортикальных областях показаны на Рисунок 7, Количественный анализ выявил зависящие от региона изменения в иммунореактивности FosB / ΔFosB при длительном прогоне (Рисунок 8). У мышей Runner площадь FosB / ΔFosB-ir была значительно выше в моторной коре (P <0.05) и коры соматосенсорной бочки (P <0.05), но не в зрительной коре (P = 0.662) или обонятельная луковица (P = 0.523). В слуховой коре область FosB / ΔFosB-ir имела тенденцию к увеличению у мышей Runner (P = 0.105).
5: Нейрогенез
Репрезентативные изображения DCX иммуноокрашивания показаны на Рисунок 9, В дорсальном гиппокампе, иммунореактивность DCX у мышей Runner (Рисунок 9справа) был качественно выше по сравнению с контрольными мышами (Рисунок 9, оставил). По сравнению с дорсальным гиппокампом иммунореактивность DCX в вентральном гиппокампе была слабее как у контрольной, так и у бегуновой мышей. У мышей Runner количество скрещиваний было значительно выше в dDGsp (P <0.01) и dDGip (P <0.01; Рисунок 10). В вентральном гиппокампе число скрещиваний у мышей Runner имело тенденцию к увеличению, но между группами не было значительных различий (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Рисунок 10).
6: корреляция между экспрессией FosB / ΔFosB и нейрогенезом
Был проведен корреляционный анализ между областью FosB / ΔFosB-ir и количеством пересечений DCX (Рисунок 11). Поскольку каждый набор данных (например, дорсальный DGsp у контрольных мышей) состоит только из пар 5, анализ сначала выполнялся со всеми парами 40. Интересно, что была значительная корреляция между областью FosB / ΔFosB-ir и количеством пересечений DCX (r = 0.885, P <0.0001). Кроме того, значимые корреляции были выявлены и при дорсальной ДГ (r = 0.762, P <0.05) и вентральной ДГ (r = 0.816, P <0.01) анализировали отдельно.
7: Идентификация изоформы FosB / ΔFosB, вызванной длительным прогоном
Наконец, чтобы определить изоформу fosB генные продукты, индуцированные в гиппокампе в ответ на длительный прогон, гиппокампы из дополнительной когорты мышей подвергали вестерн-блоттингу с использованием того же антитела к FosB. Несколько полос 35 – 37 кДа, представляющих модифицированные изоформы ΔFosB [44], были значительно увеличены у мышей Runner по сравнению с контрольными мышами (Рисунок 12, P <0.01). С другой стороны, изоформа 48 кДа FosB не обнаруживалась ни в одной из групп. Другая полоса, слабо видимая выше 25 кДа, вероятно, представляет изоформу Δ2ΔFosB (27 кДа). Были две другие полосы, более 50 кДа и 37 кДа, которые, скорее всего, были из-за неспецифического связывания. При количественной оценке не было обнаружено различий в этих полосах, отличных от ΔFosB, между группами (данные не показаны).
Обсуждение
Таким образом, в настоящем исследовании впервые был проведен иммуногистохимический анализ для изучения 1), индуцирует ли длительный произвольный ход колеса экспрессию FosB / ΔFosB в гиппокампе; и 2) существует ли специфический для региона ответ по его дорсо-вентральной оси.
Четыре недели произвольного бега колеса вызывали значительное увеличение иммунореактивности FosB / ΔFosB во всех проанализированных областях гиппокампа (то есть подполя DG, CA1 и CA3 как в дорсальной, так и вентральной частях гиппокампа). Мы подтвердили, что изоформа 35 – 37kDa ΔFosB была основной fosB продукт гена накапливается в ответ на долгосрочную работу. Эти результаты четко подтверждают гипотезу о том, что длительные регулярные физические упражнения являются мощным триггером для индукции ΔFosB по всему гиппокампу, и что его индукция может быть новым молекулярным механизмом, с помощью которого упражнения влияют на различные типы дорсальных и / или вентральных зависимых от гиппокампа функций.
1: проверка и ограничения количественного определения иммунореактивности FosB / ΔFosB с использованием порога изображения
Метод порогового изображения, широко используемый в иммуногистохимических исследованиях для подсчета количества клеток-мишеней и для оценки морфологии клеток, был принят в этом исследовании для специфической для региона количественной оценки иммунореактивности FosB / ΔFosB [15,45,46]. Была продемонстрирована значительная корреляция между уровнями иммунореактивности FosB / ΔFosB, количественно определенными с помощью порогового изображения и ручного подсчета (Рисунок 4). Однако, поскольку плотность и перекрытие препятствовали подсчету количества ядер FosB / ΔFosB-ir в областях с высокой плотностью, продемонстрированная корреляция подразумевает точность метода определения порога изображения только тогда, когда области FosB / ΔFosB-ir представляют <~ 40% от общей ROI. площадь. Следовательно, требуется тщательная интерпретация для областей FosB / ΔFosB-ir> 40% от общей площади ROI.
В частности, в DG мышей Runner (Рисунок 4), Экспрессия FosB / ΔFosB в значительной степени индуцировалась ходом колеса, и большинство ядер FosB / ΔFosB-ir перекрывались. В этих областях повышенная индукция экспрессии FosB / ΔFosB приводит к большей недооценке уровня экспрессии, независимо от используемого метода количественного определения (пороговое значение изображения или ручной подсчет). Однако, несмотря на риск недооценки, важно отметить, что настоящее исследование успешно продемонстрировало значительное увеличение площади FosB / ΔFosB-ir в DG мышей Runner. Это говорит о том, что методологические ограничения не ставят под угрозу наши выводы. Вместо этого, потенциальная недооценка повышает достоверность находки, что длительная работа увеличивала иммунореактивность FosB / ΔFosB в гиппокампе.
2: равномерная индукция ΔFosB в гиппокампе при длительном беге
Гиппокамп имеет анатомические и функциональные градиенты вдоль своей продольной оси [26], поэтому для настоящего исследования иммунореактивность FosB / ΔFosB в дорсальной и вентральной частях гиппокампа анализировали отдельно. Данные продемонстрировали, что длительный бег равномерно увеличивал экспрессию FosB / ΔFosB во всех измеренных ROI гиппокампа. Эта равномерная индукция иммунореактивности FosB / ΔFosB может быть неспецифически вызвана системными метаболическими изменениями, связанными с длительным бегом. Тем не менее, важно отметить, что в области коры головного мозга наблюдалось увеличение иммунореактивности FosB / ΔFosB. Этот результат подтверждается недавними результатами, показывающими, что острый приступ беговой дорожки усиливал региональный мозговой кровоток в гиппокампе, но не в обонятельной луковице [8]. Кроме того, Rhodes et al. (2003) продемонстрировали, что дни 7 произвольной работы колеса вызывали экспрессию c-Fos в DG и CA2 / 3 гиппокампа (CA1 не измерялось) и в сенсорной коре, но не в зрительной коре [47]. Взятые вместе, эти исследования предполагают, что равномерная индукция экспрессии FosB / ΔFosB в гиппокампе не является неспецифическим следствием длительного бега. Интересно, что Hawley et al. недавно сообщалось, что хронический непредсказуемый стресс увеличивает экспрессию FosB / ΔFosB в дорсальном, но не в вентральном, DG гиппокампа крысы [48]. При дальнейшем исследовании различные схемы индукции FosB / ΔFosB, такие как те, которые вызваны физическими упражнениями или стрессом, обеспечат постоянное понимание зависимых от стимулов воздействий на гиппокамп.
Известно, что первичное антитело против FosB, используемое в этом исследовании, распознает все изоформы белков FosB. После вестерн-блоттинга мы обнаружили, что единственными изоформами, которые увеличились в гиппокампе после длительного выполнения, были модифицированные изоформы ΔFosB (35 – 37 кДа), единственные стабильные изоформы среди белков семейства Fos [11]. Это открытие согласуется с предыдущей работой с использованием антитела pan-Fos для демонстрации того, что 35-37 кДа ΔFosB является преобладающим белком семейства Fos, индуцированным в лобной коре при хроническом стрессе [44]. Следовательно, увеличение иммунореактивности FosB / ΔFosB в гиппокампе, вызванное здесь длительным бегом, скорее всего отражает уровень ΔFosB.
Меньше известно о специфических для региона эффектах упражнений на молекулярные и структурные аспекты гиппокампа. Тем не менее, многочисленные поведенческие исследования указывают на большой потенциал вызванных физической нагрузкой улучшений как дорсальной, так и вентральной функций гиппокампа. Упражнения были продемонстрированы для улучшения пространственного обучения и памяти [34–38] а пространственная и контекстная обработка в основном зависит от дорсального гиппокампа [27,28]. Напротив, известно, что физические упражнения проявляют анксиолитические и антидепрессивные свойства [24,25,38] и эти эмоциональные реакции преимущественно регулируются вентральным гиппокампом [29,30]. Равномерная индукция ΔFosB при длительном беге, наблюдаемая в этом исследовании, позволяет предположить, что некоторые формы нейропластических изменений происходили по всему гиппокампу. Это объясняет, почему физические упражнения могут влиять как на дорсальную, так и на вентральную гиппокамп-зависимые функции.
3: специфичный для региона анализ нейрогенеза, вызванного физической нагрузкой
Функциональная диссоциация нейрогенеза между дорсальным и вентральным гиппокампом также привлекает все большее внимание [49]. В этом исследовании используются морфологические характеристики незрелых нейронов DCX-ir [43], мы посчитали количество пересечений между DCX-ir-дендритами и отрезком, проведенным вдоль середины GCL. Это измерение не дало общего числа нейронов DCX-ir в DG, но оно позволило провести количественную оценку региона, необходимую для проведения корреляционного анализа с данными экспрессии FosB / ΔFosB (см. Ниже). После длительной работы число нейронов DCX-ir значительно увеличилось в дорсальной, но не вентральной, DG. Это говорит о том, что физические упражнения могут стимулировать нейрогенез более резко в дорсальной части по сравнению с вентральной частью ГД. Тем не менее, в предыдущих исследованиях сообщалось о противоречивых результатах, в которых использование колеса увеличивало нейрогенез как на дорсальной, так и на брюшной ДГ50,51]. В настоящем исследовании число пересечений DCX-ir в брюшной DG, как правило, увеличивалось с бегом, хотя небольшой размер выборки (мышей 5 на группу) мог ограничивать способность обнаруживать статистически значимое различие между группами. Поэтому, вероятно, преждевременно исключать возможность того, что произвольный ход колеса может стимулировать нейрогенез вентрального гиппокампа. Необходимы дальнейшие подробные исследования, чтобы понять специфичность нейрогенеза, вызванного физическими упражнениями, в отношении его многоэтапного процесса (пролиферация, дифференцировка, миграция и выживание клеток).
4: функциональные последствия индуцированной физической нагрузки ΔFosB для регуляции пластичности гиппокампа
Наконец, в качестве первого шага в распознавании функциональных последствий индуцированной физической нагрузкой индукции ΔFosB в гиппокампе мы исследовали взаимосвязь иммунореактивности FosB / ΔFosB к пересечениям DCX-ir как на дорсальной, так и на вентральной DG и обнаружили значительную положительную корреляцию между две переменные. Хотя точные механизмы, с помощью которых FosB регулирует нейрогенез, вызванный физической нагрузкой, остаются неопределенными, недавнее исследование продемонстрировало, что fosBмыши, которым не хватает FosB, ΔFosB и Δ2ΔFosB (все fosB продукты), проявляется дефицит в базальном нейрогенезе гиппокампа, в том числе снижение пролиферации нейрональных клеток-предшественников, увеличение эктопической миграции новорожденных нейронов и аномальные структуры ДГ [20]. Однако эти изменения не наблюдались в fosB(документированная тратта) мыши, у которых отсутствует FosB, но не ΔFosB / Δ2ΔFosB. Интересно, что в fosBмыши, экспрессия некоторых генов, связанных с нейрогенезом, в том числе VGF (Фактор роста нервов VGF индуцируемый) и Гал (Препропептид галанина) подавлялся [20]. Поскольку VGF и GAL являются секреторными молекулами, одно предложение, которое остается многообещающим, предполагает, что нейроны, экспрессирующие ΔFosB, могут регулировать нейрогенез посредством аутокринной / паракринной активности [20].
Кроме того, следует отметить, что область, где ΔFosB индуцируется в результате бега, пространственно перекрывается с областью, где нейрогенная активность высока. Этот факт свидетельствует о том, что нейрогенез, вызванный физической нагрузкой, как минимум, зависит от активности. Активация нейронов является ключом к поддержанию и улучшению функции центральной нервной системы [9] через механизмы, включающие экспрессию и высвобождение нейротрофического фактора, происходящего из мозга (BDNF) [52,53], поглощение сывороточного инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1) через гематоэнцефалический барьер [54,55], подавление апоптоза [56] и регуляция митохондриальной моторики [57]. Следовательно, настоящее исследование предполагает, что длительные физические нагрузки вызвали повторную активацию нейронов, что проявляется в повышенной экспрессии ΔFosB, которая способствует повышению пластичности гиппокампа, возможно, посредством этих многочисленных механизмов, описанных выше.
В настоящем исследовании оценивали только нейрогенез, вызванный физической нагрузкой, и его связь с экспрессией FosB / ΔFosB в DG. Однако иммунореактивность FosB / ΔFosB также индуцировалась в подполях CA1 и CA3. Хотя необходимы дальнейшие исследования, чтобы лучше понять функциональные роли экспрессии ΔFosB, вызванной физической нагрузкой, в этих подполях, предыдущая литература предлагает многообещающую возможность. Гуан и соавт. (2011) продемонстрировали, что специфическая абляция циклинзависимой киназы 5 (Cdk5) в пирамидных нейронах CA1 или CA3 нарушала консолидацию или поиск памяти соответственно [58]. Интересно, что Cdk5 является нижестоящей целью ΔFosB [59] и участвует в регулировании синаптической пластичности [60]. Следовательно, экспрессия ΔFosB, вызванная физической нагрузкой, может участвовать в регуляции синаптической пластичности посредством активации Cdk5 в подполях CA1 и CA3.
Заключение
Несмотря на то, что острые приступы физических упражнений, как известно, индуцируют экспрессию немедленных ранних генных белков в гиппокампе, настоящее исследование предоставляет первые доказательства того, что длительные регулярные физические упражнения значительно индуцируют экспрессию ΔFosB во всем гиппокампе. ThРавномерная индукция ΔFosB подтверждает текущее понимание того, что физические упражнения являются эффективным немедикаментозным вмешательством, способным улучшить множественные функции гиппокампа. Вместе со значительной корреляцией между экспрессией FosB / ΔFosB и нейрогенезом, эти данные являются провокационными и указывают на необходимость дальнейших исследований, определяющих роль ΔFosB в опосредовании влияния упражнений на функцию гиппокампа, включая нейрогенез.
Заявление о финансировании
Рекомендации
;
