Источник
Институт Натана Клайна, Оранджбург, Нью-Йорк, 10962, США. [email protected]
Резюме
Дети и подростки все чаще подвергаются воздействию психостимуляторов, как незаконно, так и для лечения распространенных нейропсихиатрических заболеваний, таких как синдром дефицита внимания с гиперактивностью и без нее. Несмотря на широкое использование психомоторных стимуляторов в младших возрастных группах, мало что известно о хронических молекулярных нейроадаптивных реакциях на эти вещества в незрелом мозге. В данном исследовании мы демонстрируем, что после хронического введения психостимуляторов кокаина и амфетамина транскрипционный фактор DeltaFosB повышается в прилежащем ядре у мышей в периподростковом возрасте , но не у мышей после отъема от матери или взрослых мышей . Индукция DeltaFosB также происходит исключительно в хвостатом ядре и скорлупе у мышей в периподростковом возрасте после введения амфетамина . Эти результаты демонстрируют уникальную пластичность в подростковом мозге критически важной молекулы, регулирующей действие психостимуляторов, и предполагают, что эти нейроадаптивные изменения могут быть вовлечены в опосредование усиления аддиктивных наклонностей у подростков по сравнению со взрослыми.
Введение
Психостимуляторы используются для лечения распространенных детских расстройств, таких как синдром дефицита внимания и гиперактивности. Кроме того, злоупотребление стимуляторами, включая амфетамин и кокаин, распространено среди подростков, в возрасте, когда, согласно данным, наблюдается усиление аддиктивных наклонностей по сравнению со взрослыми ( Estroff et al., 1989 ; Myers and Anderson, 1991 ). Несмотря на данные, указывающие на регулируемые в процессе развития поведенческие эффекты, мало что известно о молекулярных нейроадаптивных реакциях в незрелом мозге, которые происходят во время приема этих веществ. Кокаин и амфетамин могут вызывать длительные поведенческие изменения частично за счет стимуляции дофаминовых рецепторов D1 и повышения уровня транскрипционных факторов, включая ΔFosB, в дорсальном стриатуме (т.е., хвостатом ядре и скорлупе) и вентральном стриатуме (т.е., прилежащем ядре) ( Chen et al., 1997 ). Повышение уровня ΔFosB, возможно, за счет стабилизации белковых продуктов, сохраняется в течение нескольких недель после хронического воздействия кокаина или амфетамина и регулируется, по крайней мере частично, путем передачи дофаминового сигнала ( Chen et al., 1997 ; Nestler et al., 2001 ).
Центральная дофаминергическая система молодых животных находится в состоянии постоянных изменений в результате изменения уровней критически важных молекул в процессе нормального развития, включая дофаминовый рецептор D1 DARPP-32 (фосфопротеин, регулируемый дофамином и цАМФ; молекулярная масса 32 кДа) и цАМФ ( Ehrlich et al., 1990 ; Teicher et al., 1993 ; Perrone-Capano et al., 1996 ; Tarazi et al., 1999 ; Andersen, 2002 ). Воздействие психостимуляторов, усиливающих дофаминергическую нейротрансмиссию, в этот период может, следовательно, приводить к количественно и/или качественно различным молекулярным реакциям, включая изменения в экспрессии ΔFosB. Для проверки гипотезы о наличии возрастзависимых нейроадаптивных реакций при хроническом воздействии психостимуляторов были проанализированы три группы мышей в серии экспериментов: взрослые (60 дней на момент начала инъекций), периподростковые (33 дня на момент начала инъекций) и мыши после отъема от матери (24 дня на момент начала инъекций). Это первое прямое сравнение молекулярных нейроадаптивных реакций на хроническое воздействие психостимуляторов в этих трех возрастных группах. Мы обнаружили, что после одинаковых экспериментальных парадигм периподростковые мыши демонстрируют усиленную активацию ΔFosB в ответ как на кокаин, так и на амфетамин.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные и введение препаратов. Самцы мышей линии CD-1 (Charles River Laboratories, Кингстон, Нью-Йорк) содержались в условиях 12-часового светового/темнового цикла (с 6:00 до 18:00) с неограниченным доступом к пище и воде. Животным давали возможность адаптироваться к условиям вивария в течение как минимум 10 дней до начала инъекций. С животными работали два исследователя, которые проводили все инъекции в той же комнате, где содержались животные. Все животные были отлучены от матери в возрасте 21 дня. Инъекции начинались в возрасте 24 (после отъема от матери), 33 (пери-подростковый) или 60 (взрослый) дней. Животные получали 20 мг/кг кокаина (Sigma, Сент-Луис, Миссури), 5 мг/кг амфетамина (Sigma) или равный объем физиологического раствора внутрибрюшинно с 16:00 до 17:00 ежедневно в течение 7 дней. Животных умерщвляли путем декапитации после кратковременного воздействия CO₂ в 10:00 утра на следующий день после последней инъекции. Мозг немедленно извлекали из черепа, и хвостатое ядро, скорлупа и прилежащее ядро быстро выделяли на льду. Все препарирования проводили на корональных срезах мозга одним исследователем, а белковые экстракты готовили из свежей ткани без замораживания. Все процедуры с животными были одобрены Комитетом по этике использования животных в экспериментах и соответствовали Руководству Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных.
Вестерн-блот анализ. Для вестерн-блот анализа в каждую дорожку 10% SDS-полиакриламидного геля загружали равное количество белка (40 мкг для хвостатого ядра и скорлупы и 20 мкг для прилежащего ядра) из каждого образца после измерения концентрации белка с помощью анализа BCA (Pierce, Rockford, IL). Равномерность загрузки белка также проверяли путем визуализации общего белка с помощью Понсо Ред после переноса на нитроцеллюлозу и/или блоттинга с антителами к актину (1:500; Sigma). Антисыворотка к Fos-связанному антигену (FRA), которая распознает изоформы ΔFosB, была любезно предоставлена доктором М. Иадаролой (Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд) и использовалась в концентрации 1:4000. Предыдущие исследования ( Chen et al., 1997 ; Hiroi et al., 1997 ), включая предварительную адсорбцию антисыворотки FRA с иммуногеном M-пептида, продемонстрировали специфичность этой антисыворотки. Моноклональное антитело DARPP-32 5a, используемое в разведении 1:10 000, было любезно предоставлено докторами Хью Хеммингсом и Полом Грингардом (Рокфеллеровский университет, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк). Антитело к дофаминовому транспортеру (DAT) было получено от компании Chemicon (Темекула, штат Калифорния). Блотты обрабатывали хемилюминесцентной системой NEN-DuPont (Бостон, штат Массачусетс) и экспонировали на пленку. Денситометрические значения иммунореактивности ΔFosB были получены с помощью программы ScanAnalysis для Apple (Biosoft, Фергюсон, штат Миссури). Статистическую значимость определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), за которым следовал апостериорный тест множественных сравнений Тьюки или непарный двухсторонний t- критерий Стьюдента, как указано в подписях к рисункам. В экспериментах по медикаментозному лечению анализ каждой возрастной группы проводили на отдельном блоте, и, следовательно, каждой группе, получавшей физиологический раствор, произвольно присваивали значение 100% для сравнения между возрастными группами. В исследованиях онтогенеза образцы из всех возрастных групп анализировали вместе на одном блоте.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Индукция ΔFosB после кокаина и амфетамина происходит в прилежащих ядрах только мышечно-мышечных мышей
Экспрессию ΔFosB измеряли в прилежащем ядре и хвостатом ядре и скорлупе головного мозга у мышей в возрасте после отъема от матери, в периподростковом и взрослом возрасте после 7 дней введения амфетамина или кокаина. Прилежащее ядро — это область мозга, которая считается наиболее важной для опосредования вознаграждающих эффектов психостимуляторов. Иммунореактивность ΔFosB (35 кДа) избирательно индуцировалась в прилежащем ядре у периподростковых животных после хронического введения амфетамина (рис. 1 А ) или кокаина (рис. 1 В ). В отличие от этого, уровни ΔFosB (35 кДа) существенно не изменялись в прилежащем ядре у мышей в возрасте после отъема от матери или у взрослых животных (рис. 1 А , В ). В хвостатом ядре и скорлупе головного мозга уровни ΔFosB (35 кДа) также значительно повышались после хронического введения амфетамина только у животных в периподростковом возрасте (рис. 2 А ). Во всех трех возрастных группах наблюдалось значительное увеличение экспрессии ΔFosB (35 кДа) в хвостатом ядре и скорлупе головного мозга после хронического введения кокаина (рис. 2 В ). Однако величина индукции была наибольшей у животных в периподростковом возрасте, особенно по сравнению с животными после отъема от матери (рис. 2 В ). Другие изоформы FRA и Fos оставались неизмененными во всех возрастных группах (данные не показаны).
Иммунореактивность ΔFosB в ядре прилипает после введения хронического психостимулятора. Мышей CD-1 вводили один раз в день физиологическим раствором, амфетамином или кокаином для 7 d, начиная с дня 24 (P24; post-weanling), день 33 (P33; periadolescent), или день 60 (Для взрослых). Уровни иммунореактивности ΔFosB (35 кДа) в прилежащих ядрах показаны после хронического амфетамина (A) или кокаина (B) администрации. Типичные иммуноблоты из физиологического раствора - (S), амфетамин- (A) и кокаин- (C) вводили пост-отлучение (P24), периодонтальный (P33), а взрослые мыши показаны в верхние панели. Нижние панели показывают среднее ± SEM процент от базальной экспрессии ΔFosB. n значения для каждой группы показаны в бары, Значительное увеличение ΔFosB было обнаружено в ядре accumbens только у мышей с периодонтальной точки зрения. *p <0.05; **p <0.01 (Студенческий t тестовое задание; солевой раствор против лекарственного средства).
ΔFosB иммунореактивность в хвостатом putamen после хронического введения психостимулятора. Мышей CD-1 вводили один раз в день физиологическим раствором, амфетамином или кокаином для 7 d, начиная с дня 24 (P24; post-weanling), день 33 (P33; periadolescent), или день 60 (Для взрослых). Уровни иммунореактивности ΔFosB (35 кДа) в хвостатом куртоне показаны после хронического амфетамина (A) или кокаина (B) администрации. Типичные иммуноблоты из физиологического раствора - (S), амфетамин- (A) и кокаин- (C) вводили мышечно-мышечных мышей (P33) показаны вверхние панели. Нижние панели показывают среднее ± SEM процент от базальной экспрессии ΔFosB. n значения для каждой группы показаны в бары, Значительные индуцированные амфетамином увеличения иммунореактивности ΔFosB были обнаружены у хвостатых путаманов только у мышей,A). Хроническое введение кокаина вызывало увеличение ΔFosB во всех трех возрастных группах (B). *p <0.05; **p <0.01 (Студенческий t тестовое задание; солевой раствор против лекарственного средства).
Уровни DAT и DARPP-32 не изменяются после хронического кокаина или амфетамина
Несколько ключевых молекул, экспрессируемых дофаминергическими и/или дофаминорецепторными нейронами, включая DARPP-32, дофаминовый рецептор D1 и DAT, способствуют острым и хроническим реакциям на психостимуляторы ( Moratalla et al., 1996 ; Fienberg et al., 1998 ; Sora et al., 1998 ; Gainetdinov et al., 2001 ). Данные, полученные на мышах с нокаутом генов DARPP-32, рецептора D1 и DAT, а также на мышах с подавленной экспрессией DAT, указывают на сложную взаимосвязь между их уровнями, регуляцией дофаминергической активности и реакциями на психостимуляторы. В самом деле, индукция ΔFosB не происходит у мышей с нокаутом гена DARPP-32, получающих хроническое введение кокаина ( Fienberg et al., 1998 ). Однако у взрослых мышей 7-дневное воздействие 20 мг/кг кокаина не изменяет общий уровень DARPP-32 ( Fienberg et al., 1998 ). Регуляция белка DAT ранее не описывалась у мышей, подвергавшихся хроническому воздействию психостимуляторов, хотя изменения связывания радиолиганда с дофаминовым транспортером после воздействия психостимуляторов были зарегистрированы у некоторых видов ( Letchworth et al., 2001 ). В данном исследовании мы измерили уровни белков DARPP-32 и DAT, чтобы определить, изменяется ли экспрессия этих белков после хронического введения психостимуляторов у мышей любого из трех возрастных групп. Наши результаты показывают, что не наблюдалось значительных изменений в уровнях общего DARPP-32 или DAT во всем хвостатом ядре, скорлупе или прилежащем ядре после хронического введения кокаина или амфетамина ни в одной из трех возрастных групп (таблица 1 ).
Относительные значения денситометрии для DARPP-32 и DAT у пациентов, получавших амфетамин и кокаин P24, P33 и взрослых мышей по сравнению с контролем, значения солевого раствора, произвольно устанавливаемые на 100%
Исходные уровни ΔFosB регулируются с учетом развития
Мы исследовали онтогенез ΔFosB, потому что взрослые мыши с генетически модифицированной повышенной экспрессией ΔFosB в полосатом теле имеют повышенный поведенческий ответ на психостимуляторы (Kelz et al., 1999). Мы обнаружили, что базовые уровни ΔFosB были значительно ниже у более молодых животных по сравнению со взрослыми как у хвостатого курьера, так и у ядра (рис.3 A). Уровни функциональных маркеров системы допамина, включая DARPP-32 (Ehrlich и др., 1990), DAT (Perrone-Capano и др., 1996) и допаминовые рецепторы (Teicher и др., 1993; Тарази и др., 1999) также регулируются с точки зрения развития. Предыдущие отчеты на мышах CD-1 указывают на пик в полосатом DARPP-32 в постнатальный день 28 (P28) (Ehrlich и др., 1990). В крысиных хвостатых путаменах и ядре accumbens D1пиков рецептора от P28 до P40 (Teicher и др., 1993; Тарази и др., 1999), но аналогичные исследования не выполнялись в мыши. Напротив, здесь мы обнаружили, что уровни DAT-белка в хвостатых курентах и ядре accumbens были постоянными между постнатальным днем 24 и взрослой жизнью (рис. 3 B). Таким образом, относительные отношения между D1 рецепторы, DAT, DARPP-32 и ΔFosB отличаются между возрастными группами, что потенциально приводит к различиям в D1 рецепторной активности, которая может влиять на степень индукции ΔFosB.
Экспрессия ΔFosB и DAT в процессе развития. A. Иммунореактивность ΔFosB (35–37 кДа) в хвостатом ядре, скорлупе и прилежащем ядре наивных мышей CD-1 в зависимости от возраста. Репрезентативные иммуноблоты показаны на верхних панелях . На нижних панелях показаны средние значения ± стандартная ошибка среднего для трех мышей в каждой группе. * p < 0.05, взрослые против P24; # p < 0.05, взрослые против P36 (критерий множественного сравнения Тьюки после ANOVA). B. Денситометрические значения иммунореактивности DAT в хвостатом ядре, скорлупе и прилежащем ядре наивных мышей CD-1 в зависимости от возраста. Уровни DAT не различались между тремя возрастными группами.
ОБСУЖДЕНИЕ
Поведенческие эффекты психомоторных стимуляторов зависят от возраста. Наибольшая склонность к зависимости наблюдается в подростковом возрасте, когда употребление запрещенных веществ усиливается ( Эстрофф и др., 1989 ; Майерс и Андерсон, 1991 ). Фактически, у детей младшего возраста часто возникает дисфория при воздействии психостимуляторов, тогда как подростки и взрослые испытывают эйфорию ( Рапопорт и др., 1980 ). В исследованиях на грызунах некоторые данные свидетельствуют о том, что у животных в периподростковом возрасте наблюдается более высокий базовый уровень активности ( Спир и Брейк, 1983 ) и измененная реакция на психостимуляторы по сравнению с более молодыми и более старшими животными. Таким образом, они демонстрируют меньшую двигательную активность и стремление к новизне в ответ на острое введение низких доз психостимуляторов по сравнению с животными в период отъема от матери и взрослыми животными, но повышенную гиперактивность после введения высоких доз. При хроническом применении сенсибилизация к вызванной кокаином двигательной активности выше у крыс в периподростковом возрасте по сравнению со взрослыми, тогда как сенсибилизация к стереотипным движениям ниже. Кроме того, данные микродиализа выявили различия между крысами в периподростковом и взрослом возрасте в отношении сенсибилизации к высвобождению дофамина, вызванному амфетамином ( Laviola et al., 1995 ; Adriani et al., 1998 ; Adriani and Laviola, 2000 ; Laviola et al., 2001 ). Однако существуют противоречивые исследования относительно долгосрочной реактивности на кокаин после введения метилфенидата у крыс-подростков ( Brandon et al., 2001 ; Andersen et al., 2002 ). Последние два отчета подчеркивают сложность сравнения исследований при использовании различных экспериментальных парадигм. Попытки сравнения поведенческих исследований у молодых животных дополнительно осложняются использованием разных видов и штаммов.
Мышь становится все более важной животной моделью в изучении употребления и злоупотребления психостимуляторами, и это первый систематический анализ молекулярных нейроадаптивных реакций в трех разных возрастных группах развития у мышей или любого другого отдельного вида. Предыдущие исследования, на основе которых мы разработали наши парадигмы лечения, продемонстрировали увеличение ΔFosB в изолированном дорсальном и вентральном стриатуме взрослых крыс дикого типа после хронического введения кокаина и амфетамина ( Hope et al., 1994 ; Nye et al., 1995 ; Turgeon et al., 1997 ), но только в объединенном дорсальном и вентральном стриатуме или изолированном дорсальном стриатуме взрослых мышей дикого типа после хронического введения кокаина ( Fienberg et al., 1998 ; Zachariou et al., 2001 ).
Мы продемонстрировали пространственную и количественную разницу в вызванном психостимуляторами изменении ΔFosB у мышей в пост-отъемышечном, пери-подростковом и взрослом возрасте. Наблюдение за повышенной реакцией у пери-подростковых животных по сравнению со взрослыми и пост-отъемышем подтверждается тем фактом, что реакция у мышей, получавших кокаин и амфетамин, сходна. Психостимуляторы кокаин и амфетамин увеличивают синаптический уровень дофамина, а также серотонина и норадреналина, но по разным механизмам. Кокаин связывается с плазмалеммными транспортерами дофамина, серотонина и норадреналина и ингибирует их обратный захват в пресинаптические терминали. В отличие от этого, амфетамин способствует высвобождению этих нейромедиаторов. Селективная индукция ΔFosB в прилежащем ядре только у детей периподросткового возраста после 7 дней приема стимулятора и относительно повышенная индукция ΔFosB в хвостатом ядре и скорлупе могут быть нейробиологическим отражением или причиной ранее отмеченной повышенной склонности к злоупотреблению психостимуляторами в этой возрастной группе ( Estroff et al., 1989 ; Myers and Anderson, 1991 ) и других долгосрочных изменений в экспрессии генов, которые различаются между возрастными группами ( Andersen et al., 2002 ). Более того, эти различия могут регулироваться внутренними изменениями уровней ключевых молекул в процессе развития, включая сам ΔFosB. Потенциальные последствия различий в базовых уровнях ΔFosB между возрастными группами аналогичны тем, которые были предложены в отношении различий между штаммами крыс ( Haile et al., 2001 ). Фактически, мы предполагаем, что аналогичные различия между штаммами будут обнаружены и среди инбредных мышей. Также возможно, что у мышей разного возраста будут наблюдаться различные молекулярные адаптации в областях мозга, отличных от прилежащего ядра. Дополнительный анализ с использованием мышей в периподростковом возрасте с генетически модифицированными изменениями уровней ключевых молекул и одновременные поведенческие наблюдения позволят более точно проверить эти гипотезы.
Сноски
- Полученный Апрель 8, 2002.
- Получено подтверждение Август 6, 2002.
- Принятый Август 8, 2002.
-
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения / Национальным институтом неврологических расстройств и грантом Stroke NS41871 (MEE и EMU) и Национальным институтом по борьбе со злоупотреблением наркотиками P30-DA13429 (EMU).
-
Корреспонденцию следует направлять доктору Мишель Э. Эрлих, Университет Томаса Джефферсона, Curtis 310, 1025 Walnut Street, Филадельфия, Пенсильвания , 19107. Электронная почта: [email protected]
- Copyright © 2002 Общество неврологии