Источник
Институт Натана Клайн, Оринджберг, Нью-Йорк, 10962, США. [электронная почта защищена]
Абстрактные
Дети и подростки все чаще подвергаются воздействию психостимуляторов, либо незаконно, либо для лечения общих нейропсихиатрических состояний, таких как синдром дефицита внимания с гиперактивностью и без нее. Несмотря на широкое использование психомоторных стимуляторов в младших возрастных группах, мало что известно о хронических молекулярных нейроадаптивных ответах на эти агенты в незрелом мозге. Здесь мы демонстрируем, что после хронического введения психостимуляторов кокаин и амфетамин, фактор транскрипции DeltaFosB регулируется в ядре periadolescent мышей но не в послеуборочном или взрослом мышей, Индукция DeltaFosB также происходит исключительно в хвостатом periadolescent мышей после амфетамин администрация. Эти результаты демонстрируют уникальную пластичность в подростковом мозге критической молекулы, которая регулирует действие психостимулятора и предполагает, что эти нейроадаптивные изменения могут быть вовлечены в медиацию расширение увлекательные тенденции у подростков по отношению к взрослым.
Введение
Психостимуляторы используются для лечения общих детских расстройств, таких как расстройство гиперактивности дефицита внимания. Кроме того, злоупотребление стимуляторами, в том числе амфетамином и кокаином, распространено среди подростков, возраст, в котором имеются данные об усиленных привыканиях к взрослым (например,Estroff et al., 1989; Майерс и Андерсон, 1991). Несмотря на данные, свидетельствующие о регулируемых поведенческих эффектах, мало известно о молекулярных нейроадаптивных ответах в незрелом мозге, которые происходят во время введения этих агентов. Кокаин и амфетамин могут приводить к длительным изменениям в поведении частично путем стимуляции дофамина D1рецепторы и увеличение уровней транскрипционных факторов, включая ΔFosB, в дорсальной полосатой (т. е. хвостовой путамен) и вентральной полосатой (т. е. в ядре accumbens) (Chen et al., 1997). Увеличение уровней ΔFosB, возможно, путем стабилизации белковых продуктов, сохраняется в течение нескольких недель после хронического воздействия на кокаин или амфетамин и регулируется, по крайней мере частично, путем передачи сигнала допамина (Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001).
Центральная допаминергическая система молодых животных очень сильно изменяется в результате изменения уровней критических молекул при нормальном развитии, включая допамин D1рецептор DARPP-32 (дофаминовый и цАМФ-регулируемый фосфопротеин, Mr от 32 кДа) и цАМФ (Ehrlich и др., 1990;Teicher и др., 1993; Perrone-Capano и др., 1996; Тарази и др., 1999;Андерсен, 2002). Воздействие в течение этого периода на психостимуляторы, которые усиливают дофаминергическую нейротрансмиссию, может поэтому приводить к количественному и / или качественно различным молекулярным реакциям, включая изменения в экспрессии ΔFosB. Чтобы проверить гипотезу о наличии зависимых от возраста нейроадаптивных ответов при хроническом воздействии психостимуляторов, три группы мышей были проанализированы в последовательных экспериментах: взрослые (60 d старые при начале инъекций), периодонтальные (33 d старые при начале инъекций), и post-weanling (24 d old при начале инъекции). Это первое прямое сравнение молекулярных нейроадаптивных ответов на воздействие хронического психостимулятора в этих трех возрастных группах. Мы обнаружили, что после идентичных парадигм лечения мышечно-мышечные мыши проявляют повышенную регуляцию ΔFosB в ответ на кокаин и амфетамин.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные и администрация лекарств. Мужские мыши CD-1 (Charles River Laboratories, Кингстон, штат Нью-Йорк) размещались в цикле света / темноты 12 hr (6: 00 AM до 6: 00 PM) с вволюдоступ к продовольствию и воде. Животным разрешалось приспосабливаться к комнате для животных минимум за 10 d до начала инъекций. Животных обрабатывали два следователя, которые выполняли все инъекции в той же комнате, в которой содержались животные. Все животные были отняты от груди в возрасте 21 d. Инъекции начинались с 24 (post-weanling), 33 (periadolescent) или 60 (взрослый) d возраста. Животные получали 20 мг / кг кокаина (Sigma, Сент-Луис, Миссури), 5 мг / кг амфетамина (Sigma) или равный объем засоленного внутрибрюшинно между 4: 00 и 5: 00 PM ежедневно для 7 d. Животные были убиты обезглавливанием после кратковременного воздействия СО2 в 10: 00 AM на следующий день после окончательной инъекции. Мозги сразу же удаляли из черепа, а хвостатые putamen и ядра accumbens были быстро рассечены на льду. Все расслоения выполнялись от коронарных срезов мозга одним исследователем, а белковые экстракты получали из свежей ткани без замораживания. Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по удержанию и использованию животных и проводились в соответствии с Национальными институтами здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных.
Вестерн-блот-анализ. Для анализа вестерн-блоттинга равные количества белка (40 мкг для каудатного putamen и 20 мкг для захвата ядра) из каждого образца загружали в каждую полосу 10% SDS-полиакриламидного геля после измерения концентраций белка с помощью анализа BCA (Pierce, Rockford, IL). Равномерную загрузку белка также проверяли визуализацией общего белка Ponceau Red после переноса на нитроцеллюлозу и / или блоттинга с антиактин-антителом (1: 500, Sigma). Антисыворотка, связанная с Fos (FRA), которая распознает изоформы ΔFosB, была щедро предоставлена доктором М. Ядаролой (National Institutes of Health, Bethesda, MD) и использовалась при концентрации 1: 4000. Предыдущие исследования (Chen et al., 1997; Hiroi и др., 1997), включая преадсорбцию антисыворотки FRA с M-пептидным иммуногеном, продемонстрировала специфичность этой антисыворотки. Моноклональное антитело DARPP-32 5a, используемое в 1: 10,000, было щедро предоставлено докторами. Хью Хеммингс и Пол Грингард (Университет Рокфеллера, Нью-Йорк, Нью-Йорк). Антитело-переносчик допамина (DAT) Chemicon (Темекула, Калифорния). Блоты реагировали с хемилюминесцентной системой NEN-DuPont (Boston, MA) и подвергали воздействию пленки. Денситометрические значения иммунореактивности ΔFosB были получены с использованием ScanAnalysis для Apple (Biosoft, Ferguson, MO). Статистическую значимость определяли с использованием однонаправленного ANOVA, затем Постфактум Множественный сравнительный тест Тьюки или непарный двусторонний тест Студента t как указано в легендах фигуры. Для экспериментов по лечению наркомании анализ каждой возрастной группы проводили на отдельном блоте, и поэтому каждой физиологической группе было произвольно присвоено значение 100% для сравнения между возрастными группами. Для исследований онтогенеза образцы из всех возрастных групп анализировали вместе на одном блоте.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Индукция ΔFosB после кокаина и амфетамина происходит в прилежащих ядрах только мышечно-мышечных мышей
Экспрессия ΔFosB измеряли в ядре accumbens и хвостатом putamen пост-отлученных, периодонтальных и взрослых мышей после 7 d введения амфетамина или кокаина. Ядро accumbens - это область мозга, которая считается наиболее важной для опосредования полезных эффектов психостимуляторов. Иммунореактивность ΔFosB (35 кДа) избирательно индуцировалась в ядре прилежащих периодонтальных животных после хронического введения амфетамина (рис. 1 A) или кокаина (рис. 1 B). Напротив, уровни ΔFosB (35 кДа) не были существенно изменены в ядре пришельцев после отлучения или взрослых животных (рис.1 A,B). В хвостатном курсоре уровни ΔFosB (35 кДа) также значительно повышались после введения хронического амфетамина только у черепаховых животных (рис.2 A). У всех трех возрастных групп наблюдалось значительное увеличение экспрессии ΔFosB (35 кДа) в хвостатом путамене после хронического введения кокаина (рис.2 B). Величина индукции, однако, была наибольшей у периодоориентированных животных, особенно по сравнению с пост-отлученными (рис. 2 B). Другие изоформы FRA и Fos не изменялись во всех возрастных группах (данные не показаны).
Иммунореактивность ΔFosB в ядре прилипает после введения хронического психостимулятора. Мышей CD-1 вводили один раз в день физиологическим раствором, амфетамином или кокаином для 7 d, начиная с дня 24 (P24; post-weanling), день 33 (P33; periadolescent), или день 60 (Для взрослых). Уровни иммунореактивности ΔFosB (35 кДа) в прилежащих ядрах показаны после хронического амфетамина (A) или кокаина (B) администрации. Типичные иммуноблоты из физиологического раствора - (S), амфетамин- (A) и кокаин- (C) вводили пост-отлучение (P24), периодонтальный (P33), а взрослые мыши показаны в верхние панели. Нижние панели показывают среднее ± SEM процент от базальной экспрессии ΔFosB. n значения для каждой группы показаны в бары, Значительное увеличение ΔFosB было обнаружено в ядре accumbens только у мышей с периодонтальной точки зрения. *p <0.05; **p <0.01 (Студенческий t тестовое задание; солевой раствор против лекарственного средства).
ΔFosB иммунореактивность в хвостатом putamen после хронического введения психостимулятора. Мышей CD-1 вводили один раз в день физиологическим раствором, амфетамином или кокаином для 7 d, начиная с дня 24 (P24; post-weanling), день 33 (P33; periadolescent), или день 60 (Для взрослых). Уровни иммунореактивности ΔFosB (35 кДа) в хвостатом куртоне показаны после хронического амфетамина (A) или кокаина (B) администрации. Типичные иммуноблоты из физиологического раствора - (S), амфетамин- (A) и кокаин- (C) вводили мышечно-мышечных мышей (P33) показаны вверхние панели. Нижние панели показывают среднее ± SEM процент от базальной экспрессии ΔFosB. n значения для каждой группы показаны в бары, Значительные индуцированные амфетамином увеличения иммунореактивности ΔFosB были обнаружены у хвостатых путаманов только у мышей,A). Хроническое введение кокаина вызывало увеличение ΔFosB во всех трех возрастных группах (B). *p <0.05; **p <0.01 (Студенческий t тестовое задание; солевой раствор против лекарственного средства).
Уровни DAT и DARPP-32 не изменяются после хронического кокаина или амфетамина
Несколько ключевых молекул, выраженных дофаминергическими и / или допаминоцептивными нейронами, включая DARPP-32, D1 дофаминовый рецептор и DAT, способствуют острой и хронической реакции на психостимуляторы (Moratalla et al., 1996; Fienberg и др., 1998; Sora и др., 1998; Гейнетдинов и др., 2001). Данные DARPP-32, D1 рецептор, и DAT-нуклеотиды и DAT-мыши с выбиванием указывают на сложную взаимосвязь между их уровнями, регуляцию дофаминергической активности и ответы на психостимуляторы. Фактически, индукция ΔFosB не встречается у нулевых мышей DARPP-32, которые получают хронический кокаин (Fienberg и др., 1998). Однако у взрослых мышей 7 d воздействие кокаина 20 мг / кг не изменяет общих уровней DARPP-32 (Fienberg и др., 1998). Регуляция белка DAT ранее не сообщалась у мышей, подвергнутых хроническому воздействию психостимуляторов, хотя изменения в отношении радиолиганда, связывающегося с транспортером допамина после воздействия психостимуляторов, были зарегистрированы у некоторых видов (Letchworth и др., 2001). Здесь мы измерили уровни белка DARPP-32 и DAT, чтобы определить, изменяется ли экспрессия этих белков после введения хронического психостимулятора в любом из трех возрастов мышей. Наши данные свидетельствуют о том, что не было значительных изменений в уровнях общего DARPP-32 или DAT во всем каудатном putamen или ядре accumbens после хронического введения либо кокаина, либо амфетамина в любой из трех возрастных групп (таблица 1).
Относительные значения денситометрии для DARPP-32 и DAT у пациентов, получавших амфетамин и кокаин P24, P33 и взрослых мышей по сравнению с контролем, значения солевого раствора, произвольно устанавливаемые на 100%
Исходные уровни ΔFosB регулируются с учетом развития
Мы исследовали онтогенез ΔFosB, потому что взрослые мыши с генетически модифицированной повышенной экспрессией ΔFosB в полосатом теле имеют повышенный поведенческий ответ на психостимуляторы (Kelz et al., 1999). Мы обнаружили, что базовые уровни ΔFosB были значительно ниже у более молодых животных по сравнению со взрослыми как у хвостатого курьера, так и у ядра (рис.3 A). Уровни функциональных маркеров системы допамина, включая DARPP-32 (Ehrlich и др., 1990), DAT (Perrone-Capano и др., 1996) и допаминовые рецепторы (Teicher и др., 1993; Тарази и др., 1999) также регулируются с точки зрения развития. Предыдущие отчеты на мышах CD-1 указывают на пик в полосатом DARPP-32 в постнатальный день 28 (P28) (Ehrlich и др., 1990). В крысиных хвостатых путаменах и ядре accumbens D1пиков рецептора от P28 до P40 (Teicher и др., 1993; Тарази и др., 1999), но аналогичные исследования не выполнялись в мыши. Напротив, здесь мы обнаружили, что уровни DAT-белка в хвостатых курентах и ядре accumbens были постоянными между постнатальным днем 24 и взрослой жизнью (рис. 3 B). Таким образом, относительные отношения между D1 рецепторы, DAT, DARPP-32 и ΔFosB отличаются между возрастными группами, что потенциально приводит к различиям в D1 рецепторной активности, которая может влиять на степень индукции ΔFosB.
Выражение развития ΔFosB и DAT. A, ΔFosB (35-37 кДа) иммунореактивности в хвостатых курентах и ядрах укусов наивных мышей CD-1 в зависимости от возраста. Типичные иммуноблоты показаны в верхние панели.Нижние панели показывают среднее значение ± SEM для трех мышей на группу. *p <0.05, взрослые по сравнению с P24; #p <0.05, взрослый по сравнению с P36 (тест множественного сравнения Тьюки после ANOVA). B, Денситометрические значения DAT-иммунореактивности в каудатном putamen и ядра accumbens для наивных мышей CD-1 в зависимости от возраста. Уровни DAT не отличались среди трех возрастных групп.
ОБСУЖДЕНИЕ
Поведенческие эффекты психомоторных стимуляторов зависят от возраста. Захватывающие тенденции самые высокие в подростковом возрасте, когда эскалация незаконных веществ (Estroff et al., 1989; Майерс и Андерсон, 1991). На самом деле, дети младшего возраста часто становятся дисфорическими при воздействии психостимуляторов, тогда как подростки и взрослые испытывают эйфорию (Rapoport и др., 1980). В моделях грызунов некоторые исследования показывают, что у черепахотных животных более высокие базовые уровни активности (Копье и тормоз, 1983) и измененные ответы на психостимуляторы относительно молодых и пожилых животных. Таким образом, они проявляют меньшую стимуляцию локомоторной стимуляции и новизну в ответ на острое низкодозное введение психостимуляторов по сравнению с отлученными и взрослыми животными, но повышенную гиперактивность после лечения с высокой дозой. При хроническом введении чувствительность к кокаин-индуцированной локомоции выше у крыс-подсобных крыс по сравнению со взрослыми, тогда как сенсибилизация к стереотипии ниже. Кроме того, данные микродиализа выявили различия между периодонтальными и взрослыми крысами в отношении сенсибилизации до высвобождения дофамина, вызванного амфетамином (Laviola и др., 1995; Адриани и др., 1998; Адриани и Лавиола, 2000;Laviola и др., 2001). Однако существуют противоречивые исследования относительно долгосрочной реакционной способности кокаина после введения метилфенидата у подростков-крыс (Brandon и др., 2001; Андерсен и др., 2002). В этих последних двух докладах подчеркивается трудность сравнения исследований при использовании различных экспериментальных парадигм. Попытки сравнить поведенческие исследования у более молодых животных еще больше осложняются использованием различных видов и штаммов.
Мышь становится все более важной моделью для животных при изучении использования и злоупотребления психостимуляторами, и это первый систематический анализ молекулярных нейроадаптивных ответов в трех разных возрастных группах развития у мыши или любых других отдельных видов. Предыдущие исследования, из которых мы получили наши парадигмы лечения, продемонстрировали увеличение ΔFosB в изолированном дорзальном и вентральном полосатом крысах взрослых крыс дикого типа после хронического лечения кокаином и амфетамином (Хоуп и др., 1994; Nye et al., 1995; Turgeon и др., 1997), но только в комбинированном дорсальном и вентральном полосатом теле или изолированном дорзальном полосатом у мышей дикого типа у взрослых после хронического кокаина (Fienberg и др., 1998; Zachariou et al., 2001).
Теперь мы продемонстрируем пространственную и количественную разницу в индуцированном психостимуляром ΔFosB у мышей после отлучения, черепно-возрастных и взрослых мышей. Наблюдение усиленного ответа у периадолезных животных по сравнению со взрослыми и пост-отлучениями усиливается тем фактом, что ответ аналогичен у мышей с кокаином и амфетамином. Психостимуляторы кокаина и амфетамина увеличивают синаптический допамин, а также серотонин и норэпинефрин, но различными механизмами. Кокаин связывается с переносчиками плазмолеммы для допамина, серотонина и норэпинефрина и ингибирует их обратный захват в пресинаптические терминалы. Напротив, амфетамин способствует высвобождению этих передатчиков. Селективная индукция ΔFosB в ядре accumbens только возрастной возрастной группы после 7 d введения стимулятора и относительно усиленная индукция ΔFosB в хвостатом putamen может быть нейробиологическим представлением или причиной ранее отмеченной повышенной склонности к злоупотреблению психостимуляторами в этом возрастная группа (Estroff et al., 1989; Майерс и Андерсон, 1991) и другие долгосрочные изменения экспрессии генов, которые отличаются между возрастными группами (Андерсен и др., 2002). Более того, эти различия могут быть внутренне отрегулированы изменениями развития уровней ключевых молекул, включая собственно ΔFosB. Потенциальные последствия различий в исходных уровнях ΔFosB между возрастными группами аналогичны предполагаемым различиям между штаммами крыс (Haile et al., 2001). На самом деле мы ожидаем, что аналогичные разности деформаций будут обнаружены среди инбредных мышей. Также возможно, что мыши разного возраста будут демонстрировать различные молекулярные адаптации в областях мозга, отличных от ядрового прилежащего. Дополнительный анализ с использованием черепно-мышечных мышей с генетически модифицированными изменениями в уровнях ключевых молекул и одновременными поведенческими наблюдениями будет дополнительно проверять эти гипотезы.
Сноски
- Полученный Апрель 8, 2002.
- Получено подтверждение Август 6, 2002.
- Принятый Август 8, 2002.
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения / Национальным институтом неврологических расстройств и грантом Stroke NS41871 (MEE и EMU) и Национальным институтом по борьбе со злоупотреблением наркотиками P30-DA13429 (EMU).
Переписка должна быть адресована доктору Мишель Эрлих, Университету Томаса Джефферсона, Кертису 310, 1025 Walnut Street, Филадельфии, PA 19107. Эл. адрес: [электронная почта защищена].
- Copyright © 2002 Общество неврологии
;
