PSMC5, XTUMXS Proteasomal ATPase, регулирует действие кокаина в Nucleus Accumbens (19)

PLoS One. 2015 мая 11; 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi YH1, Ониши Ю.Н.2, Накамура Т3, Оно М4, Кеннеди ПД5, Ясуюки О6, Ниши А7, Никогда8, Цузуки Т4, Nestler EJ5.

Абстрактные

ΔFosB - это стабильный фактор транскрипции, который накапливается в прилежащем ядре (NAc), ключевой части схемы вознаграждения мозга, в ответ на хроническое воздействие кокаина или других наркотиков. Хотя известно, что ΔFosB гетеродимеризуется с членом семейства Jun с образованием активного комплекса факторов транскрипции, до настоящего времени не проводилось открытого исследования других возможных партнеров связывания для ΔFosB в головном мозге. Здесь, используя дрожжевые двугибридные тесты, мы идентифицируем PSMC5, также известный как SUG1, субъединицу протеасомного комплекса 19S, содержащую АТФазу, как новый белок, взаимодействующий с ΔFosB. Мы проверяем такие взаимодействия между эндогенными ΔFosB и PSMC5 в NAc и демонстрируем, что оба белка также образуют комплексы с другими регуляторными белками хроматина, связанными с активацией генов. Мы продолжаем показывать, что хронический кокаин увеличивает ядерные, но не цитоплазматические уровни PSMC5 в NAc и что избыточная экспрессия PSMC5 в этой области мозга способствует локомоторным ответам на кокаин. Вместе эти данные описывают новый механизм, который способствует действию ΔFosB и впервые вовлекает PSMC5 в индуцированную кокаином молекулярную и поведенческую пластичность.

Образец цитирования: Онниши Ю.Х., Онниши Ю.Н., Накамура Т, Оно М., Кеннеди П.Дж., Ясуюки О. и др. (2015) PSMC5, протеасомная АТФаза 19S, регулирует действие кокаина в Nucleus Accumbens. PLOS ONE 10 (5): e0126710. DOI: 10.1371 / journal.pone.0126710

Академический редактор: Джеймс Эдгар МакКатчон, Университет Лестера, СОЕДИНЕННОЕ КОРОЛЕВСТВО

Получено: Декабрь 10, 2014; Принято: Апрель 7, 2015; Опубликовано: 11 мая 2015

Авторское право: © 2015 Ohnishi et al. Это статья открытого доступа, распространяемая на условиях Лицензии Creative Commons Attribution, который допускает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что исходный автор и источник зачисляются

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения, Национального института по борьбе со злоупотреблением наркотиками, а также Фондом Исибаси и Японским обществом содействия развитию науки (номера KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010). Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов.

Введение

ΔFosB, усеченное произведение FosB ген принадлежит к семейству транскрипционных факторов Fos, которые также включают c-Fos, полноразмерный FosB, Fra-1 и Fra-2. FosB, как и другие белки Fos, гетеродимеризуется с белком семейства Jun - c-Jun, JunB или JunD - с образованием активного фактора транскрипции AP-1 (активатор-белок-1), который индуцирует или подавляет экспрессию специфических генов-мишеней. [1,2].

Было показано, что ΔFosB играет ключевую роль в наркомании [2]. Уникально среди белков семейства Fos, он накапливается в прилежащем ядре (NAc) и других областях мозга, связанных с наградами, после многократного введения лекарственного средства из-за его высокого уровня стабильности [3,4], что опосредуется отсутствием С-концевых доменов дегронов и фосфорилированием несколькими протеинкиназами [5–7]. Такая индукция ΔFosB в NAc опосредует усиление поведенческих реакций на наркотики злоупотребления. Таким образом, сверхэкспрессия ΔFosB в этой области мозга взрослых животных путем использования вирусных векторов или индуцибельных битрансгенных мышей повышает чувствительность животного к локомоторно-активирующему и стимулирующему действию кокаина и опиатов, а также мотивацию животного к самостоятельному введению кокаин [7–11]. Наоборот, избыточная экспрессия доминантных отрицательных антагонистов ΔFosB вызывает противоположные поведенческие фенотипы [10–12].

Мы и другие ранее подтвердили, используя анализы гелевого сдвига, что JunD и, возможно, другие белки семейства Jun являются основными связывающими партнерами FosB в мозге in vivo [13–15]. Однако до настоящего времени не было проведено объективной оценки непредвзятых партнеров ΔFosB в головном мозге. Здесь мы стремились идентифицировать новых партнеров по связыванию для ΔFosB с помощью дрожжевого двухгибридного анализа [16,17]. Наши данные показали, что PSMC5, также известный как SUG1, является надежным партнером ΔFosB как in vitro, так и в NAc in vivo, где он присоединяется к ΔFosB в составе кокаин-индуцированного комплекса активации транскрипции, который также содержит CBP (CREB-связывающий белок ) и p300 - как гистонацетилтрансферазы (HAT) - так и BRG1 (белок ремоделирования хроматина). Далее мы покажем, что хроническое воздействие кокаина изменяет ядерные уровни PSMC5, АТФазсодержащей субъединицы протеасомного комплекса 19S, в NAc, и что PSMC5, в свою очередь, контролирует поведенческие реакции на кокаин.

Материалы и методы

Дрожжевой двухгибридный скрининг

Клетки дрожжей MaV203 (Invitrogen Life Technologies) совместно трансфицировали pDBLeu, приводя в движение различные фрагменты белка ΔFosB, и библиотеку мозга мыши субклонировали в pPC86 (Invitrogen Life Technologies). Трансформированные клетки выращивали на SC-среде без лейцина, триптофана и гистидина и содержали 10 мМ 3-аминотриазола. Связывание между фрагментами FosB и партнером-кандидатом индуцирует три репортерных гена (His3, Ura3качества LacZ), и индукция делает трансформантов способными выживать в условиях культивирования. Положительные клоны повторно тестировали со свежими фрагментами pDBLeu-ΔFosB с помощью анализов ретрансформации в клетках MaV203.

Сотовые линии

Клетки нейробластомы Neuro 2A мыши (ATCC) поддерживали в минимальной необходимой среде Игла (EMEM) (ATCC) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) при 37 ° C и 5% CO.2, Клетки 1A крысы были подарены Yusaku Nakabeppu (Фукуока, Япония) [18] и хранится в MEM (DMEM) Дульбекко (Life Technologies), дополненной 10% FBS при 37 ° C и 5% CO2, Трансфекцию клеток плазмидной ДНК осуществляли с использованием Effectene (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя.

Конструкции PSMC5 и ΔFosB

Несколько мутантных форм PSMC5, каждая из которых мечена FLAG на своем N-конце, были созданы для использования в экспериментах по иммунопреципитации или вирус-опосредованному переносу генов. К ним относятся: PSMC5-K196M, PSMC5-Δ домен спиральной катушки (PSMC5-ΔCC, без аминокислот 27 – 68), PSMC5-NT (состоящий из N-концевого фрагмента белка, аминокислот 1 – 151, 5 и 172) -CT (состоящий из С-концевого фрагмента белка, аминокислот XNUMX) (см. рис 1). Мы также использовали N-концевые MYC-меченые формы ΔFosB дикого типа, а также ΔFosB с мутацией в своем домене лейциновой молнии (мутация аминокислот 182 в 205, которая, как известно, стирает гетеродимеризацию белками семейства Jun [6].

миниатюрами
Рис 1. ΔFosB связывается с PSMC5 in vitro.

 

А. Схема ΔFosB, ΔFosB-LZM, в которой домен лейциновой молнии мутирует для уничтожения гетеродимеризации ΔFosB белками Jun, и Δ2ΔFosB, в котором отсутствуют первые аминокислоты 78 N-конца ΔFosB. B. Схема PSMC5, PSMC5-NT, которая содержит первые аминокислоты 151 PSMC5, PSMC5-CT, в которой отсутствуют первые аминокислоты 235 в PSMC5, и PSMC5-ΔCC, в которой отсутствует домен спиральной катушки (аминокислоты 28) XNUM-XUMX) , Домен ААА соответствует мотиву АТФазы, связанному с различными клеточными активностями, присутствующим во многих АТФазах. C. 68 мкг pcDNA2.4-ΔFosB (дорожки 3.1-1) или ΔFosB-LZM (дорожка 4) совместно трансфицировали 5 мкг меченного FLAG PSMC2.4 или различными делеционными мутантами в клетки Neuro5a. Через два дня после трансфекции клетки лизировали и подвергали иммунопреципитации антителом против FLAG, а затем вестерн-блоттингом с антителом против FosB или против FLAG. Обратите внимание, что ΔFosB, но не ΔFosB-LZM, надежно связывается с PSMC2 или PSMC5-NT, но не с PSMC5-CT или PSMC5-ΔCC. Данные, показанные на рисунке, были повторены в трех экземплярах в каждом из трех отдельных экспериментов.

DOI: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

Животные

Самцов мышей C11BL / 57J в возрасте от девяти до 6 (лаборатория Джексона) использовали для всех экспериментов. Животных содержали в цикле свет-темнота 12-h с доступом к пище и воде вволю и привыкли к 1 за неделю до экспериментов. Были использованы две схемы лечения кокаином. Чтобы изучить биохимические эффекты кокаина, животным давали 7 ежедневные дозы кокаина (20 мг / кг) или физиологического раствора и убивали путем обезглавливания 24 ч после последней инъекции. Это стандартный протокол, который, как было показано, вызывает многочисленные молекулярные и клеточные реакции на препарат [7]. Чтобы изучить влияние PSMC5 в прилежащем ядре на поведенческие реакции на кокаин, мы использовали подпороговую дозу препарата (7.5 мг / кг; см. Локомоторную сенсибилизацию ниже) на основе гипотезы о том, что PSMC5, как и ΔFosB, увеличит чувствительность животного к кокаин [8]. Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных на горе Синай.

Иммунопреципитация и вестерн-блоттинг

Клетки Neuro 2A трансфицировали дикими или мутантными формами PSMC5. Через два дня после трансфекции клетки промывали в PBS, лизировали в буфере RIPA (50 мМ Трис pH 7.4, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% NP-40, 0.25% дезоксихолат натрия, 10 мМ бутират натрия, коктейль ингибитор протеазы) , Лизаты разделяли и инкубировали с неиммунными антителами IgG (Sigma) или анти-FLAG (Sigma) в течение 3 ч при 4 ° C. Иммунопреципитацию проводили с гранулами белка G (Invitrogen), как описано [19]. Вкратце, иммунопреципитированные белки подвергали SDS-PAGE и анализировали вестерн-блоттингом с использованием антитела против FosB / ΔFosB (Cell Signaling Technology) на основе опубликованных протоколов [7]. Для анализов связывания белка in vivo мы использовали очищенные ядерные фракции от мышей, вскрытых методом пунша, после хронической обработки кокаином (20 мг / кг IP ежедневно в течение дней 7, причем мыши использовали 24 ч после последней инъекции). Коиммунопреципитацию от ядерных фракций проводили с использованием набора Nuclear Complex Co-IP (Active Motif), следуя инструкциям производителя. Были использованы следующие антитела: MYC или β-актин, технология клеточной сигнализации (Danvers, MA), PSMC5 и гистон H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 и BRG1, биотехнология Санта-Крус (Санта-Крус, Калифорния) и ФЛАГ M2, Сигма.

Иммуногистохимия

Иммуногистохимия проводилась согласно опубликованным методикам [20]. Мышей анестезировали и перфузировали внутрисердечно 4% параформальдегидом в PBS. Мозг подвергали криопротекции с помощью 30% сахарозы, а затем замораживали и хранили при -80 ° C до использования. Корональные срезы (40 мкм) вырезали на криостате и обрабатывали для иммуногистохимии. Свободно плавающие срезы предварительно инкубировали в блокирующем буфере, содержащем 0.3% Triton и 3% нормальной сыворотки осла. ΔFosB детектировали с использованием поликлонального антитела козы, выращенного против N-концевой части белка (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology). PSMC5 был обнаружен с использованием кроличьих поликлональных антител (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA). Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа (увеличение 60x; Zeiss).

Локомоторная сенсибилизация

Все мыши получали ежедневные внутрибрюшинные инъекции физиологического раствора в течение дней 3, чтобы привыкнуть к стрессу от инъекций. На следующий день мышам вводили внутрибрюшинно физиологический раствор или подпороговую дозу кокаина (7.5 мг / кг; см. Раздел «Животные» выше) и немедленно помещали в новые локомоторные боксы. Локомоторная активность мышей регистрировалась с использованием системы фотобуча в качестве разрывов амбулаторного луча в течение 30 мин. Эти процедуры повторялись ежедневно в течение дней 3.

Вирусно-опосредованный перенос генов

Мы использовали широко опубликованные методы вирус-опосредованного переноса генов [7,8,11,19]. Вкратце, экспрессионные плазмиды для PSMC5 или для нескольких его мутантов (см. Конструкции PSMC5 и ΔFosB выше) субклонировали в бицистронную плазмиду p1005 (+) HSV, экспрессирующую GFP, под контролем промотора CMV, и PSMC5 или его мутанты под таковым из IE4 / 5 промоутер. Под наркозом кетамин (100 мг / кг) / ксилазин (10 мг / кг) мышей помещали в стереотаксический инструмент для мелких животных и подвергали воздействию поверхность черепа. Шприцевые иглы тридцать три калибра использовали для двустороннего введения 0.5 мкл вектора HSV в NAc под углом 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV-4.4) со скоростью 0.1 мкл / мин. Животным, получавшим инъекции HSV, давали возможность восстановиться в течение 2 дней после операции до эксперимента.

Показатели

Использовали ANOVA и t-критерии Стьюдента с поправкой на множественные сравнения со значимостью p <0.05.

Итоги

PSMC5: новый партнер по связыванию ΔFosB

Мы выполнили предварительные эксперименты, чтобы идентифицировать соответствующий фрагмент ΔFosB, который служил приманкой в ​​дрожжевом двухгибридном анализе без аутоактивации системы. Holo-ΔFosB индуцировал активность репортерного гена сам по себе, как и N-концевой аминокислотный фрагмент белка 1 – 78. Тем не менее, N-концевой усеченный FosB (Рис. 1A), называемый Δ2ΔFosB, в котором отсутствуют первые аминокислоты 78 белка, такого эффекта не имел. Поэтому мы использовали Δ2ΔFosB в качестве белка-приманки.

Для скрининга потенциальных партнеров по связыванию мы использовали библиотеку мозга мыши, субклонированную в pPC86. Мы определили кандидатов 11 для партнеров по связыванию. Хотя эти белки включали известных партнеров гетеродимеризации ΔFosB, c-Jun и JunD (Таблица 1), наиболее распространенным кандидатом на сегодняшний день был PSMC5. Удивительно, но это было интересным открытием, так как PSMC5 было показано в одном отчете несколько лет назад, что он связывается с c-Fos in vitro [21]. Тем не менее, нет никаких предварительных сообщений об участии PSMC5 в действии кокаина. Тем не менее, из-за силы сигнала PSMC5 в двухгибридном анализе дрожжей, мы решили продолжить изучение возможных взаимодействий ΔFosB-PSMC5.

миниатюрами
Таблица 1. Результаты двухгибридного скрининга дрожжей с Δ2ΔFosB.

DOI: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Во-первых, чтобы подтвердить физическое взаимодействие между ΔFosB и PSMC5, мы провели эксперименты по совместной иммунопреципитации in vitro. Мы обнаружили, что FLAG-тег PSMC5 (Рис. 1B), трансфицированные в клетки Neuro 2A, эффективно снижают ΔFosB (Рис. 1C). Во-вторых, чтобы идентифицировать область в PSMC5, которая отвечает за его связывание с ΔFosB, мы создали несколько FLAG-меченых мутантов PSMC5 (Рис. 1B) и повторил эксперимент по совместной иммунопреципитации. ΔFosB эффективно разрушался с помощью N-концевых аминокислот 151 PSMC5 (PSMC5-NT), но не с С-концевого аминокислотного фрагмента 172 белка (PSMC5-CT) (Рис. 1C). PSMC5, в котором отсутствует домен спиральной катушки (PSMC5-ΔCC), также неэффективен для осаждения ΔFosB. Эти данные свидетельствуют о том, что PSMC5 связывает ΔFosB через его домен спиральной катушки (аминокислоты 27 – 68). Кроме того, меченный FLAG PSMC5 не осаждает мутантную форму ΔFosB с мутированным доменом лейциновой молнии (ΔFosB-LZM) (Рис. 1C), указывая, что ΔFosB либо связывает PSMC5 через этот домен, либо, что более вероятно, что для связывания PSMC5 требуется гетеродимеризация ΔFosB.

Связывание PSMC5-ΔFosB в NAc после хронического введения кокаина

Основываясь на этих результатах in vitro, мы изучили, изменяются ли уровни PSMC5 в NAc в ответ на хроническое введение кокаина. С помощью субклеточного фракционирования и вестерн-блоттинга мы обнаружили, что хронический кокаин увеличивает ядерные уровни PSMC5 в этой области мозга без изменения цитоплазматических уровней (Рис. 2A). Этот эффект не наблюдался после однократного приема кокаина (данные не показаны). Затем мы исследовали локализацию PSMC5 и ΔFosB в NAc с помощью конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии. Мы проанализировали у мышей 24 ч после последней повторной дозы кокаина, момент времени, когда ΔFosB является единственным определяемым FosB продукт гена (см. Nestler 2008). Мы обнаружили сильную иммунореактивность PSMC5 в NAc, включая сильный ядерный сигнал. ~ 85% ядер ΔFosB +, совместно окрашенных для PSMC5 (Рис. 2B). Кроме того, мы провели эксперименты по совместной иммунопреципитации с экстрактами NAc и обнаружили, что после хронической обработки кокаином ΔFosB эффективно подавлялся антителом против PSMC5 (Рис. 2C). Напротив, анализ NAc-препарата, не содержащего лекарств (после повторных инъекций физиологического раствора), не выявил обнаруживаемого снижения FosB (данные не показаны). Эти данные согласуются с нашими результатами в клеточной культуре и подтверждают, что ΔFosB и PSMC5 взаимодействуют в NAc in vivo.

миниатюрами
Рис 2. PSMC5 регуляция у мыши NAc.

 

A. Вестерн-блоттинг ядерных и цитозольных фракций NAc мышей, получавших ежедневно физиологический раствор или кокаин (20 мг / кг) в течение 7 дней, с животными, анализируемыми через 24 часа после последней инъекции. Кокаин увеличивает ядерные, но не цитозольные уровни PSMC5. Гистон H3 и ß-актин, на которые кокаин не влиял, использовали в качестве контроля нагрузки. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (n = 8–10 / группа, * p <0.05). B. Совместная локализация эндогенного PSMC5 (зеленый) и ΔFosB (синий) в NAc мышей, хронически обработанных кокаином, как в AC. Ядерные лизаты мышиных NAc после хронической обработки кокаином подвергали иммунопреципитации с антителом против PSMC5 или мышиным IgG в качестве контроля. , а затем вестерн-блоттинг с антителом против FosB / ΔFosB. На рисунке показаны взаимодействия PSMC5-ΔFosB в NAc in vivo. Данные в B и C были воспроизведены в трех экземплярах в каждом из трех отдельных экспериментов.

DOI: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 усиливает экспрессию ΔFosB in vitro

Поскольку PSMC5 является известным членом протеасомного комплекса, мы проверили, регулирует ли он уровни ΔFosB с использованием клеток крысы 1A. Сверхэкспрессия PSMC5 не оказывала влияния на базальные уровни ΔFosB, но вызывала небольшое, но значительное усиление индукции ΔFosB при сывороточной стимуляции клеток (Рис. 3A). Аналогичная тенденция наблюдалась для полноразмерного FosB, но эффект не достиг статистической значимости. И наоборот, подавление эндогенной экспрессии PSMC5 в клетках крысы 1A, достигаемое с помощью siРНК, которые нацелены на PSMC5, не влияло на базальные уровни ΔFosB, но сильно ингибировало индукцию ΔFosB при стимуляции сывороткой (Рис. 3B). Подобные эффекты были замечены для полноразмерного FosB. Эти данные свидетельствуют о том, что PSMC5 не способствует протеасомной деградации ΔFosB, как можно было бы ожидать в качестве основной субъединицы протеасомы, но вместо этого требуется для максимального накопления FosB генные продукты in vitro, возможно, путем стабилизации белков.

миниатюрами
Рис 3. PSMC5 регуляция экспрессии FosB / ΔFosB в клетках крысы 1A.

 

A. Клетки крысы 1A трансфицировали 4 мкг PSMC5 или контрольной ДНК. Сверхэкспрессия PSMC5 не влияла на базальные уровни экспрессии белка FosB или ΔFosB, как определено с помощью вестерн-блоттинга, но вызывала небольшое, но значительное увеличение индукции ΔFosB за счет стимуляции сывороткой (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Клетки крысы 1A трансфицировали 5 пмоль либо двух миРНК, либо скремблированной РНК (контроль). Обе миРНК эффективно снижали уровни белка PSMC5 по сравнению с контрольными условиями (миРНК №1, 23 ± 5% от контроля; миРНК №2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). Нокдаун PSMC5 не влиял на базальные уровни FosB или ΔFosB, но ослаблял индукцию как FosB, так и ΔFosB за счет стимуляции сывороткой (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83). , p = 0.002).

DOI: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB и PSMC5 образуют комплексы с CBP, p300 и BRG1 в NAc

Чтобы лучше понять механизмы транскрипции, с помощью которых PSMC5 может влиять на функцию ΔFosB, мы исследовали возможные дополнительные партнеры связывания для двух белков в NAc в условиях хронического лечения кокаином. Существует одно сообщение, что PSMC5 связывается с CBP - HAT - и увеличивает ацетилирование гистона H3 на проксимальном промоторе MHC-II в клетках HeLa [22]. Кроме того, мыши с дефицитом CBP проявляют пониженную поведенческую чувствительность к кокаину, а также пониженное ацетилирование гистона при FosB промоутер [23]. Таким образом, мы проверили, может ли PSMC5 связываться с ΔFosB как часть комплексов, которые также содержат CBP и, возможно, другие активаторы транскрипции.

Сначала мы продемонстрировали, что ΔFosB эффективно подавляет как CBP, так и p300, родственный HAT, в клетках Neuro2A (Рис. 4A). Напротив, мутантная форма ΔFosB лейциновой молнии, как и ожидалось, не проявляла этой активности. Аналогично, PSMC5 эффективно отключил CBP и p300 (Рис. 4B). Интересно, что этот эффект также наблюдался для PSMC5-ΔCC, который не разрушал ΔFosB, указывая на то, что PSMC5 взаимодействует с CBP и p300 через другие домены белка и независимо от его связывания с ΔFosB.

миниатюрами
Рис 4. FosB и PSMC5 взаимодействуют с CBP, p300 и BRG1 in vitro и in vivo.

 

A. Клетки Neuro2A трансфицировали 2.4 мкг меченного MYC FosB или меченного MYC FosB-LZM. Клеточные экстракты иммунопреципитировали антителом против CBP или против p300, а осадки подвергали вестерн-блоттингу с тем же антителом или антителом против MYC. Как CBP, так и p300 взаимодействуют с ΔFosB, и для таких взаимодействий требуется интактная лейциновая молния. B. Клетки Neuro2A трансфицировали 2.4 мкг меченой FLAG PSMC5 или меченной FLAG PSMC5-ΔCC. Клеточные экстракты иммунопреципитировали антителом против CBP или анти-p300, а осадки подвергали вестерн-блоттингу с тем же антителом или антителом против FLAG. Как CBP, так и p300 взаимодействуют с PSMC5, и для таких взаимодействий не требуется домен CC. C. Ядерные лизаты мышиного NAc после хронической обработки кокаином подвергали иммунопреципитации с антителом против CBP или против p300. Последующее вестерн-блоттинг полученных преципитатов с антителом против FosB / ΔFosB показало эндогенные взаимодействия между ΔFosB и CBP / p300. D. Аликвоты тех же ядерных лизатов подвергали иммунопреципитации с антителом против BRG1 или против PSMC5 с последующим вестерн-блоттингом осадков с антителом против FosB / ΔFosB или антителом против BRG1. Результаты показывают эндогенные взаимодействия между ΔFosB и BRG1, а также BRG1 и PSMC5. E. Схематическая иллюстрация комплекса активации транскрипции, состоящего из гетеродимеров ΔFosB: JunD, взаимодействующих с CBP / p300, BRG1 и PSMC5.

DOI: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Чтобы подтвердить, что эти взаимодействия также происходят in vivo, мы вводили кокаин хронически для индукции уровней ΔFosB и ядерного PSMC5, затем иммунопреципитированные экстракты NAc с антителами против CBP или против p300. В соответствии с нашими данными клеточных культур, иммунопреципитация CBP или p300 эффективно снижала FosB (Рис. 4C). Мы проверили, может ли BRG1, основная субъединица комплекса ремоделирования хроматина SWI-SNF, также связываться с ΔFosB и PSMC5, основываясь на наших ранее полученных данных о том, что BRG1 рекрутируется для определенных генов-мишеней ΔFosB в сочетании с их активацией в NAc после хронического кокаина [24]. Мы обнаружили, что иммунопреципитация BRG1 снижала ΔFosB в экстрактах NAc и что иммунопреципитация PSMC5 также соосаждалась с эндогенным BRG1 (Рис. 4D). Взятые вместе, эти результаты показывают, что ΔFosB-PSMC5 образуют комплексы в NAc, которые также включают CBP / p300 и BRG1 (Рис. 4E).

Сверхэкспрессия PSMC5 увеличивает двигательные реакции на кокаин

Значительное связывание PSMC5 с ΔFosB в NAc побудило нас исследовать, регулирует ли повышение уровней PSMC5 в этой области мозга поведенческие реакции на кокаин. Мы создали вектор вируса простого герпеса (HSV), который сверхэкспрессирует либо PSMC5 дикого типа, либо одного из его мутантов, и проверили векторы в NAc in vivo (Рис. 5A). Вирус-опосредованная экспрессия PSMC5 преобладает в ядре клетки (Рис. 5B). Мыши со сверхэкспрессией PSMC5 дикого типа не проявляли измененных ответов на начальные дозы кокаина, но демонстрировали повышенную двигательную активацию в ответ на повторные дозы кокаина по сравнению с контрольными мышами, экспрессирующими GFP. Напротив, мыши, сверхэкспрессирующие мутантную форму PSMC5, в которой отсутствует домен спиральной спирали (PSMC5-ΔCC), не проявляли этого эффекта (Рис. 5B). Интересно, что сверхэкспрессия PSMC5-K196M, в которой отсутствует АТФазная активность белка дикого типа, также усиливает локомоторные реакции кокаина.

миниатюрами
Рис 5. Сверхэкспрессия PSMC5 в NAc увеличивает двигательные реакции на кокаин.

 

A. Репрезентативная HSV-опосредованная экспрессия трансгена в медиальной NAc. АК, передняя комиссура. На рисунке отмечены подобласти ядра и оболочки NAc. B. Типичное более высокое увеличение (60x) иммуногистохимического окрашивания PSMC5 в нейронах NAc после инъекции HSV-PSMC5, показывающее, что белок является преимущественно ядерным, что отмечено окрашиванием DAPI. C. Мыши получали двусторонние инъекции HSV в NAc с последующими ежедневными внутрибрюшинными инъекциями подпороговых доз кокаина (7.5 мг / кг). Двигательные реакции проявляются в ответ на первую и последнюю из 3-х дневных доз препарата. Сверхэкспрессия PSMC5 или PSMC5-K196M увеличивает локомоторные ответы на повторяющийся кокаин, эффект, не наблюдаемый для PSMC5-ΔCC. Не наблюдалось значительного влияния трансгенов на локомоторные реакции на начальные дозы кокаина. ANOVA F (3,125) = 4.163, * p <0.05 по критерию posthoc Даннета.

DOI: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Обсуждение

Результаты настоящего исследования раскрывают новый механизм, с помощью которого FosB опосредует свое воздействие на мозг, и новый механизм, участвующий в действии кокаина. Используя непредвзятый подход, дрожжевой двухгибридный анализ, мы идентифицировали PSMC5 в качестве нового связывающего партнера для ΔFosB. Мы подтвердили этот вывод как в культивируемых клетках in vitro, так и в NAc in vivo, продемонстрировав надежное связывание PSMC5-ΔFosB. Важно, что ядерные уровни PSMC5 индуцируются в NAc при хроническом введении кокаина. Далее мы показали, что связывание PSMC5-ΔFosB происходит совместно с несколькими другими белками-активаторами транскрипции, а именно CBP и p300 (две HAT) и BRG1 (ключевой компонент комплексов ремоделирования хроматина SWI-SNF). В совокупности наши результаты подтверждают гипотезу о том, что PSMC5 является частью комплекса активации транскрипции, который рекрутируется, по крайней мере, для определенных генов, индуцированных ΔFosB, во время курса хронического введения кокаина (Рис. 4E). В соответствии с этой гипотезой имеются дополнительные данные о том, что избыточная экспрессия PSMC5 в NAc, как и избыточная экспрессия самого ΔFosB, способствует поведенческим реакциям на кокаин. В будущих исследованиях было бы интересно проследить эти наблюдения in vivo с характеристикой взаимодействий PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 с использованием репортерных анализов in vitro.

Участие PSMC5 в действии кокаина является совершенно новым. Первоначально идентифицированный как член большого семейства АТФаз, которые включают протеасому, было показано, что PSMC5 на протяжении многих лет взаимодействует с несколькими факторами транскрипции, включая c-Fos, p53, рецепторы ядерного гормона и компоненты базального транскрипционного комплекса [25], однако, за эти годы было проведено мало функциональных исследований [26]. Его наилучшим доказанным действием является стимулирование активности транскрипционных факторов MYC в культивируемых клетках [27]. Участие PSMC5 в транскрипционных механизмах предполагает потенциальную роль убиквитинирующей протеасомной активности в регуляции транскрипции генов, но участие PSMC5 в такой регуляции до настоящего времени практически не проверено [28,29].

Очень мало известно о функции PSMC5 в мозге. Более раннее исследование продемонстрировало широко распространенную экспрессию мРНК PSMC5 по всему мозгу [30], но его функциональная активность осталась неизученной. Наши результаты теперь побуждают к дальнейшим исследованиям этого интересного белка, чтобы лучше понять его роль в регуляции транскрипции генов и ее связь с убиквитинированием-протеасомной функцией в мозге. Связывание PSMC5 с ΔFosB опосредуется доменом спиральной спирали PSMC5. Кроме того, способность PSMC5 стимулировать локомоторные ответы на кокаин, хотя и требует домена спиральной катушки, не требует активности АТФазы, присущей белку. Эти результаты повышают вероятность того, что, по крайней мере в нашей системе, основная активность PSMC5 может быть опосредована через его связывание с ΔFosB и другими транскрипционными регуляторными белками, а не через его протеасомную активность как таковую. Необходима дальнейшая работа для непосредственного тестирования этой и альтернативных возможностей. Гипотеза о том, что вирус-опосредованная избыточная экспрессия PSMC5 усиливает двигательные реакции на кокаин через взаимодействия с ΔFosB, является правдоподобной, несмотря на использование режима дневного лечения кокаином 3, поскольку известно, что заметные уровни ΔFosB накапливаются в мозге в течение этого периода времени [3].

Настоящие результаты дополнительно подтверждают полезность использования непредвзятых, открытых экспериментальных подходов при изучении молекулярных основ регуляции мозга. Наше первоначальное внимание к PSMC5 было основано исключительно на его заметном связывании с ΔFosB в дрожжевом двухгибридном анализе, однако он, по-видимому, является важным компонентом транскрипционных изменений, которые рекрутируются в NAc при повторном введении кокаина. Лучшее понимание детальных механизмов, посредством которых ядерный уровень PSMC5 индуцируется кокаином, и, в свою очередь, то, каким образом PSMC5 затем вносит вклад в кокаин-индуцированные транскрипционные активационные комплексы, находится в центре внимания современных исследований. Между тем, наш дрожжевой двухгибридный анализ выявил несколько дополнительных предполагаемых партнеров связывания ΔFosB (Таблица 1), что также в настоящее время требует прямой экспертизы на моделях кокаина. Вместе эта работа способствует более глубокому пониманию сложных молекулярных механизмов, посредством которых кокаин изменяет функцию NAc.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального института по борьбе со злоупотреблением наркотиками, а также Фондом Исибаси и Японским обществом содействия науке (номера KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010).

Авторские вклады

Задумал и спроектировал эксперименты: YHO YNO EJN. Выполнены эксперименты: YHO YNO PJK RN. Проанализировал данные: YHO YNO EJN. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: TN MO OY AN RN TT. Написал бумагу: YHO EJN.

Рекомендации

  1. 1. Морган JI, Curran T (1995) Гены с ранним ранним возрастом: десять лет спустя. Тенденции Neurosci 18: 66 – 67. pmid: 7537412 doi: 10.1016 / 0166-2236 (95) 80022-t
  2. 2. Нестлер Э.Дж. (2008) Транскрипционные механизмы зависимости: роль deltaFosB. Philos Trans R Soc London B Biol Sci 363: 3245 – 3255. doi: 10.1098 / rstb.2008.0067. PMID: 18640924
  3. Просмотр статей
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Просмотр статей
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Просмотр статей
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Просмотр статей
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Просмотр статей
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Просмотр статей
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Просмотр статей
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Просмотр статей
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Просмотр статей
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Просмотр статей
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Просмотр статей
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Просмотр статей
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Просмотр статей
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Просмотр статей
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Просмотр статей
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Просмотр статей
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Просмотр статей
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Просмотр статей
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Просмотр статей
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Просмотр статей
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Просмотр статей
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Просмотр статей
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Просмотр статей
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Просмотр статей
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Просмотр статей
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Просмотр статей
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Просмотр статей
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Просмотр статей
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Просмотр статей
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. 3. Хоуп Б.Т., Най Х.Е., Келз М.Б., Сам Д.В., Ядарола М.Дж., Накабеппу Й. и др. (1994) Индукция длительно действующего комплекса AP-1, состоящего из измененных Fos-подобных белков в мозге, с помощью хронического кокаина и других хронических методов лечения. Нейрон 13: 1235 – 1244. pmid: 7946359 doi: 10.1016 / 0896-6273 (94) 90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) Мыши с мутантами FosB: потеря хронической кокаиновой индукции белков, связанных с Fos, и повышенная чувствительность к психомоторным и положительным эффектам кокаина. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10397–10402. pmid: 9294222 DOI: 10.1073 / pnas.94.19.10397
  92. 5. Улеры П.Г., Руденко Г.Г., Нестлер Е.Ю. (2006) Регуляция стабильности ΔFosB путем фосфорилирования. J Neurosci 26: 5131 – 5142. pmid: 16687504 doi: 10.1523 / jneurosci.4970-05.2006
  93. 6. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, et al. (2007) Отсутствие консервативного C-концевого дегронного домена способствует уникальной стабильности ΔFosB. Eur J Neurosci 25: 3009 – 3019. PMID: 17561814
  94. 7. Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, et al. (2013) Поведенческие и структурные реакции на хронический кокаин требуют петли прямой связи с участием ΔFosB и CaMKII в прилежащей оболочке ядра. J Neurosci 33: 4295 – 4307 doi: 10.1523 / JNEUROSCI.5192-12.2013. PMID: 23467346
  95. 8. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, et al. (1999) Экспрессия фактора транскрипции FosB в мозге контролирует чувствительность к кокаину. Природа 401: 272 – 276. PMID: 10499584
  96. 9. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB усиливают стимул для кокаина. J Neurosci 23: 2488 – 2493. PMID: 12657709
  97. 10. McClung CA, Nestler EJ (2003) Регуляция экспрессии генов и вознаграждения кокаином с помощью CREB и DFosB. Nat Neurosci 11: 1208 – 1215. pmid: 14566342 doi: 10.1038 / nn1143
  98. 11. Захариу В., Боланос К.А., Селли Д.Е., Теобальд Д., Кэссиди М.П., ​​Келз М.Б. и др. (2006) ΔFosB: существенная роль ΔFosB в прилежащем ядре в действии морфина. Nature Neurosci 9: 205 – 211. pmid: 16415864 doi: 10.1038 / nn1636
  99. 12. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, et al. (2003) Индуцируемая специфическая экспрессия в области мозга доминантно-негативного мутанта c-Jun у трансгенных мышей снижает чувствительность к кокаину. Brain Res 970: 73 – 86. pmid: 12706249 doi: 10.1016 / s0006-8993 (03) 02230-3
  100. 13. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, et al. (1995) Регуляция дельта-FosB и FosB-подобных белков с помощью электросудорожного припадка и обработки кокаином. Мол Фармакол 48: 880 – 889. PMID: 7476919
  101. 14. Hiroi N, Marek GJ, Brown J, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, et al. (1998) Существенная роль гена fosB в молекулярных, клеточных и поведенческих действиях электросудорожных припадков. J Neurosci 18: 6952 – 6962. PMID: 9712664
  102. 15. Перерез-Отано I, Мандельзис А, Морган JI (1998) Паркинсонизм MPTP сопровождается устойчивой экспрессией D-FosB-подобного белка в дофаминергических путях. Mol Brain Res 53: 41 – 52. pmid: 9473580 doi: 10.1016 / s0169-328x (97) 00269-6
  103. 16. Ma J, Ptashne M (1988) Превращение эукариотического ингибитора транскрипции в активатор. Ячейка 55: 443 – 446. pmid: 3180218 doi: 10.1016 / 0092-8674 (88) 90030-x
  104. 17. Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Fields S (1991) Двухгибридная система: метод идентификации и клонирования генов для белков, которые взаимодействуют с интересующим белком. Proc Natl Acad Sci USA 88: 9578 – 9582. pmid: 1946372 doi: 10.1073 / pnas.88.21.9578
  105. 18. Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) Пролиферативная активация покоящихся клеток Rat-1A дельта-FosB. Mol Cell Biol 13: 4157 – 4166. PMID: 8321220
  106. 19. Scobie KN, Damez-Werno D, Sun H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH, et al. (2014) Существенная роль поли (АДФ-рибозила) в действии кокаина. Proc Natl Acad Sci USA 111: 2005 – 2010. doi: 10.1073 / pnas.1319703111. PMID: 24449909
  107. 20. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, et al. (2008) Четкие закономерности индукции ΔFosB в мозге наркотиками. Синапс 62: 358 – 369. doi: 10.1002 / syn.20500. PMID: 18293355
  108. 21. Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996), млекопитающее Sug1 и c-Fos в ядерной протеасоме 26S. Proc Natl Acad Sci USA 93: 8236 – 8240. pmid: 8710853 doi: 10.1073 / pnas.93.16.8236
  109. 22. Koues OI 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D, Bhat KP, McNeal S, et al. (2008) Регуляция ацетилирования у проксимального промотора класса II главного комплекса гистосовместимости протеасомальной АТФазой Sug19 1S. Mol Cell Biol 28: 5837 – 5850. doi: 10.1128 / MCB.00535-08. PMID: 18662994
  110. 23. Левин AA, Guan Z, Barco A, Xu S, Kandel ER, Schwartz JH (2005) CREB-связывающий белок контролирует реакцию на кокаин путем ацетилирования гистонов у промотора fosB в стриатуме мыши. Proc Natl Acad Sci USA 102: 19186 – 19191. pmid: 16380431 doi: 10.1073 / pnas.0509735102
  111. 24. Кумар А., Чой К.Х., Ренталь В., Цанкова Н.М., Теобальд Д.Е., Труонг Г.Т. и др. (2005) Ремоделирование хроматина является ключевым механизмом, лежащим в основе кокаин-индуцированной пластичности в стриатуме. Нейрон 48: 303 – 314. pmid: 16242410 doi: 10.1016 / j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) Двойные функции регуляторов транскрипции: миф или реальность. J Cell Biochem Suppl 32/33: 32–40. DOI: 10.1002 / (sici) 1097-4644 (1999) 75: 32+ <32 :: aid-jcb5> 3.0.co; 2-х
  113. 26. Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) Регуляторные субъединичные взаимодействия протеасомы 26S, сложная проблема. Тенденции Biochem Sci 25: 83 – 88. pmid: 10664589 doi: 10.1016 / s0968-0004 (99) 01529-7
  114. 27. фон дер Лер Н., Йоханссон С., Ларсон Л.Г. (2003) Влияние системы убиквитин / протеасома в myc-регулируемой транскрипции. Клеточный цикл 2 – 5: 403 – 407. doi: 10.4161 / cc.2.5.484
  115. 28. Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Убиквитин и протеасомы в транскрипции. Annu Rev Biochem 81: 177 – 201. doi: 10.1146 / annurev-biochem-052110-120012. PMID: 22404630
  116. 29. Коллинз Г.А., Tansey WP (2006) Протеасома: утилита для транскрипции? Curr Op Genet Dev 16: 197 – 202. PMID: 16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) Идентификация филогенетически консервативного члена семейства Sug1 CAD, который дифференциально экспрессируется в нервной системе мышей. Дев Neurobiol 33: 877–890. DOI: 10.1002 / (sici) 1097-4695 (199712) 33: 7 <877 :: aid-neu2> 3.0.co; 2-5