J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.
Ulery PG, Руденко Г., Nestler EJ.
Источник
Отделение психиатрии, Центр базовой нейронауки, Юго-западный медицинский центр Университета Техаса, Даллас, Техас 75390-9070, США.
Абстрактные
Фактор транскрипции DeltaFosB (также называемый FosB2 или FosB [короткая форма]) является важным медиатором долговременной пластичности, индуцированной в мозге хроническим воздействием нескольких типов психоактивных стимулов, включая наркотики злоупотребления, стресса и электросудорожных припадков , Отличительной особенностью DeltaFosB является то, что после индуцирования она сохраняется в головном мозге в течение относительно длительных периодов времени в отсутствие дальнейшей стимуляции. Однако механизмы, лежащие в основе этой очевидной стабильности, остались неизвестными. Здесь мы демонстрируем, что DeltaFosB является относительно стабильным транскрипционным фактором с периодом полураспада приблизительно 10 h в культуре клеток. Кроме того, мы показываем, что DeltaFosB является фосфопротеином в головном мозге и что фосфорилирование высококонсервативного серинового остатка (Ser27) в DeltaFosB защищает его от протеасомной деградации. Мы приводим несколько строк, свидетельствующих о том, что это фосфорилирование опосредуется казеиновой киназой 2. Эти данные являются первым доказательством того, что DeltaFosB фосфорилируется и демонстрирует, что фосфорилирование способствует его стабильности, что лежит в основе его способности опосредовать длительные адаптации в головном мозге.
Введение
Фактор транскрипции ΔFosB, также обозначенный FosB2 или FosB [короткая форма], представляет собой C-концевой вариант сплайсинга немедленного раннего гена fosb (Dobrazanski et al., 1991; Накабеппу и Натанс, 1991; Yen и др., 1991). Подобно полноразмерному FosB, ΔFosB имеет ДНК-связывающий основной домен и лейциновую молнию, через которую он димеризуется с белками Jun с образованием комплексов транскрипционных факторов активатора белка-1 (AP-1), которые регулируют экспрессию многих генов (Морган и Курран, 1995; Рыльски и Качмарек, 2004). Несмотря на отсутствие части области трансактивации, обнаруженной на C-конце FosB, ΔFosB функционирует как мощный активатор транскрипции и репрессор в культивируемых клетках и в мозге (Dobrazanski et al., 1991; Накабеппу и Натанс, 1991; Chen et al., 1997; McClung и Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).
ΔFosB индуцируется на высоких уровнях специфичным для региона образом в головном мозге после хронического, но не острого воздействия различных психоактивных стимулов, включая стресс, определенные поражения, антипсихотические и антидепрессанты, наркотики злоупотребления и естественные награды (Hope и др., 1994b; Hiroi и Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing и др., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme и др., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Peakman и др., 2003; Perrotti et al., 2004; Zachariou et al., 2006). Индукция ΔFosB непосредственно связана с функциональными эффектами некоторых из этих стимулов на мозг. Сохранение ΔFosB даже при отсутствии дополнительной стимуляции отличает его от всех других факторов транскрипции семейства Fos, которые быстро индуцируются в ответ на острые стимулы, распадаются до базальных уровней в течение нескольких часов и обычно проявляют десенсибилизацию после хронической стимуляции (Хоуп и др., 1992; Daunais и др., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi и Graybiel, 1996; Perrotti et al., 2004). Это делает ΔFosB привлекательным кандидатом для опосредования некоторых длительных изменений в экспрессии генов, которые лежат в основе стабильных нейронных адаптаций, вызванных некоторыми хроническими раздражителями.
Поскольку длительное присутствие ΔFosB происходит в отсутствие дальнейшей индукции его мРНК (Chen et al., 1995), мы предположили, что, в отличие от полноразмерных FosB и всех других белков семейства Fos, которые являются внутренне неустойчивыми, ΔFosB может быть необычно стабильным транскрипционным фактором (Hope и др., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001; McClung и др., 2004). Более того, иммуноблоттинг-анализ острой или хронической стимулированной ткани мозга предполагал, что ΔFosB сдвигается в явном виде Mr (молекулярная масса) от ~33 кДа в остром состоянии до ~35-37 кДа во время хронического лечения (Хоуп и др., 1994a; Chen et al., 1995). Поскольку нет доказательств существования дополнительных мРНК, которые могут кодироваться для этих различных изоформ, мы далее предположили, что ΔFosB посттрансляционно модифицирован и что, возможно, это способствует его необычной стабильности. Однако на сегодняшний день не было представлено никаких биохимических анализов оборота или посттрансляционных модификаций ΔFosB. Целью настоящего исследования было определить, является ли ΔFosB фосфопротеином и зависит ли его фосфорилирование от его стабильности.
Предыдущий разделСледующий раздел
Материалы и методы
Клеточные линии млекопитающих и конструкции ДНК.
Клетки PC12 (Clontech, Mountainview, CA) культивировали в DMEM с высоким содержанием глюкозы, содержащей l-глутамин (L-Gln), и дополняли 5% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 10% лошадиной сывороткой (как из Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 U / ml пенициллин и 100 мкг / мл стрептомицина (оба из Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Клетки HeLa (American Type Culture Collection, Manassas, VA) культивировали в DMEM с высоким содержанием глюкозы, содержащей L-Gln, и дополняли 10% FBS, пенициллином и стрептомицином. Обе клеточные линии поддерживались при 37 ° C во влажном 5% CO2 Атмосфера.
Для переходных трансфекций с ДНК клетки PC12 или HeLa высевали на 6-луночные планшеты (покрывали коллагеном I для клеток PC12), чтобы на следующий день достичь слияния 90-100% и затем трансфицировали с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen). В некоторых экспериментах (см. Рис. 1⇓⇓⇓⇓⇓–7), ΔFosB временно экспрессировали в клетках PC12 путем заражения рекомбинантным вирусом простого герпеса (HSV).
ΔFosB и FosB кДНК были получены из наших собственных pTetop-конструкций (Chen et al., 1997) и субклонируют в вектор pcDNA3.1 (Invitrogen). Эти конструкции pcDNA3.1-ΔFosB / FosB использовали для экспрессии в клетках млекопитающих и в качестве матрицы для сайт-направленного мутагенеза. Рекомбинантный HSV-ΔFosB получали, как описано ранее (Neve et al., 1997), и у препарата был титр ~1 × 108 БОЙ / мл.
Эксперименты с импульсной цепью.
Приблизительно через 24 h после заражения / трансфекции клетки (PC12 или HeLa) в шестиходовых планшетах промывали два-три раза 2 мл PBS и инкубировали при 37 ° C в течение ~1 ч в 2 мл Cys / Met-free DMEM (Invitrogen), дополненную 5% диализованной FBS (Hyclone, Logan, UT), чтобы истощить внутриклеточные пулы Met и Cys. В конце этого периода «голодания» добавляли препараты (если клетки обрабатывались), а клетки были помечены (импульсом) с помощью 12-25 μCi 35S Промежуточная смесь для маркировки (PerkinElmer, Wellesley, MA) для ~1 h в 37 ° C для маркировки всех вновь синтезированных белков. Затем радиоактивную метку удаляли промывкой клеток два-три раза 2 мл PBS, и 35S-меченые белки следовали (преследовали) путем замены среды на «холодную» (нерадиоактивную) среду, дополненную 5% FBS, и сбор клеток в различные моменты времени. Обработки клеток поддерживались во время погони. Все цифры этих экспериментов показывают сходные начальные количества различных белков для оптимизации сопоставления их скоростей оборота.
Животные и лечение хронического электросудорожного захвата.
Взрослые крысы Sprague Dawley (200-300, Charles River Laboratories, Kingston, RI) обрабатывали один раз в день электросудорожными судорогами (ECS) для 7-9 d. ECS выполняли, как описано ранее (Хоуп и др., 1994a), используя Уго Базиль (Comerio VA, Италия) Блок ECS со следующими настройками: частота, импульсы 100 / с; импульс с, 0.5 мс; длительность удара, 1.0 s; и тока, 75 мА. Животных контрольных животных обрабатывали параллельно, применяя электроды для ушных вкладышей без какого-либо электрического тока.
32 P метаболическая маркировка.
Для маркировки срезов головного мозга крыс обезглавливали, мозг быстро рассекали, а лобные корковые фрагменты 300 μm были приготовлены с помощью микроселектора DSK (Ted Pella, Redding, CA). Кусочки инкубировали внутри пластиковых трубок в 2 мл фосфат-дефицитного искусственного CSF (ACSF) и поддерживали при 30 ° C при постоянном негласном барботировании с O2/ CO2 смесь (Hemmings и др., 1989). Срезы (два среза на пробирку) были помечены 1.3 mCi для 8-10 h в присутствии или в отсутствие одадовой кислоты (100 нг / мл). В конце этой инкубации срезы промывали по меньшей мере три раза холодным ACSF и затем гомогенизировали путем обработки ультразвуком в 250 мкл буфера для анализа холодного радиоиммунопреципитации (RIPA) [PBS, pH 7.4, 150 мм NaCl, 1% (об. / Об.) ) Igepal, 0.5% (мас. / Об.) Дезоксихолат натрия, 0.1% (мас. / Об.) SDS, 1 мм EDTA] до применения с SDS до 0.6%, коктейль ингибитора протеазы для клеток млекопитающих (используется в количестве 5 мкл / мл; Sigma-Aldrich), коктейли ингибитора фосфатазы I и II (используемые в 1: 100, Sigma-Aldrich), 1 мм PMSF и 2% глицерина. Гомогенаты затем кипятили в течение 15 мин и очищали центрифугированием при 15,000 × g для 15 мин. Концентрацию белка в полученных супернатантах оценивали с использованием анализа белка BCA (Pierce, Holmdel, NJ).
Для того, чтобы получить 32P мечения культивируемых клеток, ~24 h после заражения / трансфекции, клетки промывали два-три раза без фосфатной средой и инкубировали в этой среде в течение ~1 ч. После этого периода голодания 0.2-0.3 mCi 32PH3PO4 (PerkinElmer) добавляли в каждую лунку, и клетки были помечены для 4-12 h в зависимости от типа эксперимента (см. рис. 1-7 для спецификаций). Затем клетки трижды промывали PBS и лизировали на льду для 15 мин с помощью 50 мкл добавленного RIPA-буфера. Лизаты собирали скребками и пропускали через 10 раз через иглу 25 ga для сдвига ДНК, кипятили в течение 10 мин и центрифугировали при 15,000 об / мин для 15-30 мин при 4 ° C. Очищенные лизаты (супернатанты) переносили в новую пробирку и проводили анализ белка BCA (Pierce). Все фигуры этих экспериментов показывают сходное количество общего белка дикого типа (WT) и S27A ΔFosB для оптимизации сравнений их относительных уровней фосфорилирования.
Химические и клеточные культуры.
Окадаиновую кислоту (OA, Sigma-Aldrich) растворяли в этаноле и использовали при конечной концентрации 100 нг / мл. 5,6-Dichloro-1-β-d-рибофуранозил-бензимидазол (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО, Sigma-Aldrich) и использовали в культуре клеток при конечной концентрации 50 мкм. Спермин (Sigma-Aldrich) растворяли в воде и использовали при конечной концентрации 200 мкм. Calphostin-C (Biomol) растворяли в ДМСО и использовали в 0.2 мкм, тогда как фосфор 12-миристат 13-ацетат (PMA; Promega, Madison, WI) растворяли в ДМСО и использовали при 0.1 мкм. связанный с миристолитом-автокаммидом-2 ингибирующий пептид (m-AIP, Biomol) растворяли в воде и использовали при конечной концентрации 1 и 10 мкм. Ингибиторы белковой киназы широкого спектра действия H-7 и H-8 (Biomol) растворяли в воде и использовали при конечной концентрации 150 и 200 мкм соответственно. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) и эпоксимицин (Peptides International, Louisville, KY) растворяли в ДМСО и использовали при конечной концентрации 12.5 и 7.5 мкм соответственно. Во всех экспериментах ДМСО (носитель) добавляли к клеткам по мере необходимости, чтобы поддерживать постоянное количество ДМСО во время лечения. За 32P, эти препараты добавляли непосредственно перед этикеткой и выдерживали в течение оставшегося периода маркировки. Для экспериментов с импульсной погодой препараты добавляли во время «голодания» Cys / Met, выдерживали через период маркировки, а затем добавляли обратно в среду преследования. Ингибиторы протеасомы были пронизаны каждый 3-4 h во время погони, чтобы компенсировать быстрый оборот этих пептидов.
ΔFosB иммунопреципитация, иммуноблоттинг и авторадиография.
Для иммунопреципитаций лизаты разбавляли 1: 5 равным RIPA, чтобы довести концентрацию SDS до 0.1%, прежде чем продолжать иммунопреципитацию (IP). Чтобы ограничить неспецифическое связывание, лизаты сначала очищали иммунопреципитацией неиммунным IgG и белком G-Sepharose (Sigma-Aldrich) по меньшей мере на 4 h. Затем ΔFosB иммунопреципитировали из очищенных лизатов с использованием козьего поликлонального антитела, которое распознает внутренний эпитоп, присутствующий как в FosB, так и в FosB (SC-48G, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) при 0.5-1 мкг IgG на 10 мкг белка лизата (50-300 мкг общего белка) в общем объеме 0.5 мл. IP осторожно смешивали при 4 ° C на роторе по меньшей мере на 8 h, а затем добавляли 15 мкл белка G-сефарозы и IP смешивали, по меньшей мере, в течение еще одного 4 h. IP подвергали гранулированию путем вращения в 3000 × g для 3-5 мин при 4 ° C три раза промывали 0.5 мл холодной простой RIPA и два раза холодным PBS, содержащим 0.1% Tween 20. IP затем ресуспендировали в 0.5 мл холодного PBS, переносили, гранулировали в новую пробирку, и иммунопреципитированные белки затем элюировали добавлением 15-25 мкл 2 ×, уменьшающего буферный образец белка Laemmli. Этот протокол IP привел к конкретному и эффективному выпадению практически всех ΔFosB в лизате. Иммунопреципитированные белки подвергали SDS-PAGE путем загрузки всего IP на гель Critision Tris-HCl 12.5% (Bio-Rad, Hercules, CA) и затем переносили на PVDF или нитроцеллюлозу. После переноса мембрану высушивали на воздухе и 32P- и 35S-радиоактивно меченые полосы белка наблюдались с помощью авторадиографии с использованием авторадиографической пленки Kodak (Rochester, NY), а также путем фосфорирования с использованием PhosphorImager Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Общее (нефосфорилированное и фосфорилированное) ΔFosB в клеточных лизатах или гомогенатах головного мозга было обнаружено путем иммуноблоттинга либо иммунопреципитированного белка (с использованием той же самой мембраны, 32P-меченый белок) или равных количеств белка лизата / гомогената, подвергнутого SDS-PAGE, и переносили на PVDF или нитроцеллюлозу. Мембрану сначала блокировали путем инкубации с обезжиренным сухого молока 1% (мас. / Об.) (Bio-Rad) в PBS, дополненном 0.1% (об. / Об.) Tween 20 (Sigma) для 1 h при 25 ° C. Затем мембрану иммуноблоттировали в течение ночи при 4 ° C с помощью нашего собственного поликлонального антитела против FosB кролика, полученного против аминокислот 1-16 FosB / ΔFosB (используемого в 1: 10,000). После первичной инкубации мембраны промывали четыре раза для 5 мин блокирующим буфером и затем инкубировали при 25 ° C в течение ~1 ч с козьим антикроличьим IgG, конъюгированным с пероксидазой хрена (используемой в 1: 5000 в блокирующем буфере, из Vector Лаборатории, Бурлингейм, Калифорния). Мембраны затем промывали три раза для 10 мин блокирующим буфером и один раз для 5 мин с PBS. Суммарные полосы белка ΔFosB визуализировали на пленке Kodak MR с помощью улучшенной хемилюминесценции (Pierce) и / или путем детектирования флуоресценции с использованием реагентов ECL-Plus (Amersham Biosciences) и Storm PhosphorImager.
Сверхэкспрессия и очистка рекомбинантного ΔFosB от клеток насекомых.
ΔFosB был сверхэкспрессирован в клетках насекомых Sf9 в виде белка N-His (6) ΔFosB N-His (2) ΔFosB) с использованием системы экспрессии бакуловируса Bac-to-Bac (Invitrogen) и в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, кДНК ΔFosB (остатки 237-1), которым предшествует аффинная N-концевая метка MGHHHHHHAG, субклонировали в векторе pFASTBacTM9, который использовался для генерации рекомбинантного бакуловируса. Клетки Sf6 были инфицированы рекомбинантным вирусом, а N-His (XNUMX) ΔFosB очищали из клеточных лизатов с помощью нескольких хроматографических стадий, включая аффинную хроматографию с использованием никелевой колонки (Qiagen, Valencia, CA), анионного обмена с использованием колонки моно-Q (Amersham Biosciences) и исключение размера с использованием гель-фильтрационной колонки (Amersham Biosciences).
В пробирке фосфорилирования.
В пробирке реакции фосфорилирования для временного и стехиометрического анализа проводили в объеме 30 мкл, содержащего субстрат 10 мкм (N-His (6) ΔFosB или положительный контрольный субстрат), 250 μm ATP и 1 μCi / μl [γ-32P] ATP, буфер, подаваемый производителем киназы, и одну из следующих киназ: CK2 (20 ng / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / мкл, Upstate), PKC (1.6 ng / мкл; Calbiochem) или p70S6K (2.5 mU / мкл, Upstate). Реакции временного курса проводили путем удаления XIUMX мкл аликвот из реакционного раствора в назначенные моменты времени и добавления равного объема 5 ×, уменьшающего буферный образец белков Lemmli. Кинетические параметры Михаэлиса-Ментена для реакции CK4 определялись в эмпирически определенных линейных стационарных условиях. Эти реакции проводили для 2 min в объеме 15 мкл, содержащем фермент 10 ng / μl, 2 μm ATP, 250 μCi / μl [γ-32P] ATP и N-His (6) ΔFosB в диапазоне от 2.5-30 мкм. Все реакции проводили при 30 ° C на водяной бане. После SDS-PAGE и окрашивания гелем Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad) гель сушат и 32Индуцирование P-фосфата оценивали с помощью анализа фосфорирования (см. Ниже, количественная оценка данных, расчеты и статистика).
Двумерная карта фосфопептида и анализ фосфоаминокислот.
Оба этих анализа были выполнены, как описано в Ploegh и Dunn (2000), Вкратце, сухие фрагменты геля, содержащие 32P-меченый ΔFosB (либо из в пробирке реакции или из иммунопреципитатов метаболически меченых клеток), были вырезаны, регидратированы, промыты и подвергнуты трипсическому расщеплению. Супернатант, содержащий продукты триптического расщепления, лиофилизировали и лиофилат промывали несколько раз и ресуспендировали в 10 мкл буфера для электрофореза, pH 1.9. Образец (3 мкл) был замечен на тонкослойной хроматографии целлюлозы (TLC) (Analtech, Newark, DE) и разделен в одном измерении электрофорезом, а другой размер - по восходящей ТСХ. Полученные карты фосфопептидов визуализировали с помощью авторадиографии и фосфорирования. Для анализа фосфоаминокислот 2 мкл триптических дайджестов, которые были ресуспендированы в буфере для электрофореза, дополнительно расщепляли гидролизом HCl при 105 ° C для 25 min в 3 m HCl при N2 атмосфера. Реакцию останавливали путем шестикратного разбавления в воде и смесь лиофилизировали. Лиофилат ресуспендировали в 5 мкл буфера для электрофореза, pH 1.9 и определяли на пластинке ТСХ целлюлозы вместе с стандартами фосфо-Ser, -Thr и -Tyr. Электрофорез выполняли над половиной длины пластины ТСХ с использованием буфера для электрофореза, pH 1.9, а затем планшет переносили в буфер pH 3.5 и довод т электрофорез. Стандарты фосфоаминокислот визуализировали путем распыления пластины ТСХ раствором 1% (об. / Об.) Нингидрина в ацетоне и 32P-меченые образцы аминокислот визуализировались как с помощью авторадиографии, так и с фосфорированием.
вызванный siRNA CK2α.
Мы использовали метод интерференции РНК для выборочного снижения уровней CK2 (Di Maira et al., 2005). Клетки PC12 высевали на 6-луночные планшеты с коллагеном I с покрытием, чтобы достичь сходимости ~70-80% на следующий день, когда они были временно трансфицированы 20 нм (конечная концентрация) либо неаргирующей siRNA, либо siRNA, направленной к мРНК каталитического α субъединицы Rat CK2, используя 5 мкл трансфекционного агента SilentFectin (Bio-Rad) и следуя инструкциям производителя. Примерно через 24 h клетки временно трансфицировали плазмидой ΔFosB, как указано выше. Примерно через 24 h (~48 h после трансфекции siRNA) клетки подвергались либо 32P метаболической маркировки или анализа пульсовой чести, как описано выше. Следующие четыре CK2α миРНК были использованы с аналогичными результатами: 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ', 5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3', 5'P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3 ', 5'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3' (Dharmacon, Lafayette, CO). В качестве отрицательного контроля мы использовали Глушитель отрицательный контроль # 3 siRNA от Ambion (Austin, TX). Степень затухания CK2 контролировали путем иммуноблоттинга с использованием поликлонального антитела против CK2 (каталог # 06-873 от Upstate) в течение ночи при разведении 1: 1000. β-тубулин использовали в качестве контроля загрузки и детектировали моноклональным антителом (каталог # 05-661 от Upstate) в течение ночи при разбавлении 1: 20,000.
Сайт-направленный мутагенез.
Мутацию Ser27 в Ala или Asp осуществляли с использованием набора Mutagenesis с быстрой заменой сайта (Stratagene, La Jolla, CA) и следуя инструкциям производителя. Для введения мутаций Ser27 в белок ΔFosB мыши использовали следующие праймеры мутагенеза. Ser27 to Ala: (обратный праймер) 5'GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3. Ser27 для Asp (прямой праймер) 5'CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3. Мутированные основания выделены жирным шрифтом, а кодон Ser27 выделен курсивом.
Биоинформатика.
Были исследованы потенциальные сайты фосфорилирования и киназы для ΔFosB путем подачи последовательности белка мыши в специализированные базы данных, включая ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004) и NetPhosK (Blom et al., 2004).
Количественная оценка, расчеты и статистика.
Количество белка, присутствующего в PVDF или нитроцеллюлозной мембране, определяли количественно с использованием Storm PhosphorImager и сопутствующего программного обеспечения ImageQuant (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). В исследованиях клеток и исследований фосфорилирования мозговых срезов значения, полученные для 32Р-меченый белок затем делили на значения, полученные для полного ΔFosB, и выражали в виде отношения. в в пробирке фосфорилирования, количество 32P-меченый ΔFosB на моль ΔFosB (стехиометрия) рассчитывали, как описано ранее (Sahin и др., 2004). Все измерения проводились в диапазоне линейности используемого прибора. Кинетические параметры были рассчитаны с использованием модели Михаэлиса-Ментена, согласно которой V = VMax[S] / ([S]+KM) и расширение VMax = k2[EВсего]. Период полураспада (t1/2) ΔFosB и FosB оценивались по графикам чередования импульсов (с использованием нелинейной регрессии, которая наилучшим образом соответствовала точкам данных) и соответствовали времени, в течение которого количество оставшегося белка составляет 50% от оригинала. На всех рисунках результаты показаны как минимум от двух до трех независимых экспериментов. Во всех графиках показаны приведенные данные: средние значения ± SEM (3 ≤ n ≤16). Статистическую значимость различий оценивали с использованием непарного t тест, скорректированный для нескольких сравнений, и звездочки указывают p ≤ 0.05.
Предыдущий разделСледующий раздел
Итоги
ΔFosB - необычно стабильный транскрипционный фактор
Хотя ранее мы предположили, что ΔFosB является относительно стабильным транскрипционным фактором (Nestler et al., 2001), прямой анализ профиля оборота белка до настоящего времени не проводился. Для решения этого вопроса мы провели эксперименты с импульсной цепью с использованием клеток PC12, которые широко использовались в качестве нейроподобной клеточной линии, в которой ΔFosB временно экспрессировался путем инфицирования рекомбинантным вирусом простого герпеса (HSV-ΔFosB). Недавно синтезированные белки были метаболически помечены 35S-Met / Cys, и картина деградации 35S-меченый ΔFosB (35S-ΔFosB) контролировали путем иммунопреципитации его из клеточных лизатов, полученных в различные моменты времени после удаления радиоактивно меченных аминокислот. Анализ иммунопреципитатов с помощью SDS-PAGE и авторадиографии показал, что период полураспада ΔFosB в клетках PC12 составляет ~10 ч (Рис 1). Эти данные показывают, что период полураспада ΔFosB выше, чем у большинства индуцируемых факторов транскрипции (см. Обсуждение), включая полноразмерный FosB, период полувыведения в клеточной культуре которого составляет ~90 мин (Dobrazanski et al., 1991; Carle et al. 2004). Кроме того, стоит отметить, что деградация ΔFosB не соответствует кривой экспоненциального спада первой степени, а скорее двухфазной, начиная с более медленной скорости деградации. Это указывает на существование более чем одного вида ΔFosB и / или более одного пути деградации.
Просмотреть увеличенную версию:
Рисунок 1.
ΔFosB - необычно стабильный фактор транскрипции. Период полураспада ΔFosB составляет ~10 h в культуре клеток. ΔFosB экспрессировали в клетках PC12 путем либо инфицирования HSV-ΔFosB, либо транзиторной трансфекции с помощью плазмиды, содержащей ΔFosB, и клетки подвергали экспериментам с импульсной цепью, как описано в Материалах и методах. Эквивалентные результаты были получены независимо от метода, используемого для сверхэкспрессии ΔFosB. На рисунке показан временной ход (и репрезентативная авторадиограмма) деградации ΔFosB. Приведенные данные представляют собой среднее значение ± SEM по меньшей мере для отдельных точек данных 15, полученных по меньшей мере из пяти независимых экспериментов. Для сравнения указывается период полураспада полноразмерного FosB.
ΔFosB представляет собой фосфопротеин в головном мозге
Мы предположили, что посттрансляционная модификация ΔFosB может способствовать ее кажущейся стабильности. Поскольку показано, что фосфорилирование модулирует активность транскрипционных факторов многими способами, включая их стабильность (для обзора см. Desterro et al., 2000; Уитмарш и Дэвис, 2000), мы исследовали, является ли ΔFosB фосфопротеином. С этой целью экспрессию ΔFosB индуцировали в мозге крысы с использованием хронического ECS, которое, как известно, индуцирует высокие уровни ΔFosB, особенно в лобной коре (Хоуп и др., 1994a). На следующий день после последнего лечения ECS, когда уровни ΔFosB остаются высокими, тонкие лобные кортикальные срезы были приготовлены и метаболически помечены 32P-ортофосфат. Параллельный набор срезов не был радиоактивно меченым, и они были использованы для определения общих уровней ΔFosB. После иммунопреципитации специфическим антителом против FosB / ΔFosB и разделением иммунопреципитированных белков с помощью SDS-PAGE фосфорилировали 32P-меченый ΔFosB был обнаружен с помощью авторадиографии, тогда как общий ΔFosB был обнаружен путем иммуноблоттинга. Этот анализ показал, что ΔFosB фосфорилируется в головном мозге, о чем свидетельствует конкретный 32P-меченая полоса ~35 кДа, присутствующая в хронически обработанных образцах головного мозга, но практически не обнаруживается в обработанных ложью контролях (Рис 2A). Это согласуется с тем фактом, что при отсутствии хронической стимуляции базальные уровни ΔFosB очень низкие. Специфичность реакции иммунопреципитации иллюстрируется отсутствием сигнала в неиммунном осаждении IgG.
Просмотреть увеличенную версию:
Рисунок 2.
ΔFosB представляет собой фосфопротеин в головном мозге. A, ΔFosB фосфорилируется в головном мозге. Эндогенный ΔFosB индуцировали в мозге крысы путем хронической обработки ECS, как описано в материалах и методах. Фронтальные срезы кортикальной области были метаболически помечены 32PH3PO4 в течение нескольких часов. После гомогенизации срезов ΔFosB иммунопреципитировали и фосфорилировали ΔFosB (32P-ΔFosB) была обнаружена с помощью авторадиографии (верхняя панель). Всего ΔFosB в нерадиоактивных иммунопреципитатах было обнаружено иммуноблоттингом (нижняя панель). В качестве отрицательных контролей показан иммунопреципитат фиктивного животного и неиммунного IgG. B, Сайты фосфорилирования кандидатов и киназы с соответствующими показателями предсказания для последовательности белка FOSB мыши были получены биоинформационным анализом. Сайты-кандидаты с более высокими показателями предсказания выделяются в последовательности белка и перечисляются в таблице. ДНК-связывающий (основной) домен и лейцин-молния выделены жирным шрифтом в белковой последовательности. C, D, Фосфорилирование ΔFosB увеличивается с помощью ингибитора Ser / Thr фосфатазы OA. C, 32Уровни P-ΔFosB в иммунопреципитатах из лобных кортикальных срезов, помеченных в отсутствие (Ctr), или присутствие ON (граф и верхняя панель) 100 нг / мл были обнаружены с помощью авторадиографии. Нижняя панель показывает общее ΔFosB, обнаруженное в иммунопреципитатах из немеченых срезов путем иммуноблоттинга. D, Клетки PC12 были инфицированы HSV-ΔFosB или HSV-LacZ (вектор) и метаболически помечены 32PH3PO4 в отсутствие (Ctr) или в присутствии 100 нг / мл ОА. 32Уровни P-ΔFosB в иммунопреципитатах были обнаружены с помощью авторадиографии (график, верхняя панель). Нижняя панель показывает общее ΔFosB, обнаруженное в клеточных лизатах иммуноблоттингом.
В качестве первого шага к выяснению того, какие киназы (ы) и сайт (ы) участвуют в фосфорилировании ΔFosB, мы подвергли его аминокислотную последовательность нескольким биоинформационным анализам. Это показало, что, хотя ΔFosB не содержит сайтов-кандидатов для фосфорилирования тира, он содержит несколько консенсусных сайтов Ser / Thr-киназы, включая три сайта CaMKII, три сайта CK2 и два сайта PKC с очень высокими показателями предсказания фосфорилирования (Рис 2B). Если, как было предсказано с помощью биоинформатики, ΔFosB только фосфорилируется на остатках Ser или Thr, то его фосфорилирование должно быть значительно модулировано активностью Ser / Thr фосфатаз. Чтобы проверить эту гипотезу, мы обозначили лобные корковые срезы 32Р-ортофосфат в присутствии или в отсутствие ОА, ингибитора ферментной фосфатазы Ser / Thr. Как показано в Рисунок 2C, OA вызвало увеличение (~2.5-fold) увеличения 32P-ΔFosB. Это также вызвало небольшое увеличение общих уровней ΔFosB, что согласуется с предыдущими сообщениями, связывающими канцерогенные эффекты ОА с его способностью индуцировать несколько немедленных ранних генов, включая белки Fos (Miller и др., 1998; Choe и др., 2004). Конечным результатом является значительное увеличение (~60%) в фосфорилированных уровнях ΔFosB.
Затем мы исследовали, что в клетках PC12, которые более поддаются экспериментальной манипуляции, ΔFosB показал картину фосфорилирования, аналогичную той, что наблюдалась в мозге. Мы выражали ΔFosB в клетках PC12 путем инфицирования HSV-ΔFosB и метаболически мечеными клетками 32Р-ортофосфат в присутствии или отсутствии ОА. Успешная экспрессия и иммунопреципитация белка из инфицированных HSV-ΔFosB клеток показана наличием как в иммуноблоте (Рис 2D, нижняя панель) и авторадиограф (верхняя панель) диапазона ~35 кДа, отсутствующий в клетках, инфицированных вектором. Как наблюдалось в головном мозге, ОА вызывало небольшое увеличение общих уровней ΔFosB, но гораздо более высокое (приблизительно в два раза) увеличение 32P-ΔFosB, что привело к значительным (~50%) чистым приростом фосфорилирования ΔFosB. Кроме того, в соответствии с предсказаниями биоинформатики обработка клеток PC12 ингибитором тира фосфатазы не приводила к значительным изменениям в 32Уровни P-ΔFosB (данные не показаны). Вместе эти данные показали, что ΔFosB фосфорилируется на остатках Ser и / или Thr в головном мозге и в клетках PC12 и подтвердил, что последний является хорошей клеточной культуральной системой, в которой можно дополнительно изучить профили фосфорилирования и деградации ΔFosB.
CK2, но не PKC или CaMKII фосфорилируют ΔFosB в пробирке
Как описано выше, анализ аминокислотной последовательности ΔFosB показал высокие оценки предсказания для сайтов фосфорилирования CK2, PKC и CaMKII. Чтобы определить, какая из этих киназ может фосфорилировать ΔFosB, мы провели серию в пробирке фосфорилирования с использованием очищенных киназ и очищенного рекомбинантного ΔFosB. Как показано в Рисунок 3A, из трех кандидатов киназ, только CK2 фосфорилированный ΔFosB значительным образом. Кроме того, было проверено несколько других киназ (например, GSK3 и p70S6K), но не удалось значительно фосфорилировать ΔFosB (данные не показаны). Дополнительная характеристика реакции CK2 путем анализа временного курса показала, что эта киназа может катализировать включение ~0.5 моль фосфата на моль ΔFosB (Рис 3B). Тот факт, что CK2 может фосфорилировать ΔFosB в пробирке к значительной стехиометрии (~50%) наводит на мысль о физиологически релевантной реакции. Затем мы изучили кинетику этой реакции путем инкубации CK2 в присутствии возрастающих количеств очищенного ΔFosB, и мы определили, что CK2 фосфорилирует ΔFosB с VМакс от 5.8 пмоль · мин-1 · Мкг-1 фермента, KM от 18.4 μm и kкошка от 0.2 / s (Рис 3C). Значения, полученные для этих кинетических параметров, еще больше подтверждают физиологическую значимость этой реакции. Например, KM CK2 для DARPP32, одного из его наиболее известных подложек, - 3.4 мкм, а kкошка ~0.3 / s (Girault и др., 1989); KM для диапазонов ATP от ~10-40 мкм (Cochet et al., 1983; Silva-Neto и др., 2002), а для казеина - от ~10-50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin и др., 1987). Вместе эти данные показывают, что ΔFosB является добросовестным субстратом для CK2 в пробирке.
Просмотреть увеличенную версию:
Рисунок 3.
CK2, но не PKC или CaMKII фосфорилируют ΔFosB в пробирке, В авторадиографе (верхняя панель) показан фосфорилированный продукт, а гель с окрашенной кумасси (нижняя панель) показывает общее количество ΔFosB, присутствующее в реакции. A, Очищенный рекомбинантный ΔFosB подвергали в пробирке фосфорилирование различными киназами-кандидатами (три из которых показаны). B, Курс времени и стехиометрический анализ показывают, что CK2 может фосфорилировать ΔFosB в пробирке с стехиометрией ~50%. C, Кинетический анализ реакции CK2 показал, что ΔFosB является добросовестным в пробирке субстрат. Линеаризация реакции показана в двойном обратном графике (дно), но кинетические параметры были получены из кривой Михаэлиса-Ментена (сверху).
CK2 модулирует фосфорилирование и стабильность ΔFosB в интактных клетках
Для оценки физиологической значимости опосредованного CK2 фосфорилирования ΔFosB мы провели сравнительное картирование фосфопептидов, используя в пробирке фосфорилированный и PC12-клетка-фосфорилированный ΔFosB. После SDS-PAGE и гель-элюирования 32P-ΔFosB (из в пробирке реакции или из иммунопреципитата 32P-меченых клеток) белок расщепляли трипсином, и полученные фосфопептиды подвергали двумерному разделению. Этот анализ показал, что основной фосфопептид из реакции CK2 объединяется с одним из двух основных фосфопептидов из ΔFosB, фосфорилированных в клетках PC12 (Рис 4A), тогда как фосфопептиды, полученные в результате реакции PKC или CaMKII (данные не показаны), не имели. Был обнаружен второй фосфопептид ΔFosB, присутствующий на карте из клеток PC12, но из-за неспособности какой-либо из киназ, которые мы тестировали, для получения аналогичного фосфопептида в пробирке, мы не знаем, действительно ли этот второй фосфопептид содержит сайт фосфорилирования, отличный от другого фосфопептида, или он представляет собой отдельный триптический пептид, содержащий тот же сайт фосфорилирования.
Просмотреть увеличенную версию:
Рисунок 4.
CK2 модулирует фосфорилирование и стабильность ΔFosB в интактных клетках. A, CK2, но не PKC, по-видимому, фосфорилирует ΔFosB в клетках. Двумерные фосфопептидные карты ΔFosB, фосфорилированные CK2 или PKC в пробирке или интактными клетками PC12. Стрелки показывают перемещение CK2-фосфорилированного пептида, но не PKC-фосфорилированного с одним из фосфопептидов ΔFosB, полученных из клеток PC12. B, Фосфорилирование ΔFosB в клетках PC12 увеличивается путем обработки клеток активным спермином CK2 (SP) и снижается путем лечения ингибитором CK2 DRB. Напротив, фосфорилирование ΔFosB в клетках PC12 не влияло на лечение либо активатором PKC (PMA), либо ингибитором PKC-специфического кальфостина-C (Calph). Показана репрезентативная авторадиограмма (верхняя панель) и иммуноблот (нижняя панель). C-F-, Влияние активности CK2 на стабильность ΔFosB. Цифры показывают временной ход (и репрезентативную авторадиограмму) деградации ΔFosB. Клетки PC12, временно экспрессирующие ΔFosB, подвергали импульсным экспериментам, проводимым в отсутствие или присутствии ингибитора CK2 DRB (C), активатор CK2-спермина (D), или ингибитор киназы широкого спектра H-8 (E), который использовался для контроля неспецифических эффектов DRB. F, Влияние срыва каталитической субъединицы CK2 на стабильность ΔFosB. Клетки PC12 трансфицировали либо безнаправленной siRNA (Ctr), либо siRNA-нацеливающей крысой CK2α и 24 h, позднее трансфицированной плазмидой ΔFosB. На верхней панели изображены иммуноблоты цельноклеточных лизатов, показывающие эффект сикхины CK2 на уровни белка CK2 и ΔFosB. Соответствующий иммуноблот для β-тубулина показан как контроль загрузки.
Для дальнейшего рассмотрения физиологической значимости CK2 в качестве киназы ΔFosB мы обработали клетки, содержащие FOSB PC12, двумя препаратами, которые модулируют активность CK2. Как показано в Рисунок 4B, Фосфорилирование ΔFosB было уменьшено путем обработки клеток PC12 клетопроницаемым ингибитором CK2 DRB (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995) и увеличивают путем обработки полиаминовым спермином, который, как известно, является мощным активатором CK2 (Кочет и Чамбаз, 1983; Meggio et al., 1983). Напротив, лечение клеток PC12 ингибитором PKC - кальфостин-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) или активатор PKC PMA (Шмидт и Хеккер, 1975; Beh и др., 1989) не привело к значительным изменениям фосфорилирования ΔFosB. В случае PMA небольшое (и незначительное) увеличение 32P-ΔFosB можно было бы объяснить увеличением общих уровней ΔFosB, вызванных этим препаратом; на самом деле, было сообщено, что эфиры форбола вызывают экспрессию нескольких белков семейства Fos, включая FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Кроме того, обработка клеток специфическим клетопроницаемым ингибитором CaMKII m-AIP (Ишида и Фуджисава, 1995; Стивенс и др., 1999) также не приводило к уменьшению фосфорилирования ΔFosB (данные не показаны). Эти результаты согласуются с нашими в пробирке и показывают, что в интактных клетках ΔFosB, вероятно, фосфорилируется CK2, но не PKC или CaMKII. Тот факт, что ингибирование CK2 не полностью предотвращает фосфорилирование ΔFosB, указывает на наличие дополнительных сайтов фосфорилирования в белке.
Далее мы рассмотрели, играет ли CK2 роль в обороте ΔFosB и тем самым в его стабильности. С этой целью мы провели эксперименты с импульсной цепью с использованием экспрессирующих FOSB клеток PC12, обработанных либо ингибитором CK2, либо активатором CK2, используемым в исследовании фосфорилирования. Как показано в Рисунок 4C, лечение клеток ингибитором CK2 DRB оказало значительное влияние на скорость текучести ΔFosB, о чем свидетельствует изменение формы кривой его деградации, от двухфазной к кривой, которая ближе к кривой экспоненциального распада. И наоборот, присутствие спермина активатора CK2 вызвало значительное снижение скорости деградации ΔFosB, что привело к накоплению белка в течение первых часов погони (Рис 4D).
Как и в случае со многими активаторами киназы и ингибиторами, спермин и DRB могут иметь метаболические эффекты вне модуляции активности CK2. Было показано, что DRB ингибирует транскрипционный фактор IIH (TFIIH) -связанной киназы (Yankulov et al., 1995), что приводит к ингибированию транскрипции, опосредуемой РНК-полимеразой II. Поскольку этот эффект может существенно повлиять на стабильность ΔFosB, мы проанализировали влияние ингибитора киназы широкого спектра H-8 (Хидака и Кобаяси, 1992) при обороте ΔFosB при концентрации (200 мкм), которая, как известно, ингибирует TFIIH-ассоциированную киназу, но не CK2 (Yankulov et al., 1995). Как показано в Рисунок 4E, лечение H-8 не влияло на скорость текучести ΔFosB. Аналогичные результаты были получены с H-7, другим ингибитором киназы широкого спектра, используемым при концентрации, которая ингибирует TFIIH-ассоциированную киназу, но не CK2 (данные не показаны). Эти данные также подтверждают интерпретацию того, что снижение стабильности ΔFosB, вызванное DRB, наиболее вероятно связано с ингибированием CK2.
Чтобы далее установить роль CK2 в обороте ΔFosB, мы исследовали последствия сбивания CK2 через siRNA. Мы провели эти эксперименты с использованием клеток PC12, которые были сначала трансфецированы контрольной (неаргирующей) siRNA или siRNA, которая нацелена на мРНК каталитической субъединицы крысиного CK2 (CK2α) и 24 h, позже трансфицированных ΔFosB. Как показано в Рисунок 4F, трансфекция сикрой CK2α эффективно и конкретно сбила уровни белка CK2α, не влияя на уровни ΔFosB (верхняя панель). Анализ Pulse-chase показал, что сбивание CK2 привело к значительному увеличению скорости оборота ΔFosB, о чем свидетельствует более быстрое деградация белка. Тот факт, что ингибирование активности CK2 (будь то с помощью DRB или siRNA) увеличивает оборот ΔFosB и приводит к исчезновению низкоскоростного компонента двухфазной кривой, тогда как активация CK2 увеличивает медленную фазу кривой, обеспечивает сильную поддержку идея о том, что CK2 играет роль в регулировании стабильности ΔFosB.
CK2 фосфорилирует ΔFosB на Ser27
Чтобы начать идентифицировать сайт (ы) на ΔFosB, фосфорилированный CK2, мы провели анализ фосфоаминокислот рекомбинантного ΔFosB, фосфорилированного CK2 в пробирке и ΔFosB, фосфорилированный в клетках PC12. Эти эксперименты показали, что в обоих случаях единственной обнаруженной фосфо-аминокислотой была фосфо-сер (Рис 5A). Это открытие вместе со стехиометрией, полученной для CK2 в пробирке реакция фосфорилирования (~50%) (Рис 3B) и наличие только одного значимого пятна на карте фосфопептида CK2 (Рис 4A), предполагает, что фосфорилирование CK2 ΔFosB, вероятно, ограничивается одним остатком серина. Этот вывод согласуется с анализом консенсусного фосфорилирования (Рис 2B), который предсказал только один кандидат serine, то есть Ser27, для CK2. Таксономический анализ показал, что Ser27 высококонсервативно эволюционирует среди членов семейства Fos (Рис 5B), предполагая, что он может иметь важную физиологическую функцию.
Просмотреть увеличенную версию:
Рисунок 5.
CK2 Фосфорилаты ΔFosB на Ser27. A, Фосфоаминокислотный анализ CK2-фосфорилированного (в пробирке) и PC12-фосфорилированный ΔFosB, показывающий, что в обоих случаях основным остатком, фосфорилированным, является серин. B, Кросс-видовой анализ аминокислотной последовательности FosB / ΔFosB показал высокую сохранность Ser27 среди членов семейства Fos от человека до рыбок данио (темная подсветка). Однако кислотный остаток в положении + 3, который требуется для сайта консенсуса CK2, не сохраняется (светлый свет). C, Клетки HeLa транзиторно трансфицировали либо ΔFosB (WT) дикого типа, либо ΔFosB, содержащие точечную мутацию, чтобы заменить Ser27 на Ala (S27A). Клетки метаболически помечены 32PH3PO4 и обрабатывали транспортным средством или спермином (SP) для активации CK2. Показана репрезентативная авторадиограмма (верхняя панель) и иммуноблот (нижняя панель) полученных иммунопреципитатов FOSB. Показан иммунопреципитат ложнотрансфицированных клеток (вектор).
Чтобы определить, фосфорилирован ли Ser27 в ΔFosB, мы мутировали этот остаток в Ala и проанализировали последствия для статуса фосфорилирования белка. С этой целью мы использовали клетки HeLa (которые можно трансфицировать с более высокой эффективностью), чтобы временно экспрессировать мутант WT или S27A ΔFosB. Приблизительно 24 h после трансфекции клетки были метаболически помечены 32P-ортофосфат и цельноклеточные лизаты. После иммунопреципитации и SDS-PAGE, 32P-ΔFosB детектировали с помощью авторадиографии и общего ΔFosB путем иммуноблоттинга. Как показано в Рисунок 5C (нижняя панель), ΔFosB не был обнаружен в клетках, трансфицированных вектором, тогда как клетки, трансфецированные либо WT, либо S27A-мутантом ΔFosB, успешно экспрессировали белок. Мы обнаружили, что мутация S27A вызвала значительное (~30%) снижение 32Уровни P-ΔFosB (Рис 5C, верхняя панель и график), что указывает на то, что в живых клетках ΔFosB фосфорилируется на Ser27. Чтобы установить, действительно ли в клетках Ser27 фосфорилируется CK2, мы сравнили способность спермина активатора CK2 модулировать фосфорилирование WT и S27A ΔFosB. Как мы наблюдали ранее в клетках PC12 (Рис 4B), лечение клеток HeLa спермином значительно увеличивало фосфорилирование белка WT. Тот факт, что этот эффект был значительно уменьшен мутацией S27A (Рис 5C) поддерживает интерпретацию, что Ser27 в ΔFosB является физиологическим субстратом для CK2.
Фосфорилирование Ser27 регулирует стабильность ΔFosB
Установив, что стабильность ΔFosB уменьшается, когда CK2 ингибируется и усиливается при активации CK2 (Рис 4) и что CK2 фосфорилирует ΔFosB на Ser27 (Рис 5), мы предсказали, что предотвращение фосфорилирования этого участка должно дестабилизировать белок. Эксперименты с импульсным ходом, проводимые с клетками HeLa, временно экспрессирующими мутант WT или S27A ΔFosB, показали, что, как и было предсказано, мутация S27A приводила к значительному увеличению скорости деградации ΔFosB и сопутствующему уменьшению периода полураспада белка (Рис 6A). Затем мы исследовали, существует ли этот регуляторный механизм и в более нейронной клеточной линии PC12. Эти эксперименты показали, что, как мы наблюдали в клетках HeLa, точечная мутация S27A вызывает резкое уменьшение периода полураспада ΔFosB в клетках PC12 (от ~11 до ~4 h) (Рис 6B). Тот факт, что эта дестабилизация похожа на ту, которая вызвана ингибированием или срывом CK2 (Рис 4) обеспечивает дополнительную поддержку идеи о том, что CK2-опосредованное фосфорилирование Ser27 регулирует стабильность ΔFosB. Дополнительные доказательства регулирующей роли фосфорилирования Ser27 в отношении оборота белка ΔFosB были получены с использованием фосфомиметической Ser27-мутации Asp (S27D). Мутация S27D считается фосфомиметической, поскольку она помещает большую отрицательно заряженную (карбоксильную) группу в аминокислоту 27 и тем самым частично имитирует фосфорилирование Ser27. Как показано в Рисунок 6C, мутация S27D вызывала противоположный эффект мутации S27A и приводила к тому, что белок был значительно более стабильным, чем белок WT. Аналогично эффекту, полученному после активации CK2 (Рис 4D), мутация S27D привела к накоплению и, таким образом, увеличению уровня ΔFosB в течение первых часов погони.
Просмотреть увеличенную версию:
Рисунок 6.
Фосфорилирование Ser27 регулирует стабильность ΔFosB. A, C, Анализ Pulse-chase, показывающий влияние фосфорилирования Ser27 на коэффициент текучести ΔFosB. Показаны профиль деградации и предполагаемый период полураспада дифракционного ΔFosB (WT), мутанта Ser27-Ala (S27A) и фосфомиметического Ser27-мутанта Asp (S27D). Те же результаты были получены в клетках HeLa (A) и PC12 (B, C).
Ser27 фосфорилирование стабилизирует ΔFosB, предотвращая его протеасомную деградацию
Чтобы начать выяснять механизм, посредством которого фосфорилирование Ser27 стабилизирует ΔFosB, мы исследовали способность ингибиторов протеасомы MG132 (Palombella и др., 1994; Tsubuki и др., 1996) и эпоксимицина (Hanada и др., 1992; Ким и др., 1999) для модуляции скорости деградации мутанта WT и S27A ΔFosB. Эксперименты с импульсной цепью проводили с использованием клеток PC12, инфицированных рекомбинантным HSV, экспрессирующим либо WT, либо S27A ΔFosB, и обработанных либо ДМСО, либо одного из двух ингибиторов протеасомы. Эти эксперименты показали, что хотя скорость разложения белка WT относительно нечувствительна к присутствию любого из двух ингибиторов протеасомы (Рис 7A), мутант S27A чувствителен к этим препаратам (Рис 7B). Это указывает на то, что, в отличие от белка WT, мутант S27A является мишенью протеасомной деградации. Действительно, лечение клеток с MG132 или эпоксимицином полностью полностью меняло действие мутации S27A на скорость деградации ΔFosB, о чем свидетельствует увеличение периода полураспада мутанта S27A от ~4 до ~9 h для MG132 и до ~ 12 h для эпоксимицина (Рис 7B). Вместе эти данные показывают, что фосфорилирование ΔFosB на Ser27 защищает белок от протеасомной деградации и поэтому имеет важное значение для его необычной стабильности.
Просмотреть увеличенную версию:
Рисунок 7.
Фосфорилирование Ser27 стабилизирует ΔFosB, предотвращая его протеасомную деградацию. A, B, Анализ Pulse-chase с инфицированными HSV клетками PC12, показывающий профиль деградации и предполагаемый период полураспада ΔFosB дикого типа (A) или S27A ΔFosB (B) в отсутствие или присутствии любого из двух ингибиторов протеасомы [MG132 и эпоксимицина (Epoxo)]. Обратите внимание на тот факт, что ни один препарат не оказывает существенного влияния на оборот ΔFosB дикого типа, тогда как лечение клеток с помощью ингибитора протеасомы приводило к стабилизации S27A ΔFosB. C, Модель для роли фосфорилирования Ser27 в способности ΔFosB опосредовать долговременную пластичность мозга. После индуцирования часть ΔFosB стабилизируется в головном мозге посредством CK2-опосредованного фосфорилирования S27. Это приводит к его накоплению, что, в свою очередь, приводит к длительным изменениям экспрессии генов. Эти стабильные изменения в экспрессии генов способствуют устойчивой поведенческой адаптации. Напротив, дефосфорилирование S27 фосфатазами Ser / Thr PP1 и / или PP2A приводит к дестабилизации белка и его обработке протеосомным механизмом.
Предыдущий разделСледующий раздел
Обсуждение
В настоящем исследовании мы показываем, что ΔFosB имеет период полувыведения ~10 h в культуре клеток, что делает его стабильным по сравнению с полноразмерным FosB и большинством других индуцибельных факторов транскрипции, периоды полураспада которых в клеточной культуре могут быть короткими как несколько минут и редко превышают 3 h (Ханн и Эйзенман, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Робертс и Whitelaw, 1999; Феррара и др., 2003; Хирата и др., 2004). Кроме того, мы обнаруживаем, что ΔFosB фосфорилируется в головном мозге и что его фосфорилирование чувствительно к ингибитору PP1 / PP2A окдаиновой кислоты. Наши исследования клеточной культуры показывают, что стабильность ΔFosB модулируется CK2, с более высокой активностью CK2, стабилизирующей белок. Наконец, наши результаты показывают, что CK2 фосфорилирует ΔFosB на высококонсервативном N-концевом серине (S27) и демонстрирует, что фосфорилирование S27 защищает ΔFosB от протеасомальной деградации. Поэтому мы предлагаем модель, в которой фосфорилирование ΔFosB на S27 CK2 является критическим регулирующим механизмом оборота ΔFosB (Рис 7C). Такая стабилизация фосфорилирования ΔFosB является функционально важной, поскольку показано, что повышенные уровни ΔFosB в определенных областях мозга непосредственно регулируют многочисленные нейронные гены в естественных условиях и оказывать сильное поведенческое действие на животных моделях нескольких нейропсихиатрических расстройств (см. Введение).
Хотя фосфорилирование является быстрым и обратимым способом регуляции транскрипционной активности некоторых факторов транскрипции, таких как CREB (связывающий белок cAMP-связывающего белка) (Боман, 1990), модулируя деградацию факторов транскрипции, обеспечивает еще более мощную (менее легко обратимую) форму регулирования (Desterro et al., 2000). Факторы транскрипции, функциональная активность которых регулируется на уровне их деградации, включают NFκB (Desterro et al., 2000), c-Myc (Sears и др., 1999), и c-Fos (Феррара и др., 2003) и другие. Во многих случаях фосфорилирование является ключевым регулятором стабильности транскрипционного фактора, как показано для c-Fos (Окадзаки и Сагата, 1995; Tsurumi и др., 1995), Fos-родственный антиген-1 (Fra-1) (Vial и Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), c-Jun (Fuchs и др., 1996), JunB (Fuchs и др., 1997), ATF2 (Fuchs и др., 2000) и p53 (Buschmann et al., 2001). Таким образом, наши исследования добавляют ΔFosB к этому списку факторов транскрипции, функциональная активность которых регулируется благодаря своей фосфорилированной зависимой стабильности.
CK2 представляет собой повсеместную и конститутивно активную киназу Ser / Thr, которая имеет> 300 предполагаемых субстратов, идентифицированных на данный момент, и участвует во многих биологических процессах, включая гибель и выживание клеток (Личфилд, 2003; Unger и др., 2004), клеточные стрессовые реакции (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003), и восстановление ДНК и ремоделирование хроматина (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Более трети предполагаемых субстратов CK2 представляют собой белки, участвующие в регуляции экспрессии генов (Meggio и Pinna, 2003). Фактически, CK2, как было показано, является видной ядерной киназой (Krek et al., 1992) (для обзора см. Yu et al., 2001) и взаимодействовать с доменами bZIP нескольких факторов транскрипции (Yamaguchi et al., 1998). Было также показано, что фосфорилирование, опосредованное CK2, модулирует деградацию (либо увеличивая, либо уменьшая ее) многих белков, включая IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Торрес и Пулидо, 2001), коннексин линзы (Yin и др., 2000), хроматин-ассоциированный белок HMG1 (Wisniewski et al., 1999) и несколько факторов транскрипции, таких как HMGB (Stemmer и др., 2002), Myf-5 (Зима и др., 1997) и c-Myc (Чаннавахала и Селдин, 2002). CK2 наиболее распространен в мозге (Alcazar и др., 1988; Girault и др., 1990), и его активность была вовлечена во многие аспекты функции мозга, включая выживаемость нейронов (Boehning и др., 2003), дифференцирование (Nuthall и др., 2004), функция ионного канала (Джонс и Якель, 2003; Bildl и др., 2004), и долгосрочное потенцирование и пластичность нейронов (Диаз-Нидо и др., 1992; Либерман и Моди, 1999; Reikhardt et al., 2003).
Несмотря на это растущее доказательство роли CK2 в регуляции нейронной функции, мало что известно о том, что контролирует его активность. CK2 считается конститутивно активным, с регуляцией его способности фосфорилировать специфические субстраты, в основном опираясь на изменения в его внутриклеточной локализации (например, цитозоль против ядра) (Ахмед и Тауфич, 1994; Yu et al., 1999). Эта информация поднимает важный вопрос о том, какие сигналы необходимы для индуцирования накопления ΔFosB в головном мозге после хронической стимуляции (Рис 7C). Одним из требований является повторная активация fosB ген и индукцию мРНК ΔFosB (Chen et al., 1995). Наши данные показывают, что фосфорилирование CK2 ΔFosB имеет решающее значение для его стабильности, предполагая, что для долгосрочных эффектов ΔFosB на экспрессию гена может потребоваться второй сигнал, а именно сигнал, который стимулирует фосфорилирование белка с помощью CK2. Это может включать активацию CK2 каким-то неизвестным механизмом или его транслокацией в ядро. Альтернативно, фосфорилирование CK2 ΔFosB может быть конститутивным, так что, когда белок ΔFosB трансформируется в ответ на каждый стимул, его часть фосфорилируется и тем самым стабилизируется, так что при повторной стимуляции он накапливается до высоких уровней в затронутых нейронах.
Наши результаты показывают, что CK2 и S27, вероятно, не единственная киназа и сайт, ответственный за фосфорилирование ΔFosB, потому что ни ингибирование CK2, ни мутации S27A не смогли полностью предотвратить фосфорилирование фосфорилирования. Точно так же факт, что мутация S27A приводит к уменьшению 30% фосфо-ΔFosB, утверждает, что S27 является основным сайтом фосфорилирования на белке. Тем не менее мы изучаем другие предполагаемые киназы и сайты фосфорилирования на ΔFosB. В конечном счете, важно также проанализировать фосфорилирование S27 и любых других сайтов фосфорилирования в ΔFosB в головном мозге в естественных условиях после различных типов хронической стимуляции, например, с использованием масс-спектрометрии или фосфоспецифических антител.
Как упоминалось выше, S27 в ΔFosB очень консервативен во всей эволюции и среди других белков семейства Fos. Однако консенсусный сайт для CK2 отсутствует: как показано в Рисунок 5B, только FosB / ΔFosB (и ксенолог Zebrafish), но не c-Fos или Fra-2, обладают кислотным остатком при + 3, ключевом определителе фосфорилирования CK2 (Marin и др., 1986; Meggio et al., 1994). Таким образом, отсутствие фосфорилирования CK2 на S27 может объяснить, почему другие белки семейства Fos не так стабильны, как ΔFosB. Однако это не объясняет, почему полноразмерный FosB, имеющий тот же консенсусный сайт CK2, что и ΔFosB, не стабилизируется аналогично. Мы не знаем, фосфорилируется ли FosB во всей полноте CK2 на этом сохраненном остатке. Единственные отчеты FosB (Skinner et al., 1997) и c-Fos (Окадзаки и Сагата, 1995; Chen et al., 1996) фосфорилирование описывает сайты в С-концевой области этих белков, которые отсутствуют в ΔFosB. Потенциальное фосфорилирование полноразмерных FosB и других белков семейства Fos от CK2 требует непосредственного исследования. Однако, даже если они фосфорилированы, другие белки семейства Fos, как известно, содержат мотивы на своих C-концах, которые нацелены на белки для быстрого разложения (Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre и др., 1997; Acquaviva et al., 2002). Например, было показано, что участок остатков ~21, присутствующих на C-конце всех белков семейства Fos, но отсутствующих в ΔFosB, действует как дестабилизирующий домен для c-Fos (Acquaviva et al., 2001). Мы обнаружили, что хотя эта последовательность аналогично дестабилизирует полноразмерный FosB (Карл и др., 2004), отсутствие этого домена в ΔFosB не полностью объясняет его стабилизацию. Скорее, комбинация отсутствия этого домена C-конца и фосфорилирования Ser27, по-видимому, полностью объясняет примерно пятикратную разницу в стабильности между ΔFosB и FosB.
Хотя деградация белков семейства Fos сложна и не полностью понята, протеасомная деградация, по-видимому, является основным путем (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Феррара и др., 2003). Представленные здесь данные, в которых протеасомные ингибиторы существенно не изменяют скорость деградации ΔFosB, утверждают, что, в отличие от других белков семейства Fos, ΔFosB уклоняется от 26S-протеасомы, и это играет центральную роль в его стабилизации. Поэтому мы предлагаем схему, согласно которой повышенная стабильность ΔFosB обусловлена комбинацией двух основных факторов: (1) отсутствие дестабилизационной области C-терминала и (2) фосфорилирование S27 с помощью CK2.
Таким образом, настоящее исследование обеспечивает механистическое понимание того, почему ΔFosB, продукт немедленного раннего гена fosB, является, в отличие от всех других членов семейства Fos, относительно долгоживущим белком. Хотя считается, что другие белки семейства Fos опосредуют быстрое, но временное связывание стимул-транскрипция (Морган и Курран, 1995), относительная стабильность ΔFosB налагает на него способность опосредовать более длительные транскрипционные изменения, вызванные хронической стимуляцией. Это подтверждает мнение, что ΔFosB функционирует как устойчивый молекулярный переключатель в мозге, постепенно превращая острые реакции в хронические адаптации. Идентификация фосфорилирования Ser27 как центрального механизма устойчивости ΔFosB открывает новые возможности для разработки средств для регулирования функции ΔFosB и тем самым модулирует его долгосрочные эффекты на нейронную и поведенческую пластичность.
Предыдущий разделСледующий раздел
Сноски
- Получено ноябрь 21, 2005.
- Версия была получена в феврале 21, 2006.
- Принят апрель 2, 2006.
- Эта работа была поддержана Национальным альянсом за исследования в области защиты от шизофрении и депрессии Молодой следователь в Национальную исследовательскую службу Национального института по борьбе со злоупотреблением наркотиками (NIDA) в PGU и гранты Национального института психического здоровья и NIDA для EJN We поблагодарить д-ра Джеймса Бибба за помощь в в пробирке фосфорилирования, д-р Минг-Ху Хань за помощь в приготовлении срезов мозга, используемых для метаболической маркировки, и д-р Рахаэль Неве за помощь в упаковке рекомбинантных ВПГ.
- Нынешний адрес Г. Руденко: Институт наук о жизни и факультет фармакологии Мичиганского университета, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
- Переписка должна быть адресована Эрику Дж. Нестлеру, 5323 Harry Hines Boulevard, Даллас, TX 75390-9070. Эл. адрес: [электронная почта защищена]
Рекомендации
Аквавива С, Брокли Ф, Феррара П, Боссис Г, Сальват С, Яриэль-Энконтр I, Пьехачик М (2001) Идентификация С-концевого трипептидного мотива, участвующего в контроле быстрой протеасомной деградации протоонкопротеина c-Fos во время фазового перехода G (0) -to-S. онкоген 20:7563-7572.
Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Несколько путей деградации белков семейства Fos. Ann NY Acad Sci 973:426-434.
Ahmed K, Tawfic S (1994) Механизм внутриклеточной регуляции протеинкиназы CK2: роль опосредованной стимулами субъядерной ассоциации. Cell Mol Biol Res 40:539-545.
Алькасар А, Мартин Э, Лопес-Фандо Дж, Салинас М (1988) Улучшенная процедура очистки и свойства казеинкиназы II из головного мозга. Neurochem Res 13:829-836.
Андерссон М., Вестин Ю.Е., Ценси М.А. (2003) Временной ход стриатальной дельтаФосВ-подобной иммунореактивности и уровни пропинорфина в мРНК после прекращения лечения хроническим дофаминомиметиком. Eur J Neurosci 17:661-666.
Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) Широко распространенные экспрессионные экраны показывают глобальную роль протеинкиназы CK2 в ремоделировании хроматина. J Cell Sci 116:1563-1577.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Beh I, Schmidt R, Hecker E (1989) Два изофермента PKC, обнаруженные в клетках HL-60, показывают разницу в активации с помощью сложного эфира phorbol. FEBS Lett 249:264-266.
Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Протеинкиназа CK2 объединена с небольшими проводящими Ca (2 +) активированными каналами K + и регулирует стробирование канала. Нейрон 43:847-858.
Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Долгосрочная экспрессия Fos-родственного антигена и переходная экспрессия дельта FosB, связанная с судорогами в гиппокампе крысы и полосатом теле. J Neurochem 68:272-279.
Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Прогнозирование посттрансляционного гликозилирования и фосфорилирования белков из аминокислотной последовательности. Протеомика 4:1633-1649.
Boehning D, Moon C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Нейропередача монооксида углерода, активированная фосфорилированием CK2 гемоксигеназы-2. Нейрон 40:129-137.
Боманн D (1990) Фактор фосфатирования транскрипции: связь между сигнальной трансдукцией и регуляцией экспрессии генов. Раковые клетки 2:337-344.
Бушманн Т., Потапова О., Бар-Шира А., Иванов В.Н., Фукс С.Ю., Хендерсон С., Фрид В.А., Минамото Т., Аларкон-Варгас Д., Пинкус М.Р., Гаард В.А., Холбрук Н.Ю., Шило Й, Ронаи З (2001) Jun NH2-терминальное киназное фосфорилирование p53 на Thr-81 важно для стабилизации p53 и активности транскрипции в ответ на стресс. Mol Cell Biol 21:2743-2754.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Отсутствие консервативного С-концевого домена семейства Fos способствует уникальной стабильности deltaFosB. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.
Чаннавахала П., Селдин Д.К. (2002) Функциональное взаимодействие протеинкиназы CK2 и c-Myc в лимфомагенезе. онкоген 21:5280-5288.
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ (1995) Регулирование дельта FosB и FosB-подобных белков путем электросудорожного захвата и лечения кокаином. Mol Pharmacol 48:880-889.
Chen J, Kelz MB, Hope BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Хронические связанные с Fos антигены: стабильные варианты ΔFosB, индуцированные в мозге при хронических методах лечения. J Neurosci 17:4933-4941.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) Фосфорилирование c-Fos на С-конце усиливает его трансформирующую активность. онкоген 12:1493-1502.
Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Ингибитор протеинфосфатазы 1 / 2A okadaic acid увеличивает CREB и Elk-1 фосфорилирование и экспрессию c-fos в полосатом полости крысы in vivo. J Neurochem 89:383-390.
Cochet C, Chambaz EM (1983) Полямин-опосредованные протеиновые фосфорилирования: возможная цель для внутриклеточного действия полиамина. Mol Cell Endocrinol 30:247-266.
Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Каталитические и молекулярные свойства высокоочищенной казеиновой киназы G из бычьей ткани легкого. Biochim Biophys Acta 743:1-12.
Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) Струйная клеточная специфическая избыточная экспрессия DeltaFosB усиливает стимул для кокаина. J Neurosci 23:2488-2493.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Daunais JB, Робертс Д.К., Макгинти Дж. Ф. (1993) Самообслуживание кокаина увеличивает препродинорфин, но не c-fos, мРНК в стриатуме крысы. NeuroReport 4:543-546.
Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Регулирование факторов транскрипции путем деградации белка. Cell Mol Life Sci 57:1207-1219.
Диас-Нидо Дж, Армас-Портела Р, Авила Дж (1992) Увеличение активности цитоплазматической казеиновой киназы II сопровождает рост нейритов после ингибирования синтеза ДНК в клетках нейробластомы NIA-103. J Neurochem 58:1820-1828.
Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Протеинкиназа CK2 фосфорилирует и активирует Akt / PKB. Дифференциал смерти 12:668-677.
Добразански П., Ногучи Т, Ковари К, Риццо С.А., Лазо П.С., Браво Р. (1991) Оба продукта гена fosB, FosB и его короткая форма, FosB / SF, являются транскрипционными активаторами в фибробластах. Mol Cell Biol 11:5470-5478.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Феррара П, Андермаршер Э, Боссис Г, Аквавива С, Брокли Ф, Яриэль-Энконтр I, Пьехачик М (2003) Структурные детерминанты, ответственные за протеасомную деградацию белка c-Fos, различаются в зависимости от условий экспрессии. онкоген 22:1461-1474.
Фукс С.Ю., Долан Л, Дэвис Р.Ю., Ронай З (1996) Фосфорилирование-зависимое нацеливание на ubiquitination c-июня Jun N-киназой. онкоген 13:1531-1535.
Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun NH2-терминальные киназы нацелены на убиквитинирование их ассоциированных факторов транскрипции. J Biol Chem 272:32163-32168.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) Стабильность транскрипционного фактора ATF2 регулируется фосфорилированием и дефосфорилированием. J Biol Chem 275:12560-12564.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) Фосфорилирование DARPP-32, дофаминового и cAMP-регулируемого фосфопротеина, казеинкиназой II. J Biol Chem 264:21748-21759.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Характеристика в мозге млекопитающих серинкиназы DARPP-32, идентичная казеинкиназе II. J Neurochem 55:1772-1783.
Ханада М, Сугавара К, Канаета К, Тода С, Нишияма Й, Томита К, Ямамото Х, Кониши М, Оки Т (1992) Эпоксомицин, новый противоопухолевый агент микробного происхождения. J Antibiot (Токио) 45:1746-1752.
Ханн С.Р., Эйзенман Р.Н. (1984) Белки, кодируемые человеческим c-myc онкогеном: дифференциальная экспрессия в неопластических клетках. Mol Cell Biol 4:2486-2497.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Hemmings HC Jr, Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, циклический AMP-регулируемый фосфопротеин (Mr = 21,000), обогащенный доменами, иннервируемыми дофамином. Аминокислотная последовательность сайта, фосфорилированная циклическим АМФ в интактных клетках, и кинетические исследования его фосфорилирования in vitro. J Biol Chem 264:7726-7733.
Хидака Х, Кобаяши R (1992) Фармакология ингибиторов протеинкиназы. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377-397.
Хирата Х, Бессо Й, Кокубу Х, Масамидзу Й, Ямада С, Льюис Дж, Кагеяма Р. (2004) Нестабильность белка Hes7 имеет решающее значение для часов сомитной сегментации. Nat Жене 36:750-754.
Hiroi N, Graybiel AM (1996) Атипичные и типичные нейролептические методы лечения вызывают различные программы экспрессии транскрипционного фактора в полосатом теле. J Comp Neurol 374:70-83.
Надежда Б, Косовский Б, Хайман С.Э., Нестлер Э.Дж. (1992) Регулирование немедленной ранней экспрессии генов и связывание AP-1 в ядре крысы при хроническом кокаине. Proc Natl Acad Sci США 89:5764-5768.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Обработка хронического электросудорожного захвата (ECS) приводит к выражению долговременного комплекса AP-1 в головном мозге с измененным составом и характеристиками. J Neurosci 14:4318-4328.
Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Индукция долговременного комплекса AP-1, состоящего из измененных Fos-подобных белков в головном мозге при хроническом кокаине и других хронических методах лечения. Нейрон 13:1235-1244.
Ишида А, Фудзисава Х (1995) Стабилизация калдодулинзависимой протеинкиназы II через автоингибирующий домен. J Biol Chem 270:2163-2170.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Комплексные механизмы деградации c-fos и c-jun. Mol Biol Rep 24:51-56.
Jones S, Yakel JL (2003) Казеинкиназа II (протеинкиназа ck2) регулирует функцию канала рецептора серотонина 5-ht (3) в клетках ng108-15. неврология 119:629-634.
Kato T Jr, Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2 является C-терминальной киназой IkappaB, ответственной за активацию NF-kappaB во время УФ-ответа. Мол сотовых 12:829-839.
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Выражение фактора транскрипции deltaFosB в мозге контролирует чувствительность к кокаину. природа 401:272-276.
Ким К.Б., Мьюнг Дж, Син Н, Экипаж СМ (1999) Ингибирование протеасомы природными продуктами эпоксимицина и дигидроэпонемицина: понимание специфичности и потенции. Bioorg Med Chem Lett 9:3335-3340.
Кобаяши Е, Накано Х, Моримото М, Тамаоки Т (1989) Кальфостин C (UCN-1028C), новое микробное соединение, является сильнодействующим и специфическим ингибитором протеинкиназы C. Biochem Biophys Res Commun 159:548-553.
Krek W, Maridor G, Nigg EA (1992) Казеинкиназа II является преимущественно ядерным ферментом. J Cell Biol 116:43-55.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Протеинкиназа CK2 фосфорилирует белок домена группы высокой подвижности SSRP1, индуцируя распознавание УФ-поврежденной ДНК. J Biol Chem 278:12710-12715.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Кумар А., Чой К. Х., Рентхал В., Цанкова Н. М., Теобальд ДЭХ, Труонг ХТ, Руссо С. Я., ЛаПлант, Уистлер К., Неве Р.Л., Я.В.Д., Нестлер Е.Ю. (2005) Ремоделирование хроматина является ключевым механизмом, лежащим в основе кокаин-индуцированной пластичности в полосатом теле. Нейрон 48:303-314.
Либерман Д.Н., Моди I (1999) Казеин киназа-II регулирует функцию канала NMDA в нейронах гиппокампа. Nat Neurosci 2:125-132.
Litchfield DW (2003) Протеинкиназа CK2: структура, регуляция и роль в клеточных решениях жизни и смерти. Biochem J 369:1-15.
Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) Деградация белка c-Fos, экспрессированного N-метил-d-аспаргическая кислота в ядерных фракциях мышиного гиппокампа. Brain Res 905:34-43.
Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Отсутствие постоянно повышенного 37 kDa-fos-родственного антигена и AP-1-подобной ДНК-связывающей активности в мозге обработанных каиновой кислотой мышей с нулевым фосом. J Neurosci 17:5407-5415.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Марин О, Мегио Ф, Марчиори Ф, Борин Г, Пинна Л.А. (1986) Специфичность сайта казеин-киназы-2 (TS) из цитозоля печени крысы. Исследование с использованием модельных пептидных субстратов. Eur J Biochem 160:239-244.
McClung CA, Nestler EJ (2003) Регулирование экспрессии генов и вознаграждение кокаина CREB и DeltaFosB. Nat Neurosci 6:1208-1215.
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: молекулярный переключатель для долговременной адаптации в мозге. Мозг Res Mol Brain Res 132:146-154.
Meggio F, Pinna LA (2003) Одна тысяча и одна субстраты протеинкиназы CK2? FASEB J 17:349-368.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Фосфорилирование казеиновых фракций фосвитинкиназой печени крысы. FEBS Lett 75:192-196.
Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Автофосфорилирование типа 2 казеинкиназы TS как на его альфа-, так и на бета-субъединицах. Влияние различных эффекторов. FEBS Lett 160:203-208.
Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Производные рибофуранозилбензимидазола в качестве ингибиторов казеинкиназы-2 и казеинкиназы-1. Eur J Biochem 187:89-94.
Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Субстратная специфичность протеинкиназы CK2. Cell Mol Biol Res 40:401-409.
Миллер С, Чжан М, Он У, Чжао Дж, Пеллетье Дж. П., Мартель-Пеллетье Дж, Ди Баттиста Дж. А. (1998) Транскрипционная индукция гена циклооксигеназы-2 путем ингибирования одавойной кислоты фосфатазной активностью в человеческих хондроцитах: совместное стимулирование ядерных связывающих белков AP-1 и CRE. J Cell Biochem 69:392-413.
Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Изменения на уровне сети в экспрессии индуцируемых белков Fos-Jun в полосатом теле во время хронического лечения и изъятия кокаина. Нейрон 17:147-156.
Morgan JI, Curran T (1995) Немедленные ранние гены: десять лет спустя. Тенденции Neurosci 18:66-67.
Nakabeppu Y, Nathans D (1991) Естественная усеченная форма FosB, которая ингибирует транскрипционную активность Fos / Jun. Ячейка 64:751-759.
Nestler EJ, Barrot M, Self DW (2001) Delta FosB: устойчивый молекулярный переключатель для наркомании. Proc Natl Acad Sci США 98:11042-11046.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Введение субъединицы глутаматного рецептора 1 в моторные нейроны in vitro и in vivo с использованием рекомбинантного вируса простого герпеса. неврология 79:435-447.
Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Фосфорилирование серина 239 Groucho / TLE1 протеинкиназой CK2 важно для ингибирования дифференцировки нейронов. Mol Cell Biol 24:8395-8407.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Окадзаки К., Сагата Н. (1995) Путь Mos / MAP-киназы стабилизирует c-Fos путем фосфорилирования и увеличивает его трансформирующую активность в клетках NIH 3T3. EMBO J 14:5048-5059.
Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) Путь ubiquitin-proteasome необходим для обработки белка-предшественника NF-каппа B1 и активации NF-каппа B. Ячейка 78:773-785.
Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) Целевая деградация c-Fos, но не v-Fos, сигналом, зависящим от фосфорилирования, на c-Jun. Наука 258:1941-1944.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E (2003) Индуцибельная экспрессия доминантного негативного мутанта c-Jun у трансгенных мышей снижает чувствительность к кокаину. Brain Res 970:73-86.
Перротти Л.И., Хадеиши Й, Ульри П.Г., Баррот М., Монтеггия Л., Думан Р.С., Нестлер Э.Ю. (2004) Индукция DeltaFosB в мозговых структурах, связанных с наградами, после хронического стресса. J Neurosci 24:10594-10602.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Персико А.М., Шиндлер С.В., О'Хара Б.Ф., Браннок М.Т., Уль Г.Р. (1993) Выражение фактора транскрипции мозга: эффекты острого и хронического амфетамина и стресса для инъекций. Мозг Res Mol Brain Res 20:91-100.
Ploegh HL, Dunn BM (2000) Последующая модификация: фосфорилирование и фосфатазы. В: Текущие протоколы в области белковой науки (Данн Б.М., ред.) С. 13.01-13.02. Нью-Йорк: Вайли и сыновья.
Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Каталитические и молекулярные свойства высокоочищенной фосвитина / казеиновой киназы II типа из эпителиальных клеток человека в культуре (HeLa) и связь с экто-протеинкиназой. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215-227.
Рейхардт Б.А., Куликова О.Г., Борисова Г.Ю., Александрова И.Ю., Сапронов Н.С. (2003) Состояние системы протеинкиназы CK2-HMG14 в возрастной амнезии у крыс. Neurosci Behav Physiol 33:799-804.
Робертс BJ, Whitelaw ML (1999) Деградация базового спирального спирали / Per-ARNT-Sim гомологического доменного диоксинового рецептора по пути ubiquitin / proteasome. J Biol Chem 274:36351-36356.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Рост Б, Яхдав Г, Лю J (2004) Сервер PredictProtein. Нуклеиновые кислоты Res 32:W321-W326.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Рыльски М., Качмарек Л. (2004) Ap-1 нацеливается на мозг. Фронт Biosci 9:8-23.
Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Молекулярная характеристика рекомбинантной мышиной аденозинкиназы и оценка в качестве мишени для фосфорилирования белка. Eur J Biochem 271:3547-3555.
Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) Существуют ли многочисленные протеолитические пути, способствующие деградации белка c-Fos, c-Jun и p53 in vivo? Mol Biol Rep 26:45-51.
Schmidt R, Hecker E (1975) Автоокисление сложных эфиров форбола при нормальных условиях хранения. Рак Рез 35:1375-1377.
Шварц Е.М., Ван Антверпен Д., Верма И.М. (1996) Устойчивое фосфорилирование IkappaBalpha казеиновой киназой II происходит преимущественно у серина 293: потребность в деградации свободной икаппа-альфа. Mol Cell Biol 16:3554-3559.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras повышает стабильность белка Myc. Мол сотовых 3:169-179.
Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Циклическое нуклеотид-независимое фосфорилирование вителлина казеиновой киназой II, очищенной от ооцитов Rhodnius prolixus. Насекомое Biochem Mol Biol 32:847-857.
Skinner M, Qu S, Moore C, Wisdom R (1997) Транскрипционная активация и трансформация белком FosB требуют фосфорилирования домена активации карбоксильной группы. Mol Cell Biol 17:2372-2380.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Протеинкиназа CK2 дифференцирует фосфорилирует кукурузу с высокой подвижностью белков группы B (HMGB), модулируя их стабильность и взаимодействие ДНК. J Biol Chem 277:1092-1098.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Стивенс I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Горис J (1999) Идентификация cyk, cyclin B2 киназы, как новая кальций / кальмодулинзависимая протеинкиназа II и ее роль при созревании ооцита Xenopus laevis. Exp Cell Res 252:303-318.
Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Регулирование экспрессии гена c-fos и c-jun липополисахаридом и цитокинами в первичных культивируемых астроцитах: влияние путей PKA и PKC. Arch Pharm Res 27:396-401.
Шишка Р., Богушевская А., Гранковски Н., Балеста Ю.П. (1995) Дифференциальное фосфорилирование рибосомных кислых белков из дрожжевой клетки двумя эндогенными протеинкиназами: казеинкиназа-2 и 60S киназа. Acta Biochim Pol 42:357-362.
Тамаоки Т, Такахаши I, Кобаяши Е, Накано Х, Акинага С, Судзуки К (1990) Кальфостин (UCN1028) и связанные с кальфостином соединения, новый класс специфических и мощных ингибиторов протеинкиназы C. Adv Second Messenger Phosphoprotein Res 24:497-501.
Торрес Дж., Пулидо R (2001) Супрессор опухоли PTEN фосфорилируется протеинкиназой CK2 на своем конце C. Последствия для устойчивости PTEN к деградации, опосредованной протеасомой. J Biol Chem 276:993-998.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Цубуки С, Сайто Й, Томиока М, Ито Х, Кавасима С (1996) Дифференциальное ингибирование активности кальпаина и протеасомы пептидилальдегидами дилейцина и три-лейцина. J Biochem (Токио) 119:572-576.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) Деградация c-Fos протеасом 26S ускоряется c-Jun и множественными протеинкиназами. Mol Cell Biol 15:5682-5687.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Unger GM, Дэвис AT, Слатон JW, Ахмед К (2004) Протеинкиназа CK2 как регулятор выживаемости клеток: последствия для терапии рака. Целевые наркотики для лечения рака 4:77-84.
Vial E, Marshall CJ (2003) Повышенная активность киназы ERK-MAP защищает член семейства FOS FRA-1 от протеасомальной деградации клеток карциномы толстой кишки. J Cell Sci 116:4957-4963.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) ΔFosB регулирует работу колеса. J Neurosci 22:8133-8138.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Whitmarsh AJ, Дэвис RJ (2000) Регулирование функции фактора транскрипции путем фосфорилирования. Cell Mol Life Sci 57:1172-1183.
Зима B, Каутцнер I, Иссингер О.Г., Арнольд Х.Х. (1997) Два предполагаемых сайта фосфорилирования CK2 протеинкиназы важны для активности Myf-5. Biol Chem 378:1445-1456.
Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Учтенное фосфорилирование кислых хвостов белков 1 с высокой подвижностью казеиновой киназой II изменяет их конформацию, стабильность и специфичность связывания ДНК. J Biol Chem 274:20116-20122.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) Казеин киназа II взаимодействует с доменами bZIP нескольких факторов транскрипции. Нуклеиновые кислоты Res 26:3854-3861.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) Фосфорилирование стрессового белка A170 с помощью казеиновой киназы II-подобной активности в макрофагах. Biochem Biophys Res Commun 241:157-163.
Янкулов К., Ямашита К., Рой Р., Эгли Дж. М., Бентли Д.Л. (1995) Ингибитор удлинения транскрипции 5,6-дихлор-1-бета-d-бикофуранозилбензимидазол ингибирует транскрипционный фактор IIH-ассоциированной протеинкиназы. J Biol Chem 270:23922-23925.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Йен Дж, Мудрость Р.М., Тратнер И., Верма И.М. (1991) Альтернативная сплайсированная форма FosB является отрицательным регулятором транскрипционной активации и трансформации белками Fos. Proc Natl Acad Sci США 88:5077-5081.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Инь X, Джеджеевски П.Т., Цзян Дж. (2000) Казеинкиназа II фосфорилирует линзу коннексина 45.6 и участвует в ее деградации. J Biol Chem 275:6850-6856.
Аннотация / БЕСПЛАТНО Полный текст
Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Индукция компонентов фактора транскрипции AP-1 при активации Т-клеток интерлейкином 1 и эфирами форбола. Дифференциал роста клеток 3:677-684.
Ю С, Ван Х, Дэвис А, Ахмед К (2001) Последствия передачи сигнала CK2 на ядерную матрицу. Mol Cell Biochem 227:67-71.
Ю С, Дэвис А.Т., Го С, Грин Й.Е., Ахмед К (1999) Дифференциальное нацеливание протеинкиназы CK2 на ядерную матрицу при переходной сверхэкспрессии ее субъединиц. J Cell Biochem 74:127-134.
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: существенная роль ΔFosB в прилежании ядра при действии морфина. Nat Neurosci 9:205-211.
Статьи, ссылающиеся на эту статью
- Поведенческие и структурные реакции на хронический кокаин требуют, чтобы петля подачи, включающая {Delta} FosB и кальций / кальмодулинзависимую белково-киназу II в оболочке Nucleus Accumbens Журнал неврологии, 6 March 2013, 33(10):4295–4307
- Сверхэкспрессия стриатала {Delta} FosB воспроизводит хронические леводопы-индуцированные недобровольные движения Журнал неврологии, 26 мая 2010, 30(21):7335–7343
- Абстрактные
- Полный текст
- Полный текст (PDF)
- Абстрактные
- Полный текст
- Полный текст (PDF)
- Абстрактные
- Полный текст
- Полный текст (PDF)
- Абстрактные
- Полный текст
- Полный текст (PDF)
- Транскрипционные механизмы зависимости: роль {Delta} FosB Философские труды Королевского общества B: Биологические науки, 12 Октябрь 2008, 363(1507):3245–3255
- Прочная уязвимость к восстановлению поведения, связанного с метамфетамином, в мутантных мышах, несущих нейротрофический фактор глиальных клеток Журнал FASEB, 1 июля 2007, 21(9):1994–2004
- Фактор транскрипции активатора белка-1 в канцерогенезе респираторного эпителия Молекулярные исследования рака, 1 Февраль 2007, 5(2):109–120
;
