Сыворотка фактор отклика способствует устойчивости к хроническому социальному стрессу через индукцию DeltaFosB (2010) -. Ваш мозг на порно

КОММЕНТАРИИ: Хотя оба стресса, наркотики злоупотребления и некоторые естественные награды вызывают накопление DeltaFosB, стресс активирует различные нисходящие клетки, а затем различные рецепторы и гены. Другими словами, склонности и сопротивление стрессу основаны на принципиально разных механизмах

ПОЛНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

J Neurosci. 2010 Oct 27; 30 (43): 14585-92.

Vialou V, Maze I, Renthal W, LaPlant QC, Watts EL, Mouzon E, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ.

Источник

Фишбергский отдел нейронауки, Медицинская школа в горах Синай, Нью-Йорк, Нью-Йорк, 10029, США.

Абстрактные

Молекулярные механизмы, лежащие в основе нейронных адаптаций, вызванных стрессом и лекарством, не полностью поняты. Одной из молекул, вовлеченных в такие адаптации, является ΔFosB, фактор транскрипции, который накапливается в ядре грызуна accumbens (NAc), ключевой области награды мозга, в ответ на хронический стресс или многократное воздействие наркотиков. Tон вверх по транскрипционным механизмам, управляющим индукцией ΔFosB этими экологическими стимулами, остается неуловимым. Здесь мы идентифицируем зависящий от активности фактор транскрипции, фактор отклика сыворотки (SRF), как новый медиатор стресса, но не кокаин-, индуцированный ΔFosB. SRF понижается в NAc как у пациентов с депрессией, так и у мышей, хронически подверженных стрессу социального поражения. Эта подавление SRF отсутствует у устойчивых животных. Благодаря использованию индуцируемого мутагенеза мы показываем, что индуцируемая стрессом индукция ΔFosB, которая встречается преимущественно у резистентных мышей, зависит от экспрессии SRF в этой области мозга, Кроме того, NAc-специфическая генетическая делеция SRF способствует распространению различных продепрессорных и проакционно-подобных фенотипов и делает животных более чувствительными к вредным последствиям хронического стресса. Напротив, мы демонстрируем, что SRF не играет роли в накоплении ΔFosB в NAc в ответ на хроническое воздействие кокаина. Кроме того, NAc-специфический нокаут SRF не влияет на поведение, вызванное кокаином, что указывает на то, что хроническое стрессовое поражение со стороны общества и повторное воздействие кокаина регулируют накопление ΔFosB и чувствительность к поведению через независимые механизмы.

Введение

Ядро accumbens (NAc), ключевой регион награды за мозг, важно для интеграции сенсорных и когнитивных входов, которые стимулируют мотивационно соответствующее поведение в ответ на экологические стимулы (Nestler and Carlezon, 2006, Sesack and Grace, 2010). NAc также был замешан в поведенческих отклонениях, связанных с наркоманией и депрессией. Было показано, что нацеливание на NAc с сильным стимуляцией головного мозга облегчает депрессивные и зависимые от поведения поведения как у людей, так и у грызунов (Schlaepfer et al., 2008, Vassoler et al., 2008, Heinze et al., 2009; Kuhn et al. al., 2009).

Неоднократное воздействие препаратов злоупотребления или стресса вызывает измененные образцы экспрессии генов в NAc, потенциально лежащие в основе хронической зависимости и депрессии (Berton et al., 2006; Krishnan et al., 2007; Maze et al., 2010; Vialou et al. ., 2010). Интересно, что транскрипционный фактор ΔFosB, продукт сращивания гена fosB, накапливается в NAc в ответ на повторное воздействие препарата или стресса (Nestler, 2008, Perrotti и др., 2008, Vialou и др., 2010). ΔFosB был предложен в качестве потенциального молекулярного переключателя, обеспечивающего переход от использования рекреационного наркотика к хронически зависимому состоянию (Nestler et al., 1999, McClung и др., 2004, Renthal и др., 2009), поскольку его накопление в NAc усиливает поощряя ответы на несколько наркотических средств. В последнее время выясняется роль индукции ΔFosB в NAc после хронического стресса социального поражения (Nikulina et al., 2008, Vialou и др., 2010): ΔFosB способствует активному реагированию на стрессовые раздражители и повышает устойчивость, Хотя индукция ΔFosB происходит в зависимости от стимула, механизмы, ответственные за накопление ΔFosB, индуцируемое лекарственными средствами и стрессом, в NAc остаются неизвестными.

Фактор сывороточного ответа (SRF) - это фактор транскрипции, необходимый для зависимой от активности транскрипционной активации нескольких непосредственных ранних генов, включая c-fos, fosb, Egr1 и Arc (Knöll and Nordheim, 2009). Недавние исследования продемонстрировали эффекты SRF на морфологические и цитоархитектурные свойства нейронов, включая регуляцию синаптической активности и формирование контуров во взрослом мозге (Knöll and Nordheim, 2009). Эти данные побудили нас исследовать, регулируется ли SRF функционально хроническим воздействием наркотиков или стресса, а также потенциальное влияние такой регуляции на индукцию ΔFosB в этих условиях.

Здесь мы описываем новый механизм, с помощью которого подавление SRF в NAc способствует продепрессивному и анксиогенному фенотипам, в конечном итоге повышая уязвимость животного к пагубным последствиям хронического стресса.. Эти эффекты частично опосредованы потерей индукции ΔFosB в NAc стрессированных животных. Наблюдаемое снижение экспрессии SRF и ΔFosB в посмертной ткани NAc, полученной от пациентов с депрессией, подтверждает актуальность наших результатов для депрессии у человека. Интересно, что этот механизм, контролирующий накопление ΔFosB, по-видимому, является стресс-специфическим: хроническое воздействие кокаина не влияет на экспрессию SRF, делеция SRF из NAc не влияет на накопление ΔFosB после хронического воздействия кокаина, и такая делеция SRF не влияет на кокаин. индуцированное поведение. Это новое взаимодействие между SRF и ΔFosB в контексте стресса может представлять собой важный гомеостатический механизм, регулирующий чувствительность человека к хроническому стрессу.

Материалы и методы

Животные

Восемь недельных самцов мышей C57BL / 6J (лаборатория Джексона) использовались во всех поведенческих и биохимических экспериментах. Все животные были приучены к животному средству по крайней мере за 1 неделю до экспериментальных манипуляций и поддерживались в 23-25 ° C в 12 ч светло-темном цикле (свет от 7: 00 AM до 7: 00 PM) с ad libitum доступ к продовольствию и воде. Эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Общества по неврологии и комитетом по уходу и использованию животных в Медицинской школе горы Синай.

Для экспериментов по кокаину [Вестерн-блоттинг и количественное иммунопреципитация хроматина (ChIP)] использовали мышей C8BL / 10J с 57-6-неделями. Животные получали семь ежедневных внутрибрюшинных инъекций либо солевого раствора, либо кокаина (20 мг / кг кокаина-HCl, Sigma). Мышей использовали 24 h после окончательной обработки. Для поведенческих экспериментов мышей поодиночке размещали послеоперационную операцию и обрабатывали 10 мг / кг (локомоторная сенсибилизация) или 7.5 мг / кг (условное расположение) кокаин-HCl внутрибрюшинно, как описано ниже.

Srffl / fl-мыши были получены, как описано ранее (Ramanan et al., 2005). NAc-специфический нокаут Srf был достигнут посредством стереотаксической инъекции и последующей вирусной сверхэкспрессии Cre recombinase (Cre), слитой с зеленым флуоресцентным белком (GFP) с использованием аденоассоциированных вирусов (AAV) векторов. Использовался несамосодержащий Cre. AAV-GFP вводили вместо AAV-Cre-GFP у Srffl / fl мышей в качестве контроля. Вкратце, мышей анестезировали с использованием смеси кетамина (10 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) со следующими стереотаксическими координатами, используемыми для доставки вируса: + 1.6 (передний / задний), + 1.5 (латеральный), - 4.4 (дорсальный / вентральный) под углом 10 ° от средней линии (относительно бредмы). В общей сложности 0.5 мкл очищенного вируса доставляли на двусторонней основе в течение 5 минутного периода (0.1 мкл / мин), а затем в течение оставшегося времени 5. Мышей тестировали через 2 недель после операции, когда вирусная экспрессия была максимальной, а сайты вирусной инъекции были подтверждены для всех животных с использованием стандартных гистологических методов. Эффективность вирусной опосредованной экспрессии Cre была подтверждена иммуногистохимией и ПЦР обратной транскриптазы для Srf, проведенной на микродиссифицированных пучках NAc у животных, получавших AAV-Cre-GFP и AAV-GFP в NAc. AAV-GFP и AAV-Cre-GFP вирусы были получены, как описано ранее (Maze et al., 2010).

Поведенческие процедуры

Социальное поражение.

Мышей C57BL / 6J подвергали хроническому стрессовому стрессу для 10 последовательных дней, как описано ранее (Berton et al., 2006, Krishnan et al., 2007, Vialou et al., 2010). Вкратце, каждая мышь подвергалась воздействию незнакомой и агрессивной мужской мыши для выведения на рынок CD1 для 5 min в день. После прямого взаимодействия с агрессором CD1 животных затем помещали в соседний отсек той же клетки для следующего 24 h с сенсорным, но не физическим контактом. Контрольные животные размещались в эквивалентных клетках, но с теми же штаммами. Тесты социального взаимодействия были выполнены 24 h после последнего дня поражения.

Социальное избегание незнакомых самцов мышей CD1 оценивали в соответствии с опубликованными протоколами (Berton et al., 2006; Krishnan et al., 2007; Vialou et al., 2010). Сначала экспериментальную мышь помещали в открытое поле, содержащее пустую клетку из проволочной сетки, на 2.5 мин. Во время второго сеанса незнакомый самец мыши CD1 был помещен в проволочную клетку. Измерялось время пребывания в зоне взаимодействия (коридор шириной 8 см, окружающий клетку). Разделение побежденных мышей на восприимчивые и устойчивые субпопуляции проводили, как описано ранее (Krishnan et al., 2007; Vialou et al., 2010). Поскольку большинство контрольных мышей проводили больше времени, взаимодействуя с социальной целью, чем с пустым целевым корпусом, коэффициент взаимодействия 100 (равное время, проведенное в зоне взаимодействия в присутствии или отсутствии социальной цели) был установлен в качестве порогового значения. Мышей с баллами <100 считали восприимчивыми, а мышей с баллами ≥100 считали устойчивыми. Обширные поведенческие, биохимические и электрофизиологические анализы подтверждают достоверность этих различных восприимчивых и устойчивых субпопуляций (Krishnan et al., 2007; Wilkinson et al., 2009; Vialou et al., 2010).

Чтобы исследовать уязвимость Srffl / fl мышей к стрессу социального поражения, мыши, вводимые на двусторонней основе с помощью AAV-GFP или AAV-Cre-GFP, были подвергнуты трех поражениям подрядчиков в тот же день, а затем были протестированы на социальное взаимодействие 24 h позже. Эта процедура субмаксимального поражения была подтверждена ранее, чтобы выявить фенотипы восприимчивости после генетических манипуляций (Krishnan et al., 2007; Vialou et al., 2010).

Выявлена беспомощность.

Srffl / fl мыши, сверхэкспрессирующие либо AAV-GFP, либо AAV-Cre-GFP, подвергались изученной процедуре беспомощности, как описано ранее (Berton et al., 2007). Вкратце, мыши были подвержены прерывистым, неизбежным ударам ноги для 1 h в течение 2 целых дней (0.45 мА, длительность 5 s). В день теста мышей повторно вводили в коробку для последовательных проверок 15. Во время каждого испытания был достигнут непрерывный шок, и мышам была предоставлена возможность убежать, войдя в соседний неэтилированный отсек. После успешного побега дверь была автоматически закрыта, и латентность выхода была записана. Когда мышам не удалось избежать в течение 25, испытание было прекращено и было записано как отказ. Предыдущие исследования показали, что вирусная экспрессия в NAc и других регионах не влияет на исходное поведение побега при отсутствии стресса (Newton et al., 2002, Berton et al., 2007).

Локомоторная сенсибилизация.

Через две недели после инъекций внутри NAc либо AAV-GFP, либо AAV-Cre-GFP мышей Srffl / fl подвергали локомоторной сенсибилизации. Мышей приучали к локомоторной арене в течение 30 минут в день в течение 4 дней. После привыкания животным внутрибрюшинно вводили 10 мг / кг кокаина-HCl и помещали в локомоторные боксы. Двигательную активность животных регистрировали с помощью фотолучевой системы (San Diego Instruments) в виде амбулаторных перерывов в пучке в течение 30 минут в день. Локомоторная сенсибилизация регистрировалась в течение 6 дней.

Условное расположение места.

Процедуру кондиционирования места проводили, как описано ранее (Maze et al., 2010), со следующими модификациями. Вкратце, через 18 дней после инфузий AAV-GFP или AAV-Cre-GFP внутри NAc мышам Srffl / fl животных помещали в камеры для кондиционирования, которые состояли из трех контекстуально различных сред. Мыши, демонстрирующие значительное предпочтение любой из двух камер кондиционирования, были исключены из исследования (<10% всех животных). Группы кондиционирования были дополнительно уравновешены, чтобы учесть любое возможное смещение камеры. В последующие дни животным вводили физиологический раствор и помещали в одну камеру во второй половине дня на 30 минут, а затем вводили кокаин (7.5 мг / кг, внутрибрюшинно) и помещали на 30 минут в другую камеру на следующий день, что в сумме составляло два раунда ассоциативного тренинга на курс лечения (две пары физиологического раствора и две пары кокаина). В день испытания мышей помещали обратно в устройство без лечения на 20 мин и тестировали для оценки предпочтения сторон. Двигательные реакции на кокаин оценивались с помощью разрыва луча в камерах, соединенных с кокаином, чтобы гарантировать эффективность лечения наркотиками. Для всех групп оценивали исходную локомоцию в ответ на физиологический раствор, чтобы убедиться, что на локомоцию не повлияло лечение вирусами.

Другие поведенческие тесты.

Srffl / fl были протестированы в тестах на открытом поле, свет / темнота и принудительного плавания на основе опубликованных протоколов (Vialou et al., 2010). Активность мышей в открытом поле регистрировалась для 5 min с использованием системы видеосъемки (Ethovision) в условиях красного света. Для теста на свет / темноту мышам было разрешено свободно исследовать двухкамерную коробку, состоящую из одной большой освещенной арены, соединенной с меньшей закрытой ареной. Мышей тестировали на период 5 min, чтобы оценить количество времени, проведенного в любом приложении. В тестах на открытом поле и свете / темноте время, проведенное в центре и на светлой арене, соответственно, оценивалось как обратный показатель тревожных ответов. Испытание принудительного плавания 1 d проводилось в течение периода 5 мин. Увеличенное время неподвижности во время теста принудительного плавания было интерпретировано как поведение, подобное продепрессору. Тест принудительного плавания 1 d был широко использован у мышей и был проверен как показатель прогностической достоверности, поскольку антидепрессанты уменьшают время неподвижности.

Иммуногистохимия

Srffl / fl мышей анестезировали и перфузировали внутрисердечно с 4% параформальдегидом / PBS. Мозги удаляли и криозащиты в 30% сахарозе / PBS. Корональные срезы (30 мкм) разрезали на замораживающий микротом и обрабатывали для иммуногистохимических анализов. Проверка отмены Srffl / fl проводилась с использованием поликлонального антитела, направленного против SRF (1 / 2000, Santa Cruz Biotechnology). Экспрессия Cre была подтверждена с помощью GFP (экспрессия куриного поликлонала, 1 / 8000, Aves Labs) в расчлененных мозгах, поскольку Cre слит с GFP. Для количественной оценки индукции ΔFosB после стресса социального поражения у мышей с наружным слоем Srffl / fl ΔFosB детектировали с использованием кроличьего поликлонального антитела, выращенного против N-концевой области белка (1 / 1000, Santa Cruz Biotechnology). Изображения были сделаны с помощью конфокального микроскопа (увеличение 20 ×, Zeiss). Количество иммуноположительных клеток GFP, считающихся отрицательными и положительными для иммунореактивности ΔFosB, определяли количественно в нескольких изображениях для каждого животного со средними значениями, которые затем рассчитывались для каждого животного. Каждое животное считалось отдельным наблюдением для статистического анализа.

Человеческая посмертная ткань NAc

Ткань мозга человека после смерти была получена из коллекции мозга в Далласе, где ткань была получена из офиса судебно-медицинской экспертизы Далласа и Программы трансплантации тканей Юго-Западного Университета Техаса (Юта) после согласия ближайших родственников. Ткани были проанализированы как у мужчин, так и у женщин, сопоставленных по возрасту, посмертному интервалу, числу целостности РНК (RIN) и pH. Специфические агональные факторы, включая кому, гипоксию, гипертермию, судороги, обезвоживание, гипогликемию, полиорганную недостаточность и прием нейротоксических веществ во время смерти, влияют на целостность РНК в посмертных тканях мозга (Tomita et al., 2004). Мы использовали шкалу агонального фактора (AFS), чтобы охарактеризовать образцы тканей в каждом из этих восьми условий. Отсутствию агонального фактора была присвоена оценка 0, а его наличие - 1, чтобы обеспечить общую оценку AFS от 0 до 8. Ткань с агональной оценкой 0 или 1 отражает образцы хорошего качества; Демографические данные случая представлены в таблице 1. Превосходное качество тканей подтверждено высокими значениями RIN. Пациенты подвергали стандартному вскрытию перед быстрым замораживанием в изопентане -40 ° C и хранением при -80 ° C; Дальнейшее рассечение NAc проводили на замороженной ткани. Наблюдательный совет Юго-Западного университета рассмотрел и одобрил сбор этой ткани для использования в исследованиях. Позже для каждого случая депрессии проводилось прямое интервью с информатором, в ходе которого информация о заболевании была задокументирована; консенсусный диагноз большого депрессивного расстройства был поставлен с использованием критериев DSM-IV двумя психиатрами-исследователями. Ни в одном из случаев, включенных в это исследование, токсикологический анализ крови не показал положительных результатов на наркотические вещества, алкоголь или отпускаемые по рецепту лекарства, кроме антидепрессантов. Несмотря на лечение антидепрессантами, все пациенты на момент смерти находились в клинической депрессии. Образцы тканей раздавались для анализа слепым способом.

Таблица 1.

Демографические данные для исследования после посмертного человека

Вестерн-блоттинг

Образцы NAc человека и мыши обрабатывали, как описано ранее (Maze et al., 2010). Замороженные ткани обрабатывали ультразвуком в буфере для лизиса 5 mM HEPES, содержащем 1% SDS с протеазой (Roche) и ингибиторами фосфатазы (Sigma). Концентрации белка определяли с помощью анализа белка Dc (Bio-Rad). Равные количества образцов белка подвергали SDS-PAGE и вестерн-блоттингу. Вестерн-блоттинги зондировали с использованием антитела к SRF (1 / 2000, Santa Cruz Biotechnology) или GAPDH (1 / 1500, Abcam) и затем проверяли и количественно определяли с использованием системы визуализации Odyssey (Licor).

Выделение РНК и количественная ПЦР

Изоляция РНК, количественная ПЦР (qPCR) и анализ данных выполнялись, как описано ранее (Maze et al., 2010; Vialou et al., 2010). Вкратце, РНК выделяли реагентом TriZol (Invitrogen) и далее очищали микронаборами RNAeasy от Qiagen. Было определено, что все образцы РНК имеют значения 260 / 280 и 260 / 230 ≥1.8. Обратную транскрипцию выполняли с использованием iScript (Bio-Rad). qPCR с использованием SYBR green (Quanta) выполнялся с использованием PCR Applied Biosystems 7900HT RT со следующими параметрами цикла: 2 min при 95 ° C; 40 циклов 95 ° C для 15 s, 59 ° C для 30 s, 72 ° C для 33 s; и градуированный нагрев до 95 ° C для генерации кривых диссоциации для подтверждения отдельных продуктов ПЦР. Данные анализировали путем сравнения значений C (t) состояния лечения (контроль против восприимчивых или эластичных мышей или человеческих контролей против депрессивных пациентов) с помощью метода ΔΔC (t) (Tsankova et al., 2006). ΔFosB qPCR праймеры: foward, AGGCAGAGCTGGAGTCGGAGAT и обратный, GCCGAGGACTTGAACTTCACTCG.

чИП

ChIP выполняли, как описано ранее (Maze et al., 2010), на пул двусторонних NAc-штампов от контрольных, восприимчивых и устойчивых мышей (четыре 14-калибровочных ударов / мышь) 1 h после последнего опыта поражений и от соляных и кокаино- обработанных животных 24 h после окончательной обработки. Ткань была сшита в 1% формальдегиде. Фиксацию затем прерывали с помощью применения глицина, и ткань промывали и выдерживали при -80 ° C до использования. Обрезанный хроматин инкубировали в течение ночи с анти-SRF-антителом (Santa Cruz Biotechnology), ранее связанным с магнитными шариками (Dynabeads M-280, Invitrogen). После обратного сшивания и очистки ДНК связывание SRF с промотором fosb определяли с помощью qPCR, используя праймеры, охватывающие область промотора fosb, содержащую два сайта связывания с сайтом ответа на сыворотку. Выбросы SRF были значительно обогащены по сравнению с контролем без антител. Простые промоторы гена мыши fosb: вперед, CCCTCTGACGTAATTGCTAGG и обратный, ACCTCCCAAACTCTCCCTTC.

Статистический анализ

Односторонний дисперсионный анализ ANOVA использовался для сравнения средних значений контрольных, восприимчивых и устойчивых мышей в биохимических и поведенческих анализах. Двусторонний дисперсионный анализ ANOVA использовали для сравнения индукции ΔFosB в результате социального поражения у мышей с локальным нокаутом Srf, а также для сравнения эффекта нокаута Srf в протоколах выученной беспомощности и локомоторной сенсибилизации. T-критерий Стьюдента использовали для сравнения средних значений эффекта нокаута Srf на индукцию ΔFosB, а также между группами в посмертном анализе ткани человека и ChIP мыши. Различия между экспериментальными условиями считали статистически значимыми при p ≤ 0.05.

Итоги

SRF и ΔFosB в депрессии человека и социально побежденных мышах

Чтобы изучить потенциальную роль SRF в развитии депрессивно-подобного поведения, мы сначала оценили экспрессию белка SRF в NAc у пациентов с посмертной депрессией. Субъекты с депрессией показали значительно сниженные уровни SRF в NAc по сравнению с их контрольной группой того же возраста (t (19) = 1.9; p <0.05) (рис. 1A). Учитывая роль SRF в регуляции зависимой от активности экспрессии немедленных ранних генов (Ramanan et al., 2005), мы предположили, что SRF может участвовать в контроле экспрессии ΔFosB в этой области мозга. В поддержку этой гипотезы мы наблюдали, что уровни мРНК Δfosb также были значительно снижены в NAc людей с депрессией (t (16) = 1.8; p <0.05) (рис. 1B). Это согласуется с недавними открытиями снижения уровня белка ΔFosB в этих условиях (Vialou et al., 2010).

Рисунок 1.

Хроническая стресс-индуцированная репрессия SRF коррелирует со снижением транскрипции ΔFosB в NAc. A, B, пациенты с посмертной депрессией у людей демонстрируют сниженные уровни белка SRF (n = 10 / группа; A) и экспрессии мРНК Δfosb в NAc (n = 8 / группа; B). C. Мыши, подвергшиеся хроническому (10 дней) стрессу социального поражения, были сгруппированы в восприимчивые и устойчивые субпопуляции. D, стресс от хронического социального поражения снижает уровни белка SRF в NAc у восприимчивых мышей, но не у устойчивых мышей, по сравнению с контролем через 24 часа после теста социального взаимодействия, показанного на C.E, уровни мРНК ΔfosB в NAc не изменяются у восприимчивых мышей, но значительно активирована у устойчивых животных (n = 7–15 / группа). Белок F, SRF демонстрирует повышенное связывание с промотором гена fosb после стресса хронического социального поражения только у устойчивых, а не у восприимчивых мышей (n = 5 / группа). Отображаемые данные выражены в виде среднего значения ± SEM (представлены в виде столбцов ошибок). Con., Control; Деп., Депрессивный; Sus., Восприимчивый; Res., Упругий. * р <0.05 по сравнению с контролем; *** p <0.001 по сравнению с контролем; #p <0.05 по сравнению с восприимчивым; ## p <0.01 по сравнению с восприимчивыми; ### p <0.001 по сравнению с восприимчивыми.

Чтобы расширить эти результаты, мы использовали протокол стресса хронического социального поражения у мышей. Две различные группы побежденных мышей, восприимчивые и устойчивые, были очевидны (Krishnan et al., 2007) на основе меры социального избегания, в которой восприимчивые животные демонстрировали значительно меньшее социальное взаимодействие по сравнению с контрольными и устойчивыми животными (F (2,23, 157.2) = 0.001; p <0.001; t-тесты с поправкой Бонферрони, восприимчивые по сравнению с контролем, p <0.05; эластичные по сравнению с контролем, p <0.01; эластичные по сравнению с восприимчивыми, p <1) (рис. 2,32C). Через два дня после последнего эпизода поражения восприимчивых, устойчивых и непораженных контрольных мышей анализировали на экспрессию SRF в NAc. Подобно результатам при депрессии человека, уровни белка SRF были значительно снижены в NAc восприимчивых мышей по сравнению с контролем, тогда как уровни SRF не были затронуты в NAc устойчивых мышей (F (4.7) = 0.05; p <0.05; t-тесты с Поправка Бонферрони, восприимчивый против контроля, p <0.05; устойчивый против восприимчивого, p <1) (рис. XNUMXD).

Затем мы исследовали экспрессию мРНК Δfosb в NAc этих трех групп животных и наблюдали значительное увеличение экспрессии Δfosb только у устойчивых животных с тенденцией, но не наблюдалось значительного увеличения у восприимчивых мышей (t (14) = 2.1; p <0.05 ) (Рис. 1E). Для дальнейшего изучения возможных взаимодействий между уровнями SRF и транскрипцией Δfosb мы использовали ChIP, чтобы проверить, изменилось ли связывание SRF с промотором гена fosb после стресса хронического социального поражения в отдельных когортах восприимчивых и устойчивых мышей. Устойчивые животные показали значительно повышенное связывание SRF с промотором fosb в NAc по сравнению с контролем (t (8) = 2.1; p <0.05), а также по сравнению с восприимчивыми мышами (t (8) = 2.0; p <0.05). Никаких различий между контрольными и восприимчивыми мышами не наблюдалось, что, вероятно, отражает отсутствие индукции SRF у восприимчивых мышей (рис. 1F).

Чтобы подтвердить роль SRF в регуляции ΔFosB после стресса хронического социального поражения, мышей Srffl / fl использовали для изучения влияния избирательной делеции SRF из NAc на индукцию стресса ΔFosB. Мышам Srffl / fl стереотаксически вводили интра-NAc векторы AAV, экспрессирующие GFP или Cre-GFP. Иммуногистохимически подтвержден NAc-специфический нокаут SRF, индуцированный AAV-Cre-GFP (фиг. 2A). Действительно, не было перекрытия между окрашиванием SRF и экспрессией Cre, что демонстрирует эффективность нокаута. В микродиссекционных штампах NAc мы обнаружили значительное 50% снижение уровней белка SRF (t (11) = 4.3; p <0.001). Величина, вероятно, отражает тот факт, что часть ткани в таких микродиссекции не инфицирована вирусами.

Рисунок 2.

SRF опосредует индукцию ΔFosB в результате стресса хронического социального поражения. А. Инъекция AAV-Cre-GFP в NAc мышей Srffl / fl приводит к нокауту белка SRF в нейронах, экспрессирующих Cre. Введение AAV-GFP не дало заметного эффекта. Б. Такое избирательное отключение SRF из NAc полностью блокирует индукцию ΔFosB в NAc после стресса хронического социального поражения (n = 4 / группа). Отображаемые данные выражены в виде среднего значения ± SEM (представлены в виде столбцов ошибок). * p <0.05 по сравнению с контролем AAV-GFP; ** p <0.01 по сравнению с поражением AAV-GFP.

Затем мы выполнили количественный иммуногистохимический анализ для ΔFosB в NAc пораженных мышей Srffl / fl, которым интра-NAc инъецировали AAV-Cre-GFP или AAV-GFP. После стресса хронического социального поражения экспрессия ΔFosB значительно индуцировалась в NAc животных, которым инъецировали AAV-GFP (взаимодействие вируса × лечение, F (1,12) = 6.4; t-тесты с поправкой Бонферрони, контроль против поражения, p <0.05; AAV-Cre против AAV-GFP, p <0.01). Однако эта индукция не наблюдалась у мышей Srffl / fl, получавших AAV-Cre-GFP (фиг. 2B), демонстрируя, что индукция ΔFosB в NAc при хроническом стрессе требует SRF.

Выделение SRF в NAc способствует фенотипам, защищающим продепрессионные и проактивноподобные

Поскольку ранее было показано, что индукция ΔFosB под воздействием стресса хронического социального поражения способствует устойчивости (Vialou et al., 2010), мы предположили, что подавление SRF и, как следствие, потеря индукции ΔFosB у восприимчивых животных может представлять собой негативную адаптацию, которая в конечном итоге приводит к животные более уязвимы к пагубным последствиям стресса. Чтобы проверить эту гипотезу, мы индуцировали локальную NAc-специфическую делецию гена Srf у взрослых мышей Srffl / fl, как описано выше, и полученные в результате мыши и их контрольные группы были протестированы с использованием набора поведенческих парадигм для оценки исходной депрессии и тревожности. нравится поведение. Локальная делеция SRF в NAc способствовала эффекту, похожему на прогрессирующую депрессию, по результатам теста принудительного плавания (t (30) = 2.5; p <0.05), а также анксиогенному эффекту, измеренному в открытом поле (t (38) = 1.9; p <0.05) и тесты свет / темнота (t (8) = 1.9; p <0.05). Таким образом, мыши Srffl / fl, получавшие AAV-Cre-GFP в NAc, демонстрировали уменьшенную латентность до неподвижности в тесте принудительного плавания, меньшее время в центре открытого поля и меньшее время в светлом отсеке светлой / темной коробки. по сравнению с животными, которым инъецировали AAV-GFP (рис. 3A – C). Однако делеция SRF внутри NAc не изменяла исходные уровни локомоции, предполагая, что наблюдаемые поведенческие эффекты у животных с нокаутом SRF не были обусловлены аномалиями общей двигательной активности (рис. 3D). Эти данные интересны в свете предыдущих сообщений, предполагающих, что, хотя ΔFosB в NAc регулирует депрессивно-подобное поведение, он, по-видимому, не участвует в ответах, связанных с тревогой (Vialou et al., 2010). Наши текущие данные о том, что потеря SRF вызывает анксиогенные реакции, предполагают, что это происходит через мишени, отличные от ΔFosB.

Рисунок 3.

Нокаут SRF из NAc способствует продепрессионным и тревожным фенотипам. A – C, Селективное отключение SRF от NAc, достигнутое с помощью инъекции AAV-Cre-GFP в NAc мышей Srffl / fl, снижает латентный период до неподвижности в тесте принудительного плавания (n = 14–18 / группа; A) и сокращает время, проведенное в центре, и время, проведенное в светлом отсеке в тестах «открытое поле» (B) и свет / темнота (C), соответственно (n = 5–15 / группа). D: Никаких различий в базальной двигательной активности не наблюдалось в открытом поле у мышей, которым вводили внутри NAc инъекции AAV-GFP или AAV-Cre-GFP. E, F: повышенная восприимчивость к усвоенной беспомощности (n = 7–8 / группа; E) и стрессу от социального поражения (n = 5–6 / группа; F), как измерено, соответственно, латентностью к побегу и временем социального взаимодействия. . Отображаемые данные выражены в виде среднего значения ± SEM (представлены в виде столбцов ошибок). * p <0.05 по сравнению с GFP или по сравнению с отсутствием цели; ** p <0.01 по сравнению с GFP; *** p <0.001 по сравнению с GFP.

Затем мы изучили, увеличивает ли делеция SRF в NAc уязвимость животного к пагубным последствиям повторяющегося стресса. Мышей Srffl / fl, которым инъецировали AAV-Cre-GFP или AAV-GFP в NAc, исследовали на двух моделях депрессии, обученной беспомощности и стрессу хронического социального поражения. При выученной беспомощности животные Srffl / fl, получавшие AAV-Cre-GFP, демонстрировали увеличенную латентность, чтобы избежать шока стопы после предшествующего воздействия неизбежного шокового стресса стопы (взаимодействие лечение × испытания, F (14,180) = 10.2; t-тесты с поправкой Бонферрони, p <0.001; AAV-Cre по сравнению с AAV-GFP, p <0.01), что указывает на повышенную восприимчивость к вызванным стрессом поведенческим дефицитам (рис. 3E). Аналогичным образом, локальная делеция SRF из NAc также увеличивала социальную неприязнь (t (10) = 1.8; p <0.05) по сравнению с контрольными животными, которым инъецировали AAV-GFP, после стресса хронического социального поражения (рис. 3F), что является эффектом, подобным депрессии.

Отсутствие участия SRF в индукции ΔFosB и поведенческих реакциях на кокаин

Учитывая, что ΔFosB также индуцируется в NAc в ответ на наркотики, вызывающие злоупотребление, такие как кокаин, было интересно изучить потенциальную роль SRF в действии кокаина. В отличие от стресса хронического социального поражения, повторное воздействие кокаина не влияло на экспрессию белка SRF в NAc (t (14) = 0.8; p> 0.05) (рис. 4A) и не влияло на связывание SRF с промотором гена fosB в этой области мозга. (t (4) = 0.7; p> 0.05) (рис. 4B). Это говорит о том, что, в отличие от стресса, индукция ΔFosB после хронического приема кокаина не опосредуется через SRF. Мы проверили это напрямую, исследуя, изменяется ли накопление ΔFosB после хронического приема кокаина у животных Srffl / fl, получавших AAV-Cre-GFP по сравнению с AAV-GFP в NAc. Мы обнаружили, что делеция SRF не влияла на вызванное кокаином накопление ΔFosB в этой области мозга (рис. 4C).

Рисунок 4.

Потеря SRF не влияла на индукцию кокаина ΔFosB или поведение, регулируемое кокаином. A, B, повторное воздействие кокаина (7 d, 20 мг / кг кокаина-HCl) не влияло на экспрессию белка SRF в NAc (A) или на связывание SRF с промотором гена fosB в этой области мозга (B) 24 h после воздействие препарата (n = 5 / группа). C, ΔFosB, измеренное иммуноцитохимически, после хронического воздействия кокаина не зависит от NAc-специфического нокаута SRF. D, E, локальное удаление SRF из NAc также не влияло на локомоторную активность после инъекции солевого раствора (d 1) на кокаин-индуцированную локомоторную активность и сенсибилизацию (n = 8 / группа) (d 1-7; D) или на предпочтениях, связанных с кокаином (n = 8 / группа; E). Отображаемые данные выражаются как среднее ± SEM (представлены как полосы ошибок).

Чтобы продолжить это удивительное открытие, мы исследовали, изменяет ли селективный нокаут SRF из NAc поведенческие реакции на кокаин. В соответствии с отсутствием регуляции SRF индукции ΔFosB кокаином, NAc-специфический нокаут SRF не оказывал влияния на двигательную активность, вызванную острой кокаином, или локомоторную сенсибилизацию, наблюдаемую после повторных воздействий кокаина (лечение × взаимодействие времени, F (4,80) = 0.3; p> 0.05) (рис. 4D). Аналогичным образом, NAc-специфический нокаут SRF не повлиял на обусловленное кокаином предпочтение места (t (14) = 0.1; p> 0.05) (рис. 4E), что является косвенным показателем вознаграждения за кокаин.

Обсуждение

Это исследование идентифицировало SRF как новый медиатор верхнего уровня ΔFosB в NAc после хронического стресса социального поражения и подразумевает SRF в развитии депрессивного и тревожноподобного поведения. Мы даем прямые доказательства того, что хроническое стрессовое поражение со стороны общества уменьшает уровни SRF в NAc восприимчивых, но не упругих животных, и что эта подавление препятствует индукции ΔFosB в этой области мозга, что, как мы показали, необходимо для эффективного преодоления хронического стресса, т.е. устойчивость (Vialou et al., 2010). Аналогичное снижение экспрессии SRF было обнаружено в NAc депрессивных людей, где также уменьшалась мРНК FOSB и белок, Напротив, уровни ΔFosB не были снижены у NAc восприимчивых мышей, несмотря на понижающую регуляцию SRF, что еще не выявило других механизмов транскрипции, контролирующих экспрессию ΔFosB. Каузальная роль SRF в опосредовании индукции ΔFosB в NAc после хронического стресса была установлена с помощью индуцируемой генетической делеции SRF из этой области мозга. Поведенческий анализ мышей с этим NAc-специфическим нокаутом SRF далее подразумевает, что SRF играет ключевую роль в развитии как базовой, так и стрессовой депрессии и тревожноподобного поведения. В поразительном контрасте удаление SRF не влияло на индукцию ΔFosB в ответ на хроническое введение кокаина или на поведенческие эффекты кокаина. Эти результаты подтверждают новую специфическую роль стимула для SRF в регуляции индукции ΔFosB и поведенческих реакций на различные возмущения окружающей среды.

Ранее было показано, что SRF-опосредованная транскрипция реагирует на синаптическую активность, в основном вызванная увеличением притока кальция, а также на усиление нейротрофической активности, особенно в случае нейротрофического фактора мозга (BDNF) (Bading et al., 1993; Xia et al., 1996, Johnson et al., 1997, Chang et al., 2004, Kalita и др., 2006, Knöll и Nordheim, 2009). Это вызывает интересный вопрос о том, почему СРФ является нарушенной в NAc восприимчивых, но не устойчивых мышей после хронического стресса социального поражения. Это дифференциальное регулирование, скорее всего, не опосредовано сигналами допамина или BDNF, поскольку восприимчивые мыши отображают повышенные уровни белка BDNF и увеличивают сигнал BDNF вниз по течению в NAc, а также улучшают взрывную работу дофаминовых нейронов вентральной тегментальной области (VTA), которые иннервируют NAc, тогда как устойчивые животные отображают нормальные уровни сигнализации BDNF и скорости VTA (Krishnan et al., 2007). Альтернативная возможность заключается в том, что экспрессия SRF подавляется в NAc в ответ на измененную глутаматергическую иннервацию этой области головного мозга, которая, как мы показали, дифференциально регулируется у восприимчивых против упругих мышей (Vialou et al., 2010). Необходима дальнейшая работа для непосредственного изучения этого и других возможных механизмов.

Недавние исследования с использованием генома и других методов предполагают, что ~5-10% целевых генов SRF в нейронах являются непосредственными ранними генами (Philippar et al., 2004, Ramanan et al., 2005, Etkin et al., 2006, Knöll и Нордхайм, 2009). Это согласуется с нашими данными, демонстрирующими критическую роль SRF в индукции ΔFosB, усеченного продукта немедленного раннего гена fosb, при хроническом стрессе. Интересно, что многочисленные целевые гены SRF, идентифицированные в этих различных исследованиях, также представляют собой известные мишени ΔFosB в NAc (Kumar et al., 2005, Renthal et al., 2008, 2009, Maze et al., 2010). Среди этих обычно регулируемых генов есть несколько, которые, как известно, регулируют нейронный цитоскелет (например, Cdk5, Arc и Actb). Это, в свою очередь, согласуется с сообщениями о том, что SRF влияет на динамику актина и подвижность нейронов в нескольких типах нейронных клеток (Alberti et al., 2005, Ramanan et al., 2005, Knöll и др., 2006), тогда как ΔFosB известен влияют на рост дендритного позвоночника нейронов NAc (Maze et al., 2010). Такие общие функциональные конечные точки могут отражать согласованные эффекты SRF в сочетании с его индукцией ΔFosB, действующей на ряд общих генов-мишеней, чтобы влиять на морфологию нейронов и, в конечном счете, сложное поведение.

Было продемонстрировано также, что SRF играет важную роль в регуляции синаптической пластичности и экспрессии и поведения генов, зависящих от активности нейронов. Например, потеря SRF-зависимой индукции немедленных ранних генов в ответ на добровольное исследование новой среды или активацию нейронов электросудорожными судорогами была связана с нарушением долгосрочного синаптического потенцирования в гиппокампе мутантов Srf (Ramanan et al. , 2005, Etkin et al., 2006). Кроме того, показано, что истощение СРФ в гиппокампе вызывает дефицит в долгосрочной синаптической депрессии, немедленную раннюю экспрессию генов, вызванную новым контекстом, и нарушение привыкания при исследовании новой среды (Etkin et al., 2006). Эти данные устанавливают важность SRF в способности животного соответствующим образом адаптироваться к возмущениям окружающей среды, как в вышеупомянутом случае обучения, чтобы привыкнуть к новой среде, или, в случае адаптации к негативным стрессовым стимулам, предотвращать распространение стресса. -индуцированные поведенческие дефициты, как в нашем настоящем исследовании. Таким образом, мы наблюдаем, что животные, демонстрирующие дефицит экспрессии SRF, либо в ответ на стресс социального поражения у восприимчивых индивидуумов, либо в результате прямого нокдауна SRF, демонстрируют усиленное депрессивное и тревожное поведение. Учитывая, что у людей с депрессией также наблюдаются пониженные уровни SRF в NAc, можно предположить, что SRF играет фундаментальную роль в регулировании способности человека положительно адаптироваться к негативным стимулам окружающей среды, частично посредством регуляции экспрессии ΔFosB в NAc.

РАЗЛИЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ: УКАЗАНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ СТРЕССА

Неожиданным нахождением настоящего исследования является то, что, хотя SRF необходим для накопления ΔFosB в NAc в ответ на хронический стресс, это не требуется для индукции ΔFosB в той же области мозга в ответ на хронический кокаин. Аналогично, SRF не требуется для нормальных поведенческих реакций на препарат. Эти данные показывают, что, несмотря на то, что ΔFosB индуцируется в NAc в ответ на многие типы стимулов (Nestler et al., 1999, Nestler, 2008), по-видимому, существуют различные молекулярные пути, ведущие к индукции ΔFosB. Одним из возможных объяснений этих выводов является частично различные типы клеток, которые показывают накопление ΔFosB в ответ на стресс по сравнению с кокаином. Хронический стресс индуцирует ΔFosB примерно одинаково в двух основных субпопуляциях средних колючих нейронов NAc, которые экспрессируют преимущественно D1 и D2 дофаминовые рецепторы, тогда как хронический кокаин индуцирует ΔFosB преимущественно внутри нейронов D1 + (Kelz et al., 1999, Perrotti et al., 2004) , Таким образом, возможно, что SRF-зависимые пути могут быть важны для индукции ΔFosB в D2 + нейронах, Однако это не объясняет полную потерю индукции ΔFosB у мышей с нокаутом SRF после хронического стресса, поскольку индукция происходит в обоих подтипах нейронов. Альтернативное объяснение заключается в том, что хронический стресс и хронический кокаин воздействуют на отдельные внутриклеточные сигнальные каскады в силу их различных режимов действия на нейронах NAc, при хроническом стрессе, возможно, воздействуя на измененную глутаматергическую передачу, как отмечалось ранее, и хронический кокаин, работающий преимущественно через D1 (Nestler, 2008). Еще одна возможность заключается в том, что индукция ΔFosB хроническим стрессом по сравнению с хроническим кокаином зависит от различных транскрипционных механизмов, которые дифференциально контролируются отдельными нервными входами, иннервирующими NAc из различных глутаматергических областей проекции, например, несколькими областями префронтальной коры, гиппокампа и миндалин. Необходима дальнейшая работа для изучения этих и альтернативных возможностей.

Вместе наши результаты идентифицируют новый механизм транскрипции, через который ΔFosB индуцируется в NAc, чтобы опосредовать предрезивные реакции на стрессовые стимулы. Это исследование также дает важное новое представление о роли SRF на уровне NAc в регуляции депрессивного и тревожноподобного поведения. Лучшее понимание транскрипционной роли SRF в регуляции такого поведения поможет в идентификации новых генов-мишеней, участвующих в устойчивости к расстройствам, связанным со стрессом, и может способствовать будущей разработке более эффективных методов лечения антидепрессантами.

Эта работа была поддержана грантами Национального института психического здоровья и Национального института по борьбе со злоупотреблением наркотиками и исследовательским альянсом с AstraZeneca. Мы благодарим Дэвида Д. Гинти за предоставление мышей Srffl / fl.

Переписка должна быть адресована Эрику Дж. Нестлеру, Отделение нейробиологии Фишберга, Медицинская школа Маунт-Синай, One Gustave L. Levy Place, Box 1065, Нью-Йорк, NY 10029-6574. [электронная почта защищена]

Фактор ответа сыворотки способствует устойчивости к хроническому социальному стрессу посредством индукции DeltaFosB (2010)

Абстрактные

Введение

Материалы и методы

Итоги

Обсуждение

Рекомендации

Полезное