Абстиненция вызывает различные паттерны экспрессии FosB / ∆FosB у беспородных швейцарских мышей, классифицированных как чувствительные и устойчивые к индуцированной этанолом локомоторной сенсибилизации (2014 г.)

Pharmacol Biochem Behav. 2014 Feb; 117: 70-8. doi: 10.1016 / j.pbb.2013.12.007. Epub 2013 Dec 16.

Де Паули РФ¹, Coelhoso CC², Tesone-Coelho C², Линарди А³, Mello LE², Silveira DX¹, Santos-Junior JG⁴.

Абстрактные

Хроническое воздействие лекарственного средства и снятие препарата индуцируют экспрессирующую пластичность нейронов, которые можно рассматривать как функциональные и патологические реакции. Хорошо известно, что пластичность нейронов в лимбической системе играет ключевую роль в рецидиве, а также в компульсивных характеристиках наркомании. Хотя увеличение экспрессии FosB / DeltaFosB представляет собой одну из наиболее важных форм пластичности нейронов при наркомании, неясно, представляют ли они функциональную или патологическую пластичность. Примечательно, что индивидуальные различия в переходе от рекреационного использования к наркомании. Эти различия были отмечены в исследованиях, связанных с парадигмой локомоторной сенсибилизации, вызванной этанолом. В настоящем исследовании мы исследовали, чувствительны ли сенсибилизированные и не сенсибилизированные мыши в терминах экспрессии FosB / DeltaFosB. Взрослых самцов выведенных из строя швейцарских мышей ежедневно обрабатывали этанолом или физиологическим раствором для 21days. В соответствии с локомоторной активностью в фазе получения они классифицировались как сенсибилизированные (EtOH_High) или не сенсибилизированные (EtOH_Low). После 18h или 5days их мозг обрабатывали для иммуногистохимии FosB / DeltaFosB. В 5-ый день отмены мы могли наблюдать повышенную экспрессию FosB / DeltaFosB в группе EtOH_High (в моторной коре), в группе EtOH_Low (в брюшной тегментальной области) и в обеих группах (в полосатом теле). Различия были более последовательными в группе EtOH_Low. Таким образом, поведенческая изменчивость, наблюдавшаяся на этапе сбора вызванной этанолом локомоторной сенсибилизации, сопровождалась дифференциальной пластичностью нейронов во время периода отмены. Кроме того, различные образцы экспрессии FosB / DeltaFosB, обнаруженные у сенсибилизированных и не сенсибилизированных мышей, по-видимому, больше связаны с периодом отмены, а не с хроническим воздействием лекарственного средства. Наконец, увеличение экспрессии FosB / DeltaFosB в течение периода отмены можно рассматривать как обусловленное как функциональной, так и патологической пластичностью.

Галерея

Выражение DeltaFosB является важной формой пластичности нейронов при наркомании
Однако неясно, представляет ли он функциональную или патологическую пластичность.
Здесь мы обнаружили различия в DeltaFosB среди сенсибилизированных и не сенсибилизированных мышей.
Эти различия больше связаны с периодом отмены, а не с лекарственным воздействием.
Мы полагаем, что эти изменения отражают как функциональную, так и патологическую пластичность.

Ключевые слова

FosB;
DeltaFosB;
Локомоторная сенсибилизация;
Запросить выплату;
Поведенческая изменчивость;
Мыши

1. Введение

Задача текущих нейробиологических исследований в области наркомании заключается в том, чтобы понять механизмы нейроновой пластичности, которые опосредуют переход от рекреационного использования к потере контроля над наркотиками и употреблению наркотиков. Одна из наиболее важных теорий наркомании, называемая «темной стороной склонности», предполагает, что происходит прогрессирование от импульсивности (связанной с положительным подкреплением) к компульсивности (связанное с отрицательным подкреплением). Эта прогрессия в свернутом цикле включает следующие состояния: озабоченность / ожидание, опьянение выпивки и снятие / отрицательное воздействие (Koob и Le Moal, 2005, Koob и Le Moal, 2008 и Кооб и Волков, 2010). Из этого сценария исследования наркомании фокусировались на нейробиологических механизмах, связанных с отрицательными эмоциональными состояниями, возникающими как при остром, так и затяжном воздержании. Согласно теории «темной стороны склонности», как представляется, происходят долгосрочные и постоянные изменения пластичности нейронных цепей, направленные на ограничение награды. Однако эти изменения пластичности приводят к негативному эмоциональному состоянию, которое возникает, когда предотвращается доступ к препарату. Этот механизм обеспечивает сильное мотивационное стремление к установлению зависимости, а также его поддержанию (Koob и Le Moal, 2005 и Koob и Le Moal, 2008).

Локомоторная сенсибилизация является полезной моделью на животных, основанной на том факте, что увеличение субъективного воздействия лекарств при их повторном воздействии аналогично увеличению вызванных лекарственными средствами стимуляторов локомоторных эффектов (Вандершурен и Каливас, 2000 и Вандершурен и Пирс, 2010). Хотя локомоторная сенсибилизация не подражает нескольким видам поведения, связанным с наркоманией, ее временные морфологические и нейрохимические особенности находятся параллельно с теми, которые приводят к переходу от рекреационного использования к самой наркотической зависимости (Робинсон и Колб, 1999, Вандершурен и Каливас, 2000 и Вандершурен и Пирс, 2010). Традиционно протокол локомоторной сенсибилизации включает три этапа: приобретение (повторное лекарственное воздействие), период отмены и вызов (новый контакт с препаратом после периода отмены). К сожалению, большинство исследований, использующих локомоторную сенсибилизацию, фокусировались только на этапе сбора и поиска, перекрывая период вывода.

Хорошо известно, что повторное воздействие наркотических средств (Perrotti et al., 2008) и хронического стресса (Perrotti et al., 2004) увеличивает экспрессию фактора транскрипции fosB / deltafosB в кортиколимбической системе. Предполагается, что накопление FosB / DeltaFosB в этих регионах играет центральную роль в устойчивости к стрессу (Berton и др., 2007 и Vialou et al., 2010) и в полезных эффектах кокаина (Harris et al., 2007 и Muschamp et al., 2012), этиловый спирт (Kaste et al., 2009 и Li et al., 2010) и опиоиды (Zachariou et al., 2006 и Solecki et al., 2008). Таким образом, возможно, что FosB / DeltaFosB модулирует некоторые из событий нейроновой пластичности, связанные с вызванной этанолом локомоторной сенсибилизацией, а также изъятие, которое наступает после фазы сбора локомоторной сенсибилизации.

Следует отметить, что во время перехода от рекреационного использования к наркомании наблюдаются индивидуальные различия (Flagel и др., 2009, Джордж и Кооб, 2010 и Swendsen и Le Moal, 2011). Например, мыши DBA / 2 J более склонны реагировать, чем мыши C57BL / 6 J, на индуцированную этанолом сенсибилизацию локомоторной системы (Phillips и др., 1997 и Melón и Boehm, 2011a). У аутированных швейцарских мышей поведенческая изменчивость в отношении вызванной этанолом локомоторной сенсибилизации была впервые описана Мазур и душ Сантуш (1988), С тех пор другие исследования продемонстрировали важные нейрохимические особенности, связанные с изменчивостью поведения при приобретении вызванной этанолом локомоторной сенсибилизации (Souza-Formigoni и др., 1999, Abrahão et al., 2011, Abrahão et al., 2012, Quadros et al., 2002a и Quadros et al., 2002b). Однако в этих исследованиях не рассматривалось влияние изменчивости поведения в период отмены после фазы сбора локомоторной сенсибилизации. В недавнем исследовании наша лаборатория описала существенное различие между сенсибилизированными и не сенсибилизированными отбитыми швейцарскими мышами в отношении экспрессии рецептора каннабиноидного типа 1 (CB1R) во время отмены. В этом исследовании сенсибилизированные (но не сенсибилизированные мыши) увеличивали экспрессию CB1R в префронтальной коре, вентральной тегментальной области, миндалине, полосатом и гиппокампе (Coelhoso et al., 2013).

Учитывая четко установленную вариабельность поведения беспородных швейцарских мышей в отношении локомоторной сенсибилизации, вызванной этанолом, и то, что эта вариабельность сопровождается отчетливыми нейрохимическими особенностями во время последующего абстиненции, в настоящем исследовании изучалась экспрессия FosB / DeltaFosB у сенсибилизированных и несенсибилизированных мышей вначале. (18 ч) и через 5 дней после отмены.

2. Материал и методы

2.1. Предметы

Использовались самцы беспородных мышей Swiss Webster (колония EPM-1, Сан-Паулу, штат Пенсильвания), происходящие от линии Albino Swiss Webster из Центра разработки моделей животных в биологии и медицине Федерального университета Сан-Паулу. . На момент начала тестирования мыши были 12-недельного возраста (30-40 г). Группы из 10 мышей содержали в клетках (40 × 34 × 17 см) с подстилкой из щепы. Температура (20–22 ° C) и влажность (50%) контролируемых колоний животных поддерживалась в режиме свет / темнота (12/12 ч), с включением света в 07:00, с использованием гранул для мышей и водопроводной воды. libitum, кроме периода тестирования. Мышей содержали в этих условиях содержания не менее 7 дней до начала лечения лекарственными препаратами и поведенческих тестов. Уход за животными и экспериментальные процедуры проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по этике ухода и использования животных Университета (номер протокола: 2043/09), в соответствии с Директивой ЕС 2010/63 / EU для экспериментов на животных (http://ec.europa.eu/environmental/chemicals/lab_animals/legislation_en.htm).

2.2. Локомоторная сенсибилизация

Протокол локомоторной сенсибилизации был основан на предыдущем исследовании из нашей собственной лаборатории (Coelhoso et al., 2013). В начале протокола всем животным внутрибрюшинно (внутрибрюшинно) вводили физиологический раствор и немедленно тестировали в автоматическом боксе активности (Insight, Бразилия) в течение 15 минут для установления базальной локомоции. Двумя днями позже животным ежедневно вводили этанол (2 г / кг, 15% мас. / Об. В 0.9% NaCl, внутрибрюшинно - группа EtOH, N = 40) или физиологический раствор (аналогичный объем, ip, - контрольная группа, N = 12), в течение 21 дня. Сразу после 1-й, 7-й, 14-й и 21-й инъекций животных помещали в клетку для активности на 15 мин. Горизонтальную локомоцию в каждой ситуации измеряли с помощью системы поведенческого анализа (Pan Lab, Испания). Как и ожидалось ( Мазур и душ Сантуш, 1988 и Coelhoso et al., 2013), поведенческая изменчивость в локомоторной активности на 21st день приобретения позволяет распределять животных группы EtOH в подгруппах 2: EtOH_High (взято из верхнего 30% распределения) и EtOH_Low (взято из нижнего 30% распределение). Таким образом, в анализ был включен только 60% животных. Эта стратегия идентична той, которая используется в исследованиях, посвященных индивидуальной изменчивости в парадигме сенсибилизации этанола ( Мазур и душ Сантуш, 1988, Souza-Formigoni и др., 1999, Quadros et al., 2002a, Quadros et al., 2002b, Abrahão et al., 2011, Abrahão et al., 2012 и Coelhoso et al., 2013).

После классификации экспериментальных групп мы провели 2 независимых эксперимента в соответствии с временными критериями периода исключения: (i) животные были подвергнуты фазе приобретения и умерщвлены через 18 часов после отмены, и (ii) животные, представленные на этапе получения и умерщвленные. через 5 дней после вывода. Итак, это исследование включало 3 экспериментальные группы (Control, EtOH_High и EtOH_Low), которые были разделены на 2 подгруппы (18 часов и 5 дней отмены) (N = 6 на подгруппу). Выбор этих двух временных отметок в период отмены был обусловлен кинетическими аспектами экспрессии FosB и DeltaFosB после 18 часов отмены (как объяснено в разделе обсуждения) и после 5 дней отмены, на основе предыдущих исследований нашей лаборатории. который исследовал некоторые нейрохимические особенности периода отмены в рамках парадигмы локомоторной сенсибилизации ( Fallopa и др., 2012 и Escosteguy-Neto и др., 2012). Наконец, чтобы провести корреляцию между локомоторной сенсибилизацией и экспрессией FosB / DeltaFosB, мы рассчитали балл локомоторной сенсибилизации для каждого животного по формуле: оценка = (Локомоция в 21-й день - Локомоция в 1-й день) * 100 / Локомоция в 1 день.

2.3. иммуногистохимия

После соответствующего периода отмены животных глубоко анестезировали коктейлем, содержащим кетамин (75 мг / кг, внутрибрюшинно) и ксилазин (25 мг / кг, внутрибрюшинно). После потери роговичного рефлекса их перфузировали транскардиально 100 мл 0.1 М раствора фосфатного буфера [фосфатно-солевой буфер (PBS)], а затем 100 мл 4% параформальдегида (PFA). Мозг удаляли сразу после перфузии, хранили в PFA в течение 24 часов, а затем держали в растворе 30% сахароза / PBS в течение 48 часов. Серийные коронковые срезы (30 мкм) вырезали с использованием замораживающего микротома и помещали в раствор, предотвращающий замерзание, который будет использоваться в процедурах иммуногистохимии, путем свободно плавающего окрашивания.

Для иммуногистохимии использовали обычный метод авидин-биотин-иммунопероксидазы. Срезы головного мозга всех экспериментальных групп были включены в один цикл, предварительно обработанные пероксидазой водорода (3%) в течение 15 минут, а затем промытые PBS в течение 30 минут. Затем все срезы экспонировали в течение 30 минут в PBS-BSA 5%, чтобы избежать неспецифических реакций. После этого срезы инкубировали в течение ночи с первичным кроличьим антителом против FosB / DeltaFosB (1: 3,000; Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США, кат. AV32519) в растворе PBS-T (30 мл PBS, 300 мкл Triton Х-100). Затем срезы инкубировали в течение 2 ч в биотинилированном вторичном антителе козьего анти-кроличьего IgG (1: 600; Vector, Burlingame, CA, USA) при комнатной температуре. Затем срезы обрабатывали комплексом авидин-биотин (стандартный набор Vectastain ABC; Vector, Burlingame, CA, USA) в течение 90 мин и подвергали усиленной никелем диаминобензидиновой реакции. Между этапами срезы промывали PBS и встряхивали на ротаторе. Срезы помещали на покрытые желатином предметные стекла, сушили, обезвоживали и закрывали покровным стеклом.

Были проанализированы следующие энцефальные области: предлобная кора (передняя кору головного мозга (Cg1), предлимбическая кора (PrL) и инфралимическая кора (IL)], моторная кора [первичный (M1) и вторичный (M2)], дорсальный стриатум [дорсомедиальный стриатум ( DmS) и дорсолатеральная стриатум (DlS)], брюшная полосатая яма (ядро окутанного ядра (Acbco) и оболочка (Acbsh), вентральный паллидум (VP)], гиппокамп [пирамидальный слой Cornus Ammong 1 и 3 (CA1 и CA3, соответственно) гранулированный слой зубчатой извилины (DG)], амигдала [базолатеральное ядро (BlA) и центральное ядро (CeA)], вентромедиальное ядро гипоталамуса (VMH) и брюшная тегментальная область [передняя (VTAA) и задняя (VTAP) части] ( Увидеть рисунок 1). Микроскоп Nikon Eclipse E200, подключенный к компьютеру, использовался для захвата изображений с каждой секции при увеличении × 20. Изображения были сохранены в виде архивов .tiff для апостериорного анализа иммунореактивности FosB / DeltaFosB. Иммунореактивные клетки подсчитывали с помощью программного обеспечения ImageJ (NIH Image, Bethesda, MD, США). Области мозга были очерчены на каждой фотографии в соответствии с Атласом мозга стереотаксических мышей (Франклин и Паксинос, 1997). Так как микрофотографии, сделанные под микроскопом, составляют 2.5 × 10³ мкм² при 20-кратном увеличении количественное определение клеток, меченных FosB / DeltaFosB, выражается как среднее количество иммуноокрашенных клеток на 2.5 × 10³ мкм². Значения, полученные в группах EtOH, были нормализованы к контрольным значениям и выражены в%. (Контроль = 100%).

Рисунок 1.
Схематическое изображение выбранных зон мозга. Схематический чертеж участков коронации головного мозга мыши, указывающих области, отобранные (адаптированные из Франклин и Паксинос, 1997). M1 = первичная моторная кора; M2 = вторичная моторная кора, CG1 = передняя поясная кора, PrL = прелимбическая кора, IL = инфралимбическая кора, Acbco = ядро прилежащего ядра, Acbsh = оболочка прилежащего ядра, VP = вентральное паллидум, DmS = дорсомедиальное полосатое тело, DlS = дорсолатеральное полосатое тело, CA1 = Cornus Ammonis 1, CA3 = Cornus Ammonis 3; DG = зернистый слой зубчатой извилины, BlA = базолатеральное ядро миндалины, CeA = центральное ядро миндалины, VmH = вентромедиальное ядро гипоталамуса, VTAA = передняя часть вентральной тегментальной области, VTAP = задняя часть вентральной тегментальной области.
Параметры рисунка

2.4. статистический анализ

Первоначально метод Шапиро – Уилка использовался для проверки нормальности распределения всех переменных. Поведенческие результаты были проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа для повторного измерения, учитывая в качестве фактора 5 периодов локомоторной сенсибилизации: базальный, день 1, день 7, день 14 и день 21. Гистологические результаты были проанализированы с помощью двустороннего дисперсионного анализа с учетом в качестве факторов: период отмены (18 ч и 5 дней) и экспериментальная группа (контроль, EtOH_High и EtOH_Low). Непараметрические переменные были стандартизированы в Z-баллы, чтобы уменьшить разброс данных, и впоследствии применены в двухфакторном дисперсионном анализе, как описано ранее. Ньюман Кеулс ретроспективном использовался при необходимости. Наконец, мы исследовали возможные корреляции между FosB / DeltaFosB положительными клетками и оценками локомоторной сенсибилизации. Эти корреляции были рассчитаны только для ядер, где были обнаружены статистические различия между экспериментальными группами. Поскольку эти различия были ограничены 5 днями отказа (см. Раздел результатов), значения FosB / DeltaFosB, учитываемые в этих корреляциях, относятся к этому конкретному периоду времени отказа. Поскольку эти различия были ограничены 5 днями отмены (см. Раздел результатов), значения FosB / DeltaFosB, учитываемые в этой корреляции, относятся к этому конкретному времени отмены. Уровень значимости был установлен на уровне 5% (p <0.05).

3. Результаты

3.1. Локомоторная сенсибилизация

ANOVA для повторных измерений обнаружил существенные различия в групповом коэффициенте [F_(2,32) = 68.33, p <0.001], в период протокола [F_(4,128) = 9.13, p <0.001], а взаимодействие между ними [F_(8,128) = 13.34, p <0.001]. Не было различий в базальной локомоции, и обе группы EtOH имели одинаковое увеличение локомоции в первый день приобретения по сравнению с контрольной группой (p <0.01). Однако EtOH_High (но не EtOH_Low) демонстрировал постепенное увеличение двигательной активности на протяжении фазы приобретения (p <0.01 по отношению к контрольной группе и группе EtOH_Low в последний день сбора данных; p <0.01 по отношению к его двигательной активности в первый день приобретения) ( рисунок 2). Эти данные подтвердили результаты первоначального исследования ( Мазур и душ Сантуш, 1988) и из нашего предыдущего доклада ( Coelhoso et al., 2013) относительно поведенческой изменчивости у выведенных из строя швейцарских мышей, вызванных вызванной этанолом локомоторной сенсибилизацией.

Рисунок 2.
Этанол способствует постепенному и устойчивому увеличению локомоции на протяжении длительного лечения в группе EtOH_High, но не в группе EtOH_Low. Данные были выражены как среднее значение ± SEM. N = 12 для контрольных, EtOH_High и EtOH_Low групп. ^⁎⁎P <0.01 по отношению к контрольной группе за тот же период. ^##P <0.01 по отношению к группе EtOH_Low за тот же период. ^‡‡P <0.01 по отношению к основной двигательной активности в той же группе. ^¥¥P <0.01 по отношению к двигательной активности на 1^st день приобретения, в пределах одной группы.
Параметры рисунка

3.2. Выражение FosB / DeltaFosB

Иллюстративная фотомикрография иммунореактивности FosB / DeltaFosB изображена в рисунок 3 и нормированные значения показаны в рисунок 4, рисунок 5, рисунок 6 и рисунок 7, Двунаправленная ANOVA обнаружила значительные различия в M1, M2, DmS, DlS, Acbco, Acbsh, VP и VTA (для ненормированных значений иммунореактивности FosB / DeltaFosB и статистического анализа всех структур, см. Таблица Suppl1 и Таблица 1соответственно). В структурах, где можно было наблюдать статистические различия, было четыре различных паттерна экспрессии FosB / DeltaFosB. В первом, наблюдаемом в M1 и M2, наблюдалось увеличение экспрессии FosB / DeltaFosB на пятый день отмены этанола только в группе EtOH_High (по сравнению со значениями EtOH_High на 18 часах отмены, а также с контрольной группой. и группы EtOH_Low через 5 дней после отмены) (см. рисунок 4). Во втором паттерне, наблюдаемом в VTAA, экспрессия FosB / DeltaFosB увеличивалась через 5 дней отмены этанола только в группе EtOH_Low (по сравнению с значениями EtOH_Low через 18 часов после отмены, а также с контрольной группой через 5 дней после отмены). ) (увидеть рисунок 5). В третьем паттерне, наблюдаемом в DmS, Acbco и Acbsh, экспрессия FosB / DeltaFosB увеличивалась через 5 дней после отмены этанола в обеих группах EtOH_High и EtOH_Low (по сравнению с их соответствующими значениями через 18 часов после отмены), однако только в группе EtOH_Low. отличался от контрольной группы (см. рисунок 6). Наконец, в четвертом паттерне, наблюдаемом в DlS и VP, экспрессия FosB / DeltaFosB увеличивалась через 5 дней после отмены этанола как в группах EtOH_High, так и EtOH_Low (по сравнению с их соответствующими значениями через 18 часов после отмены), хотя это увеличение было статистически более выраженным. в EtOH_Low, чем в EtOH_High группе, и только группа EtOH_Low отличалась от контрольной группы (см. рисунок 7).

Рисунок 3.
Иллюстративная микрофотография иммунореактивности FosB / DeltaFosB при увеличении × 20. DmS = дорсомедиальное полосатое тело; DlS = дорсолатеральное полосатое тело; Acbco = прилежащее ядро ядра; Acbsh = прилежащее ядро оболочки; VP = брюшной паллидум; VTAa = передняя часть вентральной тегментальной области.
Параметры рисунка

Рисунок 4.
Экспрессия FosB / DeltaFosB через 18 часов и 5 дней периода вывода в группах EtOH_High и EtOH_Low в M1 и M2. Данные были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего и представляют собой нормализованные данные в соответствии со значениями контрольных групп (пунктирная линия - считается за 100%). Серые столбцы = 18 часов выхода этанола; Черные столбцы = 5 дней отказа от этанола. ** P <0.01 по отношению к соответствующей контрольной группе; ## P <0.01 по отношению к соответствующему значению через 18 часов после отмены. ‡‡ P <0.01 по отношению к группе EtOH_Low за тот же период. M1 = первичная моторная кора, M2 = вторичная моторная кора.
Параметры рисунка

Рисунок 5.
Экспрессия FosB / DeltaFosB через 18 часов и 5 дней периода вывода в группах EtOH_High и EtOH_Low в VTA. Данные были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего и представляют собой нормализованные данные в соответствии со значениями контрольных групп (пунктирная линия - считается за 100%). Серые столбцы = 18 часов выхода этанола; Черные столбцы = 5 дней отказа от этанола. ** P <0.01 по отношению к соответствующей контрольной группе; ## P <0.01 по отношению к соответствующему значению через 18 часов после отмены. VTA = вентральная область покрышки.
Параметры рисунка

Рисунок 6.
Экспрессия FosB / DeltaFosB через 18 часов и 5 дней периода вывода в группах EtOH_High и EtOH_Low в Acbco, Acbsh и DmS. Данные были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего и представляют собой нормализованные данные в соответствии со значениями контрольных групп (пунктирная линия - считается за 100%). Серые столбцы = 18 часов выхода этанола; Черные столбцы = 5 дней отказа от этанола. * P <0.05 ** P <0.01 по отношению к соответствующей контрольной группе; ## P <0.01 по отношению к соответствующему значению через 18 часов после отмены. Acbco = прилежащее ядро ядра, Acbsh = прилежащее ядро оболочки, DmS = дорсомедиальное полосатое тело.
Параметры рисунка

Рисунок 7.
Экспрессия FosB / DeltaFosB через 18 часов и 5 дней периода вывода в группах EtOH_High и EtOH_Low в VP и DlS. Данные были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего и представляют собой нормализованные данные в соответствии со значениями контрольных групп (пунктирная линия - считается за 100%). Серые столбцы = 18 часов выхода этанола; Черные столбцы = 5 дней отказа от этанола. ** P <0.01 по отношению к соответствующей контрольной группе; # P <0.05 ## P <0.01 по отношению к соответствующему значению через 18 часов после отмены. ‡‡ P <0.01 по отношению к группе EtOH_Low за тот же период. VP = вентральный паллидум, DlS = дорсолатеральное полосатое тело.
Параметры рисунка

Таблица 1.
Статистические параметры, полученные в двухстороннем ANOVA относительно анализа выражения FosB / DeltaFosB.

Ядро	Период	Фактор лечения	Период * Лечение
M1	F_(1,30) = 5.61, P = 0.025	F_(2,30) = 3.21, P = 0.055	F_(2,30) = 2.61, P = 0.089
M2	F_(1,30) = 4.72, P = 0.038	F_(2,30) = 1.53, P = 0.233	F_(2,30) = 3.45, P = 0.045
CG1	F_(1,30) = 11.08 P = 0.002	F_(2,30) = 0.95, P = 0.398	F_(2,30) = 3.31, P = 0.050
PrL	F_(1,30) = 8.53, P = 0.007	F_(2,30) = 1.72, P = 0.197	F_(2,30) = 2.74, P = 0.081
IL	F_(1,30) = 3.77, P = 0.062	F_(2,30) = 1.91, P = 0.167	F_(2,30) = 0.98, P = 0.389
Acbco	F_(1,30) = 22.23 P <0.001	F_(2,30) = 2.63, P = 0.089	F_(2,30) = 5.68, P = 0.008
Acbsh	F_(1,30) = 50.44 P <0.001	F_(2,30) = 4.27, P = 0.023	F_(2,30) = 13.18, P <0.000
VP	F_(1,30) = 38.01 P <0.001	F_(2,30) = 5.07, P = 0.013	F_(2,30) = 10.93, P <0.000
Dms	F_(1,30) = 28.89 P <0.001	F_(2,30) = 3.75, P = 0.035	F_(2,30) = 7.71, P = 0.002
DLS	F_(1,30) = 13.58 P = 0.001	F_(2,30) = 5.41, P = 0.011	F_(2,30) = 4.72, P = 0.017
CA1	F_(1,30) = 4.81, P = 0.036	F_(2,30) = 7.37, P = 0.002	F_(2,30) = 1.62, P = 0.215
CA3	F_(1,30) = 14.92 P = 0.001	F_(2,30) = 2.46, P = 0.102	F_(2,30) = 3.81, P = 0.034
DG	F_(1,30) = 0.59, P = 0.447	F_(2,30) = 1.49, P = 0.241	F_(2,30) = 0.24, P = 0.785
BLA	F_(1,30) = 6.47, P = 0.016	F_(2,30) = 0.12, P = 0.884	F_(2,30) = 1.71, P = 0.199
CeA	F_(1,30) = 2.55, P = 0.121	F_(2,30) = 0.22, P = 0.801	F_(2,30) = 0.71, P = 0.501
ВМХ	F_(1,30) = 6.51, P = 0.016	F_(2,30) = 0.71, P = 0.503	F_(2,30) = 1.75, P = 0.192
VTAA	F_(1,30) = 9.64, P = 0.004	F_(2,30) = 3.76, P = 0.035	F_(2,30) = 2.65, P = 0.087
ВТАП	F_(1,30) = 6.05, P = 0.021	F_(2,30) = 1.79, P = 0.184	F_(2,30) = 1.64, P = 0.211

M1 = первичная моторная кора; M2 = вторичная моторная кора, CG1 = передняя поясная кора, PrL = прелимбическая кора, IL = инфралимбическая кора, Acbco = ядро прилежащего ядра, Acbsh = оболочка прилежащего ядра, VP = вентральное паллидум, DmS = дорсомедиальное полосатое тело, DlS = дорсолатеральное полосатое тело, CA1 = Cornus Ammonis 1, CA3 = Cornus Ammonis 3; DG = зернистый слой зубчатой извилины, BlA = базолатеральное ядро миндалины, CeA = центральное ядро миндалины, VmH = вентромедиальное ядро гипоталамуса, VTAA = передняя часть вентральной тегментальной области; VTAP = задняя часть центральной покровной области.
Параметры таблицы

Чтобы подтвердить, что изменения в экспрессии FosB / DeltaFosB были вызваны изъятием, а не воздействием этанола, мы выполнили корреляции между оценкой локомоторной сенсибилизации и иммуноблочными клетками FosB / DeltaFosB в 5-ый день изъятия в упомянутых выше ядрах (M1, M2, Acbco, Acbsh, DmS, DlS, VP, VTAA). Как и ожидалось, существенных корреляций ни для одного из этих ядер не было (M1 - r² = 0.027862, p = 0.987156; M2 - r² = 0.048538, p = 0.196646; Acbco - r² = 0.001920, p = 0.799669; Акбш - r² = 0.006743, p = 0.633991; ДМС - r² = 0.015880, p = 0.463960; DlS - r² = 0.023991, p = 0.914182; ВП - r² = 0.002210, p = 0.785443; VTAA - r² = 0.001482, p = 0.823630).

4. обсуждение

Результаты, полученные в настоящем исследовании, показывают, что повышенная экспрессия FosB / DeltaFosB, наблюдаемая в парадигме локомоторной сенсибилизации, вызванной этанолом, скорее всего, будет связана с изъятием, а не с хроническим воздействием лекарственного средства. Однако поведенческая изменчивость в развитии локомоторной сенсибилизации сопровождалась различными образцами экспрессии FosB / DeltaFosB во время отмены. Роль моторной коры, брюшной тегментальной области и полосатого тела в приобретении и выражении парадигмы локомоторной сенсибилизации хорошо установлена (Вандершурен и Пирс, 2010). Кроме того, дерегулирование мезолимбического пути является одной из центральных нейробиологических особенностей периода отмены, а также появление расширенной миндалины (Koob и Le Moal, 2005 и Koob и Le Moal, 2008). Тем не менее, только в немногих исследованиях изучался период отмены парадигмы локомоторной сенсибилизации. Наши результаты выявили интересные изменения в экспрессии FosB / DeltaFosB в моторной коре, вентральной тегментальной области и стриатуме в течение этого периода.

КДНК FosB кодирует экспрессию белков 33, 35 и 37 кДа. Воздействие острых раздражителей приводит к сильной индукции 33- и дискретных 35- и 37-кДа белка Fos. Как следствие, при острой активации преобладающая экспрессия FosB связана с 33 кДа (McClung и др., 2004 и Nestler, 2008). Между этими белками есть еще одно примечательное различие: только белки с молекулярной массой 35–37 кДа являются высокостабильными изоформами. Из-за этой высокой стабильности эти усеченные формы FosB, также называемые DeltaFosB, накапливаются в головном мозге и сильно экспрессируются в ответ на хронические раздражители, такие как лечение психотропными препаратами, хронические электросудорожные припадки и стресс (Kelz и Nestler, 2000, Nestler et al., 2001 и McClung и др., 2004). Как следствие, DeltaFosB рассматривали как устойчивый молекулярный переключатель для опосредования форм долговременной нервной и поведенческой пластичности. Интересно, что элегантное исследование с использованием линий мыши, экспрессирующих дифференциально FosB и DeltaFosB, показало, что FosB необходим для повышения толерантности к стрессу, а также нейтрализует корреляцию между вызванной психостимулятором локомоторной сенсибилизацией и накоплением DeltaFosB в полосатом теле (Ohnishi et al., 2011). Следовательно, оба белка могут играть важную роль в экспериментальном протоколе, используемом в настоящем исследовании. Примечательно, что использованное антитело FosB распознает как FosB, так и DeltaFosB. Поскольку FosB снижается до исходного уровня в течение 6 часов после острого раздражителя (Nestler et al., 2001) и DeltaFosB накапливаются после многократных воздействий стимулов, мы решили умертвить животных через 18 часов после фазы сбора, чтобы избежать возможных предубеждений при обработке этанолом по сравнению с экспрессией FosB. Тем не менее, чтобы быть технически точным, мы будем называть в настоящем исследовании выражение FosB / DeltaFosB. Важно отметить, что эта стратегия использовалась в других исследованиях, включая те, в которых использовалось то же самое первичное антитело, описанное здесь (Conversi et al., 2008, Li et al., 2010, Flak и др., 2012 и García-Pérez и др., 2012). Как следствие, помимо этих экспериментальных ограничений, мы обсудим наши результаты, учитывая роль DeltaFosB в пластичности нейронов.

Хорошо известно, что хроническое лекарственное воздействие увеличивает экспрессию FosB / DeltaFosB в нескольких областях мозга (Nestler et al., 2001 и Perrotti et al., 2008). Любопытно, что в настоящем исследовании ни сенсибилизированные этанолом, ни несенсибилизированные этанолом мыши не отличались от мышей, которым хронически вводили физиологический раствор, в отношении экспрессии FosB / DeltaFosB через 18 часов после фазы приобретения. Кроме того, не было значимой корреляции между экспрессией FosB / DeltaFosB и показателями локомоторной сенсибилизации. Это расхождение можно объяснить, по крайней мере частично, различиями, обнаруженными в протоколе эксперимента. Например, учитывая воздействие этанола, в двух исследованиях парадигма выбора двух бутылок была использована в 15 сессиях с перерывами (Li et al., 2010) или полноценный жидкий корм, вводимый автоматически в течение 17 дней (когда животные потребляют этанол в дозах от 8 до 12 г / кг / день) (Perrotti et al., 2008). В другом исследовании, хотя авторы ссылаются на хроническое лечение, протокол состоял только в экспозиции этанола 4 (Рябинин и Ван, 1998). Таким образом, протоколы, используемые где-то еще, полностью отличаются от того, который используется здесь, который состоит из 21 дня лечения, когда экспериментатор вводит ежедневные инъекции этанола. Несмотря на эти различия, существует несколько исследований с участием внутрибрюшинных инъекций, сообщающих об увеличении экспрессии FosB / DeltaFosB после протоколов локомоторной сенсибилизации, вызванной психостимуляторами (Brenhouse и Stellar, 2006, Conversi et al., 2008 и Vialou et al., 2012) и опиоиды (Kaplan et al., 2011). Тем не менее, протоколы локомоторной сенсибилизации в этих исследованиях вовлекают гораздо меньше, чем 21 наркотиков, и в некоторых из них препарат вводили прерывистым способом. Напротив, в нашем протоколе используется тот же метод лечения, который описан в предыдущих исследованиях с использованием ежедневных инъекций этанола 21 (Мазур и душ Сантуш, 1988, Souza-Formigoni и др., 1999, Quadros et al., 2002a, Quadros et al., 2002b, Abrahão et al., 2011 и Abrahão et al., 2012). Имеются данные о том, что хотя хроническое введение кокаина способствует накоплению экспрессии DeltaFosB в ядре accumbens, оно также способствует толерантности к индукции мРНК DeltaFosB как в брюшном, так и в дорзальном полосатом теле (Ларсон и др., 2010). Поэтому мы предположили, что отсутствие различий в наших экспериментальных группах на фазе сбора может быть связано с допуском в отношении индукции FosB / DeltaFosB, поскольку в настоящем протоколе был больший период фазы сбора по сравнению с периодами, используемыми для психостимулятора и опиоидов в других исследованиях.

Исследования с использованием нокаутных и трансгенных мышей показали, что мутантные мыши FosB улучшают поведенческую реакцию на кокаин, такие как стимуляторные двигательные эффекты и условное расположение. Кроме того, экспрессия как базального, так и кокаин-индуцируемого DeltaFosB отсутствует у этих мутантных мышей (Hiroi и др., 1997). Напротив, трансгенные мыши с индуцируемой сверхэкспрессией DeltaFosB проявляют повышенную чувствительность к полезным эффектам кокаина и морфина (Muschamp et al., 2012). Эти результаты дали прямые доказательства тесной корреляции между DeltaFosB и процессом награждения. Помимо повторного воздействия лекарств, хронический стресс также увеличивает экспрессию DeltaFosB в кортиколимбических цепях (Perrotti et al., 2004). Интересно, что трансгенные мыши, сверхэкспрессирующие DeltaFosB, менее чувствительны к продепрессирующим эффектам каппа-опиоидного агониста, которые, как известно, вызывают дисфорию и стрессовые эффекты у грызунов (Muschamp et al., 2012). Таким образом, помимо процесса вознаграждения, DeltaFosB также играет ключевую роль в эмоциональных аспектах явления. В этом сценарии абстиненция также может вызвать экспрессию FosB / DeltaFosB, поскольку стресс является ключевым компонентом отмены препарата. Эта перспектива соответствует нашим результатам, поскольку не было корреляции между экспрессией FosB / DeltaFosB и показателями сенсибилизации, и, кроме того, увеличение экспрессии FosB / DeltaFosB наблюдалось только на пятый день отмены.

Интересно отметить, что в некоторых структурах увеличение FosB / DeltaFosB наблюдалось как в группе EtOH_High, так и в группе EtOH_Low, хотя более выразительно в первой группе, что указывает на то, что эти повышения могут иметь разные функциональные последствия в зависимости от их интенсивности. Эта гипотеза может быть объяснена несколькими различными функциональными функциями FosB / DeltaFosB. Например, крысы, хронически подверженные кокаину, увеличивали экспрессию DeltaFosB в ядре при приеме во время периода отмены, эффект положительно коррелировал с предпочтением кокаина, но отрицательно с предпочтением новизны. Кроме того, стресс во время изъятия увеличивает поведенческую реакцию на психостимуляторы путем увеличения экспрессии DeltaFosB в кортиколимбических нейронах (Никулина и др., 2012). Таким образом, DeltaFosB может предсказать дисрегуляцию гедонической обработки, которая возникает при длительном снятии (Marttila et al., 2007). С другой стороны, как устойчивость к стрессу, так и реакция антидепрессанта связаны с более высокой экспрессией DeltaFosB в полосатом теле (Vialou et al., 2010). Поэтому мы предполагаем, что увеличенный FosB / DeltaFosB на полосатом теле в EtOH_High мог бы повысить полезные эффекты этанола, придавая более высокую восприимчивость к последующим воздействиям наркотиков. С другой стороны, более интенсивное увеличение FosB / DeltaFosB, наблюдаемое в группе EtOH_Low, могло бы снизить чувствительность к эффектам дисфории и стресса, минимизируя отрицательные эффекты усиления последующего воздействия препарата и, как следствие, объясняя более высокое сопротивление в этом группа. Интересно, что этот парадокс имел нейрохимическую основу. Например, трансгенные мыши, сверхэкспрессирующие FosB в срединном позвоночнике ГАМКергические нейроны ядра accumbens, увеличивали уровни как му- и каппапиоидных рецепторов (Sim-Selley и др., 2011), и эти рецепторы соответственно увеличивают и ингибируют мезолимбический тон (Manzanares et al., 1991 и Devine et al., 1993). Кроме того, выражение типа ячейки также может радикально изменить функциональные последствия увеличенного FosB / DeltaFosB. В изящном исследовании с использованием мышей, сверхэкспрессирующих DeltaFosB в D1- или D2-экспрессирующих нейронах в ядре accumbens, было обнаружено, что DeltaFosB в D1- (но не в D2-) нейронах усиливает поведенческие реакции на кокаин (Grueter и др., 2013).

Любопытно, что в отношении моторной коры увеличение экспрессии FosB / DeltaFosB наблюдалось только в группе EtOH_High, и это было ограничено 5-м днем отмены. Отсутствие увеличения через 18 ч после отмены можно объяснить возможным механизмом толерантности в экспрессии FosB / DeltaFosB в этой области после хронического воздействия этанола. Кроме того, наши результаты предполагают, что в период отмены в моторной коре происходят активные нейрохимические изменения, несмотря на то, что в этот период с животными не манипулировали. Это интересно, потому что эта пластичность может играть роль, по крайней мере частично, в поддержании локомоторной сенсибилизации. Хотя устойчивая гиперлокомоция после нескольких дней отмены здесь не изучалась, есть несколько исследований, в том числе предыдущие из нашей лаборатории, показывающие, что у сенсибилизированных мышей (но не несенсибилизированных) улучшалась локомоция при введении этанола после определенного периода отмены (Мазур и душ Сантуш, 1988, Souza-Formigoni и др., 1999, Quadros et al., 2002a, Quadros et al., 2002b, Abrahão et al., 2011, Abrahão et al., 2012, Fallopa и др., 2012 и Coelhoso et al., 2013).

Наконец, следует отметить, что только группа EtOH_Low отображала увеличенную экспрессию FosB / DeltaFosB в передней (но не задней) части вентральной тегментальной области. Эти части имеют отчетливые прогнозы и нейрохимические профили, и их участие в процессе вознаграждения зависит от нескольких факторов (Икемото, 2007). Например, самостоятельное введение этанола крысами связано с задней частью, но не с вентральной частью вентральной области покрышки (Rodd-Henricks и др., 2000 и Rodd и др., 2004). Кроме того, эндоканнабиноидная система, а также ГАМК-А, допаминергические D1-D3 и серотонинергические рецепторы 5HT3 играют важную роль в поведении этанола (Linsenbardt и Boehm, 2009, Rodd и др., 2010, Melón и Boehm, 2011b и Hauser и др., 2011). Однако GABA-B в передней части вентральной тегментальной области имеет важное значение с точки зрения награждения (Мур и Бем, 2009) и стимуляторных локомоторных эффектов (Boehm и др., 2002) этанола. Кроме того, холинергические никотиновые рецепторы в передней части участвуют в увеличенных уровнях акцепмального дофамина, вызванных этанолом (Эриксон и др., 2008). Поэтому, независимо от отдельного профиля этих частей, возможно, что изменения, наблюдаемые в группе EtOH_Low в передних частях, могут быть связаны с процессом награждения. Хронический кокаин, но не хронический морфин или хроническое стрессовое воздействие, увеличивает DeltaFosB в брюшной тегментальной области, особенно в популяции клеток гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК)Perrotti et al., 2005). Этот факт может объяснить нормальные уровни FosB / DeltaFosB во время отмены, встречающиеся в брюшной тегментальной области мышей EtOH_High, независимо от предполагаемого высокого стрессового опыта в этот период. Более того, эти данные подтверждают, по крайней мере частично, гипотезу о том, что увеличение экспрессии FosB / DeltaFosB во время вывода в EtOH_Low можно охарактеризовать как адаптивный ответ.

Отдельные различия, наблюдаемые при переходе от рекреационного использования к наркомании, замечательны (Flagel и др., 2009, Джордж и Кооб, 2010 и Swendsen и Le Moal, 2011). Как следствие, необходимо изучить нейробиологические особенности, связанные с индивидуальной изменчивостью. Поведенческая сенсибилизация - это животная модель, обычно используемая для исследования нейробиологических особенностей наркомании. Основой этой модели является то, что субъективные эффекты препаратов увеличиваются по мере их повторного воздействия. После приобретения локомоторная сенсибилизация длительна и находится в прямом временном отношении к морфологическим и нейрохимическим изменениям в мезолимбическом пути и нескольким энцефалическим ядрам, связанным с эмоциональностью и двигательным поведением (Робинсон и Колб, 1999 и Вандершурен и Пирс, 2010). Первоначальное исследование, проведенное Мазур и душ Сантуш (1988) продемонстрировало, что у аутированных швейцарских мышей наблюдается большая поведенческая изменчивость в отношении вызванной этанолом локомоторной сенсибилизации. С тех пор другие исследования продемонстрировали важную корреляцию между нейрохимическими особенностями и изменчивостью поведения, главным образом теми, которые связаны с допаминергическим (Abrahão et al., 2011, Abrahão et al., 2012 и Souza-Formigoni и др., 1999) и глутаматергических систем (Quadros et al., 2002a и Quadros et al., 2002b). Кроме того, предыдущее исследование из нашей лаборатории с использованием парадигмы локомоторной сенсибилизации, вызванной этанолом, показало, что сенсибилизированные (но не сенсибилизированные) мыши продемонстрировали значительное увеличение количества рецепторов каннабиноидного типа 1 (CB1R) в течение периода отмены (Coelhoso et al., 2013). Здесь мы идентифицировали различные образцы экспрессии FosB / DeltaFosB во время вывода между группами EtOH_High и EtOH_Low.

Подводя итог, поведенческая изменчивость, наблюдаемая в фазе захвата вызванной этанолом локомоторной сенсибилизации, сопровождается отчетливой пластичностью нейронов во время периода отмены. Интересно, что наши результаты показывают, что различные модели экспрессии FosB / DeltaFosB, обнаруженные у сенсибилизированных и не сенсибилизированных мышей, более связаны с периодом отмены, а не с хроническим воздействием лекарственного средства, вероятно, из-за толерантности к транскрипции FosB / DeltaFosB, индуцированной лекарственным средством.

Ниже приводятся дополнительные данные, относящиеся к этой статье.

Таблица Suppl1.
Ненормированное выражение экспрессии FosB / DeltaFosB в экспериментальных группах.
Помощь в файлах DOC
Опции

Благодарности

RFP и CCC получили магистерскую стипендию от CAPES и FAPESP, соответственно. CTC, LEM, DXS и JGSJ предоставляются FAPESP и CNPq.