Аверсивное поведение, вызванное оптогенетической инактивацией нейронов дофамина вентральной тегментальной области, опосредуется рецепторами дофамина D2 в ядре accumbens (2014)

Proc Natl Acad Sci US A. Apr 29, 2014; 111 (17): 6455-6460.

Опубликован онлайн Apr 15, 2014. DOI:  10.1073 / pnas.1404323111

PMCID: PMC4036004

неврология

Эта статья была цитируется другие статьи в PMC.

Перейти к:

Значение

Дофаминовые (DA) нейроны в брюшной тегментальной области (VTA) реагируют на отвратительные стимулы в основном за счет временного молчания. Остается неясным, непосредственно ли эта реакция вызывает отвратительные реакции при ведении мышей. Мы рассмотрели этот вопрос, оптогенетически контролируя нейроны DA в VTA и обнаружили, что инактивация нейронов DA привела к отвратительному ответу и обучению. Было учтено, что ядром accumbens (NAc), основными выходными ядрами нейронов VTA DA, отвечает за этот ответ, поэтому мы исследовали, какой из основных путей в NAc был критичен для этого поведения, используя нокдаун D1 или D2-рецептора, и обнаружил, что специфический для рецептора D2 путь имеет решающее значение для такого поведения.

Абстрактные

Передача допамина (DA) из брюшной тегментальной области (VTA) имеет решающее значение для контроля как положительного, так и отвратительного поведения. Временное молчание нейронов DA является одним из ответов на отклоняющие стимулы, но его последствия и нейронные механизмы в отношении отвратительных ответов и обучения в значительной степени остаются неуловимыми, Вот, мы сообщаем, что оптогенетическая инактивация нейронов VTA DA быстро снижала регулируемые уровни DA и индуцировала повышение регуляции нейральной активности в ядре accumbens (NAc), как оценивается выражением Fos. Tего оптогенетическое подавление стрельбы DA-нейроном немедленно вызывало отвратительные реакции на ранее предпочтительную темную комнату и приводило к аверсивному обучению в оптико-обусловленном месте. Важно отметить, что отвращение этого места было отменено путем нокдауна дофаминовых D2-рецепторов, но не по сравнению с рецепторами D1 в NAc. Таким образом, замораживание нейронов DA в VTA было необходимо для индукции ответных реакций и обучения через дофаминовые D2-рецепторы в NAc.

Мезолимбическая дофаминергическая система не только играет ключевую роль в широком диапазоне мотивации и обучения (1–3), но его дисфункция также была связана с тяжелыми нейропсихиатрическими расстройствами, примером которых является болезнь Паркинсона, шизофрения и наркомания. Дофаминовые (DA) нейроны в брюшной тегментальной области (VTA) реагируют на полезные стимулы фазическим обжигом, и основная функция этого стрельба теоретизируется, чтобы кодировать «ошибку прогноза вознаграждения», разницу в значении между прогнозируемым вознаграждением и фактическое вознаграждение (4). В отличие от ответа на поощрительные стимулы, их реакция на отвратительные стимулы далека от гомологичности; т. е. некоторые DA нейроны активируются в ответ на аверсивные раздражители, тогда как большинство других реагирует на временное подавление их стрельб (5–9). Фактически, недавние исследования показали, что оптогенетическая активация ГАМКергических нейронов и результирующая инактивация нейронов ДА подавляют потребление вознаграждения и вызывают отвратительный ответ (10, 11). Тем не менее, в значительной степени остается неуловимым в отношении того, какие механизмы в нейронных цепях имеют важное значение для приобретения аверсивного обучения после инактивации нейронов DA в VTA и в отношении того, как поведенческие реакции контролируются для подавления потребления вознаграждения и вызывания аверсивного поведения.

Накопленные данные показали, что мотивационное и познавательное обучение в ответ на положительные и отрицательные стимулы в значительной степени регулируются нейронными цепями, включая базальные ганглии (12), которые получают большое количество дофаминергической проекции от среднего мозга. В стриатуме две основные нейронные цепи состоят из указанных средних шейных нейронов (MSN), каждый из которых выражает определенный тип DA-рецептора (13).

  • Одна схема представляет собой прямой путь, состоящий из MSN, непосредственно проецирующих на выходные ядра базальных ганглиев, субстанции nigra pars reticulata (SNr) и преимущественно экспрессирующих рецепторы дофамина D1 (D1R).
  • Другой - косвенный путь, состоящий из MSN, которые косвенно реализуются через globus pallidus для SNr и прежде всего экспрессируют DopNAMX рецепторы дофамина (D2R).

DA от среднего мозга динамически модулируют эти два параллельных пути противоположным образом через D1R и D2R, и эта модуляция должна способствовать мотивационному обучению (3, 14).

  • Что касается полезных стимулов, считается, что регулируемые уровни DA, вызванные полезными сигналами, активируют D1R и, таким образом, преимущественно облегчают прямой путь в ядре accumbens (NAc).
  • С другой стороны, подавление пиков DA neuron в ответ на отклонения от аюрведических стимулов снижает уровни DA в NAc; и эта реакция должна специально способствовать передаче сигнала в косвенном пути через активированные D2Rs.

Хотя исследования, использующие фармакологические стратегии и метод обратимой блокировки нейротрансмиссией (RNB), подтвердили этот механизм регуляции в NAc (15, 16), остается неизвестным, является ли подавление стрельбы нейронов DA достаточным для содействия активности косвенного пути и впоследствии вызывает поведение избегания. В этом настоящем исследовании мы рассматривали этот вопрос путем избирательного инактивации нейронов DA в VTA путем оптиогенного манипулирования мембранно-гиперполяризующим Arch-белком (17) и явно продемонстрировал, что подавление DA нейронов в VTA впоследствии уменьшило уровни DA в NAc и вызвало аверсивную реакцию и обучение. Кроме того, мы исследовали механизмы регулирования этой реакции и показали, что эта аверсивная реакция специфически контролируется D2Rs в NAc.

Итоги

Оптогенетическая инактивация DA-нейронов блокирует предпочтение темной комнаты.

Для выборочного инактивации стрельбы DA-нейронов мы вводили Cre-индуцируемую адено-ассоциированную вирусную конструкцию, кодирующую Arch-eGFP [AAV-double-floxed инвертированную открытую рамку считывания (DIO) -Arch] (17) в одностороннем порядке в ВТА взрослых мышей тирозингидроксилазы (TH) -Cre (18) и однопометников дикого типа (WT) и поместили оптическое волокно над VTA (Рис. S1 A и C). Через две недели после операции Arch-eGFP была обнаружена в VTAРис. S1B). Мы проверили гиперполяризующий эффект белка Arch путем электрофизиологической записи и измерили эффект оптической стимуляции VTA мышей TH-Cre, инъецированных AAV-DIO-Arch. В электрофизиологических записях in vivo от VTA анестезированных мышей TH-Cre было обнаружено, что оптическая стимуляция предполагаемых нейронов DA препятствует их стрельбе (Рис. S2), что указывает на то, что оптическая стимуляция достаточно гиперполяризовала мембранный потенциал эритроцитарных DA-клеток и, таким образом, препятствовала их спонтанному обжигу.

Используя этих мышей, мы в дальнейшем рассмотрели, может ли оптическая инактивация нейронов DA в VTA служить отвратительным сигналом для поведенческого обучения. Мыши обладают врожденной тенденцией предпочитать темную среду (19). Мы разработали поведенческий аппарат, в котором мыши могли свободно исследовать темную комнату и открывать яркое пространство (Рис 1A). После привыкания мышей WT преимущественно оставались в темной комнате с оптической стимуляцией или без нее в темной комнате (Рис. S1D), гарантируя, что сама оптическая стимуляция не влияла на их поведение, предпочитающее темную комнату. Мы запланировали поведенческий эксперимент животных для проверки влияния оптической инактивации нейронов DA на их поведение (Рис. S1E). После привыкания и предварительного осмотра мышей определяли путем оптического стимулирования нейронов DA в VTA, когда они находились в темной комнате. Даже в течение первого минимального кондиционирования 5 мышей TH-Cre оставались из ранее предпочтительной темной комнаты и последовательно избегали темной комнаты во время кондиционирования (Рис 1B). Мышцы TH-Cre не отменяли свое избегание в темной комнате, даже если они не получали оптической стимуляции на посттесте (Рис 1C). Эти данные указывают на то, что гиперполяризация нейронов DA не только индуцировала временное аверсивное поведение, но и служила сигналом для аверсивного обучения против темной комнаты, а также демонстрировала, что инактивация нейронов DA сыграла причинную роль как в временном аверсивном поведении, так и в продолжительном аверсивном обучении.

Рис. 1.  

Оптогенетическая инактивация DA-нейронов блокирует предпочтение темных комнат свободно управляемых мышей. (A) Иллюстрация устройства, используемого в тесте предпочтения темной комнаты. Мышам разрешалось свободно перемещаться по темной комнате и яркому пространству. (B) Продолжительность курса ...

Оптогенетическая понижающая регуляция уровней DA в NAc.

Далее мы исследовали, действительно ли инактивация нейронов DA в VTA фактически модифицировала концентрацию DA в ее основной области нацеливания, NAc. Мы измеряли уровни DA в NAc с помощью циклической вольтамперометрии с быстрым сканированием (FSCV) у анестезированных мышей TH-Cre, которые были введены AAV-DIO-Arch в их VTA. Уровни DA в NAc были быстро увеличены с помощью электрической стимуляции VTA, и вызванное высвобождение DA было значительно уменьшено путем одновременной оптической стимуляции VTA (Рис. S3). Затем мы проверили, может ли оптическая стимуляция VTA снизить уровень тонического DA в NAc. В тех же экспериментальных условиях мы наблюдали, что уровень DA в NAc временно уменьшался на 20 s оптической стимуляции VTA (Рис 2), что согласуется с сообщенной реакцией FSCV против аверсивных раздражителей (20). Эти данные показывают, что оптическая стимуляция VTA была достаточно эффективной, чтобы инактивировать нейроны VTA DA и уменьшать уровень DA в NAc во время поведенческого эксперимента.

Рис. 2.  

Оптическая инактивация нейронов DA в VTA снижает уровень DA в NAc. (A) Усредненные DA ответы на оптическую стимуляцию в NAc, измеренные FSCV. Зеленая линия указывает продолжительность оптической стимуляции (n = Трассы 7-11). (B) Усредненный ...

Up-Регулирование экспрессии гена Fos путем оптической инактивации нейронов DA в VTA.

Поведенческое изменение, вызванное условной инактивацией нейронов DA в VTA, показало, что оптическая стимуляция непосредственно изменяет нейронную активность и приводит к сдвигу поведенческих характеристик. Поэтому мы исследовали области, в которых нейронная активность была повышена условной инактивацией нейронов DA путем изучения экспрессии Fos, немедленного раннего гена. Вскоре после того, как кондиционирование было проведено в тесте на темной комнате, мышей быстро обрабатывали для определения количества экспрессии Fos путем количественного анализа гибридизации in situ (Рис 3 и Рис. S4). NAc, область, которая получает большое количество допаминергических проекций из VTA, показала значительно увеличенное количество экспрессии Fos у мышей TH-Cre (Рис 3). Это повышение регуляции также было обнаружено в контралатеральной стороне оптической стимуляции, которая предположительно была вызвана небольшим количеством вирусной инфекции в эту сторону. Однако повышающая регуляция была намного выше на ипсилатеральной стороне, чем на контралатеральной стороне оптической стимуляции, что указывает на то, что оптическая инактивация нейронов DA непосредственно регулирует нейронную активность NAc. Повышенная экспрессия Fos наблюдалась также в других областях мозга, включая перегородку, перивентрикулярные области полосатого тела, базалатеральную амигдалу (BLA) и латеральный гипоталамус, но не в латеральной оболочке или медиальной префронтальной коре (mPFC; Рис. S4). Эти результаты показывают, что области, активированные оптической инактивацией нейронов DA, ​​не ограничивались прямыми участками мишеней нейронов VTA DA, а скорее включали области, которые могут быть косвенно активированы в зависимости от нервной цепи. Это наблюдение позволяет предположить, что оптическая инактивация нейронов DA, ​​модифицированных в масштабе всей нейронной активности, может не только вызывать аверсивную реакцию, но также вызывать несколько других функций мозга, таких как тревога, страх и стресс-реакции (21).

Рис. 3.  

Связанная с действием экспрессия гена Fos, индуцированная ингаляцией оптогенетических DA нейронов. (A–C) Репрезентативные фотографии для выражения Fos (желтый) в NAc. Были сделаны снимки стимулированной стороны мыши TH-Cre (A), нестимулированных ...

DA Signaling Through D2R имеет решающее значение для аутогенетически индуцированного условного нежелания места.

Большинство дофаминергических сигналов от VTA передаются в MSN в рецепторах NAc через DA, D1R и D2R. D1R почти исключительно экспрессируется в веществе P (кодируется геном Tac1), экспрессирующем MSN, и D2R преимущественно экспрессируется в энкефалине (закодированном геном Пенк) - экспрессирующих MSN; каждый тип MSN представляет собой прямой и косвенный пути, соответственно, в NAc (3). Поскольку сродство к DA намного выше для D2R (порядок nM), чем для D1R (порядок μM) (22, 23), считается, что снижение уровней DA приводит к инактивации Gi-coupled D2R, но не оказывает заметного влияния на D1R (3, 24), тем самым повышая тем самым регулирование нейронной активности конкретно в косвенном пути. Более того, активация Fos более заметно наблюдалась в экспрессирующих клетках Penk- или Drd2 (D2R), чем в экспрессирующих клетках Tac1- или Drd1a (D1R)Рис. S5). Основываясь на этих наблюдениях, мы предположили, что передача сигналов DA через D2R может играть важную роль в наблюдаемой аверсивной кондиции.

Чтобы проверить эту гипотезу, мы выполнили трехкамерный тест на отвращение (CPA)Рис. S6). Мы подготовили поведенческий аппарат, содержащий две камеры с практически идентичными обстоятельствами и один небольшой коридор. Это непредвзятое состояние окружающей среды в тесте CPA позволило нам дополнительно изучить, может ли инактивация нейронов VTA DA стимулировать отвратительную реакцию и обучение, в дополнение к блокировке предпочтений темной комнаты. Когда животным разрешалось свободно перемещаться по всему аппарату, большинство из них оставалось в двух камерах без какой-либо типичной поведенческой разницы при предварительном тестировании. Затем оптическое кондиционирование осуществлялось путем спаривания оптической стимуляции с одной неподвижной камерой. Даже когда одна из камер использовалась для кондиционирования, мышей TH-Cre постоянно и значительно избегали оставаться в оптически кондиционированной камере во время кондиционирования и на посттесте (Рис. S6 B–E). Статистический анализ подтвердил значительное снижение времени пребывания мышей TH-Cre в оптически кондиционированной камере при посттесте по сравнению с временем пребывания у мышей WT (Рис. S6F).

Затем мы попытались указать подтипы DA-рецепторов, участвующие в этом аверсивном поведении, путем специфического подавления каждого из DA-рецепторов в NAc (Рис 4 и Рис. S7). Мы разработали и подтвердили лентивирусные векторы, содержащие короткую шпилечную РНК (shRNA), специфичную для каждого DA-рецептора с конститутивной экспрессией mCherry. Через три недели после инъекции лентивируса в NAc надежная экспрессия mCherry была локализована в NAc (Рис 4B). Эффективный нокдаун экспрессии мРНК каждого рецептора был подтвержден количественным анализом ПЦР в реальном времени (рис. S7A). Измерение уровней белка посредством Вестерн-блоттинга также показало, что инъекция каждого из лентивирусов выборочно уменьшала его целевой белковый продукт, не влияя на экспрессию другого подтипа DA-рецептора (Рис 4C и Рис. S7 B–G). Экспрессирующие shD1R- и shD2R лентивирусы уменьшали уровень целевого белка до 46.2 ± 1.1% и 38.4 ± 4.9% соответственно, по сравнению с уровнем для контрольного вируса (Рис 4C). Эти результаты подтвердили, что лентивирусные векторы, экспрессирующие shRNA, специфичные для D1R и D2R, избирательно и достаточно подавляют свои целевые РНК и снижают количество соответствующих белковых продуктов. Мы также подтвердили, что вирус-опосредованная экспрессия mCherry не была обнаружена в VTA, исключая возможность того, что опосредуемая лентивирусом shRNA непосредственно влияет на VTA.

Рис. 4.  

Передача сигналов DA через D2R имеет решающее значение для оптически индуцированной CPA. (A) Иллюстрация, иллюстрирующая хирургическую процедуру. Шприн-кодирующий лентивирус для D1R или D2R вводили на двусторонней основе в NAc. AAV-DIO-Arch вводили в одностороннем порядке в ...

Используя эти лентивирусы, содержащие shRNA, мы тестировали, какой тип DA-рецептора ответственен за аверсивное поведение, вызванное оптогенетической инактивацией нейронов DA. Мы ввели shRNA-содержащий лентивирус или контрольный лентивирус в двусторонний NAc вместе с AAV-DIO-Arch в левый VTA мышей TH-Cre. Оптическое волокно также было вставлено над VTA (Рис 4A). Когда трехкамерный тест CPA проводили через три недели после операции, мышей TH-Cre, которым вводили lenti: shD1R-mCherry по-прежнему показывали явное CPA против камеры с оптической стимуляцией, сравнимую с таковой у мышей TH-Cre, инъецированных контрольный лентивирус (lenti: mCherry). Напротив, мышам TH-Cre вводили lenti: shD2R-mCherry не проявлял явной CPA во время кондиционирования (Рис 4D). Исключительный дефицит обучения мышей TH-Cre, которым вводили lenti: shD2R-mCherry, был дополнительно обоснован анализом аверсивного обучения на посттесте (Рис 4E). Эти результаты показывают, что аверсивное поведение в месте, обусловленном инактивацией нейронов DA, ​​было специально вызвано D2R, а не через D1R, в NAc.

Обсуждение

В стриатуме исследования показали, что активация Gs-coupled D1R облегчает его стрельбу, тогда как активация Gi-coupled D2R приводит к снижению эффективности срабатывания (25). Acв зависимости от специфичности экспрессии DA-рецептора фазовые обстрелы DA-нейронов главным образом активируют прямой путь через D1R, тогда как переходное снижение пирингов DA-нейронов преимущественно способствует непрямой передаче через D2R (3, 26). Основываясь на этом механизме регулирования, было высказано предположение, что молчание нейронов DA в ответ на отвратительные стимулы в основном обрабатывается через косвенный путь и приводит к аверсивному поведению (3). Недавние исследования показали, что блокада синаптической передачи косвенного пути ухудшает восприятие аверсивного поведения, вызванного поражением электрическим током (15) и что это нарушение вызвано ингибированием передачи сигнала, опосредованной D2R (16). ЯКроме того, оптогенетическое повышение регуляции D2R-экспрессирующих MSN в косвенном пути вызывает поведенческое избегание (27). Однако, поскольку DA нейроны проявляют как усиленные, так и подавленные стрельбы в ответ на отвратительные стимулы, а также потому, что одновременно обрабатывается другая сенсорная информация, связанная с шоком, в ней еще предстоит выяснить, может ли заставить замолчать нейронов DA непосредственно вызвать аверсивную реакцию и обучение, и регулируется ли эта реакция через D2R-экспрессирующие MSN в косвенном пути.

В этом исследовании мы использовали оптогенетическое управление пирамидами DA нейрона в двух поведенческих тестах: тест предпочтения темной комнаты и трехкамерный тест CPA. Наша оптогенетическая манипуляция показала эффективное подавление пигментов нейрона в DA в VTA и понижающую регуляцию уровней DA в NAc, Наша точная оптогенетическая инактивация стрельбы DA нейронов только в период, когда животные оставались в кондиционированной камере, явно вызывала отвратительную реакцию и обучение, демонстрируя, что временное молчание DA непосредственно вызвало поведение пассивного избегания. Кроме того, в этом исследовании выяснилось, что обработка сигналов, опосредованная D2R, является ключевым фактором, определяющим индукцию этой отвратительной реакции и обучения.

Хотя наши данные показали, что D1R не влиял на поведенческие эксперименты, чтобы вызвать CPA, в нескольких исследованиях было зафиксировано, что фазисное возбуждение нейронов DA требуется для ответов на страх и аверсивного обучения (28, 29). Эта разница обусловлена ​​экспериментальной установкой; т. е. наш оптогенный подход исключил возможность передачи сигналов через активированные нейроны DA, чтобы вызвать аверсивное поведение, что указывает на то, что инактивация DA нейронов была достаточной для индуцирования аверсивного поведения и обучения. Функция и обработка сигнала активированного выстрела ДА, вызванного аверсивными стимулами, имели бы другой вклад в поведение отвращения от изученных здесь и должны быть уточнены в будущем.

DA нейроны также выступают в различных регионах, включая mPFC, миндалину и гиппокамп. Недавнее исследование показало, что Оптогенетическая активация латеральных нейронов галенулы, проецирующих DA нейроны в VTA, способны индуцировать аверсивное поведение, и эти DA нейроны в основном и конкретно нацелены на mPFC (30), хотя их оптогенетическое кондиционирование было отличным от того, что было в нашем текущем исследовании, так как их оптигенетическая стимуляция была продлена на весь сеанс кондиционирования. Поскольку дофаминергический вход в mPFC, как сообщается, активируется не только аверсивными раздражителями, но и хроническим стрессом (31, 32), возможно, что их непрерывная активация mPFC-проецирующих DA нейронов будет восприниматься как сигналы из сильно стрессовой среды; и в результате накопления стрессового кондиционирования животные будут проявлять аверсивное поведение в кондиционированной камере. Напротив, мы ингибировали стрельбу DA нейронов только тогда, когда животные находились в кондиционированной камере. Результаты наших поведенческих экспериментов с использованием согласования с учетом времени показали, что внезапное подавление сигнала DA будет восприниматься как внезапный аверсивный вход, что привело к их быстрому отвратительному ответу.

DA нейроны также проектируют в миндалину, регион, который в значительной степени способствует реакции страха. Действительно, передача сигналов DA в миндалину была замешана в реакции страха и приобретении памяти страха (33, 34). В нашем исследовании, маркировка DA нейронов в VTA идентифицировала набор DA нейронов, проецирующих BLA, но степень этих проекций была намного ниже, чем у NAc. Хотя мы не могли исключить тонкий эффект сигнальной DA-сигнализации, вызванной амигдалой, по нашему наблюдаемому аверсивному поведению, основной эффект нашей оптико-инактивации нейронов DA должен быть на NAc, поскольку наши эксперименты с конкретным нокдауном D2R в NAc резко уменьшились аверсивное поведение. Будущие исследования, направленные на целевую специфическую передачу сигналов ДА, необходимы для выяснения эффектов сквозной модификации нейронов DA на отклонениях от аверсивных раздражителей и страха.

Материалы и методы

Предметы.

Тирозингидроксилаза :: IRES-Cre (TH-Cre) мышечные мыши (EM: 00254) (18) были получены из Европейского архива мутантов мышей. Все экспериментальные животные были перекрещены к штамму C57BL / 6J для более чем 10 поколений. Мышей соединяли с мышами C57BL / 6J WT и размещали со стандартным темным циклом 12-h light / 12-h и получали пищу и воду ad libitum. Cre+ и Cre- для экспериментов использовались мыши из одних и тех же пометов (3-6 mo возраста). Все эксперименты на животных были одобрены комитетом животных Института биологии Осаки в соответствии с руководящими принципами экспериментов на животных.

Поведенческие тесты.

Во время всех поведенческих тестов мыши были связаны с оптическим волокном и позволяли перемещаться по всему аппарату. Движение мышей контролировалось так, что они могли перемещаться без каких-либо препятствий, даже когда они были связаны с оптическим волокном на головах. Положение мыши было обнаружено видеокамерой, приостановленной над поведенческим аппаратом, и проанализировано с помощью специальной программы, использующей программное обеспечение Labview.

Тест предпочтений в темной комнате.

Пользовательский поведенческий аппарат, используемый в тесте, состоял из темной комнаты (15 × 9.5 см) и яркого открытого пространства (15 × 11 см). В темной комнате были стены, пол и крыша, которые были окрашены в черный цвет и имели вход (4.5 см длиной) в открытое яркое пространство. Открытое светлое пространство было сформировано как эллипс и имело металлический сетчатый пол и прозрачные стены без крыши. Перед тестом все мыши были приучены к 10 мин в аппарате. Тест состоял из трех сеансов: в начале половины 1 (предварительный тест: 5 мин) мышам было разрешено исследовать весь аппарат. С поздней половины дня 1 до дня 4 (кондиционирования: всего 35 мин) мыши получали оптическую стимуляцию, когда они находились в темной комнате. В день 5 предпочтение темной комнаты тестировалось без оптической стимуляции (posttest: 5 min; Рис. S1E).

Трехкамерный тест CPA.

Специально выполненное трехкамерное устройство предпочтения / CPA с условным помещением, используемое в тесте, состояло из двух камер (10 × 17 см) и соединительного коридора. Тест состоял из трех сеансов. День 1 (предварительный осмотр: 15 мин): Мышам было разрешено свободно исследовать весь аппарат. Мыши, которые оставались в 1.5 раз больше в одной камере, чем в другой, были исключены из теста. Дни 2 и 3 (кондиционирование: 15 мин каждый): Мыши получали оптическую стимуляцию, когда они находились в световой спаренной камере. Выбор световой парной камеры был уравновешен. День 4 (posttest: 15 min): Тест проводился в тех же условиях, что и в предварительном испытании (Рис. S6A).

В сеансе кондиционирования оптическая стимуляция была остановлена ​​для 30 s, когда мыши постоянно оставались на 30 в темной комнате или в спаренной комнате, чтобы избежать перегрева. Мощность лазера контролировалась приблизительно на 5 мВт на кончике оптического волокна во всех поведенческих тестах.

Циклическая вольтамперометрия Vivo с быстрым сканированием.

Эксперименты FSCV проводили с использованием метода, описанного в предыдущих исследованиях (35–37). Мышей анестезировали смесью кетамин / ксилазин, как описано в Материалы и методы СИ и помещается в стереотаксическую рамку. Оптическое волокно, используемое для стимуляции эритроцитарных нейронов DA, ​​находилось вблизи стимулирующего электрода. Затем стимулирующую оптрон помещали в VTA (от bregma: передний-задний, -3.2 мм, латеральный, 0.5 мм и дорзально-вентральный, 3.5 мм) и опускались с интервалом 0.25-mm. Углеволоконный микроэлектрод (длина 300 мкм) для вольтамперометрической записи был опущен в NAc (от bregma: передний-задний, 1.0 мм, боковой, 1.0 мм и дорзально-вентральный, 3.5 мм). Вольтамперометрические измерения проводились каждые 100 мс путем применения формы треугольника (-0.4 V до + 1.3 V до -0.4 V по сравнению с Ag / AgCl, на 400 V / s) на углерод-волокнистый микроэлектрод. Пользовательский потенциостат использовался для изоляции сигналов и усиления тока. Выделение DA вызывалось электрической стимуляцией нейронов DA с использованием стимуляции 24-импульса (100 μA, длительность 5 мс, 30 Гц). Оптическая стимуляция нейронов DA (532 нм, ~5 мВт мощности на кончике волокна) была применена для 10 с начала 5 s до начала электрической стимуляции. Микроэлектроды из углеродного волокна откалибровали в растворе с известными концентрациями DA (0.2 мкМ, 0.5 мкМ и 1.0 мкМ). Все данные вольтамперометрии были проанализированы по специальным программам с использованием программ Labview и Matlab. Уменьшение уровней DA путем оптической стимуляции разрешалось с помощью анализа основных компонентов с использованием шаблонных сигналов DA, ​​полученных из электрических стимулов VTA, для разделения сигналов допамина (35, 36).

Статистический анализ.

Статистический анализ проводился с использованием GraphPad PRISM 5.0 (GraphPad Software). Данные анализировали с помощью повторных измерений ANOVA (Рис. 1B, , 4D,4Dкачества Рис. S6 D и E) или односторонний ANOVA (Рис. 1C, , 3D,3D, 4 C и Eкачества Рис. S4 K–M, S6Fкачества S7A), а послеоперационный анализ проводили с использованием теста Бонферрони. Все метки / столбцы и столбцы представляли среднее значение и ± SEM соответственно.

Другие экспериментальные процедуры, включая подготовку и инъекцию вирусов, электрофизиологическую запись и иммуногистохимический и мРНК-анализ, подробно описаны в Материалы и методы СИ.

Дополнительный материал

Вспомогательная информация:  

Благодарности

Мы благодарим Э. Бойдена за конструкцию Arch, Р. Мацуи за технические консультации по производству и очистке лентивирусов и Ю. Хаяши за технические консультации по программированию анализа данных. Эта работа была поддержана исследовательскими грантами-в-силе 22220005 (до SN), 23120011 (до SY и SN), 24700339 (до TD) и 25871080 (до SY) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и Технология Японии и грант Научного фонда Такеда (до SN).

Сноски

 

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.

Рекомендации

1. Мудрый РА. Допамин, обучение и мотивация. Nat Rev Neurosci. 2004; 5 (6): 483-494. [PubMed]
2. Шульц В. Множественные функции допамина на разных временных курсах. Annu Rev Neurosci. 2007; 30: 259-288. [PubMed]
3. Бромберг-Мартин Э.С., Мацумото М., Хикосака О. Допамин в мотивационном контроле: вознаграждение, отвращение и предупреждение. Neuron. 2010; 68 (5): 815-834. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
4. Schultz W, Dayan P, Montague PR. Нейронный субстрат прогнозирования и вознаграждения. Наука. 1997; 275 (5306): 1593-1599. [PubMed]
5. Schultz W, Romo R. Ответы нигростриальных дофаминовых нейронов на высокоинтенсивную соматосенсорную стимуляцию у обезглавленной обезьяны. J Neurophysiol. 1987; 57 (1): 201-217. [PubMed]
6. Ungless MA, Magill PJ, Bolam JP. Равномерное торможение дофаминовых нейронов в брюшной тегментальной области с помощью аверсивных стимулов. Наука. 2004; 303 (5666): 2040-2042. [PubMed]
7. Brischoux F, Chakraborty S, Brierley DI, Ungless MA. Фазическое возбуждение дофаминовых нейронов в вентральном ВТА с помощью вредных стимулов. Proc Natl Acad Sci USA. 2009; 106 (12): 4894-4899. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
8. Мацумото М., Хикосака О. Два типа нейронов допамина отчетливо передают положительные и отрицательные мотивационные сигналы. Природа. 2009; 459 (7248): 837-841. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
9. Cohen JY, Haesler S, Vong L, Lowell BB, Uchida N. Нейронные специфические сигналы для вознаграждения и наказания в брюшной тегментальной области. Природа. 2012; 482 (7383): 85-88. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
10. Tan KR, et al. Нейроны ГАМК VTA-привода обусловливают отвращение. Neuron. 2012; 73 (6): 1173-1183. [PubMed]
11. van Zessen R, Phillips JL, Budygin EA, Stuber GD. Активация нейронов VTA GABA нарушает потребление вознаграждения. Neuron. 2012; 73 (6): 1184-1194. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
12. Packard MG, Knowlton BJ. Изучение и функции памяти базальных ганглиев. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 563-593. [PubMed]
13. Surmeier DJ, Song WJ, Yan Z. Скоординированное экспрессия дофаминовых рецепторов в неоспитальных средних колючих нейронах. J Neurosci. 1996; 16 (20): 6579-6591. [PubMed]
14. Surmeier DJ, Plotkin J, Shen W. Dopamine и синаптическая пластичность в дорзальных полосатых цепях, контролирующих выбор действия. Curr Opin Neurobiol. 2009; 19 (6): 621-628. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
15. Hikida T, Kimura K, Wada N, Funabiki K, Nakanishi S. Отдельные роли синаптической передачи в прямых и косвенных полосатых путях для вознаграждения и аверсивного поведения. Neuron. 2010; 66 (6): 896-907. [PubMed]
16. Hikida T, et al. Путь-специфическая модуляция ядровых приемов в вознаграждении и аверсивном поведении с помощью избирательных рецепторов-передатчиков. Proc Natl Acad Sci USA. 2013; 110 (1): 342-347. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
17. Chow BY, et al. Высокоэффективное генетически ориентируемое оптическое нейронное молчание с помощью легких протонных насосов. Природа. 2010; 463 (7277): 98-102. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
18. Lindeberg J, et al. Трансгенная экспрессия рекомбиназы Cre из локуса тирозингидроксилазы. Genesis. 2004; 40 (2): 67-73. [PubMed]
19. Бурин М, Хаскоэт М. Тест мышиного света / темного ящика. Eur J Pharmacol. 2003; 463 (1-3): 55-65. [PubMed]
20. Roitman MF, Wheeler RA, Wightman RM, Carelli RM. Химические реакции в реальном времени в ядре accumbens дифференцируют полезные и отвратительные стимулы. Nat Neurosci. 2008; 11 (12): 1376-1377. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
21. LeDoux JE. Эмоциональные схемы в мозге. Annu Rev Neurosci. 2000; 23: 155-184. [PubMed]
22. Маено H. Допаминовые рецепторы в собачье хвостатодном ядре. Mol Cell Biochem. 1982; 43 (2): 65-80. [PubMed]
23. Richfield EK, Penney JB, Young AB. Сравнение анатомического и аффинного состояния между дофаминовыми D1 и рецепторами D2 в центральной нервной системе крысы. Neuroscience. 1989; 30 (3): 767-777. [PubMed]
24. Хикосака О. Основополагающие механизмы ганглиев ориентированного на вознаграждение движения глаз. Ann NY Acad Sci. 2007; 1104: 229-249. [PubMed]
25. Surmeier DJ, Ding J, Day M, Wang Z, Shen W. D1 и D2 допамин-рецепторная модуляция полосатой глутаматергической сигнализации в полосатой среде колючих нейронов. Тенденции Neurosci. 2007; 30 (5): 228-235. [PubMed]
26. Фрэнк МЮ. Динамическая модуляция допамина в базальных ганглиях: нейрокомпьютационный учет когнитивных дефицитов в медикаментозном и немедицинском паркинсонизме. J Cogn Neurosci. 2005; 17 (1): 51-72. [PubMed]
27. Кравиц А.В., Тай Л.Д., Крейцер А.С. Отдельные роли для прямых и непрямых путей полосатых нейронов в арматуре. Nat Neurosci. 2012; 15 (6): 816-818. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
28. Fadok JP, Dickerson TM, Palmiter RD. Допамин необходим для зависящего от биза страха. J Neurosci. 2009; 29 (36): 11089-11097. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
29. Zweifel LS, et al. Активация нейронов допамина имеет решающее значение для аверсивного кондиционирования и предотвращения генерализованной тревоги. Nat Neurosci. 2011; 14 (5): 620-626. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
30. Lammel S, et al. Специфический для входа контроль за вознаграждением и отвращением в области вентральной области. Природа. 2012; 491 (7423): 212-217. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
31. Манц Дж., Тьерри А.М., Гловинский Дж. Влияние ядовитого хвостового пинча на скорость разряда мезокортикальных и мезолимбических нейронов допамина: селективная активация мезокортикальной системы. Brain Res. 1989; 476 (2): 377-381. [PubMed]
32. Tidey JW, Miczek KA. Социальное поражение стресса избирательно изменяет высвобождение мезокортиколибмного дофамина: исследование микродиализа in vivo. Brain Res. 1996; 721 (1-2): 140-149. [PubMed]
33. Pezze MA, Feldon J. Мезолимбические допаминергические пути в обучении страху. Prog Neurobiol. 2004; 74 (5): 301-320. [PubMed]
34. де ля Мора, Гальегос-Кари А, Аризменди-Гарсия Й, Марцеллино Д., Фукс К. Роль механизмов рецепторов допамина в модуляции страха и тревоги в миндалевидной структуре: Структурно-функциональный анализ. Prog Neurobiol. 2010; 90 (2): 198-216. [PubMed]
35. Heien ML, Johnson MA, Wightman RM. Устранение нейротрансмиттеров, обнаруженных циклической вольтамперометрией с быстрым сканированием. Anal Chem. 2004; 76 (19): 5697-5704. [PubMed]
36. Heien ML, et al. Измерение пульсаций допамина в режиме реального времени после кокаина в мозге поведения крыс. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102 (29): 10023-10028. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
37. Natori S, et al. Субсекундное высвобождение дофамина, связанное с наградами, в дорсальном полосатом мыше. Neurosci Res. 2009; 63 (4): 267-272. [PubMed]