Дофамин, норадреналин и различие в сексуальном поведении между римским высоким и низкой Крысой Избежанием Мужа: А микродиализным исследованием в медиальном префронтальной коре головного мозга

Фронт. Behav. Neurosci., 07 Июнь 2017 | https://doi.org/10.3389/fnbeh.2017.00108

текс

¹Отделение биомедицинских наук, Отделение нейробиологии и клинической фармакологии и Центр передового опыта по нейробиологии зависимостей, Университет Кальяри, Кальяри, Италия
²Отделение наук о жизни и окружающей среде, Отделение фармацевтических, фармакологических и нутрицевтических наук, Университет Кальяри, Кальяри, Италия
³Институт нейронауки, Национальный исследовательский совет, секция Кальяри, Cittadella Universitaria, Кальяри, Италия

Римские беспородные крысы с высоким (RHA) и низким уровнем избегания (RLA), которые отличаются относительно быстрым или плохим приобретением активного ответа избегания в челночной коробке, показывают различия в сексуальной активности, когда помещены в присутствии сексуально восприимчивая самка крысы. Действительно, крысы RHA демонстрируют более высокие уровни сексуальной мотивации и совокупной эффективности, чем крысы RLA, которые сохраняются и после повторной сексуальной активности. Эти различия коррелировали с более высоким тонусом мезолимбической дофаминергической системы крыс RHA по сравнению с крысами RLA, что было выявлено более высоким увеличением дофамина, обнаруженного в диализате, полученном из ядра accumbens RHA, чем у крыс RLA во время половой активности. Эта работа показывает, что внеклеточный дофамин и норадреналин (NA) также увеличивают диализат из медиальной префронтальной коры (mPFC) самцов крыс RHA и RLA, помещенных в недоступных самок крыс, и более заметно во время прямого полового взаимодействия. Такое увеличение дофамина (и его основного метаболита 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты, DOPAC) и NA было обнаружено как у сексуально наивных, так и у опытных животных, но они были выше: (i) у RHA, чем у крыс с RLA; и (ii) у сексуально опытных крыс с RHA и RLA, чем у их наивных собратьев. Наконец, различия в дофамине и NA в mPFC возникали одновременно с таковыми в сексуальной активности, поскольку крысы RHA демонстрировали более высокие уровни сексуальной мотивации и совокупной эффективности, чем крысы RLA как в сексуально наивных, так и в опытных условиях. Эти результаты позволяют предположить, что более высокий дофаминергический тонус также наблюдается в mPFC, вместе с повышенным норадренергическим тонусом, который может быть вовлечен в различные паттерны копуляции, обнаруживаемые у крыс с RHA и RLA, как предполагается для мезолимбической дофаминергической системы.

Введение

Римские линии беспородных крыс с высоким (RHA) и низким уровнем избегания (RLA), первоначально выбранные для соответственно быстрого и плохого получения активного ответа избегания в челночной коробке (Bignami, 1965; Бродхерст и Бингами, 1965; Дрисколл и Бэттиг, 1982; Фернандес-Теруэль и др., 2002; Георгий и др., 2007) демонстрируют существенные различия в сексуальной активности, когда помещаются в присутствии сексуально восприимчивой самки крысы. Действительно, крысы RHA демонстрируют более высокий уровень сексуальной мотивации, чем крысы RLA, о чем свидетельствует более высокое число неконтактных эрекций полового члена, показанных этими крысами в присутствии недоступно восприимчивой самки, и лучшие показатели совокупления, чем у крыс RLA, как выявлено значительными различиями в многочисленных копулятивных параметрах, обнаруженных в основном в первом копулятивном тесте между двумя линиями крыс, но также и после пяти копулятивных тестов, хотя и ослабленных (Санна и др., 2014a). Среди наиболее выраженных различий, обнаруженных между крысами RHA и RLA, есть процент крыс, которые инициируют монтаж и интромитирование и которые эякулируют в первом копулятивном тесте, 80% крыс RHA против 40% крыс RLA соответственно (Санна и др., 2014a). Большое количество экспериментальных данных свидетельствует о том, что функционально отличающийся дофаминергический тонус участвует в различиях совокупления между крысами RHA и RLA. Фактически, было обнаружено, что различные копулятивные паттерны у крыс RHA и RLA по-разному модифицируются апоморфином, смешанным агонистом допаминового рецептора D1 / D2, вводимым в дозах, облегчающих сексуальное поведение, и галоперидолом, антагонистом рецептора допаминового D2, вводимым в низкие дозы, которые подавляют сексуальное поведение (Санна и др., 2014b). Соответственно, было обнаружено, что крысы RLA более чувствительны к облегчению и ингибированию сексуального поведения, вызванного апоморфином и галоперидолом, соответственно, что демонстрируется большими модификациями, индуцированными этими двумя лекарственными средствами, главным образом при введении в более низких дозах при различных параметрах копуляции. Крысы RLA по отношению к крысам RHA (Санна и др., 2014b). Возможно, более важно для этого исследования, различные паттерны совокупления RHA и RLA крыс также связаны с различиями в активности мезолимбических дофаминергических нейронов, активность которых, как известно, увеличивается во время сексуального поведения (Pfaus et al., 1990; Pleim и др., 1990; Pfaus и Phillips, 1991; Damsma и др., 1992; Wenkstern et al., 1993; Balfour и др., 2004; Питчерс и др., 2010, 2013; Белоат и др., 2016). Действительно, несмотря на тот факт, что крысы RHA и RLA, подвергшиеся сексуальному наивному и сексуальному опыту, имеют сходные базальные значения внеклеточного дофамина в диализате из ядра accumbens, концентрации внеклеточного дофамина и 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (DOPAC, один из его основных метаболитов) ), было обнаружено, что по-разному увеличивают в диализатах, полученных из прилежащего ядра оболочки наивных и сексуально опытных крыс RHA и RLA в обеих упреждающих и consummatory фаз сексуального поведения. Вышеуказанные различия были более выражены между крысами RHA и RLA, не получавшими сексуального контакта, но сохранялись между крысами RHA и RLA, имеющими сексуальный опыт, хотя они имели тенденцию к уменьшению у этих крыс, как было обнаружено при различиях в сексуальном поведении (Санна и др., 2015).

Функциональная роль повышения дофаминергической активности в прилежащем ядре, наблюдаемая во время половой активности (как на аппетитной, так и на завершающей стадиях сексуального поведения), все еще остается предметом дискуссий, а также во время кормления, которая, как и сексуальная активность, имеет сильную мотивационная валентность. Таким образом, хотя дофамин в прилежащем ядре участвует в мотивации, а мезолимбические дофаминергические нейроны обычно называют полезными нейронами, в последние 15 годы недавние исследования подтверждают гипотезу о том, что мезолимбический дофамин не связан с первичным выражением мотивированного или полезного поведения, а скорее с обучением и памятью ассоциаций стимул-вознаграждение (Agmo и др., 1995; Берридж и Робинсон, 1998; Ikemoto и Panksepp, 1999; Питчерс и др., 2013, 2014; Белоат и др., 2016; Salamone и др., 2016). В соответствии с этой гипотезой недавно было обнаружено, что блокада дофаминовых рецепторов в прилежащем ядре или инактивация дофаминергических нейронов в области вентрального сегмента не в состоянии изменить экспрессию аппетитных и совокупных аспектов копулятивного поведения у самцов крыс (Питчерс и др., 2013, 2014; Белоат и др., 2016).

Однако нельзя исключать роль других областей мозга, содержащих дофамин, в вышеуказанных различиях в сексуальном поведении между крысами RHA и RLA. Соответственно, хорошо известно, что допамин оказывает стимулирующее влияние на упреждающую и завершающую фазы сексуального поведения у лабораторных животных, а также у людей не только в прилежащем ядре (Everitt, 1990; Pfaus et al., 1990; Халл и др., 1991; Pfaus и Everitt, 1995; Мелис и Аргиолас, 2011), но также и в других областях мозга, таких как медиальная преоптическая область, гипоталамус и его ядра (то есть паравентрикулярное ядро (PVN); Pfaus и Phillips, 1991; Argiolas и Melis, 1995, 2005, 2013; Халл и др., 1995, 1999; Мелис и Аргиолас, 1995; Melis et al., 2003; Succu и др., 2007; Pfaus, 2010). Другой областью, которая содержит дофамин и может играть роль в сексуальном поведении, является медиальная префронтальная кора (mPFC; Fernández-Guasti и др., 1994; Агмо и Вильяльпандо, 1995; Agmo и др., 1995; Эрнандес-Гонсалес и др., 1998, 2007; Какяма и др., 2003; Balfour и др., 2006; Afonso et al., 2007; Дэвис и др., 2010; Febo, 2011). На самом деле, в этой области мозга обнаруживаются нервные окончания мезокортикальных дофаминовых нейронов, а их клеточные тела локализуются в вентральной сегментарной области в виде мезолимбических дофаминовых нейронов. Что касается прилежащего ядра, точная роль этой области мозга в сексуальном поведении далеко не ясна. Действительно, поражения mPFC обычно оказываются неспособными изменить сексуальное поведение самцов крыс с сексуально восприимчивой самкой (Fernández-Guasti и др., 1994; Агмо и Вильяльпандо, 1995; Agmo и др., 1995; Эрнандес-Гонсалес и др., 1998, 2007; Какяма и др., 2003; Balfour и др., 2006; Afonso et al., 2007), а также выражение условного места предпочтения сексуального вознаграждения (Дэвис и др., 2010). Однако поражения mPFC, которые не изменяли вид обусловленного предпочтения места для сексуального вознаграждения, у тех же животных устраняли способность формировать условное отвращение к сексуальной активности в сочетании с отвращающими стимулами (Дэвис и др., 2010) и выборочный запуск клеток при приближении поведения самца крысы к недоступной сексуально восприимчивой самке измеряли в mPFC самцов крыс (Febo, 2011). Эти результаты позволили предположить, что активация mPFC во время сексуального поведения играет роль в интеграции внешней и внутренней информации для исполнения и контроля целенаправленного поведения, а не в выражении врожденных реакций на естественных подкрепляющих факторов (см. Goto и Grace, 2005). Соответственно, вместе с прилежащим ядром, mPFC является частью сложной нервной системы, вовлеченной в модуляцию мотивированного поведения (целенаправленное поведение), которая требует интеграции когнитивной информации из mPFC, эмоциональной информации из миндалины и контекста- связанная информация от гиппокампа, в прилежащем ядре (Goto и Grace, 2005).

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что высвобождение дофамина в mPFC участвует в адаптивной регуляции мотивированного поведения, и считается, что нарушение регуляции этих механизмов играет роль в патологических или неадаптивных состояниях, таких как психические расстройства, такие как шизофрения, дефицит внимания и гиперактивные расстройства ( СДВГ), депрессия (Данлоп и Немрофф, 2007; Масана и др., 2011), или злоупотребление психоактивными веществами и азартные игры (Эверитт и Роббинс, 2005). Интересно, что на активность дофамина, высвобождаемого в mPFC, может влиять норадреналин (NA), который присутствует в mPFC на более высоких уровнях, чем дофамин, и, в частности, переносчик NA (NET), который не только более распространен, чем транспортер допамина (DAT) в mPFC (Carboni et al., 1990, 2006; Греш и др., 1995; Westernik et al., 1998), но также показывает сродство к дофамину даже выше, чем сродство к NA (Рог, 1973). Поскольку дофамин и NA часто взаимодействуют во многих функциях mPFC, от формирования рабочей памяти и концентрации внимания и перехода к обучению с изменением направления, подавлению реакции и реакции на стресс (см. Роббинс и Арнстен, 2009), это повышает вероятность того, что дофамин, один или вместе с NA, в mPFC также может играть роль в поведенческих различиях между RHA и RLA крысами, в том числе обнаруженными в сексуальном поведении.

Чтобы проверить эту гипотезу, активность мезокортикальной дофаминергической системы и норадренергической системы в mPFC была исследована в двух линиях крысы RHA и RLA посредством интрацеребрального микродиализа. Вкратце, дофамин (и его основной метаболит DOPAC) и NA измеряли в диализатах, полученных из предлимбических (PrL) и инфралимбических (IL) компартментов mPFC сексуально наивных (например, никогда не подвергавшихся воздействию восприимчивой женщины) и сексуально опытных RHA и Крысы RLA (например, которые прошли пять предварительных тестов на совокупление и показывают постоянные уровни копулятивной активности), когда их помещают в присутствии недоступной восприимчивой самки и во время прямого полового взаимодействия с помощью жидкостной хроматографии высокого давления в сочетании с электрохимическим обнаружением (HPLC-ECD).

Материалы и методы

Животные

Беспородные самцы крыс RHA и RLA (N = 30 для каждой линии, весом ≈300 г в начале экспериментальной работы) все были из колонии, основанной в 1998 в Университете Кальяри, Италия (Георгий и др., 2007). Процедуры, используемые для селекционного разведения сардинской колонии, уже были подробно описаны (Георгий и др., 2005).

Овариэктомизированный стимул SD самок крыс (250 – 300 g в начале экспериментальной работы), использованный во всех экспериментах, был получен от Envigo (San Pietro al Natisone, Италия). Животных акклиматизировали по четыре на клетку (38 см × 60 см × 20 см) в места содержания животных Департамента биомедицинских наук Университета Кальяри в течение минимум 10 дней до начала экспериментов, при 24 ° C, влажности 60%, обратный цикл 12 h свет / темнота (свет выключен с 08: 00 h до 20: 00 h), вода и стандартная лабораторная пища вволю, Животных ежедневно обрабатывали 1 – 2 min в течение всего периода привыкания, чтобы ограничить манипуляционный стресс во время экспериментов; Кроме того, контакт с обслуживающим персоналом приюта для животных был ограничен одним обслуживающим персоналом, и постельные принадлежности в домашних клетках никогда не менялись ни накануне, ни в день экспериментов. Все эксперименты проводились между 10: 00 h и 18: 00 h. Это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями руководящих принципов европейских сообществ, сентябрьской директивы 22, 2010 (2010 / 63 / EU) и итальянского законодательства (DL March 4, 2014, n. 26). Протокол был одобрен Этическим комитетом по экспериментам на животных Университета Кальяри (Авторизация № 361 / 2016-PR, апрель 08, 2016 to FS).

Экспериментальные группы

Использовали наивных и сексуально опытных самцов крыс RHA и RLA. Сексуально наивными крысами были крысы, никогда не подвергавшиеся воздействию сексуально восприимчивой овариэктомии и эстрадиола + прогестерона, загрунтованного самкой; крысы с сексуальным опытом были крысами, которые уже проходили пять последовательных тестов совокупления 60 мин с интервалами дней 3 с восприимчивой самкой (Санна и др., 2014a,b). Самки были доставлены в эструс путем обработки подкожным бензоатом эстрадиола (200 мкг / крыса в арахисовом масле) и прогестероном (0.5 мг / крыса в арахисовом масле), 48 h и 6 h перед тестами на совокупность, соответственно. Эструс был проверен по окраске Мей-Грюнвальд-Гимзы и микроскопическому исследованию влагалищных мазков 1 ч до экспериментов. В соответствии с предыдущими исследованиями (Санна и др., 2014a,b, 2015) было обнаружено, что пяти предварительных тестов на совокупление было достаточно, чтобы у самцов римских крыс обеих линий были постоянные уровни копулятивной активности: например, крысы RHA и RLA, прошедшие половое испытание, удовлетворяли критерию по меньшей мере одной эякуляции, достигнутой в каждом из двух последних тестов. (одна крыса RHA и две крысы RLA, которые не удовлетворяли этому критерию, были выброшены на этом этапе). Через два дня после этих предварительных копулятивных тестов у римских крыс, подвергшихся сексуальному испытанию, была проведена стереотаксическая операция по имплантации зонда микродиализа в mPFC, как описано ниже (Санна и др., 2015).

Микродиализ в mPFC во время сексуального поведения

За день до микродиализа крысы, не подвергавшиеся сексуальному или опытному RHA и RLA, помещались в стереотаксический аппарат (Stoelting Co., Wood Dale, IL, США) под изофлурановой анестезией (1.5% -2%; Гарвардский аппарат, Холлистон, Массачусетс, США) и имплантирован с помощью вертикального самодельного зонда для микродиализа (диализная мембрана ≈3 мм свободной поверхности; Melis et al., 2003) и направлены в одностороннем порядке в отсеки mPFC, PrL и IL (координаты: 3.0 мм спереди и 0.7 мм сбоку от брегмы и 5.5 мм вентрально от твердой мозговой оболочки; Паксинос и Ватсон, 2004). В день эксперимента животных переводили во время темновой фазы цикла в сопряженную клетку (45 см × 30 см × 24 см), которая находилась в звуконепроницаемой комнате, освещенной тусклым красным светом и содержащей внутри другого маленькая клетка из оргстекла (15 см × 15 см × 15 см) с отверстиями 25 (Ø 2 мм) в вертикальных стенах для обеспечения визуального, обонятельного и акустического, но не прямого взаимодействия. После периода привыкания 2 ч зонд для микродиализа был подключен к микроинфузионному насосу CMA / 100 (Гарвард Аппарат, Холлистон, Массачусетс, США) с полиэтиленовой трубкой и перфузирован раствором Рингера (147 мМ NaCl, 3 мМ KCl и 1.2 мМ CaCl₂, pH 6.5), при скорости потока 2.5 мкл / мин. После периода уравновешивания 2 h перфузионной среды с внеклеточной жидкостью аликвоты диализата по 37.5 мкл собирали каждые 15 мин во время эксперимента в охлажденных льдом полиэтиленовых пробирках для измерения концентрации дофамина, DOPAC и NA, как описано ниже. После сбора по меньшей мере четырех аликвот диализата в небольшую клетку, расположенную в клетке спаривания, вводили восприимчивую самку крысы в течение 30 мин. В течение этих 30 мин были собраны две другие аликвоты диализата. В этих условиях самцы крысы не могут напрямую взаимодействовать с самкой, но демонстрируют бесконтактную эрекцию (см. Ниже). По истечении этого периода небольшую клетку удаляли, позволяли копуляцию в течение 75 мин и собирали другие пять аликвот диализата. В конце этого периода самка была удалена из брачной клетки и была собрана дополнительная аликвота диализата (Pfaus и Everitt, 1995; Melis et al., 2003; Санна и др., 2015). Половые параметры, относящиеся к предвосхищающей и завершающей фазам сексуального поведения, регистрировались на протяжении всего эксперимента (см. Ниже).

Сексуальное поведение

Несколько параметров сексуальной мотивации и копулятивных показателей, связанных с упреждающей и завершающей фазами сексуального поведения, были зафиксированы на протяжении всего эксперимента наблюдателем, который не знал о конкретных условиях эксперимента, например, который не знал линии и уровня сексуального опыта. животных, использованных в этом эксперименте (см. ниже). Вкратце, латентность к первой бесконтактной эрекции (NCPEL, приуроченная к введению восприимчивой женщины во внутренней маленькой клетке) и их частота (NCPEF, число неконтактных эрекций полового члена, которые происходят в период, в котором женщина присутствовали во внутренней клетке). Эти опосредованные феромонами эрекции полового члена, которые возникают у сексуально сильных самцов крыс в присутствии недоступной восприимчивой самки, считаются важным показателем сексуального возбуждения (Сакс и др., 1994; Sachs, 2000; Melis et al., 2003). Когда было разрешено половое взаимодействие, например, во время совокупления, задержка нарастания и интромит (ML и IL, приуроченные к удалению внутренней маленькой клетки до первого наложения или первого введения, соответственно); частота монтирования и интромитирования (MF и IF, количество скакунов и интромиссий соответственно в первой серии копулятивной активности и в течение всего периода копуляции); латентность к эякуляции (EL, приуроченная от первого интромиссии первой серии до эякуляции); частота эякуляции (EF, общее количество эякуляций во время теста на совокупление) и постэякуляторный интервал (PEI, рассчитанный по времени от первой эякуляции до следующей интромиссии). Кроме того, совокупная эффективность (CE; число интромиссий данной серии, деленное на сумму количества скакунов и интромиссий в одной и той же серии) и интервал между интромизиями (III; соотношение между задержкой эякуляции данной серии и количество интромиссий в этой серии) также рассчитывали для первой серии копулятивной активности (Сакс и Барфилд, 1976; Meisel и Sachs, 1994; Melis et al., 2003; Санна и др., 2014a,b, 2015).

Определение концентраций дофамина, ДОФАК и норадреналина в диализате из mPFC

Концентрации дофамина, DOPAC и NA измеряли в мкл 20 той же аликвоты диализата из mPFC с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) в сочетании с электрохимическим детектированием с использованием двойной ячейки 4011 (Coulochem II, ESA, Cambridge, MA, USA), как уже описано (Melis et al., 2003). Обнаружение проводилось в режиме восстановления при + 350 и -180 мВ. ВЭЖХ оснащали колонкой Supelcosil C18 (7.5 см × 3.0 мм, размер частиц 3 мкм; Supelco, Supelchem, Милан, Италия), элюировали 0.06 M цитрат / ацетат pH 4.2, содержащий метанол 20% об. / Об., 0.1 мМ ЭДТА, 1 мкМ триэтиламин и 0.03 мМ додецилсульфат натрия в качестве подвижной фазы при скорости потока 0.6 мл / мин и комнатной температуре. Чувствительность анализа составляла 0.125 pg для дофамина, 0.1 pg для DOPAC и 0.2 pg для NA.

гистология

В конце экспериментов крыс умерщвляли путем декапитации, мозг немедленно удаляли из черепа и погружали в 4% водный формальдегид на 12 – 15 дни. После этого периода срезы головного мозга 40 мкм готовили с помощью замораживающего микротома, окрашивали нейтральным красным и проверяли на фазово-контрастном микроскопе. Положение кончика зонда затем локализовали в mPFC, следуя тракту зонда через ряд срезов мозга (см. Рисунок 1). Только крысы, у которых обнаружено, что активная часть диализирующей мембраны правильно расположена в компартментах PrL и IL mPFC, были рассмотрены для статистической оценки результатов (одна крыса из каждой экспериментальной группы была выброшена на этой стадии).

Рисунок 1

Рисунок 1, Схематическое изображение коронарного отдела головного мозга крысы, показывающее трек зонда микродиализа в PrL и IL-частях медиальной префронтальной коры (mPFC; Паксинос и Ватсон, 2004). Квадратная скобка на микрофотографии указывает на участок, окрашенный в нейтральный красный цвет, показывающий активную часть диализирующей мембраны зонда для микродиализа. Сокращения: PrL, предлимбическая область; ИЛ, инфралимбическая зона; AC, передняя комиссура; CC, мозолистое тело.

Показатели

Статистический анализ биохимических (дофамин, DOPAC и NA) и поведенческих (NCPEL и NCPEF, ML, IL и EL, MF, IF и EF и PEI) данных проводился либо по всем экспериментальным субъектам (как это традиционно делалось в исследованиях на самцах крыс). копулятивное поведение) или исключение тех субъектов, которые не совокупились с эякуляцией во время эксперимента по микродиализу. В первом случае, когда все животные были включены в анализы, животным, которые не показывали NCPE в течение времени, когда самка была недоступна или не садилась, не интромитировала или не эякулировала с доступной самкой, присваивались соответствующие оценки полного диапазона: 1800 s, если мужчина не показывал NCPE в течение минимума 30, в течение которого женщина была недоступна; 900 s для ML и IL, если мужчина не монтировал или не интромитировал с имеющейся женщиной; 1800 для EL, если мужчина не достиг эякуляции, и 600 для PEI, если мужчина не интромитировал после первой эякуляции. Во втором случае те животные, которые не совокупились с эякуляцией, были исключены из анализа. Это было сделано для того, чтобы оценить, могут ли различия в сексуальном поведении соотноситься с различиями в концентрациях внеклеточного дофамина, DOPAC и NA в mPFC линий римских крыс во время двух фаз сексуальной активности, исключающих возможные путаницы из-за включения субъектов, которые не демонстрировали сексуальное поведение, назначая им фиксированные значения для анализируемых сексуальных параметров.

Несколько статистических анализов были выполнены с ANOVA, чтобы обнаружить и лучше охарактеризовать возможные различия между используемыми экспериментальными условиями. Перед выполнением ANOVA наборы данных каждой из различных экспериментальных переменных были проверены на однородность отклонений среди четырех экспериментальных групп (выполненных со всеми животными или с крысами, совокупляющимися только с эякуляцией) с помощью теста Бартлетта или Левина в зависимости от конкретного случая. Когда были обнаружены существенные различия в дисперсиях, наборы данных были преобразованы в логарифм (то есть экспериментальные значения Y изменены на значения Log Y), повторно проверены на однородность дисперсий и затем проанализированы с помощью ANOVA. Вкратце, поведенческие параметры, полученные до (например, с недоступной самкой) и во время первой серии копулятивной активности (от первого подъема / интромиссии до первого подъема / интромиссии после первого семяизвержения) наивных и сексуально опытных крыс-самцов RHA и RLA во время микродиализа анализировали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с использованием линии крысы и уровня сексуального опыта между факторами субъекта (средние значения поведенческих параметров приведены в таблице. 1 и F значения и уровни значимости анализов ANOVA в таблице 2).

ТАБЛИЦА 1

Таблица 1, Копулятивные параметры, измеренные в первой серии копулятивной активности (которая начинается с первого монтирования / интромиссии, когда самка становится доступной для самца, и заканчивается после постэякуляторного интервала с первым монтированием / интроммизацией второй серии) и бесконтактного полового члена эрекция сексуально наивных и опытных крыс RHA и RLA.

ТАБЛИЦА 2

Таблица 2. F Значения и уровни значимости двустороннего ANOVA, выполненного на данных, представленных в таблице 1 с использованием линии крысы (RHA против RLA) и уровня сексуального опыта (наивный или опытный) в качестве факторов субъектов.

Кроме того, был проведен общий анализ данных, полученных от каждой крысы во время микродиализа, путем расчета сначала значений AUC, полученных путем построения графиков значений концентраций дофамина, DOPAC или NA или числа бесконтактных эрекций, монтировок, интромиссий и эякуляций в сравнении с . время (начиная с 1 ч после введения самца крысы в брачную клетку до конца эксперимента -180 мин, деленное на доли 15 мин для нейрохимических значений - или во время, когда самка была введена в брачную клетку для поведенческих параметров), а затем путем сравнения рассчитанных значений с помощью двухстороннего ANOVA с использованием линии крысы и уровня сексуального опыта, как между факторами субъектов (средние значения AUC нейрохимических и поведенческих параметров приведены в таблице 4 и F значения и уровни значимости анализов ANOVA в таблице 5). И наконец, факторный анализ каждого набора данных (т. Е. Значений концентраций дофамина, DOPAC, NA и числа бесконтактных эрекций, подъемов, интромиссий и эякуляций в зависимости от времени) был выполнен факториально. ANOVA для повторных измерений с использованием линии крысы и уровня сексуального опыта между субъектными факторами и временем (то есть долями диализата) как внутри субъектного фактора ( F Значения и уровни значимости этих анализов ANOVA приведены в таблице. 6). Аналогичные анализы проводились также с учетом только базовых значений нейрохимических параметров (последние четыре аликвоты диализата, собранные до введения в брачную клетку восприимчивой женщины), средние значения которых приведены в таблице 3, В качестве первого, но не второго порядка взаимодействия были обнаружены при выполнении общих факторных ANOVA для повторных измерений, в частности взаимодействия Line × Time и Experience × Time для нейрохимических параметров (см. Таблицу 6), двухсторонние ANOVA с линией или уровнем сексуального опыта как между субъектным фактором, так и временем как внутри субъектного фактора были выполнены на этих наборах данных путем прямого сравнения сексуально наивных или опытных крыс с RHA и RLA, или сексуально опытных и наивные крысы RHA или сексуально опытные или наивные крысы RLA. Результаты Постфактум парные контрасты, выполненные с использованием теста Тьюки HSD для значимых взаимодействий, выявленных этими двусторонними ANOVA, представлены на рисунке. 2, Во всех остальных случаях Постфактум Сравнений не сообщалось, поскольку ANOVA не удалось выявить какого-либо значимого взаимодействия между линией крыс, уровнем сексуального опыта и временем. Статистический анализ был проведен с использованием Graph Pad 5 (PRISM, Сан-Диего, Калифорния, США) и STATISTICA 12 (Statsoft, Tulsa, OK, USA) с уровнем значимости, установленным на P <0.05.

ТАБЛИЦА 3

Таблица 3, Базальные концентрации дофамина (DA), 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (DOPAC) и норадреналина (NA) (нМ) в диализате из медиальной префронтальной коры (mPFC) сексуально наивных и опытных крыс с RHA и RLA.

ТАБЛИЦА 4

Таблица 4, Общая оценка различий в концентрациях DA, DOPAC и NA и в сексуальном поведении между сексуально неопытными и опытными крысами RHA и RLA путем анализа усредненных AUC, полученных из результатов, показанных на рисунках 2 и 3.

ТАБЛИЦА 5

Таблица 5. F Значения и уровни значимости двусторонних ANOVA, выполненных на данных, представленных в таблице 4 с использованием линии крысы (RHA против RLA) и уровня сексуального опыта (наивный или опытный) в качестве факторов субъектов.

ТАБЛИЦА 6

Таблица 6. F Значения и уровни значимости общих факторных ANOVA для повторных измерений, выполненных на результатах, показанных на рисунках 2 и 3 с использованием линии крысы (L; RHA против RLA) и уровня сексуального опыта (E) (наивный или опытный) между факторами субъектов и временем (T) (фракции диализата) как внутри факторов субъектов.

Рисунок 2

Рисунок 2, Концентрации дофамина (DA), DOPAC и норадреналина (NA) в диализатах mPFC из сексуально наивных (А, С, Е) и опытные RHA и RLA самцы крыс (В, D, F) во время сексуальной активности с восприимчивой женщиной. Сексуально наивные (то есть никогда ранее не подвергавшиеся сексуально восприимчивой женщине) и сексуально опытные (которые прошли пять тестов на совокупление) обеих линий с микродиализным зондом, стереотаксически имплантированным в mPFC, были помещены индивидуально в клетку для спаривания. Микродиализный зонд перфузировали диализным буфером, как описано в разделе «Материалы и методы». После сбора четырех аликвот диализата для определения базальных значений недоступную восприимчивую самку помещали в небольшую клетку сопряженного аппарата (время = 0, inaccess.fe). Через 30 min небольшая клетка была удалена, и было разрешено совокупление в течение 75 min (совокупление), после чего самка была удалена из сопряженной клетки (fe.remov). В ходе эксперимента были измерены неконтактные эрекции и параметры совокупления, и аликвоты диализата собирали каждые 15 мин и анализировали на допамин, DOPAC и NA, как описано в разделе «Материалы и методы». Значения представляют собой средние значения ± SEM значений, полученных всеми крысами 12 на группу (RHA_all = сплошные зеленые линии, RLA_all = сплошные коричневые линии) или значения, которые копируются только для эякуляции (RHA_cop = пунктирные красные линии; RLA_cop = пунктирные синие линии). У опытных крыс RHA все животные достигли совокупления и значения идентичны. *P <0.05 по отношению к базовым значениям (нет самок) группы (зеленый для RHA_all; красный для RHA_cop, коричневый для RLA_all, синий для RLA_cop); ^#P <0.05 относительно соответствующих значений группы RLA (красный, RHA_all vs. RLA_all; зеленый, RHA_cop vs. RLA_cop); ^§P <0.05 относительно согласованных по времени значений у сексуально наивных крыс (зеленые, опытные RHA_all против наивных RHA_all; красные, опытные RHA_cop против наивных RHA_cop; коричневые, опытные RLA_all против наивных RLA_all; синие, опытные RLA_cop против наивных RLA_cop) (двухфакторный дисперсионный анализ, выполненный на показанных данных после их логарифмического преобразования, как объяснено в разделе «Материалы и методы», подраздел «Статистика», за которым следуют тесты HSD Тьюки).

Итоги

Крысы RHA и RLA демонстрируют различное количество неконтактных эрекций и различные модели копулятивного поведения

В соответствии с более ранними исследованиями (Санна и др., 2014a,b, 2015), другое количество половозрелых самцов крыс RHA и RLA стало участвовать в сексуальной активности, когда их объединяли с восприимчивой самкой во время сбора аликвот диализата из mPFC с помощью внутримозгового микродиализа. Вкратце, в этом исследовании 10 из 12 половозрелых самцов крыс RHA (83%) копировали для эякуляции в своем первом копулятивном тесте против только 6 из 12 наивных крыс RLA (50%) во время эксперимента по микродиализу. Эта разница была также обнаружена у сексуально опытных самцов крыс RHA и RLA (после пяти копулятивных тестов), хотя и ослаблена, причем все крысы 12 RHA достигли эякуляции против 9 из крыс 12 RLA во время микродиализа. Всегда в согласии с предыдущими исследованиями, также в этом исследовании две линии римских крыс демонстрировали различную латентность и частоту неконтактной эрекции полового члена при контакте с недоступной восприимчивой самкой, а также разные паттерны копулятивного поведения во время полового взаимодействия. Эти различия были обнаружены либо при рассмотрении данных всех экспериментальных животных данной группы, независимо от того, совокуплялись ли они с эякуляцией, либо нет (например, путем присвоения полных баллов тем животным, которые не проявляли поведение, то есть крысам, которые не совокупились с эякуляция) или при рассмотрении данных о животных, которые действительно демонстрируют поведение только данной группы (например, животных, которые совокупились с эякуляцией; таблица 1). Соответственно, статистический анализ значений бесконтактной эрекции (NCPE) и копулятивных параметров, измеренных в первой серии копулятивной активности с помощью двухстороннего ANOVA, выявил существенные различия между двумя линиями крыс либо при рассмотрении всех экспериментальных крыс, либо только у копулирующих крыс. в четырех экспериментальных группах (см. таблицу 2). Фактически, когда рассматривались данные, полученные от всех экспериментальных животных, количество бесконтактных эрекций было выше, а NCPEL, ML, IL и PEI были значительно короче у крыс с RHA по сравнению с крысами с RLA. Кроме того, EF и CE были выше, в то время как III был значительно короче, у крыс с RHA по сравнению с крысами с RLA. Некоторые из вышеуказанных различий между двумя линиями римских крыс имели тенденцию уменьшаться или исчезать при повторных копулятивных тестах. Тем не менее, некоторые из этих различий все еще присутствовали после стабилизации сексуального поведения путем повторного сексуального опыта. Аналогичные результаты были получены при рассмотрении только значений животных из четырех экспериментальных групп, которые совокуплялись с эякуляцией, за исключением EF (см. Таблицы 1, 2).

Базальные концентрации внеклеточного дофамина, DOPAC и норадреналина в mPFC-диализатах от половозрелых и опытных крыс с RHA и RLA

В настоящих условиях эксперимента количество дофамина, DOPAC и NA в диализатах, полученных из mPFC всех (например, независимо от того, были ли они скопированы с эякуляцией или нет) у крыс RHA и RLA, не подвергавшихся сексуальному насилию, представляло собой 2.32 pg и 2.11 pg для дофамина, 322.56 pg и 124.42 pg для DOPAC и 6.05 pg и 2.24 pg для NA, соответственно, в 20 мкл диализата. Аналогичные количества были измерены в диализатах, полученных от mPFC крыс RHA и RLA, подвергшихся сексуальному испытанию (дофамин: 3.73 pg и 3.33 pg, DOPAC: 353.62 pg и 133.32 pg, NA: 7.17 pg и 2.78 pg у крыс RHA и RLA соответственно) , Эти значения указывают концентрацию ≅0.8 – 1.2 нМ и ≅95 – 100 нМ для внеклеточного дофамина и DOPAC соответственно, и ≅1.8 – 2.2 нМ для внеклеточного NA, в mPFC крыс RHA, и концентрацию ≅0.8 – 1.2 нМ и N35-40 нМ для внеклеточного дофамина и DOPAC, соответственно, и ≅0.6-0.9 нМ для внеклеточного NA, в mPFC крыс RLA (таблица 3). Вышеуказанные значения были получены после периода уравновешивания 2 h буфера для диализа с внеклеточной жидкостью mPFC. Поскольку восстановление достоверного дофамина, DOPAC и NA диализных зондов было оценено как близкое к 20%, внеклеточные дофамин, DOPAC и NA могут быть оценены как близкие к ≅4 – 5 нМ в обеих линиях для дофамина, ≅500 и N 200 нМ для DOPAC и ≅10 и ≅4 нМ для NA в mPFC крыс RHA и RLA соответственно. Факторные ANOVA для повторных измерений, выполненных на вышеуказанных значениях после логарифмической трансформации, выявили существенные различия в базальных уровнях дофамина между сексуально наивными и сексуально опытными крысами (F_(1,44,132) = 26.05, P <0.001), а также в базальных уровнях ДОПАК (F_(1,44,132) = 63.36, P <0.001) и NA (F_(1,44,132) = 42.14, P <0.001) между крысами RHA и RLA (последние четыре образца собраны перед помещением самки в маленькую клетку). Аналогичные значения были обнаружены при рассмотрении только крыс, которые совокуплялись до эякуляции во время эксперимента по микродиализу (таблица 3). Также в этом случае факторные ANOVA для повторных измерений, выполненных на значениях после логарифмической трансформации, выявили существенные различия в базальных уровнях дофамина между сексуально наивными и сексуально опытными крысами (F_(1,33,99) = 26.97, P <0.001), а также в базальных уровнях ДОПАК (F_(1,33,99) = 42.95, P <0.001) и NA (F_(1,33,99) = 27.63, P <0.001) между крысами RHA и RLA.

Концентрации внеклеточного дофамина, ДОФАК и норадреналина в mPFC-диализатах от половозрелых и опытных крыс RHA и RLA изменяются дифференциально во время сексуальной активности

Присутствие недоступной восприимчивой самки во внутренней маленькой клетке и последующее прямое половое взаимодействие увеличивали концентрации внеклеточного дофамина, DOPAC и NA в mPFC-диализатах, полученных как от сексуально наивных, так и от опытных самцов крыс RHA и RLA, хотя со значительными различиями между две линии крыс и уровень условий опыта, при рассмотрении всех экспериментальных животных или только тех, которые совокупились с эякуляцией (рисунок 2). Фактически, двухсторонние ANOVA AUC концентраций дофамина, DOPAC и NA, показали, что общее содержание дофамина, DOPAC и NA во всем тесте было значительно выше у крыс с RHA по сравнению с крысами с RLA, а также в половом отношении. опытные по сравнению с наивными крысами (см. таблицу 4 для значений AUC и таблицы 5 для F ценности и уровень значимости). Эти различия были дополнительно подтверждены факторными ANOVA от точки к точке для повторных измерений количества дофамина, DOPAC и NA для двух наивных и опытных линий крысы в эксперименте, которые выявили значительные основные эффекты линии, опыта, времени и значимой линии × времени и опыт × время взаимодействия первого порядка (см. таблицу 6 для F ценности и уровень значимости).

Концентрации внеклеточного дофамина, ДОФАК и норадреналина в mPFC-диализатах, полученных от крыс RHA и RLA, подвергшихся сексуальному заражению, изменяются дифференциально во время половой активности

У крыс RHA и RLA, не подвергавшихся сексуальному насилию, внеклеточный дофамин, но не DOPAC, сначала увеличивался при введении в присутствии недоступной самки, тогда как NA увеличивался только у крыс RHA. У наивных RHA крыс внеклеточный дофамин дополнительно увеличивался в первые 15 мин полового взаимодействия, как было обнаружено с DOPAC и NA. Увеличение внеклеточного дофамина, DOPAC и NA продолжалось в течение всего времени совокупления, причем дофамин, DOPAC и NA достигли пикового значения при 60 min, 75 min и 75 min соответственно, затем внеклеточном дофамине и, в меньшей степени, DOPAC и NA , уменьшился до значений, аналогичных базальным после удаления самки.

С другой стороны, первое значительное увеличение и пиковое значение внеклеточного дофамина, DOPAC и NA наблюдалось у крыс RLA, не получавших лечение, в течение первой минуты 15 копуляции. Однако, в отличие от крыс RHA, у крыс RLA внеклеточный дофамин, DOPAC и NA имели тенденцию возвращаться к значениям, аналогичным базальным, в течение первого минимума 30 прямого взаимодействия с самкой (см. Рисунки 2A, С, Е).

Наконец, во время совокупления прирост внеклеточного дофамина был более значительным и более устойчивым у RHA, не подвергавшихся сексуальному насилию, чем у крыс с RLA (см. Рис. 2A) тогда как в отсутствие самки их концентрации были одинаковыми, хотя и не идентичными, по двум линиям крыс (см. выше и таблицу 3). Интересно, что хотя не было обнаружено различий между двумя римскими линиями в процентном увеличении DOPAC и, в меньшей степени, концентрации NA во время присутствия восприимчивой женщины, разница более чем в два раза в абсолютных значениях концентраций DOPAC и NA наблюдался между двумя линиями крыс как в базальных условиях (см. таблицу 3) и на протяжении всего теста с восприимчивой женщиной (см. рисунки 2C, E).

Концентрации внеклеточного дофамина, ДОФАК и норадреналина в mPFC-диализатах, полученных у крыс RHA и RLA, подвергшихся половому опыту, дифференцированно изменяются во время половой активности

Как обнаружено у крыс RHA и RLA, не получавших сексуальной активности, присутствие недоступных самок и последующее прямое половое взаимодействие приводило к увеличению количества внеклеточного дофамина и DOPAC в диализате mPFC, полученном от половозрелых самцов крыс RHA и RLA. Однако и в этом случае были обнаружены различия, связанные с линией крыс, при рассмотрении всех экспериментальных животных или, в меньшей степени, только тех, которые совокупились с эякуляцией (рис. 2). У крыс RHA и RLA, подвергшихся сексуальному опыту, первое увеличение внеклеточного дофамина произошло с недоступной самкой. После этого концентрации допамина увеличивались во время копуляции в обеих линиях крыс. Концентрации дофамина достигли своих пиковых значений после 45 – 60 мин. Совокупности и медленно снижались к базовым значениям в конце копулятивного теста (см. Рисунок 2B). Подобно сексуально наивным крысам, концентрации внеклеточного дофамина были выше у крыс RHA, подвергшихся сексуальному опыту, по сравнению с крысами RLA, в основном в аликвотах диализата, собранных во время центральной части фазы совокупления (после минимума 30 – 45 мин совокупления). Концентрации DOPAC увеличивались в присутствии недоступной самки только у крыс с RHA, в то время как она увеличивалась в одинаковой степени в обеих линиях крыс во время копуляции (пиковые значения при 75 – 90 мин) и имела тенденцию к возврату к базальным значениям в конце Копулятивный тест (см. рисунок 2D). Концентрации NA также увеличивались в обеих линиях крыс, подвергшихся половому опыту, после введения самки, достигая пиковых значений при минимальной 90 у крыс RHA и при минимальной 45 у крыс RLA (см. Рисунок 2F). В отличие от дофамина (см. Выше), аналогичные различия были обнаружены в увеличении концентраций DOPAC и NA у крыс, подвергшихся половому опыту, обеих линий при рассмотрении всех животных по сравнению с животными, достигшими только эякуляции. Однако, как было обнаружено у сексуально наивных крыс, хотя процентное увеличение концентраций DOPAC и NA было сходным, существенные различия в абсолютных значениях DOPAC и NA были обнаружены между сексуально опытными крысами RHA и RLA на протяжении всего теста (то есть до, во время и после присутствие восприимчивой самки), причем у крыс RHA были более высокие значения, чем у крыс RLA (см. таблицу 3 для базальных значений и цифр 2D, F для значений по всему тесту).

Сексуальный опыт влияет на изменение концентрации дофамина и норадреналина в диализатах mPFC, полученных от крыс RHA и RLA во время сексуальной активности

Сравнение концентраций внеклеточного дофамина и NA у сексуально наивных и опытных крыс с RHA и RLA показало, что сексуальный опыт изменил концентрацию внеклеточного дофамина и, в меньшей степени, NA у обеих линий крыс, либо при рассмотрении всех экспериментальных животных или те, которые совокупились только с семяизвержением (рисунки 2A, В, Е, F). Соответственно, существенные различия имели место в базальных значениях дофамина между сексуально наивными и опытными крысами обеих линий (см. Таблицу 3) и значения дофамина во время копулятивной активности были в целом выше у крыс RHA и RLA, подвергшихся сексуальному испытанию, по сравнению с их наивными аналогами (см. рисунок 2B). Кроме того, у крыс RHA, получавших сексуальное опыт, хотя увеличение дофамина, обнаруженное в присутствии недоступной самки, следовало тому же временному паттерну, который наблюдался у сексуально наивных крыс, во время копуляции были обнаружены различия во временном паттерне. Фактически, в этом случае, в отличие от того, что наблюдалось у крыс RHA, не подвергавшихся сексуальному насилию (один основной пик в течение 60 мин), были обнаружены два основных значения пиков: первое после 15 мин и второе после 45 мин совокупления. После этого последнего увеличения значения допамина имели тенденцию возвращаться к базальным значениям (см. Рисунок 2B).

Подобная картина была обнаружена у сексуально наивных и опытных крыс с RLA. Фактически, аналогично тому, что было обнаружено у крыс RHA, также у опытных крыс RLA был обнаружен временный паттерн, характеризующийся тремя основными повышениями внеклеточного дофамина: первый с недоступной самкой и два других во время копуляции, то есть после 15 min и 60 мин совокупления (см. рисунки 2A, В). В целом, сексуальный опыт, по-видимому, вызывает более длительные изменения во временной структуре выделения дофамина в обеих линиях крыс при переходе от сексуально наивного к опытному состоянию.

Как показано на рисунках 2C-Fтолько небольшие различия были обнаружены в концентрации DOPAC и NA между наивными и опытными крысами обеих линий. Тем не менее, незначительная тенденция во внеклеточной NA к более высоким значениям у опытных по сравнению с наивными крысами наблюдалась у базальных (до введения восприимчивой самки, см. Таблицу 3) и в общих количествах NA, как показано значениями AUCs (см. таблицу 4) в расчете на внеклеточные концентрации, полученные из всего теста (до и во время присутствия восприимчивой женщины). Наконец, временная структура концентраций NA была очень похожа при сравнении опытных крыс обеих линий крыс с их наивными аналогами, что указывает на то, что сексуальный опыт может приводить к общему увеличению внеклеточной NA, а не к изменениям в схеме ее увеличения (см. Рисунки 2E, F).

Изменения концентрации внеклеточного дофамина и норадреналина в диализатах mPFC, полученных от наивных и опытных крыс RHA и RLA, происходят одновременно с изменениями в сексуальном поведении

Различия в концентрациях внеклеточного дофамина, DOPAC и NA в диализатах, полученных из mPFC, обнаружены как у половых, так и у опытных RHA и RLA крыс во время теста (рисунок 2) произошли вместе с изменениями в различных сексуальных параметрах, измеренных во время двух основных фаз экспериментов (то есть, женщины недоступны и доступны для мужчины, соответственно), которые включают, среди прочего, бесконтактную эрекцию полового члена (рисунки 3A, В), крепления (цифры 3C, D), интромиссий (рисунки 3E, F) и семяизвержение (рисунки 3G, Н). Эти различия были обнаружены либо при рассмотрении всех экспериментальных животных, либо тех, которые совокуплялись только с эякуляцией. Фактически, предварительный анализ значений AUC этих параметров с помощью двусторонних ANOVA (см. Таблицу 4 для значений AUC и таблицы 5 для F значения и уровень значимости) с последующим точечным анализом значений этих параметров в ходе эксперимента с помощью факторного анализа ANOVA для повторных измерений выявлены существенные основные эффекты взаимодействий Линии, Опыт, Время, значимые линии первого порядка × Время и Опыт × Время, и значительное взаимодействие второго порядка для креплений (см. таблицу 6 для F ценности и уровень значимости). Соответственно, в соответствии с предыдущими исследованиями (Санна и др., 2015): (i) крысы RHA, не подвергавшиеся сексуальному насилию, продемонстрировали больше неконтактных эрекций, коней, интромиссий и эякуляций полового члена, чем их аналоги RLA; (ii) крысы RHA, имеющие сексуальный опыт, показали большее число неконтактных эрекций, интромиссий и эякуляций полового члена, чем их аналоги RLA; и (iii) у крыс обеих линий, получивших сексуальное воздействие, и, в частности, у крыс RLA, было выявлено больше неконтактных эрекций, интромиссий и эякуляций полового члена, чем у их сексуально наивных собратьев. Фактически, в то время как у крыс с RHA большая часть изменений, вызванных сексуальным опытом, произошла во времени, а не в частоте поведенческих параметров (например, опытные крысы совокупились в основном в первой половине теста, тогда как наивные крысы показали аналогичная тенденция к совокуплению на протяжении всего теста), у крыс с RLA более выраженное общее улучшение сексуального поведения, главным образом в отношении сексуальной активности, было вызвано сексуальным опытом, как показали изменения значений параметров совокупления у опытных крыс с RLA по сравнению с их наивные аналоги.

Рисунок 3

Рисунок 3, Изменения в количестве бесконтактных эрекций полового члена (NCPE), верховых, интромиссий и эякуляций, зарегистрированных на сексуально наивных (А, С, Е, G) и опытные крысы RHA и RLA (В, D, F, H) во время экспериментов по микродиализу, представленных на рисунке 2, Все экспериментальные условия были идентичны тем, которые описаны в легенде на рисунке 2, Значения представляют собой средние значения ± SEM значений, полученных всеми крысами 12 на группу (включая те, которым были назначены очные оценки за полный рабочий день; RHA = сплошные зеленые линии, RLA = сплошные коричневые линии) или те, которые копировали только для эякуляции (RHA = пунктирные красные линии ; RLA = пунктирные синие линии). У опытных крыс RHA все животные достигли совокупления и значения идентичны. Поскольку не было обнаружено значимых взаимодействий между фактором линии крысы (RHA и RLA), фактором уровня сексуального опыта (наивный или опытный) и временем путем анализа данных с помощью двухстороннего ANOVA, как показано в таблице 6, Постфактум сравнений не сообщалось, как объясняется в подразделе «Материалы и методы», «Статистика».

Обсуждение

Это исследование подтверждает и расширяет результаты предыдущих исследований, показывающих, что крысы RHA и RLA, которые демонстрируют заметно разные стили преодоления в ответ на неблагоприятные условия (Дрисколл и Бэттиг, 1982; Георгий и др., 2003a; Штаймер и Дрисколл, 2003), демонстрируют отчетливые поведенческие паттерны в присутствии недоступной восприимчивой женщины и во время классических копулятивных тестов (Санна и др., 2014a,b, 2015). Соответственно, это исследование также показывает, что крысы RHA, не подвергавшиеся сексуальному насилию (никогда ранее не подвергавшиеся воздействию восприимчивой самки), демонстрировали более высокую сексуальную мотивацию и лучшую сексуальную работоспособность по сравнению с крысами, не подвергавшимися сексуальному контакту с RLA, например, крысы RHA демонстрируют более высокое число неконтактных эрекций полового члена (феромон- индуцированная эрекция полового члена считается показателем сексуального возбуждения; Сакс и др., 1994; Sachs, 2000) и различные просексуальные изменения в нескольких копулятивных параметрах, как было обнаружено в предыдущих исследованияхСанна и др., 2014a,b, 2015). Эти различия все еще сохранялись в обеих линиях римских крыс после приобретения сексуального опыта, то есть после стабилизации сексуального поведения с пятью экспозициями и тестами совокупления с восприимчивой самкой. Это исследование также впервые показывает, что у крыс линии RHA и RLA, как в наивном, так и в опытном состоянии, неконтактная эрекция полового члена и сексуальное взаимодействие происходили одновременно с увеличением концентрации внеклеточного дофамина (и его основного метаболита DOPAC). ) и NA в диализатах, полученных путем внутримозгового микродиализа из mPFC обеих линий римских крыс. Интересно, что эти увеличения внеклеточного дофамина и NA в mPFC, по-видимому, связаны с различиями либо в фенотипе крысы, либо в уровне сексуального опыта. Соответственно, как подробно показано в разделе «Результаты», как у крыс с сексуальной наивностью, так и у опытных крыс с RHA наблюдалось более высокое и длительное увеличение внеклеточного дофамина и NA по сравнению с их аналогами RLA как в аппетитной, так и в завершающей фазе сексуального поведения. Кроме того, у опытных крыс обеих римских линий наблюдалось более высокое и длительное увеличение внеклеточного дофамина и NA в mPFC в обеих фазах сексуального поведения по сравнению с их наивными аналогами. Наконец, все вышеупомянутые различия во внеклеточном дофамине и NA в mPFC, по-видимому, были связаны с различиями в поведенческих параметрах сексуального поведения, например, у сексуально опытных крыс обеих римских линий наблюдалась более высокая сексуальная мотивация и лучшие показатели совокупления по сравнению с их наивными аналогами. и сексуально наивные и опытные крысы RHA демонстрировали более высокую сексуальную мотивацию и лучшие показатели совокупления по сравнению с их сексуально наивными и опытными аналогами RLA.

Что касается увеличения внеклеточного дофамина, обнаруженного в диализате mPFC во время половой активности, первое увеличение произошло в течение первого 15 спустя мин после введения сексуально восприимчивой самки в брачный аппарат, когда самка была недоступна для самца, что обычно показывает в этом состоянии бесконтактные эрекции полового члена. Второе и большее увеличение внеклеточного дофамина происходило в течение первой минуты 15 после того, как самка стала доступна самцу для совокупления. Интересно, что в то время как в наивном состоянии внеклеточный дофамин повышался в основном в первой части теста с доступной самкой с тенденцией к возврату к базальным значениям во второй части, в условиях сексуального опыта дофамин оставался повышенным на протяжении всего теста, достигая пиковых значений после 45 – 60 мин совокупления в обеих линиях римских крыс.

Помимо вышеупомянутых различий во внеклеточном дофамине во время различных фаз сексуальной активности между крысами RHA и RLA в сексуально наивном и опытном состоянии, это исследование также показывает неожиданные важные и очень значимые различия в концентрации внеклеточного DOPAC между двумя линиями римских крыс ранее (т.е. , базальные значения) и после введения восприимчивой самки в брачный аппарат. Соответственно, было обнаружено, что базальные значения внеклеточного ДОФА в диализате mPFC у крыс с RHA примерно в 2.6 раз выше, чем у крыс с RLA. Это различие между крысами RHA и RLA возникало и сохранялось в сексуально наивных и опытных условиях, несмотря на очень скромные различия в базальных значениях внеклеточного дофамина в диализатах mPFC, полученных из двух линий римских крыс в этих экспериментальных условиях. Взятые вместе, эти различия могут указывать на различный оборот дофамина на уровне mPFC между двумя линиями римских крыс. Соответственно, концентрации ДОФАК обычно отражают количество допамина, высвобождаемого и затем повторно захватываемого дофаминергическими нервными окончаниями и превращаемого в ДОФАК моноаминооксидазой (МАО; Carlsson, 1975). Следовательно, более высокие базальные концентрации DOPAC, обнаруженные у крыс RHA, позволяют предположить, что более высокие количества дофамина высвобождаются и повторно захватываются дофаминергическими нервными окончаниями в mPFC крыс RHA, например, более высокая базальная активность мезокортикальной дофаминергической системы крыс RHA по сравнению с RLA крысы. Более высокий мезокортикальный дофаминергический тонус у крыс с RHA, чем у крыс с RLA, также подтверждается более высокими концентрациями внеклеточного дофамина, обнаруженными во время половой активности в диализате mPFC как у сексуально наивных, так и у опытных крыс с RHA, по сравнению с таковыми у их аналогов RLA. В связи с этим уместно напомнить, что более высокий дофаминергический тонус считается ответственным, по крайней мере частично, за многие из различных и даже противоположных поведенческих признаков, присутствующих у крыс с RHA и RLA. Соответственно, крысы RHA являются активными коперами, высоко импульсивными, искателями новизны и ощущений и склонны к потреблению и злоупотреблению несколькими классами лекарств от зависимости, тогда как крысы RLA являются реактивными коперами, гиперэмоциональными и склонными к развитию депрессивных симптомов (Zeier et al., 1978; Георгий и др., 1994, 2003b, 2007; Корда и др., 1997, 2014; Escorihuela и др., 1999; Штаймер и Дрисколл, 2003; Лекка и др., 2004; Хименес-Лорт и др., 2005; Carrasco и др., 2008; Fattore et al., 2009; Moreno et al., 2010; Коппенс и др., 2012; Диас-Моран и др., 2012; Sabariego и др., 2013; Манзо и др., 2014a,b; Oliveras et al., 2015), включая более высокую сексуальную мотивацию и лучшую совместную работу у сексуально наивных и опытных крыс с RHA по сравнению с крысами с RHA (Санна и др., 2015). Более высокое увеличение концентраций внеклеточного дофамина, обнаруженного в диализате у mPFC сексуально наивных и опытных крыс RHA, напоминает более высокие концентрации внеклеточного дофамина, обнаруженные в диализате из ядра, прилежащего у сексуально наивных и опытных крыс RHA, в отношении их аналогов RLA (Санна и др., 2015). Однако, в отличие от mPFC, базальные уровни внеклеточного дофамина и DOPAC в диализате из прилежащего ядра как сексуально наивных, так и опытных крыс с RHA и RLA существенно не различались (Санна и др., 2015). Таким образом, более высокий мезолимбический дофаминергический тонус в прилежащем ядре у половых наивных и опытных крыс RHA может быть выведен только при более высоких концентрациях внеклеточного дофамина, обнаруженных в диализатах из прилежащего ядра крыс RHA, по сравнению с аналогами RLA в присутствии рецептивных крыс. самка, а не другой базальной дофаминергической активностью, выявленной более высокими и более низкими базальными уровнями концентрации DOPAC у крыс RHA и крыс RLA, соответственно, как обнаружено в mPFC в этом исследовании. Это также согласуется с результатами более ранних сообщений, показывающих, что уровни внеклеточного дофамина в диализате от mPFC крыс RHA были обнаружены выше, чем у крыс RLA, в то время как аналогичные уровни дофамина были обнаружены в диализате из оболочки ядра accumbens. крыс RHA и RLA в разных экспериментальных условиях (Д'Анджо и др., 1988; Скаттон и др., 1988; Виллиг и др., 1991; Георгий и др., 2003a, 2007). Несмотря на вышеупомянутые различия между mPFC и прилежащим ядром, половой опыт, по-видимому, приводит к более длительному увеличению mPFC временного паттерна высвобождения дофамина в обеих линиях римских крыс при переходе от сексуально наивного к опытному состоянию, хотя такое увеличение были обычно выше у крыс RHA, чем у крыс RLA. Это несколько отличается от того, что обнаружено в прилежащем ядре, где сексуальный опыт имел тенденцию сдвигать увеличение внеклеточного дофамина к первой части совокупного теста на крысах с RHA, в то время как увеличивал его на протяжении всего теста на совокупность у крыс с RLA (Санна и др., 2015).

Насколько нам известно, это исследование также впервые показывает, что не только внеклеточный дофамин, но и внеклеточный NA увеличивается во время половой активности в диализате от mPFC как у крыс с RHA, так и у RLA, как это было обнаружено с дофамином, но также и в этом случае с различия, связанные с линией римских крыс и сексуальным опытом. В частности, при отклонении от базовых уровней дофамина, которые были обнаружены очень похожими в диализате от mPFC крыс RHA и RLA, базальные уровни внеклеточного NA в диализате от mPFC крыс RHA были значительно выше (примерно в 2,5-кратном размере). ), чем у крыс RLA. Причины этих различий неизвестны, но, как обсуждалось выше для дофамина и DOPAC, эти результаты могут указывать на то, что более высокий базальный норадренергический тонус существует, по крайней мере, в коре mPFC у крыс с RHA по сравнению с крысами с RLA. Такой более высокий норадренергический тонус также может быть связан с различными и часто противоположными поведенческими признаками, присутствующими у крыс с RHA и RLA, как обсуждалось выше для дофамина. Дальнейшая поддержка более высокого норадренергического тонуса у крыс с RHA, чем у крыс с RLA в mPFC, основана на результатах, показывающих, что различия в уровнях базального внеклеточного NA сохранялись также во время половой активности как в сексуально наивных, так и в опытных условиях, например, уровни внеклеточного NA увеличивались в диализат mPFC у крыс RHA при воздействии недоступной самки и в течение всего периода совокупления значительно больше, чем у крыс RLA, у которых уровни NA повышались только в первые 15 мин периода копуляции, после чего уровни NA возвращались к базальным значениям , Эти изменения уровня внеклеточной NA наблюдались как в сексуально наивном, так и в опытном состоянии, но увеличение уровней NA было выше у крыс RHA и RLA, подвергшихся сексуальному опыту, по сравнению с их сексуально наивными аналогами. Таким образом, сексуальный опыт, по-видимому, вызывает дальнейшее усиление норадренергической активности у mPFC крыс RHA и, в меньшей степени, у крыс RLA, как уже обсуждалось для дофамина. Сопутствующие более высокие норадренергические и дофаминергические тоны в mPFC крыс RHA по сравнению с крысами RLA заслуживают некоторого комментария. Фактически сообщалось, что норадренергическая активность в mPFC может влиять на высвобождение дофамина через различные механизмы (например, см. Carboni et al., 1990, 2006; Греш и др., 1995; Westernik et al., 1998 и ссылки в нем). Один из них связан с активностью NET, которая, как было показано, связывает дофамин со сродством, даже более высоким, чем сродство к NA в синаптосомах, полученных из гомогенатов PFC (Рог, 1973). Если бы это произошло в mPFC в естественных условияхДофамин, высвобождаемый в mPFC, может быть повторно захвачен не только дофаминергическими, но и норадренергическими нервными окончаниями со скоростью даже выше, чем у NA. Это может вызвать увеличение выброса дофамина из дофаминергических терминалов (например, повышение дофаминергического тонуса), чтобы компенсировать количество дофамина, удаленного из синаптической щели; таким образом, более высокий норадренергический тонус, обнаруженный у крыс с RHA, может способствовать, по меньшей мере частично, более высокому дофаминергическому тонусу, обнаруженному у mPFC у крыс с RHA, по сравнению с крысами с RLA. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы проверить эту возможность. Примечательно, что разница в норадренергической активности, выявленная в этом исследовании в mPFC между RHA и RLA крысами, также может играть роль в их различном ответе на лечение антидепрессантами. Фактически, крысы RHA считаются моделью устойчивости, а крысы RLA - моделью уязвимости к депрессии. Соответственно, острое или хроническое лечение антидепрессантами, такими как дезипрамин, флуоксетин и хлоримипрамин, все значительно улучшали поведенческие реакции в тесте принудительного плавания у крыс RLA, не влияя на ответы крыс RHA (Пирас и др., 2010, 2014).

Наконец, это исследование подтверждает и расширяет предыдущие результаты, показывающие, что mPFC участвует в контроле сексуального поведения, хотя точная роль этой области мозга в сексуальном поведении далеко не ясна (Fernández-Guasti и др., 1994; Агмо и Вильяльпандо, 1995; Agmo и др., 1995; Эрнандес-Гонсалес и др., 1998, 2007; Какяма и др., 2003; Balfour и др., 2006; Afonso et al., 2007; Дэвис и др., 2010; Febo, 2011). Недавно было показано избирательное включение клеток в mPFC при приближении поведения самца крысы к недоступной сексуально восприимчивой самке с использованием парадигмы записи одиночного запуска клеток (Febo, 2011). Интересно, что нейроны, которые не реагировали во время первой экспозиции мужчины на недоступную восприимчивую самку, становятся активными во время второй экспозиции, как если бы предыдущий опыт был способен вызвать пластические изменения, приводящие к изменению поведенческих реакций. Тем не менее, было обнаружено, что повреждения, вызванные иботеновой кислотой mPFC, не могут изменить сексуальное поведение самцов крыс с сексуально восприимчивой самкой или выражение условного предпочтения места для сексуального вознаграждения. Однако у этих поврежденных животных способность к формированию условного отвращения к сексуальной активности в сочетании с отвращающими стимулами была обнаружена полностьюДэвис и др., 2010). Это говорит о том, что активация mPFC во время сексуального поведения играет роль в интеграции внешней и внутренней информации для выполнения и контроля целенаправленного поведения, а не в выражении врожденных реакций на естественных подкрепителей (см. Goto и Grace, 2005). Более важно для этой работы, несколько исследований показали, что области мозга, участвующие в сексуальной мотивации и сексуальном поведении, такие как прилежащее ядро, вентральная сегментарная область, медиальная преоптическая область, ядро ложа stria Terminalis, базолатеральная миндалина и парвоцеллюлярное субпарафасцикулярное ядро таламуса получают входные данные от mPFC во время сексуальной активности (см. Balfour и др., 2006). Многие из этих областей мозга участвуют в сложной нервной цепи, связанной с контролем сексуального поведения, от сексуальной мотивации и вознаграждения до сексуальной активности. Эта схема включает окситоцинергические нейроны, которые происходят из PVN гипоталамуса (PVN) и проецируются в область вентрального сегмента, прилежащее ядро, гиппокамп, миндалина, PFC, ядро ложа stria Terminalis, продолговатый мозг и спинной мозг, мезолимбический / мезокортикальный дофамин нейроны, выступающие из вентральной области тегмента в прилежащее ядро и PFC, инсерто-гипоталамические дофаминергические нейроны и глутаматергические нейроны, которые участвуют на локальном и системном уровне в нескольких областях цепи (см. Мелис и Аргиолас, 1995, 2011; Melis et al., 2003, 2007, 2009, 2010; Succu и др., 2007, 2008, 2011). Таким образом, увеличение внеклеточного дофамина (но также и NA) в диализатах от mPFC, наблюдаемое во время половой активности, может указывать на то, что mPFC является активной частью этой цепи, то есть мезокортикальные дофаминергические нейроны вместе участвуют в контроле сексуальной активности с норадренергическими, мезолимбическими, дофаминергическими, окситоцинергическими и глутаматергическими нейронами, хотя это не является строго необходимым для выражения сексуального поведения (Дэвис и др., 2010). В соответствии с этой гипотезой, это исследование показывает, что различия в высвобождении дофамина и NA в mPFC во время половой активности происходили одновременно с различиями в количестве неконтактных эрекций полового члена и изменениями в копулятивных параметрах, с более высоким выбросом дофамина и NA во время полового акта. аппетитные и непревзойденные фазы, связанные с более высокой сексуальной мотивацией и лучшими копулятивными показателями как у римских крыс, так и в сексуально наивных и опытных условиях.

Обсуждение, данное выше, основано главным образом на хорошо известном увеличении количества внеклеточного дофамина, которое происходит в прилежащем ядре самцов крыс во время половой активностиPfaus et al., 1990; Pleim и др., 1990; Pfaus и Phillips, 1991; Damsma и др., 1992; Wenkstern et al., 1993). Однако дофамин и другие нейротрансмиттеры могут высвобождаться в mPFC (и в прилежащем ядре) в других экспериментальных условиях, таких как стресс или борьба с ним (Thierry и др., 1976; Fadda et al., 1978), которые не связаны строго с сексуальным поведением. Таким образом, можно утверждать, что увеличение дофамина обнаружено во внеклеточном дофамине в mPFC (это исследование) или в прилежащем ядре (Санна и др., 2015) больше относится к стрессу, связанному с наличием и / или взаимодействием с сексуально восприимчивой женщиной, а не к сексуальной активности. Это может иметь некоторое отношение к крысам RHA и RLA, у которых заметно разные стили преодоления и разные активации оси гипоталамус-гипофиз-надпочечник в ответ на аверсивные состояния (у крыс RLA активация этой оси гораздо выше, чем у крыс RHA; см. Carrasco и др., 2008; Диас-Моран и др., 2012). Это также повышает вероятность того, что гормоны стресса (то есть кортикостероиды) могут влиять на дофаминергическую активность в mPFC и других областях мозга. Действительно, крысы RLA являются реактивными коперами и демонстрируют гиперэмоциональное поведение, характеризуемое гипомобильностью и замораживанием, тогда как крысы RHA проявляют проактивное копинг-поведение, направленное на получение контроля над стрессором (Дрисколл и Бэттиг, 1982; Виллиг и др., 1991; Escorihuela и др., 1999; Штаймер и Дрисколл, 2003; Георгий и др., 2007). Хотя невозможно полностью исключить, что это может происходить у сексуально наивных крыс (которые никогда раньше не взаимодействовали с восприимчивыми самками) и, в частности, у сексуально наивных крыс RLA (см. Выше), это маловероятно. В наших экспериментальных условиях делается все возможное, чтобы избежать любого стресса (см. Раздел «Материалы и методы»), и эксперименты организованы таким образом, что самцы взаимодействуют с самкой не сразу, а только после 30 минут воздействия на нее. , во время которого измеренное увеличение дофамина намного ниже, чем при половом контакте. Если увеличение дофамина, обнаруженное в mPFC (и в прилежащем ядре) римских крыс (у неопытных половым путем крысы RHA и RLA имеют базальные уровни внеклеточного дофамина в диализате из mPFC и прилежащего ядра, очень похоже), было действительно вторичным по отношению к стресс из-за присутствия / взаимодействия с самкой или преодоление ее: (i) повышение дофамина было бы намного выше в первый период времени, когда самцов помещают в присутствие самки, а не позже, как обнаруживается во время совокупления; и (ii) ожидается, что повышение дофамина исчезнет или сильно снизится после приобретения стабильной сексуальной активности, то есть, когда процессы обучения (включая совладание с новизной) будут завершены и будут играть лишь незначительную роль в выполнении сексуальных действий. активности, в то время как, напротив, она продолжает происходить при повторении сексуальной активности. Другими словами, внеклеточный дофамин в mPFC (и в прилежащем ядре) всегда увеличивается во время совокупления, даже после того, как сексуальное поведение было изучено. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы прояснить функциональную роль этого увеличения активности дофамина в mPFC (и в прилежащем ядре; см. Раздел «Введение и ссылки»).

В заключение, это исследование впервые показывает, что присутствие, и даже больше, взаимодействие с сексуально восприимчивой женщиной приводит к увеличению внеклеточного дофамина и NA в диализате из-за mPFC сексуально наивного (никогда не подвергавшегося сексуальным стимулам). ) и сексуально опытные (которые прошли пять предварительных тестов на совокупление и показали стабильные сексуальные показатели) крысы RHA и RLA, которые демонстрируют заметно разные стили совладания в ответ на неблагоприятные условия и различные модели копулятивного поведения с сексуально восприимчивой самкой. Соответственно, концентрация дофамина и NA были найдены выше в диализате от сексуально наивной и опытных крыс RHA по сравнению с их аналогами RLA во время обоего упреждающей и consummatory фазы сексуальной активности. Эти результаты могут быть частично обусловлены дофаминергическим и норадренергическим тонусом у mPFC у крыс с RHA выше, чем у крыс с RLA, как сообщается для дофамина в прилежащем ядре (Санна и др., 2015). Более того, внеклеточный mPFC дофамин и NA также были обнаружены выше у RHA с сексуальным опытом и, в меньшей степени, у крыс с RLA по сравнению с их сексуально наивными аналогами в базальных условиях, а также во время аппетитной и завершающей фаз сексуального поведения. Это говорит о том, что сексуальный опыт индуцирует пластические процессы, которые дополнительно усиливают нейротрансмиссию дофамина и NA в mPFC, как обнаружено для дофамина в прилежащем ядре обеих линий римских крыс (Санна и др., 2015). Вышеуказанные различия в дофаминергической и норадренергической нейротрансмиссии в mPFC двух римских линий могут играть роль не только в различных моделях сексуального поведения, но также в различных и часто противоположных поведенческих чертах, которые характеризуют эти две линии крыс.

Авторские вклады

FS, AA, MRM, OG и MGC разработали проект. FS и JB разработали, выполнили и проанализировали данные экспериментов по сексуальному поведению и микродиализу. MAP, OG и MGC отобрали и разводили римских крыс. FS, AA, MRM, OG и MGC контролировали исследование. FS, AA, MRM, OG и MGC написали рукопись. Все авторы обсудили результаты и прокомментировали рукопись.

Финансирование

Эта работа была частично поддержана грантами итальянского Министерства университета и исследований (MIUR) (научная независимость молодых исследователей, SIR 2014, код № RBSI14IUX7) для FS из Автономного региона Сардиния (ARS) (LR 7 / 2007 , «Содействие научным исследованиям и технологическим инновациям на Сардинии», Европейский социальный фонд, 2007 – 2013, код проекта № CRP-59842) для OG и от Университета Кальяри до AA, MRM, FS, OG и MGC.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Доктор Барбара Тувери, Университет Кальяри, для содержания животных и ухода.