Базальные ганглии Дисфункция Содействует физическую неактивность в Ожирении (2016)

Доступно в Интернете по 29 декабря 2016

http://dx.doi.org/10.1016/j.cmet.2016.12.001

Галерея

• Ожирение связано с физической бездеятельностью

• У мышей с ожирением меньше полосатого связывания D2R, что может объяснить их бездействие

• Восстановление G_i сигнализация в iMSNs спасает уровни физической активности тучных мышей

• Физическая бездеятельность является скорее следствием причины увеличения веса

Обзор

Ожирение связано с физической бездеятельностью, что усугубляет последствия для здоровья увеличения веса. Однако механизмы, которые опосредуют эту связь, неизвестны. Мы предположили, что дефицит сигналов допамина способствует физической бездействию при ожирении. Чтобы исследовать это, мы количественно определили множественные аспекты передачи сигналов допамина у мышей с ожирением и тучными. Мы обнаружили, что связывание рецептора D2 (D2R) в стриатуме, но не связывание рецептора типа D1 или уровни дофамина, было уменьшено у мышей с ожирением. Генетическое удаление D2R из полосатой среды колючих нейронов было достаточным для снижения двигательной активности у мышей, а восстановление G_i сигнализация в этих нейронах увеличивала активность у мышей с ожирением. Удивительно, но хотя мышей с низким D2R были менее активными, они не были более уязвимы к увеличению веса, вызванному диетой, чем контрольные мыши. Мы пришли к выводу, что дефицит в полосатой передаче сигналов D2R способствует физической бездействию при ожирении, но бездействие является скорее следствием, чем причиной ожирения.

Графическая абстракция

Параметры рисунка

Ключевые слова

ожирение;
дофамин;
физическая активность;
упражнение;
D2;
Полосатый;
ожирение;
потеря в весе

Введение

Ожирение связано с физической бездеятельностью (Браунсон и др., 2005 г. и Эккекакис и др., 2016), который связывает отрицательные последствия для здоровья диабета II типа и сердечно-сосудистых заболеваний (de Rezende et al., 2014 и Шарма и др., 2015). Механизмы, лежащие в основе этой ассоциации, неизвестны, что отразилось на отсутствии эффективных вмешательств для изменения уровней физической активности в популяциях с ожирением (Эккекакис и др., 2016). Интересно, что ожирение связано с изменениями в полосатой дофаминовой (ДА) сигнальной передаче, что привело к гипотезам о дисфункции вознаграждения при ожирении (Блюм и др., 2011, Kenny, 2011 и Волков и Мудрый, 2005). Хотя стриатальный DA сильно связан с двигательной продукцией, в нескольких исследованиях изучалось, как диэктомированные допаминергические изменения могут влиять на физическую инертность. Мы выдвигаем гипотезу о том, что полосатая DA-сигнализация нарушается при ожирении и что это способствует физической бездеятельности. Понимание биологических причин физической бездеятельности может привести к эффективным вмешательствам для повышения активности и, тем самым, к улучшению здоровья у людей с ожирением.

Striatal DA критически участвует в управлении двигателем. Это проявляется в двигательных расстройствах, таких как болезнь Паркинсона, которая характеризуется смертью допаминергических нейронов в среднем мозге и в результате потери полосатого DA (Hornykiewicz, 2010). Две популяции полосатых проекционных нейронов, модулированных DA, известны как прямые и непрямые средние колючие нейроны (dMSNs и iMSNs) (Александр и Crutcher, 1990, DeLong, 1990 и Герфен и др., 1990). dMSN выражают G_s-связанный D1-рецептор (D1R) и проецировать на субъединичный нигр и внутренний сегмент globus pallidus, тогда как iMSN выражают G_i-coupled D2R и выполнить проект во внешний сегмент globus pallidus (GPe) (Герфен и др., 1990, Le Moine и Bloch, 1995 и Леви и др., 1993). Генетическая элиминация D2Rs из iMSN или оптико-стимулирующая стимуляция iMSNs достаточна для уменьшения движения (Кравиц и др., 2010 г. и Лемос и др., 2016). Основываясь на связях между дисфункцией D2R и ожирением, мы предположили, что ожирение животных изменило выход iMSN, что привело к физической неактивности.

Здесь мы рассмотрели несколько аспектов передачи сигналов ДА у мышей с ожирением и диеты, вызванных ожирением. Связывание D2R было снижено у мышей с ожирением, тогда как уровни связывания D1R и внеклеточного DA оставались неизменными. Тучные мыши также проявляли нарушения в полосатом обстреле и уменьшали движение. Генетическое устранение D2Rs из iMSN уменьшает активность у мышей с пониженной выживаемостью, тогда как восстановление G_i сигнализация в iMSN повысила активность у мышей с ожирением. Эти результаты показывают, что сигнализация D2R в iMSN может двунаправленно модулировать физическую активность. Затем мы спросили, были ли мыши с низкой передачей D2R более уязвимыми к увеличению веса на диете с высоким содержанием жиров из-за их низкой активности. Для этого мы рассмотрели прирост веса относительно естественного изменения связывания D2R у мышей, а также у мышей с генетической элиминацией полосатых D2R. Хотя мыши с низким уровнем D2R имели низкий уровень физической активности, они набирали вес с той же скоростью, что и мыши с неповрежденными D2R. Это говорит о сильной причинно-следственной связи между физической активностью и увеличением веса. Мы пришли к выводу, что нарушения в сигнале D2R способствуют физической бездействию при ожирении, но эта бездеятельность не обязательно приводит к увеличению веса.

Итоги

Диетически индуцированная ожирение ассоциировалась с физической неактивностью

Самцов мышей C57BL6 / J (3–4 месяца) кормили либо стандартной пищей (постное, n = 8), либо диетой с высоким содержанием жиров (ожирение, n = 8) в течение 18 недель (Рисунок S1А). Начиная со 2 недели и продолжаясь до 18 недели, у тучных мышей была значительно более высокая масса тела и жировая масса, чем у тощих мышей (p <0.0001; Цифры 1A и S1Б). Массовая масса не была существенно изменена (Рисунок S1C). Мы измеряли уровень активности в открытом поле каждые 2 недели в течение 18 недель (Ethovision; Noldus Information Technologies). Мыши с ожирением имели более низкую активность, чем худые мыши, начиная с 4 недели и сохраняя ее до 18 недели (p <0.0001; Цифры 1Б и 1С). На 18 неделе тучные мыши тратили меньше времени на движения (p = 0.005), имели меньше движений (p = 0.0003) и имели более низкую скорость во время движения (p = 0.0002; фигура 1D) относительно мышей. Разведение и уход не были существенно изменены (фигура 1D). Мыши с ожирением также бегали меньше, чем худые мыши, когда им предоставлялся доступ к беговым колесам домашней клетки (p = 0.0005; фигура 1E). Мы тестировали, коррелирует ли дефицит движения с увеличением веса в группе с ожирением. Хотя увеличение веса коррелировало с потреблением калорий с высоким содержанием жиров (фигура 1F), он не коррелировал с уровнями движения в открытом поле или с энергией, затраченной в течение периода с высоким содержанием жиров (Цифры 1G и 1H). Интересно, что те же корреляции проводились, когда мы исследовали потребление пищи в первую неделю эксперимента (Цифры 1I-1K), что указывает на то, что начальные уровни потребления жиров с высоким содержанием жиров (но не движение или затраты энергии) были предсказаны для более позднего увеличения веса.

Фигура 1.

Хроническая диета с высоким содержанием жиров, вызванная физической бездеятельностью

(A) Мышей, которых кормили диету с высоким содержанием жиров, весили больше, чем мышей, получали стандартную чау, начиная с недели 2 и продолжая неделю 18 (F_(18,252) = 62.43, p <0.0001).

(B и C) (B). Примеры дорожек с активностью открытого поля, показывающие, что (C) тучные мыши уменьшают физическую активность по сравнению с мышами-мышами, начинающимися на неделе 4, и продолжаются до недели 18 (F_(10,140) = 4.83, p <0.0001).

(D) После 18 недель диеты с высоким содержанием жиров у тучных мышей уменьшилось время, затрачиваемое на движение (t₍₁₄₎ = 3.32, p = 0.005), уменьшилась частота движений (t₍₁₄₎ = 4.74, p = 0.0003) и уменьшенной скорости при движении (t₍₁₄₎ = 4.69, p = 0.0002) по сравнению с контролем постного мяса. У мышей с ожирением также наблюдалась тенденция к уменьшению выращивания (p = 0.07).

(E) При наличии доступа к бегущему колесу в домашней клетке у мышей с ожирением было меньше оборотов колеса относительно мышей (t₍₁₄₎ = 4.55, p = 0.0005).

(F – H) Общий набор веса имел значительную корреляцию с (F) потреблением энергии в ходе эксперимента (r = 0.74, p = 0.04), но не (G) расходом энергии (r = 0.52, p = 0.19). nor (H) скорость в открытом поле (r = 0.19, p = 0.65).

(I – K) Общая прибавка в весе имела значительную корреляцию со (I) средним потреблением энергии в течение первой недели (r = 0.88, p = 0.004), но не (Дж) с расходом энергии (r = -0.19, p = 0.66) , nor (K) скорость в открытом поле (r = 0.36, p = 0.38).

Статистический анализ. (A и C) двухсторонние повторные измерения ANOVA с последующим post hoc t test с нормой ложного обнаружения Benjamini-Hochberg; (D и E) непарный тест Стьюдента; (F-H) линейная регрессия; ^*р <0.05, ^**р <0.01, ^***p <0.0001 по сравнению с постным. (I – K) линейная регрессия; ^***р <0.001 по сравнению с худыми мышами.

Параметры рисунка

Ожирение ассоциировалось с сокращением дофамина D2R Binding

Чтобы идентифицировать механизмы, лежащие в основе физической бездеятельности, мы количественно определили множественные аспекты передачи сигналов ДА у мышей с ожирением и тучными. В соответствии с предыдущими сообщениями у грызунов связывание с рецептором D2R (с помощью авторадиографии с ³H-спиперон, далее называемый связыванием D2R) был ниже у тучных мышей по сравнению с худыми мышами (p <0.0001; Цифры 2A и 2B), обнаружение, которое было значимым во всех трех подразделах полосатого тела (дорсомедиальный: p = 0.004; дорсолатеральный: p <0.0001; вентральный: p <0.001; Цифры S2A и S2B). Однако связывание D2R не коррелировало с жировыми отложениями в группе худых или страдающих ожирением (p> 0.55 для обоих; фигура 2C), предполагая, что, хотя связывание D2R и хранение жира изменяются хронической диетой с высоким содержанием жиров, эти переменные могут быть причинно не связаны друг с другом.

Фигура 2.

Диета с высоким содержанием жиров Нарушенный стриатальный допамин D2R Binding

(A) Изображения стриатального связывания D2R, измеренные через ³H-spiperone авторадиография.

(B) Связывание стриатального D2R уменьшалось при ожирении по сравнению с мышами-мышами (t₍₂₅₎ = 5.02, p <0.0001).

(C) Связывание полосатого тела D2R не коррелировало с процентным содержанием телесного жира у худых (р = 0.95) или тучных мышей (р = 0.56).

(D-F) (D) Связывание стриатального D1R (t₍₂₄₎ = 1.31, p = 0.20), (E) общее содержание дофамина (DA; t₍₁₃₎ = 0.85, p = 0.41) и (F) плотность тирозингидроксилазы (TH) (t₍₁₄₎ = 0.48, p = 0.64) не различались между группами диеты.

Статистический анализ. Имею ввиду с отдельными мышами; n = 8–19 мышей / группа; T-критерий Стьюдента (B и D – F) или линейная регрессия (C); ^*р <0.01.

Параметры рисунка

Мы попытались определить механизм опосредованного ожирением сокращения связывания D2R. Для этого мы искали различия в Drd2 мРНК (посредством гибридизации in situ) и обнаружил, что она не изменилась во всех трех подразделениях полосатого тела (дорсомедиальный: p = 0.92; дорсолатеральный: p = 0.90; вентральный: p = 0.34; Рисунок S2C). Мы провели вестерн-блоттинг для количественной оценки общих уровней белка D2R и не отметили никаких изменений ни в полосах 50-, ни в 70 кДа, которые, как полагают, представляют различные состояния гликозилирования D2R (оба p> 0.95, Цифры S2D и S2E) (Джонсон и Кенни, 2010). Наконец, мы оценили маркеры метаболической дисфункции у мышей с ожирением и тучными, чтобы выяснить, могут ли они относиться к уменьшению D2R, как сообщалось ранее (Данн и др., 2012 г.). Мыши с ожирением имели более высокий уровень холестерина натощак (p <0.0001), лептина (p <0.0001), глюкозы (p = 0.0002), инсулина (p = 0.001) и оценки гомеостатической модели на основе резистентности (HOMA-IR) (p <0.001) , но не триглицериды или свободные жирные кислоты (Цифры S1Д-S1J). Однако ни один из этих факторов не коррелировал с связыванием D2R у мышей с ожирением (данные не показаны).

Связывание с D1R (с помощью авторадиографии с ³H-SCH23390, далее называемое связыванием D1R) не различается у тучных и худых мышей (p = 0.20; фигура 2D). Не было также различий в содержании DA в полосатом теле, измеренном с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) штампов ткани полосатого тела (p = 0.41; фигура 2E) или иммуно-мечение тирозингидроксилазы (p = 0.64; фигура 2F). В свете многочисленных сообщений о различиях в базальном DA у тучных мышей (Карлин и др., 2013 г., Дэвис и др., 2008 г., Vucetic et al., 2012 и Ван и др., 2014), мы дополнительно исследовали этот момент с помощью микродиализа без чистого потока (новые мыши, n = 6 на группу). Мы снова не наблюдали различий во внеклеточном DA (p = 0.99) или любом из двух его метаболитов, 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (DOPAC) (p = 0.85) и гомованилиновой кислоты (HVA) (p = 0.68, Рисунок S3), с этим методом, указывая на то, что ожирение не было связано с уменьшением внеклеточного DA-тона в этих экспериментах.

Движение, связанное с стриатальным обстрелом, было нарушено у мышей с ожирением

Мы выполнили электрофизиологию in vivo, чтобы изучить, как снижение связывания D2R полосатого тела может изменять выход нейронов полосатого тела и тем самым способствовать уменьшению движения. Мы записывали данные из дорсомедиального полосатого тела у худых и страдающих ожирением мышей (n = 3 мыши в группе, гистология в фигура 3F). Хотя в целом мыши с ожирением двигались меньше, скорость выполняемых движений не различалась между этими группами (p = 0.55; фигура 3A), что позволяет нам сравнить увольнение, связанное с движением, у худых и полных мышей. Частота базальных многокомпонентных добавок не различалась между худыми и тучными мышами (худые, 2.1 ± 0.4 Гц; ожирение, 2.0 ± 0.7 Гц; p = 0.93). Однако преобладание юнитов, активируемых движением (фигура 3B) был заметно ниже у мышей с ожирением (p <0.0001; фигура 3C). Это не зависело от нашего статистического определения единиц «активируемых движением», так как мы также наблюдали уменьшение скачков вокруг движений в среднем ответе всех зарегистрированных единиц у мышей с ожирением и у худых мышей (взаимодействие по ANOVA, p <0.0002; Цифры 3D и 3E). Мы пришли к выводу, что общая частота пробивки в полосатом теле не различалась, но организация шипов вокруг движения нарушалась у тучных мышей.

Фигура 3.

Движение, связанное с стрельбой в стриатуме, было нарушено у мышей с ожирением

(A) События движения имели сходную скорость у мышей с ожирением и тучными.

(B) Примеры активированного движением и невосприимчивого обжига в полосатых нейронах.

(D) Средняя стрельба по движению всех зарегистрированных нейронов.

(E) Увольнение, связанное с движением, было значительно ниже после воздействия диеты (диета × движение, F_(1,171) = 14.77, p <0.0002).

(F) Схема (адаптирована из Франклин и Паксинос, 1997), иллюстрирующий размещение электродной матрицы у худых и полных мышей (n = 3 каждая).

Статистический анализ. (C) Точный тест Фишера. (D и E) Двухсторонние повторные измерения ANOVA.

Параметры рисунка

Ингибирование выхода iMSN для восстановленных уровней активности у мышей с ожирением

Чтобы проверить, может ли снижение выхода iMSN увеличивать движение мышей с ожирением, мы использовали зависимую стратегию Cre-recombinase (Cre) для выражения ингибирующего G_iрецептор рецептора опиоидного рецептора каппа, исключительно активированный дизайнерскими препаратами (KOR-DREADD) в iMSN у тучных мышей (фигура 4А). Хотя мышь Adnosine 2A-рецептор Cre (A2A-Cre) ранее была проверена с иммуноокрашиванием, чтобы продемонстрировать, что экспрессия Cre специфична для полосатых iMSN (Cui et al., 2013 и Лемос и др., 2016), мы провели дополнительную проверку этой линии с помощью двойной флуоресцентной гибридизации in situ. Почти все нейроны (98.7% ± 0.6% из 1,301 подсчитанного нейрона) экспрессировали оба Cre и Drd2 мРНК, тогда как очень немногие (1.3% ± 0.6%) экспрессировали либо Cre or Drd2 мРНК, но не обе, подтверждая, что линия A2A-Cre точно нацелена на iMSN ( Рисунок S4).

Фигура 4.

DREADD-опосредованное ингибирование iMSN восстанавливает физическую активность у мышей с ожирением

(A) Фотография выражения KOR-DREADD и схема (адаптировано из Франклин и Паксинос, 1997), иллюстрирующие сайты вирусной инъекции всех KOR-DREADD у мышей A2A-Cre; opacity указывает количество мышей, выражающих вирус в определенном месте.

(B) Мышцы с ожирением двигались чаще, когда вводили SalB по сравнению с DMSO (t₍₇₎ = 3.056, p = 0.02).

(C-G). После введения SalB у мышей с ожирением наблюдались незначительные изменения в (C) частоте движений, (D) средняя длительность движения и (E) скорость движения относительно того, когда вводили ДМСО. (F) введение Sal-B увеличивало частоту воспитания (t₍₇₎ = 3.116, p = 0.02), но (G) существенно не изменил частоту ухода.

(H) Бережливые мыши двигались больше, когда вводили SalB по сравнению с ДМСО (t₍₉₎ = 3.3, p = 0.01).

(I) SalB не влиял на движение у мышей дикого типа, которые не экспрессировали KOR-DREADD (p = 0.77).

Статистический анализ. (B – I) Парные t-тесты Стьюдента; среднее с отдельными мышами; n = 6–10 мышей / группа.

Параметры рисунка

Инъекции агониста KOR-DREADD сальвинорина-B (SalB) увеличивали расстояние, пройденное тучными мышами, экспрессирующими KOR-DREADD (p = 0.02; фигура 4Б). SalB также увеличил частоту выращивания (p = 0.02; фигура 4F) и вызвала тенденцию к увеличению частоты (t₍₇₎ = 1.64, p = 0.12), но не продолжительность или скорость движения (Цифры 4C – 4E). Инъекции SalB также увеличивали подвижность худых мышей (p = 0.01; фигура 4H), но не у мышей дикого типа, которые не экспрессировали KOR-DREADD (p = 0.73; фигура 4Я). Мы пришли к выводу, что сокращение выхода iMSN является достаточным для увеличения уровней передвижения как животных с ожирением, так и ожирением.

Низкие уровни D2R не предрасполагают животных к будущему увеличению веса

Наконец, мы рассмотрели, могут ли ранее существовавшие различия в сигнале D2R предрасполагать отдельных мышей к ожирению, вызванному диетой. Чтобы решить этот вопрос, мы провели микропозиционную эмиссионную томографию (микро-ПЭТ) с ¹⁸F-fallypride, чтобы определить базовую доступность D2R до экспозиции с высоким содержанием жиров (фигура 5А). Мы отметили высокий уровень дисперсии потенциала связывания D2R среди мышей, как показали другие (Константинеску и др., 2011 г.). Индивидуальные различия в доступности D2R положительно коррелировали с движением в открытом поле (p = 0.045; фигура 5B), что соответствует роли D2R в движении. После сканирования методом микро-ПЭТ животных поддерживали на диете с высоким содержанием жиров в течение 18 недель, чтобы проверить, будут ли мыши с низким D2R более уязвимы к увеличению веса, вызванному диетой. Удивительно, но мы обнаружили тенденцию к положительный взаимосвязь между начальной доступностью D2R и увеличением веса в этом эксперименте (p = 0.10; фигура 5С). Хотя эта корреляция не была существенной, она утверждает, что гипотеза о низкой доступности D2R или низкой физической активности делает животных более уязвимыми для увеличения веса. Это также согласуется с нашими выводами о том, что ни базальная активность открытого поля, ни активность открытого поля во всем эксперименте не коррелировали с увеличением веса (Цифры 1F-1K).

Фигура 5.

Базальное связывание D2R не предсказало будущую прибавку в весе

(A) Пример Кривые доступности D2R для микро-ПЭТ в полосатом и мозжечке с использованием ¹⁸F-fallypride.

(B и C) (B) потенциал связывания коррелировал с базальным движением в открытом поле (r = 0.56, p = 0.045), а (C) имел тенденцию к положительной связи с увеличением веса, вызванным диетой с высоким содержанием жиров (r = 0.50, p = 0.10, n = 12–14 мышей).

(D) Репрезентативная автодиадиография D2R у мышей с интактными D2R (сверху) и iMSN-Drd2-KO мышей (внизу).

(E и F) (E) iMSN-Drd2-KO мышей уменьшали физическую активность в открытом поле (t₍₈₎ = 2.99, p = 0.02) и (F) на ходовых колесах домашней клетки (p = 0.01, n = 5–19 мышей / группа).

(G) iMSN-Drd2-KO мышей и Drd2-floxed littermate контролировал такое же количество веса на диете с высоким содержанием жиров (F_(5,70) = 1.417, p = 0.23; n = 6–10 мышей / группа).

(H – J) (H) Не было значительной разницы в нормированном потреблении энергии (p = 0.60), (I) расходе энергии (p = 0.47) или (Дж) RER (p = 0.17) между iMSN-D2R-KO. контроль мышей и однопометников.

Статистический анализ. (B и C) Линейная регрессия; (E, F и H-J) непарный тест Стьюдента; (G) двухсторонние повторные измерения ANOVA, ^*р <0.05.

Параметры рисунка

Для дальнейшего изучения взаимосвязи между ранее существовавшими различиями в уровнях активности и увеличением веса мы использовали генетическую модель мыши с целенаправленным удалением Drd2 ген из iMSN (iMSN-Drd2-KO), но сохраненное выражение в других типах клеток ( Доббс и др., 2016 и Лемос и др., 2016). Как сообщалось ранее, iMSN-Drd2-KO мыши передвигались меньше, чем контрольные однопометники в открытом поле (p = 0.02; фигура 5E) и ходовых колес домашней обоймы (p = 0.01; фигура 5F). В соответствии с вышеприведенными экспериментами iMSN-Drd2-KO-мыши не набирали больше веса, чем их контрольные сверстники, когда их помещали на диету с высоким содержанием жиров (p = 0.23; фигура 5Г). Чтобы более внимательно изучить их использование энергии, мы провели косвенные калориметрические эксперименты для сравнения iMSN-Drd2-KO мышей для контроля над однопометниками. Мы не обнаружили значительных различий в потреблении энергии (p = 0.60), расходе энергии (p = 0.47) или коэффициенте респираторного обмена (RER) (соотношение CO₂ производство до O₂ потребление [VCO₂/ В.О.₂], p = 0.17) между мышами iMSN-Drd2-KO и их контрольными однопометниками, что указывает на то, что уменьшение движения мышей IMSN-Drd2-KO не привело к изменениям в использовании энергии (Цифры 5Н-5J). Наконец, мы исследовали, насколько меньшие сокращения в полосатом D2R (например, наблюдаемые у наших тучных мышей) могут регулировать движение и увеличение веса. Для этого мы использовали линию мыши, которая приводит к уменьшению 30% -40% в полосатой Drd2 мРНК (iMSN-Drd2-Het) ( Лемос и др., 2016). Эти мыши также демонстрировали снижение подвижности, демонстрируя, что частичного нокдауна D2R достаточно, чтобы вызвать моторный дефицит (p = 0.04; Рисунок S5А). Подобно мышам iMSN-Drd2-KO, мыши iMSN-Drd2-het не были более восприимчивы к увеличению веса, вызванному диетой с высоким содержанием жиров (p = 0.89; Рисунок S5Б). Мы заключаем, что изменения в полосатых D2R достаточно для изменения движения, но не для баланса калорий или веса тела у мышей.

Обсуждение

Ожирение связано с физической бездеятельностью, которая, как часто полагают, способствует увеличению веса. Кроме того, предполагается, что повышенное ожирение способствует снижению уровня активности у людей с ожирением (Эккекакис и Линд, 2006 и Вестертерп, 1999), хотя эту идею трудно проверить напрямую. Интересно, что люди, которые теряют вес либо через диету (де Бур и др., 1986, де Гроот и др., 1989 г., Мартин и др., 2007 г. и Редман и др., 2009 г.) или бариатрическая хирургия (Берглинд и др., 2015 г., Берглинд и др., 2016 г., Бонд и др., 2010 г. и Рамирес-Марреро и др., 2014 г.) не увеличивают их уровни активности, утверждая против веса ожирения, вызывающего их бездействие. Здесь мы исследовали гипотезу о том, что ожирение, вызванное диетой, вызывает физическую инертность через дефицит в полосатой передаче ДА. В соответствии с предыдущей работой мы обнаружили, что хроническая диета с высоким содержанием жиров уменьшала связывание полового члена D2R (Хайнал и др., 2008 г., Хуанг и др., 2006 г., Нараянасвами и др., 2013 г., ван де Гиссен и др., 2012 г. и ван де Гиссен и др., 2013 г.). Мы также наблюдали дефицит в моторном обстреле полосатых нейронов у мышей с ожирением. Ингибирование iMSN с помощью G_i-Coupled DREADD спасает активность у мышей с ожирением, демонстрируя, что мыши с избыточным ожирением могут нормально перемещаться при восстановлении выхода базальных ганглиев. Однако, как ни удивительно, ни базовые измерения D2R, ни физическая активность не коррелировали с увеличением массы тела, что мы наблюдали в многочисленных экспериментах. Это в отличие от исследования у крыс, которое может отражать различия в видах или экспериментах (Михаэлидес и др., 2012). Мы заключаем, что сокращения D2Rs и последующая физическая инертность являются следствиями ожирения, но не обязательно причинно связаны с дальнейшим увеличением веса у мышей.

Связь между измененной сигнализацией D2R и ожирением была впервые идентифицирована у людей и первоначально была воспроизведена другими (de Weijer et al., 2011, Кесслер и др., 2014 г., Волков и др., 2008 г. и Ван и др., 2001). Однако более поздняя работа назвала это определение под вопросом (Караваджо и др., 2015, Косгроув и др., 2015, Данн и др., 2012 г., Guo et al., 2014, Карлссон и др., 2015, Карлссон и др., 2016, Стил и др., 2010 г. и Туоминен и др., 2015). Хотя для изучения расхождений, наблюдаемых в клинических исследованиях, необходимы дополнительные исследования, они могут отражать сложности, присущие клиническим исследованиям и визуализации ПЭТ. Например, raclopride, радиолиганд, используемый во многих исследованиях, может быть смещен эндогенным DA, и поэтому на связывание могут влиять различия в базальном тоне DA (Хорстманн и др., 2015). Кроме того, связь между уровнями D2R и ожирением может быть нелинейной, так что изменения в D2R могут происходить по-разному у пациентов с различными уровнями ожирения (Хорстманн и др., 2015). Наконец, такие факторы, как продолжительность сна (Wiers et al., 2016) и потребление кофеина (Волков и др., 2015 г.) также могут влиять на связывание D2R и не сообщаются или не контролируются в большинстве клинических исследований. Эти источники дисперсии могут быть смягчены в исследованиях на животных, которые рисуют согласованную картину сокращения мРНК D2R (Mathes et al., 2010 и Чжан и др., 2015 г.), белка (Адамс и др., 2015 и Джонсон и Кенни, 2010) и связывание рецептора (Хайнал и др., 2008 г., Хуанг и др., 2006 г., Нараянасвами и др., 2013 г., ван де Гиссен и др., 2012 г. и ван де Гиссен и др., 2013 г.) у тучных грызунов. Наша работа расширяет этот объем литературы, сообщая, что другие аспекты передачи сигналов ДА остаются неизменными у мышей с ожирением, даже с сокращениями в D2R. Кроме того, учитывая наше наблюдаемое снижение связывания D2R ³H-spiperone, но без изменения общего белка D2R или Drd2 мРНК, мы считаем, что изменения в D2R могут включать посттрансляционные изменения, такие как интернализация рецепторов. Хотя наши данные свидетельствуют о том, что снижение связывания D2R является достаточным для снижения физической активности при ожирении, на физическую активность влияют многие факторы, включая генетику и окружающую среду ( Бауман и др., 2012 г.). Мы считаем маловероятным, что D2R являются единственным неврологическим изменением, связанным с физической бездеятельностью при ожирении. Например, изменения в циркулирующих гормонах, таких как грелин, лептин и инсулин, действуют на дофаминергические нейроны и могут влиять на активность (Мюррей и др., 2014 г.). Наконец, хотя мы не наблюдали изменений в D1R, мы не можем исключать изменений в нейронном обстреле нейронных путей прямого пути, которые также могут влиять на физическую активность.

Неясно, влияет ли изменение в доступности D2R, чтобы люди набирали вес. Люди с Drd2 У аллеля Taq1A снижение доступности D2R и повышенный риск ожирения ( Блюм и др., 1996, Карпентер и др., 2013 г., Нобл и др., 1991, Стайс и др., 2008 г. и Томпсон и др., 1997 г.). Кроме того, мыши с глобальным удалением D2R более легко набирали вес на диете с высоким содержанием жиров, что было связано с физической бездеятельностью (Beeler et al., 2015). Напротив, индивидуальные вариации (естественные или генетически индуцированные) в полосатом D2R коррелировали с уровнями активности в нашем исследовании, но не коррелировали с увеличением веса. Важным отличием в нашем исследовании было то, что наша генетическая модель удаляла D2R исключительно из iMSN. Кроме того, тщательные измерения потребления пищи и затрат энергии показали, что манипулирование D2R на этих нейронах не меняет энергетический баланс. Таким образом, исследования, демонстрирующие связи между глобальной функцией D2R и энергетическим балансом, могут наблюдать эффекты D2R на другие типы клеток. Наши эксперименты подтверждают вывод о том, что физическая инертность является следствием ожирения, но сама по себе недостаточна для изменения веса.

Несмотря на растущие доказательства того, что физическая активность связана с улучшением сердечно-сосудистого здоровья и снижением риска для ряда других хронических заболеваний, физическая активность остается низкой у людей с ожирением (Эккекакис и др., 2016). Отсутствие эффективных вмешательств для повышения уровня физической активности отражается в недостаточном понимании клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе физической бездеятельности у людей с ожирением. Здесь мы связываем физическую бездеятельность с изменениями функции базальных ганглиев, предоставляя биологическое объяснение отсутствия физической активности у людей с ожирением.

Экспериментальные процедуры

Субъекты и диеты

Во всех исследованиях мышей содержали индивидуально в стандартных условиях (12-часовой цикл свет / темнота, 21–22 ° C) с неограниченным доступом к пище и воде. Мышам давали либо стандартную диету (диета 5001 для грызунов; 3.00 ккал / г с 29% энергии, полученной из белка, 13% из жиров и 56% из углеводов; LabDiet), либо диета с высоким содержанием жиров (D12492; 5.24 ккал / г с 20% энергии получают из белка, 60% из жиров и 20% из углеводов; Research Diets). Все процедуры выполнялись в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу и использованию животных Национального института диабета, болезней органов пищеварения и почек.

Трансгенный условный нокаут iMSN-Drd2-Мышей KO генерировали скрещивающими мышами, экспрессирующими Cre, обусловленными регуляторными элементами гена рецептора аденозина 2A (Adora2a) (B6.FVB (Cg) -Tg (Adora2a-Cre) KG139Gsat / Mmucd; GENSAT; 036158-UCD) с мышами, несущими условные Drd2 null alleles B6.129S4 (FVB) -Drd2^{tm1.1Mrub / Дж}, JAX020631 (Белло и др., 2011 г.).

Расчет состава тела и расчеты затрат энергии

Состав тела измеряли каждую неделю, используя ¹H-ЯМР-спектроскопия (EchoMRI-100H, Echo Medical Systems). Расходы энергии определялись с использованием расчета энергетического баланса (Guo et al., 2009 и Равуссин и др., 2013):

Energyexpenditure = Metabolizableenergyintake- (Δfatmass + Δfat-freemass).

Включите MathJax

Деятельность на открытом поле

Тесты в открытом поле проводились в клетках PhenoTyper (30 × 30 см; Noldus IT), а программное обеспечение для анализа видео EthoVision (версия 11; Noldus IT) использовалось для отслеживания мышей на протяжении всего тестирования.

Запуск колесика

Бег колес измеряли, помещая низкопрофильные беспроводные колеса для бега (Med Associates) в домашние клетки мышей на 72 часа каждые 3 недели (эксперименты с ожирением, вызванным диетой) или постоянно (iMSN-Drd2-KO эксперименты).

Меры крови

Окулярную кровь вен из умерших животных использовали для анализа метаболитов сыворотки и гормонов после 4-hr fast.

Авторадиография рецептора допамина

Правые гемисекции делали криосекциями на уровне полосатого тела (-0.22, 0.14, 0.62 и 1.18 мм от брегмы, покрывая всю длину полосатого тела) на 12-мм срезы. Предметные стекла размораживали и предварительно инкубировали в буфере для анализа (20 мМ HEPES, 154 мМ NaCl и 0.1% бычий сывороточный альбумин [BSA]; pH 7.4) в течение 20 минут при 37 ° C. Связывание D1R оценивали путем инкубации слайдов в буфере для анализа, содержащем 1.5 нМ меченного тритием SCH-23390 (Perkin-Elmer) и 100 нМ кетансерин в течение 60 мин при 37 ° C. Связывание D2R оценивали, инкубируя предметные стекла с 600 пМ меченного тритием спиперона (Perkin-Elmer) и 100 нМ кетансерина в течение 100 минут при 37 ° C. После инкубации с подходящим радиолигандом предметные стекла дважды промывали в течение 10 мин при 4 ° C в промывочном буфере (10 мМ Tris-HCl, 154 мМ NaCl), а затем погружали в воду (0 ° C) и оставляли сушиться в течение ночи. Затем предметные стекла экспонировали на планшетах для визуализации люминофора в течение 7 (связывание D1R) или 11 дней (связывание D2R) и проявляли с использованием фосфорно-визуализатора (Cyclone; Perkin-Elmer). Для анализа области интересов были очерчены и проанализированы с использованием программного обеспечения для анализа изображений Optiquant (Perkin-Elmer).

Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинги инкубировали с мышиным анти-D2DR-антителом (1: 500, Santa Cruz, sc-5303) или мышиным анти-GAPDH-антителом (1: 1,000, Santa Cruz, sc-32233), а затем с козьим антимышиным IgG- HRP (1: 1,000; Santa Cruz, sc-2005). Сигнал хемилюминесценции генерировали с использованием усовершенствованных реагентов для детектирования вестерн-блоттинга хемилюминесценции (Bio-Rad) и визуализировали с помощью системы Chemidoc Imaging System (Bio-Rad).

Гибридизация в ситуации

Набор для множественного флуоресцентного анализа RNAscope использовали для гибридизации in situ (Advanced Cell Diagnostics). Вкратце, фиксированные формалином срезы обезвоживали в этаноле с последующим воздействием протеазы. Затем срезы гибридизовали с олигонуклеотидными зондами РНКскопа против Drd2, После гибридизации зонда слайды инкубировались с усилителем сигнала в соответствии с протоколами RNAscope. Слайды затем промывали буфером для промывки RNAscope. Наконец, слайды были смонтированы с контрастированием DAPI.

Высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимическим детектированием

Левые полурезы обрабатывали для обнаружения DA с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой с электрохимическим детектированием (HPLC-EC), как описано ранее (Килпатрик и др., 1986).

Тирозингидроксилаза Иммуногистохимия

Установленные на слайдах срезы фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, промывали в 0.1 M TBS (pH 7.5) и инкубировали в растворе первичных антител, содержащем 3% нормальной ослиной сыворотки, 0.3% Triton X-100 и кроличьи антитела против тирозингидроксилазы. (1: 1,000; Millipore; MAB152) в течение ночи при 23 ° C. На следующий день срезы тканей промывали в TBS и инкубировали в растворе вторичных антител, содержащем 3% нормальную ослиную сыворотку, 0.3% Triton X-100 и козьи антикроличьи антитела, конъюгированные с Alexa Fluor 555 (Millipore; AQ132F). Для каждой мыши были проанализированы два среза полосатого тела, за исключением четырех мышей (две HFD, два Chow), у которых был проанализирован только один срез из-за плохого качества ткани или изображения.

Micro-PET

Мышам вводили ¹⁸F-фаллиприд с удельной активностью 2.5 ± 0.34 мКи / нмоль в объеме 130 мкл через хвостовую вену под изофлурановой анестезией. Сканирование микро-ПЭТ выполняли в течение 2 часов, в течение которых для анализа было получено 25 кадров. Кривые время-активность для ¹⁸F-fallypride в интересующих регионах (ROI) были извлечены с использованием программного обеспечения AFNI (https://afni.nimh.nih.gov/afni) и кинетические параметры соответствовали четырехкамерной модели с использованием пользовательского сценария MATLAB (с использованием мозжечка, используемого в качестве эталонной ткани) для определения потенциала связывания D2R (Ламмерцма и Юм, 1996).

Электрофизиология in vivo

Записи были сделаны с массива электродов, содержащего 32 вольфрамовых микропровода с тефлоновым покрытием (диаметром 35 мм), односторонне имплантированных в дорсомедиальное полосатое тело (передний / задний [A / P]: +0.8; медиальный / латеральный [M / L]: +1.5 ; дорсальный / вентральный [D / V]: -2.6 мм на брегму) и обрабатывали с помощью коммерческого программного обеспечения (Offline Sorter и Neuroexplorer; Plexon).

Стереотаксическая инъекция вирусных векторов

Мышей ненадолго анестезировали воздействием изофлурана. После глубокой анестезии был сделан один разрез по средней линии, обнажили череп и сделали двустороннюю краниотомию (A / P: +0.5; M / L: ± 1.5 мм на брегму). Вирусный вектор, содержащий ингибирующий KOR-DREADD (Syn-DIO-hKORD-IRES-mCit-WPRE; 0.5 мкл), инъецировали с двух сторон в дорсомедиальное полосатое тело (D / V, -2.8 мм от верха черепа) и позволяли экспрессировать 9 недель до экспериментов.

Анализ микродиализа и дофамина без потока

Измерения базальных внеклеточных DA, DOPAC и HVA в дорсальном полосатом теле мышей выполняли методом микродиализа без сетевого потока. Односторонние 2-мм зонды (отсечка мембраны 18 кДа) стереотаксически имплантировали через 1 неделю после имплантации канюли с непрерывной перфузией искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) со скоростью 1 мкл / мин в течение 4 часов перед взятием образца (см. Дополнительные экспериментальные процедуры). Эксперимент без чистого потока для измерения уровней внеклеточного DA проводили путем случайной перфузии шести различных концентраций DA (0, 2.5, 5, 10, 20 и 40 нМ) в aCSF через диализный зонд. Каждую концентрацию DA перфузировали в течение 30 минут, а затем собирали 2 × 10-минутные образцы в 2.5 мкл 100 мМ HCl плюс 1 мМ ЭДТА для предотвращения разложения катехоламинов и замораживали при -80 ° C. Для нейрохимического анализа использовалась изократическая система ВЭЖХ, связанная с амперометрическим детектированием (ВЭЖХ-ЕС; BASi LC-4C). В анализ были включены только мыши с правильным размещением зонда (Рисунок S3E).

Показатели

Статистический анализ выполняли с использованием GraphPad Prism (версия 6.07; программное обеспечение GraphPad). Если не указано иное, использовали двусторонний t-критерий Стьюдента. В противном случае использовались двусторонние парные t-тесты, односторонние ANOVA с повторными измерениями или двусторонние ANOVA с повторными измерениями, когда это было необходимо и как указано. За дисперсионным анализом следовали t-тесты для апостериорных сравнений. Результаты считались значимыми при альфа p <0.05 или с альфа, определяемым с помощью коррекции частоты ложных открытий (FDR) Беджамини-Хохберга, где это было необходимо.

Авторские вклады

DMF, KD, TJO, MS, AK, IPSGRVAA, MR, KDH и AVK разработали эксперименты. DMF, KD, TJO, MS и AVK проводили и анализировали поведенческие эксперименты. IP провел эксперименты по вестерн-блоттингу. ДМФ и АВК выполняли и анализировали электрофизиологические данные in vivo. DMF, J.-SL, JG и AVK провели и проанализировали эксперименты с микро-ПЭТ. Рукопись написали DMF, KD, TJO и AVK. Все авторы обсудили результаты и прокомментировали рукопись.

Благодарности

Эта работа была поддержана Программой Intrumural Research NIH, Национального института диабета и болезней пищеварения и почек (NIDDK). Мы хотели бы поблагодарить Mouse Metabolism Core в NIDDK за оценку метаболитов сыворотки и гормонов Андреса Буонанно с его помощью в разработке экспериментов по микродиализу дофамина и д-ра Джудит Уолтерс, доктора Кристин Дюпре и доктора Клэр Делавиль за помощь в ВЭЖХ анализ содержимого дофаминовой ткани. Мы также хотели бы поблагодарить доктора Скотта Янга за использование его лабораторного оборудования и помощь в проведении обязательных исследований. Спасибо также членам лаборатории AVK Марку Рейтману и Нику Рыбе за ввод экспериментального проекта и тщательное прочтение рукописи.

Дополнительная информация

Документ S1. Дополнительные экспериментальные процедуры и рисунки S1-S5.

Помощь в файлах PDF

Опции

Документ S2. Статья плюс дополнительная информация.

Помощь в файлах PDF

Опции

Рекомендации

Адамс и др., 2015
WK Adams, JL Sussman, S. Kaur, AM D'souza, TJ Kieffer, CA Winstanley
Долгосрочное потребление калорий с высоким содержанием жиров у крыс снижает контроль импульсов и сигнализацию сигналов вентрального полосатого D2 - два маркера уязвимости к наркомании
Евро. J. Neurosci., 42 (2015), стр. 3095-3104
CrossRef

Полезное