Дофаминовые D2-рецепторы при склонности к наркомании и их компульсивное питание у тучных крыс (2010)

Комментарий: Это исследование демонстрирует, что когда животному предоставляется неограниченный доступ, сильное естественное подкрепление (очень стимулирующая пища) может вызвать снижение рецепторов D2. Это снижение наблюдалось почти у всех крыс и происходило довольно быстро. Когда "очень вкусная" пища была удалена, крысы отказались есть нормальную пищу. Крысы продолжали переедать (когда могли), несмотря на то, что удары электрическим током сочетались с «очень вкусной» пищей.

• Полное исследование

Nat Neurosci. 2010 май; 13(5): 635-641. Опубликован онлайн 2010 March 28. DOI:  10.1038 / nn.2519

Абстрактные

Мы обнаружили, что развитие ожирения связано с возникновением постепенно ухудшающегося дефицита в ответах на нервные награды. Подобные изменения в гомеостазе вознаграждения, вызванные кокаином или героином, считаются решающими в инициировании перехода от случайного к компульсивному употреблению наркотиков. Соответственно, мы обнаружили компульсивное поведение при кормлении у тучных, но не постных крыс, измеряемое как приемлемое потребление пищи, которое было устойчиво к нарушению отвратительным условным раздражителем. Дозировка дофамина D2 рецепторов (D2Rs) была подавлена ​​у тучных крыс, как сообщалось у людей, употребляющих наркотики. Более того, опосредуемое lentivirus нокдаун полосатых D2R быстро ускоряло развитие наркомании как дефицит вознаграждения и начало компульсивно-подобной пищи, ищущей у крыс с расширенным доступом к вкусной высокожирной пище. Эти данные демонстрируют, что чрезмерное потребление приемлемой пищи вызывает зависящие от наркозависимости реакции в цепях вознаграждения мозга и стимулирует развитие компульсивного питания. Таким образом, общие гедонистические механизмы могут лежать в основе ожирения и наркомании.

Введение

На кормление влияют удовольствие и вознаграждение, и получение пищевого вознаграждения может сильно мотивировать потребление1, 2. Тем не менее гедонистические механизмы, способствующие ожирению, остаются плохо изученными. У людей с гиперфагией и врожденной недостаточностью лептина активность в спинном и вентральном полосатом теле, которые являются основными компонентами цепей вознаграждения мозга, заметно возрастает в ответ на изображения еды3, а заместительная терапия лептином снижает как активность полосатого тела, так и самооценку `` симпатии '' к пище3 . Это говорит о том, что полосатое тело играет важную роль в гедонистических аспектах пищевого поведения. Недавно было показано, что активация полосатого тела в ответ на очень вкусную пищу притупляется у лиц с ожирением по сравнению с контрольной группой с постным жиром4. Более того, гипофункция дорсального полосатого тела и длительное увеличение веса наиболее выражены у лиц с аллелем TaqIA локуса гена DRD2 – ANKK1, что приводит к снижению экспрессии D2R в полосатом теле и, как было показано, предрасполагает людей к расстройствам зависимости от веществ4, 5 Эти и подобные наблюдения привели к предположению, что дефицит обработки вознаграждения может быть важным фактором риска развития ожирения, и что люди с ожирением могут компульсивно потреблять вкусную пищу, чтобы компенсировать пониженную чувствительность к вознаграждению6. Примечательно, что неясно, является ли дефицит обработки вознаграждения конститутивным и предшествует ли ожирение, или чрезмерное потребление вкусной пищи может вызвать дисфункцию вознаграждения и тем самым способствовать ожирению, вызванному диетой.

Определяющей характеристикой людей с избыточным весом и ожирением является то, что они продолжают переедать, несмотря на хорошо известные негативные последствия для здоровья и общества. Действительно, многие люди с избыточным весом выражают желание ограничить потребление пищи, но все же борются за контроль над их потреблением и многократно потребляют сверх своих энергетических требований7, 8. Развитие поведения кормления, которое нечувствительно к отрицательному результату, аналогично компульсивному лекарственному поведению, наблюдаемому у людей, употребляющих наркотики, что также невосприимчиво к негативным последствиям 9. Здесь мы исследовали влияние расширенного доступа к приемлемой диете с высоким содержанием жиров на чувствительность систем вознаграждения мозга у крыс. Мы также рассмотрели связь между диетологической гедонистической дисрегуляцией и появлением компульсивного поиска пищи. Наконец, мы исследовали роль стриатальных D2R в этих зависимых от поведения поведенческих реакциях.

Зависимые от наркомании дефициты у тучных крыс

Чтобы проверить влияние ограниченного или расширенного доступа к аппетитной диете с высоким содержанием жиров, мы подготовили крыс-самцов Wistar (300-350 г) с биполярным стимулирующим электродом в боковом гипоталамусе и тренировали их в течение 10-14 дней в дискретном испытании. процедура вознаграждения за текущую пороговую стимуляцию мозга (BSR) до тех пор, пока не будут установлены стабильные пороги вознаграждения 4. В процедуре BSR крысы энергично реагируют для получения полезной электрической самостимуляции через постоянный стимулирующий электрод с минимальной интенсивностью стимуляции, которая поддерживает поведение самостимуляции, называемое порогом вознаграждения10. Поскольку пороги вознаграждения остаются стабильными и неизменными в течение длительного времени при базовых условиях, эта процедура обеспечивает чувствительную меру реакции систем вознаграждения мозга. После установления стабильных пороговых значений BSR (определяемых как изменение пороговых значений <10% в трех последовательных сеансах) мы разделили крыс на три группы, которые не показали различий в средней массе тела или пороговых значениях вознаграждения между группами. Этим трем группам был предоставлен дифференцированный доступ к диете «в стиле кафетерия», состоящей из вкусной высококалорийной пищи, легко доступной для употребления человеком (см. Онлайн-методы). Крысы имели 0 часов (крысы, получавшие только пищу; n = 9), 1 час (крысы с ограниченным доступом; n = 11) или 18–23 часов (крысы с расширенным доступом; n = 11) доступа к диете в день в течение 40 дней подряд. Диеты в кафетерии, как известно, вызывают ожирение у крыс11. Все крысы также имели неограниченный доступ к стандартному лабораторному питанию, при этом пороговые значения поощрения, прибавка в весе и потребление калорий регистрировались на всем протяжении.

Вес заметно повышался у крыс с расширенным доступом к диете в кафетериях по сравнению с группами только для чау-чау или ограниченного доступа (рис. 1a). Вес также имел тенденцию к увеличению у крыс с ограниченным доступом по сравнению с крысами только с чау, но этот эффект не достиг статистической значимости. Развитие ожирения у крыс с расширенным доступом тесно связано с ухудшением дефицита функции вознаграждения мозга, что отражается в постепенно повышающихся порогах BSR (рис. 1b). Поскольку среди трех групп (Дополнительный рисунок 1) не наблюдалось различий в задержках ответа для BSR, дефицит поведенческих характеристик не может объяснить это наблюдение. Аналогичные недостатки в функции вознаграждения мозга были зарегистрированы у крыс с расширенным, но не ограниченным доступом к внутривенному введению кокаина или героина12, 13, 14. Таким образом, расширенный доступ к вкусной высококалорийной пище может вызвать зависимость от наркомании в функции вознаграждения мозга, которая считается важным источником мотивации, которая может вызвать переедание и способствовать развитию ожирения1, 6.

Рисунок 1: увеличение веса и нарушение дисфункции у крыс с расширенным доступом к диете в кафетериях.

(a) Среднее (± средн.) прибавка в весе у крыс, употребляющих только пищу, ограниченный доступ и расширенный доступ (взаимодействие доступа × день: F39,702 = 7.9, P <0.0001; * P <0.05 по сравнению с группой, получавшей только пищу, апостериорный тест). (b) Среднее (± средн.) процентное изменение от базовых пороговых значений вознаграждения (доступ × время взаимодействия: F78,1092, 1.7 = 0.0005, P <0.05; * P <XNUMX по сравнению с группой только с пищей, апостериорный тест).

Когда мы подробно исследовали поведение кормления (рис. 2), мы обнаружили, что общее ежедневное потребление калорий было сходным между крысами только с чау и крысами с ограниченным доступом (рис. 2a, d). Напротив, общее потребление калорий у крыс с расширенным доступом было почти в два раза выше, чем у крыс с ограниченным доступом и только с чау-чау (рис. 2a, d). Несмотря на то, что крысы с ограниченным доступом и крысы с чау-чатом поддерживали примерно одинаковое ежедневное потребление калорий (рис. 2a, d), крысы с ограниченным доступом получали только ~ 33% от их ежедневных калорий от чау (рис. 2b, d), что указывает на то, что они развили походное поведение и потребляли ~ 66% от их ежедневного потребления калорий во время сеанса доступа 1 h к диете столовой 15 (рис. 2d). Крысы с расширенным доступом получали лишь небольшую долю (~ 5%) от их общего потребления калорий из чау (рис. 2b); они потребляли столовую диету почти исключительно (рис. 2d). Изменение диетического предпочтения в группах с ограниченным и расширенным доступом также отразилось на заметном увеличении потребления жиров по сравнению с крысами только с чау-чау (рис. 2c и дополнительный рисунок 2). В соответствии с предыдущими отчетами16 наблюдалась тенденция к снижению потребления калорийной диеты со временем у крыс с расширенным доступом. Это может отражать развитие толерантности к вкусовой привлекательности продуктов питания, предоставляемых как часть столовой диеты с течением времени. Тем не менее, предпочтение от кафетерийной диеты по сравнению с стандартной чау-чарой оставалось неизменно высоким у этих крыс (дополнительный рис. 3). Эти данные демонстрируют, что расширенный, но не ограниченный доступ к приемлемой диете с высоким содержанием жиров вызывает склонность к наркомании, недостаток пищи, переедание и потерю гомеостатического энергетического баланса. В отличие от этого, ограниченный доступ к вкусной пище приводит к появлению размытых моделей потребления, но не нарушает гомеостатического баланса энергии и функции вознаграждения мозга. Тем не менее, возможно, что ограниченный доступ к диете в кафетериях более чем за 40 дней подряд приведет к значительному увеличению веса и нарушению функции вознаграждения мозга.

Рисунок 2: Модели потребления у крыс с расширенным доступом к диете в кафетериях.

(a) Среднее (± средн.) суточное потребление калорий у крыс, употребляющих только пищу, ограниченный доступ и расширенный доступ (доступ: F1,324 100.6 = 0.0001, P <18,324; время: F7.8 0.0001 = 18,324, P <4.6; доступ × время взаимодействия: F0.0001 0.05 = 2,504, P <349.1; * P <0.0001 по сравнению с группой только с пищей, апостериорный тест). (b) Среднее суточное потребление калорий (± средн.) от еды (доступ: F18,504 = 5.9, P <0.0001; время: F36,504 = 3.52, P <0.0001; доступ × время взаимодействия: F0.05 = 2,486, P <118.7; * P <0.0001 по сравнению с группой только с пищей, апостериорный тест). (c) Среднее суточное потребление калорий (± средн.) из жира (доступ: F18,486 8.8 = 0.0001, P <36,486; время: F 6.2 0.0001 = 0.05, P <40; доступ × время взаимодействия: F 2,54 25.0 = 0.0001, P <2,54; * P <1235.2 по сравнению с группой только с пищей, апостериорный тест). (d) Сравнение среднего (± средн.) общего количества потребляемых калорий и калорий, потребляемых исключительно с пищей, в течение всего 0.0001-дневного периода доступа (доступ: F2,54 = 485.7, P <0.0001; источник калорий: F0.001 = 0.001, P <XNUMX; доступ × взаимодействие источника калорий: FXNUMX = XNUMX, P <XNUMX; *** P <XNUMX по сравнению с общим количеством калорий в группе, потребляющей только пищу, ### P <XNUMX по сравнению с общим количеством калорий в группе та же группа крыс, апостериорный тест).

Через 40 дней крысам больше не разрешался доступ к аппетитной диете, но они продолжали иметь неограниченный доступ к стандартной лабораторной корме. Мы оценивали пороги вознаграждения и ежедневное потребление пищи в течение этого принудительного периода «воздержания». Повышение пороговых значений вознаграждения сохранялось по крайней мере в течение 2 недель у крыс с расширенным доступом, когда они больше не имели доступа к приемлемой диете (рис. 3а). Это контрастирует с относительно кратковременным (~ 48 ч) дефицитом функции вознаграждения, о котором сообщалось у крыс, воздерживающихся от приема кокаина самостоятельно13. Также наблюдалось заметное снижение потребления калорий (рис. 3b) и постепенное уменьшение массы тела (рис. 3c) у крыс с расширенным доступом и, в меньшей степени, у крыс с ограниченным доступом, во время этого периода воздержания, что согласуется с предыдущие отчеты11, 15. Через 14 дней воздержания крыс умерщвляли и расположение электродов определяли путем окрашивания крезиловым фиолетовым (рис. 3d).

Рисунок 3: Постоянная дисфункция дисфункции и гипофагия во время абстиненции у крыс с расширенным доступом к диете в кафетериях.

(a) Среднее процентное изменение от базовых пороговых значений вознаграждения (± sem) во время воздержания от вкусной диеты с высоким содержанием жиров (доступ: F2,112 = 3.7, P <0.05; время: F4,112 = 2.3, P> 0.05; * P <0.05 по сравнению с группой, получавшей только еду, апостериорный тест). (b) Среднее потребление калорий (± средн.) в последний день доступа к диете с высоким содержанием жиров (исходный уровень) и в течение 14 дней воздержания, когда была доступна только стандартная еда (доступ: F2,168 41.7 = 0.0001, P <6,168 ; время: F65.6, 0.0001 = 12,168, P <38.3; доступ × время взаимодействия: F0.0001, 0.05 = 14, P <1,126; * P <37.2 по сравнению с группой только с едой, апостериорный тест). (c) Изменение средней массы тела (± средн.) по сравнению с массой тела в последний день доступа к диете с высоким содержанием жиров (исходный уровень) и в течение 0.0001 дней воздержания, когда была доступна только стандартная еда (доступ: F7,126 = 3.1, P <0.01; время: F7,126 = 40.9, P <0.0001; доступ × время взаимодействия: F0.05 = XNUMX, P <XNUMX; * P <XNUMX по сравнению с группой только с пищей, апостериорный тест). (d) Гистологическая реконструкция расположения стимулирующих электродов BSR в латеральном гипоталамусе крыс с ограниченным доступом (треугольники), ограниченным доступом (квадраты) и расширенным доступом (круги).

Striatal D2Rs у тучных крыс: роль в дефиците вознаграждения

Затем мы проверили гипотезу о том, что чрезмерное употребление вкусной диеты в кафетерии может снизить плотность полосатого тела D2R, способствуя развитию гипочувствительности к вознаграждению, похожей на зависимость. Новой когорте крыс, употреблявших только пищу, ограниченный доступ и расширенный доступ, был разрешен доступ к питанию в кафетерии до тех пор, пока не было статистически значимого увеличения массы тела у крыс расширенного доступа по сравнению с группой, получавшей только пищу (P <0.05 ; Рис. 4а). Экспрессия в полосатом теле, как сообщается, сильно гликозилированной (~ 70 кДа) мембраносвязанной формы D2R была ниже у крыс с расширенным доступом, чем у крыс с ограниченным доступом или крыс, употребляющих только пищу (рис. 4b; см. Онлайн-методы). Когда мы разделили крыс в каждой группе доступа на две подгруппы на основе среднего деления веса тела (легкое или тяжелое), мы обнаружили четкую обратную зависимость между массой тела и экспрессией полосатого тела D2R (рис. 4a, c). Мы не обнаружили статистически значимого снижения экспрессии негликозилированных незрелых (~ 39 кДа) и промежуточно гликозилированных цитоплазматических (~ 51 кДа) форм D2R (дополнительный рис.4) 17, что указывает на то, что экспрессия D2R в полосатом теле у крыс расширенного доступа, вероятно, является регулируется посттранскрипционными механизмами.

Рисунок 4: Увеличение веса обратно пропорционально отношению к полосатым уровням D2R.

(a) Крысы, получавшие только пищу, ограниченный доступ и расширенный доступ, были разделены на две группы в зависимости от условий доступа на основе среднего разделения масс тела: легкие (L) и тяжелые (H). (b) Полный стриарный комплекс собирали у всех крыс, и уровни D2R в каждой группе измеряли с помощью вестерн-блоттинга. Связанная с мембраной полоса D2R была разрешена при 70 кДа, и контроль загрузки белка показан ниже (β-актин, 43 кДа). Полноразмерные иммуноблоты показаны на дополнительном рисунке 12. (c) Относительные количества D2R в полосатом теле крыс, употребляющих только пищу, крыс с ограниченным и расширенным доступом, были количественно определены денситометрией (F2,6 = 5.2, P <0.05, основной эффект доступа; * P <0.05 и ** P <0.01 по сравнению с группой только корма L).

Затем, чтобы проверить функциональную значимость снижения диеты у детей в полосатой D2R до функции вознаграждения мозга, мы разработали и подтвердили лентивирусный вектор для доставки короткой шпилечной интерферирующей РНК (shRNA), чтобы сбить D2R (Lenti-D2Rsh; 5 и дополнительный рисунок 5). Пороги вознаграждения начали увеличиваться у крыс, получавших Lenti-D2Rsh, практически сразу после того, как им был разрешен расширенный доступ к диете в кафетериях, тогда как пороговые значения вознаграждения оставались неизменными у крыс с расширенным доступом, обработанных пустым лентивирусным вектором (Lenti-control) за относительно короткий период доступа к столовой диете (14 d, рис. 6a). Задержки реакции не изменялись в обеих группах крыс, показывая, что этот эффект не был вторичным по отношению к дефициту в производительности задачи (дополнительный рисунок 6). Пороги вознаграждения также не изменялись у крыс, получавших Lenti-D2Rsh или Lenti-control, которые имели доступ к чау только за тот же период (рис. 6b).

Пороги оставались настойчиво повышенными во время дополнительного 15 d абстиненции, когда все крысы имели доступ только к стандартной чау (Дополнительный рисунок 7). Таким образом, нокдаун полосатого D2R повышал уязвимость к гипофункции, вызванной диетой, но не изменял базовую активность систем вознаграждения мозга.

Рисунок 5: опосредуемое лентивирусом нокдаун стриатальной экспрессии D2R.

(а) Графическое изображение полосатого тела, в которых была сверхэкспрессирована Lenti-D2Rsh. Зеленые круги в левом полосатом полушарии представляют собой места, на которые были нацелены вирусные инфузии. Окрашивание в зеленый цвет в правом полосатом полушарии представляет собой типичное иммунохимическое окрашивание на зеленый флуоресцентный белок (GFP) из мозга крысы Lenti-D2Rsh. (b) Типичный иммуноблоттинг сниженной экспрессии D2R в полосатом теле крыс Lenti-D2Rsh. Полноразмерные иммуноблоты показаны на дополнительном рисунке 13. (c) Относительные количества D2R в полосатом теле крыс Lenti-контроля и Lenti-D2Rsh, количественно определяемые денситометрией (* P <0.05 по сравнению с контрольной группой Lenti, апостериорный тест ). (d) Заражение глиальных клеток полосатого тела вектором Lenti-D2Rsh не обнаружено. Зеленое окрашивание - GFP от вируса; красный - маркер астроцитов, глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP); ядра клеток выделены DAPI-окрашиванием синим цветом. Белые стрелки указывают на локализованную область глиоза, обнаруженную только в месте инъекции вируса в полосатом теле, а не в окружающих тканях, в которые вирус распространился. Даже в этой области ни один из астроцитов не является GFP-положительным. Желтые стрелки на увеличенном изображении выделяют типичные GFP-отрицательные астроциты, которые были обнаружены. (e) Высокие уровни нейрональной инфекции в полосатом теле, вызванной вектором Lenti-D2Rsh. Зеленое окрашивание - GFP от вируса; красный - нейрональный ядерный маркер NeuN; ядра клеток выделены DAPI-окрашиванием синим цветом. Желтые стрелки на увеличенном изображении выделяют GFP-положительные и NeuN-положительные нейроны в полосатом теле. (f) Изображение с большим увеличением вирусно инфицированного (GFP-позитивного) нейрона в полосатом теле крыс Lenti-D2Rsh, которое показывает типичные морфологические особенности нейронов со средними шипами.

Рисунок 6: Нокдаун стриатальной D2R увеличивает уязвимость для поощрения дисфункции у крыс с расширенным доступом к диете в кафетериях.

(а) Среднее (± средн.) процентное изменение от базовых пороговых значений вознаграждения у крыс Lenti-control и Lenti-D2Rsh, которые имели расширенный доступ к питанию в кафетерии в течение 14 дней подряд (вирус: F1,156 5.9 = 0.05, P <13,156; время: F2.2 = 0.05, P <13,156; вирус × время взаимодействия: F2.2 = 0.05, P <0.05; #P <2, эффект взаимодействия). (b) Среднее (± sem) процентное изменение от базовых пороговых значений вознаграждения у крыс Lenti-control и Lenti-D14Rsh, которые имели доступ только к корму. (c) Среднее (± средн.) потребление калорий крысами в течение 2,28 дней только приема пищи или расширенного доступа (доступ: F135.6 = 0.0001, *** P <14). (г) Среднее (± средн.) прибавление в весе в течение 2,28 дней только приема пищи или расширенного доступа (доступ: F96.4 = 0.0001, P <0.001; *** P <XNUMX, основной эффект доступа).

Мы обнаружили, что потребление калорий (рис. 6c) и увеличение массы тела (рис. 6d) были одинаковыми в Lenti-D2Rsh и соответствующих группах контроля Lenti в условиях только chow или расширенного доступа (дополнительные диаграммы 8 и 9). Таким образом, стриатальный нокдаун D2R не изменил ни предпочтения для диеты столовой, ни полного потребления калорий, когда вкусная пища была свободно доступна для потребления.

Компульсивное питание у тучных крыс: роль для полосатого D2R

Затем мы проверили гипотезу о том, что компульсивное переедание может возникнуть у крыс с расширенным доступом к питанию в кафетерии и что дефицит передачи сигналов полосатого тела D2R может способствовать этому эффекту. Новой когорте крыс, употреблявших только пищу, ограниченный доступ и расширенный доступ, был разрешен доступ к рациону в кафетерии в течение> 40 дней до тех пор, пока у расширенных крыс не произошло статистически значимое увеличение веса (P <0.05 по сравнению с крысами, употребляющими только пищу; данные не показано). Затем всем трем группам крыс разрешался только 30-минутный доступ к рациону кафетерия в течение 5-7 дней в рабочей камере до достижения стабильного потребления (определяемого как изменение суточного потребления <10%). Половина крыс в каждом состоянии доступа затем подвергалась воздействию света (условный раздражитель) в сочетании с нанесением ударов ногами (наказываемая группа), тогда как оставшиеся крысы в ​​каждой группе подвергались воздействию светового сигнала в отсутствие сотрясения ступней (безнаказанная группа). ). В день тестирования мы исследовали влияние одного лишь светового сигнала на съедобную пищу (рис. 7; см. Онлайн-методы). Мы обнаружили, что среднее потребление калорий во время 30-минутных базовых сеансов было выше у крыс, употребляющих только пищу и крыс с ограниченным доступом, чем у крыс с расширенным доступом (рис. 7a, b). Это говорит о том, что крысы, употребляющие только пищу и крысы с ограниченным доступом, ели вкусную пищу во время прерывистых 30-минутных сеансов доступа, что отражается в том факте, что эти крысы потребляли ~ 40-50% своего дневного потребления калорий, обычно ~ 100 кКал, во время этих сеансов (рис. 7а, б). Напротив, крысы с расширенным доступом кажутся устойчивыми к развитию этого пищевого поведения, похожего на переедание, возможно, потому, что их история почти неограниченного доступа к вкусной пище в течение> 40 последовательных дней установила модели питания, которые были относительно негибкими для изменения. В день тестирования мы не наблюдали статистически значимых эффектов воспроизведения световых сигналов на потребление корма у безнаказанных крыс из групп только для кормления, ограниченного доступа или расширенного доступа по сравнению с потреблением в течение базового периода (рис. 7a). Таким образом, один лишь световой сигнал не имел мотивационной значимости. У подвергнутых наказанию крыс парный импульсный световой сигнал значительно снизил потребление вкусной пищи у крыс с ограниченным доступом и только для корма. Тем не менее, световой сигнал не оказал никакого влияния на прием аппетитной пищи у крыс с расширенным доступом, показывая, что их потребление было нечувствительным к отталкивающим сигналам окружающей среды, предсказывающим невзгоды. Исходное потребление энергии у крыс расширенного доступа было ниже, чем у других групп. Однако, поскольку потребление пищи в те же периоды времени было намного ниже (рис. 7d), маловероятно, что это представляет собой «эффект пола», который искажает наши выводы. В совокупности наши данные подтверждают идею о том, что компульсивное пищевое поведение может проявляться у крыс с расширенным доступом аналогично компульсивному приему кокаина, наблюдаемому у крыс с историей расширенного доступа к наркотику18.

Рисунок 7: Компульсивное реагирование на вкусную пищу.

(a) Среднее (± полу) потребление аппетитной диеты у ненаказанных крыс во время 30-минутных исходных сессий и в день тестирования, когда крысы подвергались воздействию нейтрального условного стимула, который ранее не был сопряжен с ядовитым шоком стопы (доступ: F2,20 = 5.2, P <0.05; #P <0.05 по сравнению с крысами, употребляющими только пищу). (b) Среднее (± полу) потребление аппетитной диеты у наказанных крыс во время 30-минутных исходных сессий и в день тестирования, когда крысы подвергались воздействию условного стимула, который ранее был сопряжен с ядовитым шоком стопы (доступ: F2,21 = 3.9 , P <0.05; сигнал: F1,21 = 8.6, P <0.01; доступ × взаимодействие с сигналом: F2,21 = 4.7, P <0.05; * P <0.05 по сравнению с потреблением во время базовой сессии, #P <0.05 по сравнению с крысы, употребляющие только пищу). (c) Среднее (± sem) потребление аппетитной диеты во время 30-минутных базовых сеансов и в день тестирования у крыс Lenti-control и Lenti-D2Rsh, которые ранее имели только пищу или расширенный доступ к диете кафетерия (сигнал: F1,26, 29.7 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <30 по сравнению с потреблением во время исходных сессий, апостериорный тест). (d) Среднее (± средн.) потребление корма во время 2-минутных исходных сессий и в день тестирования у крыс Lenti-control и Lenti-D1,26Rsh, которые ранее ели только пищу или имели расширенный доступ к рациону кафетерия (сигнал: F44.9 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <XNUMX по сравнению с потреблением во время исходных сессий, апостериорный тест).

Наконец, мы исследовали влияние условного стимула, связанного с наказанием, на потребление пищи у крыс Lenti-control и Lenti-D2Rsh, которые ранее имели доступ только к корму или имели расширенный доступ к рациону кафетерия (крысы с рис. 6). Мы обнаружили, что исходное потребление вкусной пищи во время исходных 30-минутных сессий было одинаково высоким (~ 40 кКал) во всех четырех группах (рис. 7c). Кроме того, общее ежедневное потребление корма (в домашней клетке) было одинаковым для всех четырех групп крыс во время сеансов кондиционирования и в день тестирования (дополнительный рис. 10). Таким образом, 14 дней предшествующего доступа к питанию в кафетерии было недостаточно, чтобы блокировать пищевое поведение, похожее на переедание, аналогично тому, как это наблюдается у крыс, у которых был расширенный доступ к рациону питания> 40 дней (рис. 7a, b). Отвратительный световой раздражитель нарушал прием аппетитной пищи у крыс Lenti-control и Lenti-D2Rsh, которые ранее имели доступ только к питанию (рис. 7c). Точно так же аверсивный условный раздражитель нарушал прием аппетитной пищи у крыс группы Lenti, которые ранее имели доступ к питанию в кафетерии на 14 дней. Напротив, аверсивный условный стимул не оказал влияния на потребление вкусной пищи у крыс Lenti-D2Rsh, которые ранее имели 14-дневный расширенный доступ к диете кафетерия (рис. 7c). Пороги BSR оставались значительно повышенными у этих крыс, когда регистрировались через 48 часов после сеанса тестирования, тогда как пороги оставались стабильными и неизменными в трех других группах крыс.

(Дополнительный рисунок 11). Чтобы убедиться в том, что резистентность к вызванному условным раздражителем подавлению приемлимого пищевого продукта у крыс с расширенным доступом Lenti-D2Rsh не была вторичной по отношению к нарушениям в классических процессах кондиционирования, мы проверили эффекты отвратительного условного раздражителя на потребление менее приемлемого стандартного чау-чау в все четыре группы крыс. В отличие от потребления пищи, пригодной для выпивки, мы обнаружили, что все четыре группы крыс потребляли небольшую чау (~ 2 kCal) во время сеансов базовой линии 30 (рис. 7d), и что потребление чау во всех четырех группах было нарушено аналогичная величина при воздействии условного условного раздражителя (рис. 7d). Эти данные демонстрируют, что нокдаун полосатых D2R заметно ускорил появление компульсивного приема пищи, но только у крыс с историей расширенного доступа. Более того, поскольку компульсивное питание было обнаружено только у крыс Lenti-D2Rsh, которые имели повышенные пороги BSR, гипофункция, вызванная питанием, может быть необходимым предшественником возникновения компульсивного поиска пищи.

Обсуждение

Простота доступа к приемлемым пищевым продуктам с высоким содержанием жира считается важным фактором риска для окружающей среды для ожирения19. Мы обнаружили, что расширенный доступ к очень вкусной диете в стиле кафетерий привел к перееданию и увеличению веса в сочетании с постепенным повышением пороговых уровней BSR у крыс. Этот эффект на пороги BSR можно объяснить постепенным снижением чувствительности схем вознаграждения мозга, что согласуется с тем фактом, что ограничение питания и потеря веса могут увеличиваться20, тогда как острая перекармливание может временно уменьшаться21, отвечая на BSR у крыс. Это открытие представляет собой продолжение работы, показывающей, что острое перекармливание крыс через внутрижелудочную питательную трубку 21 и расширение желудка или внутривенную инфузию глюкагона, которая имитирует постпрандиальное насыщение22, 23, 24, уменьшает ответ на награждение латерального гипоталамического BSR и увеличивает отвратительные ответы на stimulation25. Предыдущие работы также показали, что неоднократно кормящие корм крыс через внутрижелудочные трубки до тех пор, пока их вес не увеличился на ~ 200 g, также не уменьшится скорость ответа на BSR, эффект, который сохраняется до тех пор, пока масса тела не нормализуется23. Как и в этих выводах у крыс, реакция у кошек на боковые гипоталамические BSR была ингибирована предыдущим питанием до насыщения26, показывая, что взаимодействия между функцией вознаграждения мозга и метаболическим состоянием сохраняются и, следовательно, могут возникать и у людей. Простота доступа и последующее переедание диет в стиле кафетерий у людей считается важным фактором, влияющим на нынешнюю эпидемию ожирения в западных обществах 19. Наши данные показывают, что у крыс появляется гипофункция вознаграждения, которая волеизверно переедает вкусную диету в кафетериях, подобную той, которая потребляется людьми, и что этот эффект становится все хуже и хуже, поскольку они приобретают больший вес. Примечательно, что у всех крыс с превышением порога награды ≥20% были электроды BSR, расположенные в ~ 500 мкм передней части дорсолатерально. Чувствительность нейронов, связанных с вознаграждением, в этой области увеличивается с ограничением пищи таким образом, который чувствителен к жировому гормонному лептину, и эта область мозга считается важным субстратом для награды за питание 27. Таким образом, мозговые цепи, которые регулируют пищевую гедонику, ингибируются постингистирующими сигналами, которые предсказывают насыщение, что согласуется с недавними исследованиями в области изображений человека, показывающими, что желудочное растяжение28 и полученный из кишечника постпрандиальный факторный пептид YY3-36 (PYY) 29 модулируют активность областей мозга участвует в обработке вознаграждений. Кроме того, системы вознаграждения также блокируются чрезмерным увеличением веса. Недавние сообщения показывают, что циркулирующий лептин, ключевой регулятор энергетического баланса, может проникать в ткани мозга и препятствовать активности схем вознаграждения3, 27, 30, 31.

Дефицит вознаграждения у крыс с избыточным весом может отражать противодействующее снижение базовой чувствительности цепей вознаграждения мозга для противодействия их чрезмерной стимуляции вкусной пищей. Такая индуцированная диетой гипофункция вознаграждения может способствовать развитию ожирения за счет повышения мотивации к потреблению высокоэффективных «ожиренных» диет, чтобы избежать или облегчить это состояние отрицательного вознаграждения6, 32. Это может объяснить гипофагию, которую мы наблюдали при расширенном доступе. крыс и, в меньшей степени, у крыс с ограниченным доступом, когда аппетитная пища была изъята и была доступна только менее аппетитная пища. Такой сценарий также согласуется с данными исследований изображений головного мозга человека, в которых притупленная активация полосатого тела в ответ на очень вкусную пищу, особенно у людей с генетическим полиморфизмом, который, как считается, снижает экспрессию полосатого тела D2R, связана с долгосрочным набором веса4. Неясно, проявляется ли такая пониженная чувствительность к вознаграждению у тучных людей до развития ожирения и связана исключительно с генетическими факторами («синдром дефицита вознаграждения»), или же переедание может вызвать нарушение обработки вознаграждения. Наши данные демонстрируют, что расширенный доступ к аппетитной высококалорийной пище и последующее притупление переедания поощряют чувствительность и, следовательно, могут представлять собой важный гедонистический механизм, который способствует развитию ожирения. Дисфункция вознаграждения, аналогичная описанной здесь у крыс с ожирением, также обнаруживается у крыс с историей расширенного доступа к внутривенному введению кокаина или героина, но не у крыс с историей ограниченного доступа12, 13, 14. Более того, переход от Было высказано предположение, что случайный или компульсивный поиск наркотиков является результатом попытки облегчить постоянное состояние уменьшенного вознаграждения, вызванное этой вызванной лекарством дисфункцией вознаграждения12, 32, 33. Таким образом, наши данные показывают, что ожирение и наркомания могут иметь общие основные гедонистические механизмы.

Снижение регуляции полосатой экспрессии D2R является заметным нейроадаптивным ответом на чрезмерное потребление вкусной пищи. Действительно, снижение плотности полосатого D2R наблюдается у людей с избыточным весом4, 34 и грызунов35, 36. И наоборот, люди с нервной анорексией имеют повышенный стригальный D2R37, а потеря веса у лиц, страдающих ожирением, после операции на бариатрическом (желудочном шунтировании) связана с повышенной стриатальной плотностью D2R28. Полиморфизм генов, называемый аллелем TaqIA A1, приводит к снижению плотности полосатого D2R, а индивидуумы, укрывающие эту аллель, чрезмерно представлены в группах с ожирением4. Аллея TaqIA также повышает уязвимость к алкоголизму, опиоидной и психомоторной стимуляционной зависимости 38. Снижение плотности полосатого D2R, происходящее либо через конститутивные генетические факторы, либо в результате переедания, может поэтому способствовать нейробиологическим механизмам ожирения. Мы обнаружили, что полосатые уровни изоформы 70 kDa D2R, которые, как полагают, отражают связанный с мембраной D2R, были обратно связаны с массой тела у крыс из групп с ограниченным доступом и расширенным доступом (рис. 4). Выпадение полосатой экспрессии D2R, наиболее заметно в дорсолатеральной стриатуме (рис. 5), вызвало появление порогов BSR почти сразу после контакта с диетой столовой. Снижение экспрессии полосатого D2R, следовательно, быстро ускорило появление гипофункции вознаграждения у крыс с расширенным доступом к высокоприменимым пищевым продуктам, что соответствует данным визуализации человеческого мозга, которые указывают на то, что дефицит в полосатой плотности D2R способствует снижению гипофункции у лиц с ожирением4.

Также заслуживают внимания три особенности крыс Lenti-D2Rsh. Во-первых, хотя стриатальный нокдаун D2R в сочетании с расширенным доступом к приемлемой диете привел к повышению пороговых уровней BSR, не было различий в потреблении калорий или прибавлении веса у этих крыс по сравнению с контрольными крысами. Это может отражать тот факт, что крысы имели только 14 d доступа к кафетерии; более длительные периоды доступа могли бы привести к увеличению веса с течением времени, аналогично более высокой восприимчивости к увеличению веса, наблюдаемой у людей с дефицитом в полосатой сигнальной передаче D2R4. Однако преимущество ограничения доступа к диете в кафетериях только к 14 d состоит в том, что крысы с нокдауном с расширенным доступом были единственной группой, которая показывала повышенные пороги BSR, и это позволило нам оценить потенциальную роль гипофункции вознаграждения в развитии компульсивного (см. ниже). Во-вторых, пороги BSR оставались стабильными и неизменными у крыс с нокаутом, у которых был доступ только к чау. Это указывает на то, что уменьшенная экскреция полосатого D2R сама по себе недостаточна для того, чтобы вызвать положительную гипочувствительность; вместо этого он, казалось, взаимодействовал с чрезмерным потреблением вкусной пищи, чтобы ускорить появление этого состояния с пониженной чувствительностью к награде. Другие адаптивные ответы в схемах вознаграждения головного мозга могут, таким образом, вызвать положительную гипочувствительность у крыс с расширенным доступом к диете в кафетериях. Имея это в виду, мы отмечаем, что агонистический бромокриптин D2R снижает циркулирующие уровни leptin39, а лептин ингибирует подачу, по меньшей мере частично, путем ингибирования полосатых областей, которые контролируют гедонистические реакции на продукты 3, 30, 31. Таким образом, возможно, что подавление стриалального D2R в ответ на увеличение массы тела увеличивает передачу сигналов лептина и тем самым повышает тормозящие эффекты этого адипокина на системы вознаграждения мозга. Наконец, отметим, что мы нацелили наши лентивирусные векторы на дорсолатеральный стриатум. Это было главным образом по техническим причинам, поскольку боковое размещение канюлей для доставки вируса в полосатый ствол позволило нам также разместить постоянный гипоталамический стимулирующий электрод для определения порога BSR. Таким образом, возможно, что нацеливание D2Rs на нокдаун в других областях полосатого тела, особенно дорсомедиальных и вентральных областях (ядро и сердцевина ядра) может иметь повышенные пороги BSR даже в отсутствие приемлемой диеты.

Дорсолатеральное полосатое тело в значительной степени вовлечено в обучение типу привычки «стимул-ответ», что отражается в развитии конъюнктурного поведения, нечувствительного к девальвации предшествующим кормлением до насыщения или сочетанием с вредными стимулами 40. Ориентируясь в основном на дорсолатеральное полосатое тело, мы могли бы уничтожить популяции D2R, которые регулируют уязвимость крыс к развитию компульсивно-подобного переедания. В соответствии с ролью полосатого тела D2R в компульсивном поведении, аллель TaqIA локуса гена DRD2-ANKK1 человека, который приводит к низкой плотности полосатого тела D2R5, притупляет активацию полосатого тела в ответ на вкусную пищу4 и повышает уязвимость к ожирению4 - также связан с дефицит обучения, позволяющий избегать действий с негативными последствиями41. Потеря тормозящего контроля над поведением, которое может иметь отрицательный результат, является характерной чертой как ожирения, так и наркозависимости, при которой консумативное поведение сохраняется, несмотря на отрицательные социальные, медицинские или финансовые последствия. Поведение крыс, принимающих кокаин, в анамнезе интенсивно употреблявшее наркотики, может стать негибким и устойчивым к нарушению аверсивным условным стимулом, который предсказывает отрицательный результат (шок стопы) 18. Точно так же мыши, у которых ранее был доступ к аппетитной диете с высоким содержанием жиров, будут проводить больше времени в неблагоприятной среде (ярко освещенной), чтобы получить вкусную пищу, чем мыши, которые не имели опыта диеты42. Мы обнаружили, что потребление вкусной пищи у крыс с расширенным доступом к диете кафетерия было так же нечувствительно к аверсивному условному раздражителю. В соответствии с ролью полосатого тела D2R в этом эффекте, компульсивное питание было обнаружено у крыс с нокдауном полосатом тела D2R, которые ранее имели 14-дневный расширенный доступ к диете кафетерия, но не в контрольных группах. С точки зрения нейросхемы, расширенный доступ к аппетитной пище может запускать пластичность кортикостриатальных путей, тем самым делая животных более уязвимыми для развития компульсивно-подобного поведения, с дефицитом передачи сигналов полосатого тела D2R, усиливающего этот процесс. В самом деле, снижение плотности полосатого тела D2R у лиц с ожирением коррелирует со снижением метаболизма в префронтальных и орбитофронтальных областях коры 43, которые осуществляют ингибирующий контроль над поведением 44.

Примечательно, что компульсивное потребление потребляемой пищи было обнаружено только у крыс с нокдауном, которые ранее имели расширенный доступ к диете в кафетериях, а не у контрольных крыс, которые имели расширенный доступ к диете в кафетериях в течение того же периода времени, а также у крыс с нокдауном, которые имели доступ только для чау-чау. Основное различие между крысами с нокаутом с предварительным расширенным доступом и другими группами было их постоянно повышенными порогами BSR. Это может отражать общее нейробиологическое происхождение наградной гипофункции и появление компульсивно-подобной еды, которые являются временно совпадающими, но независимыми явлениями. В качестве альтернативы, гипофункция, вызванная диетой, может служить в качестве субстрата для отрицательного усиления, что облегчает развитие компульсивно-подобной еды14, 32, 33. Каковы бы ни были основные механизмы, наши результаты показывают, что склонность к наркотикам, как компульсивное реагирование на вкусную пищу, может возникать у тучных крыс и указывать на то, что дефицит в полосатой передаче сигналов D2R повышает уязвимость к развитию этого поведения.

Таким образом, мы обнаружили, что чрезмерное стимулирование систем вознаграждения мозга за счет чрезмерного потребления приемлемой, энергетически плотной пищи вызывает глубокое состояние повышенной гипочувствительности и развитие компульсивного питания. Эти неадекватные поведенческие реакции у тучных крыс, вероятно, возникают из-за дефицита диеты при полосатой передаче сигналов D2R. Overconsumption наркотиков злоупотребления аналогичным образом уменьшает плотность полосатого D2R, вызывает глубокое состояние гипофункции вознаграждения и вызывает появление компульсивного поведения наркотиков наркотиков. Таким образом, наши результаты подтверждают предыдущие результаты работы4, 19, 42, 45, 46, 47, указывающие на то, что ожирение и наркомания могут возникать из-за подобных нейроадаптивных ответов в схемах вознаграждения мозга.

методы

Крысы.

Самцы крыс Wistar, взвешивающих 300-350 g в начале экспериментов, были получены из реки Чарльз. По прибытии крыс размещали индивидуально при постоянной температуре в темно-темном цикле 12-h (загорается на 2200 ч). Крысам разрешался доступ к стандартному лабораторному чау и воде в течение всего эксперимента. Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованием в Scripps Florida, и крыс лечили в соответствии с руководящими принципами, установленными Национальными институтами здравоохранения в отношении принципов ухода за животными.

Хирургические процедуры.

Крыс, приготовленных с помощью стимулирующих электродов BSR, сначала обезболивали путем ингаляции 1-3% изофлурана в кислороде и помещали в стереотаксическую структуру (Kopf). Биполярные электроды BSR (длиной 11 мм) были имплантированы в задний боковой гипоталамус (переднезадний, -0.5 мм от брегмы, медиолатеральный, ± 1.7 мм от средней линии, дорсовентральный, 8.3 мм от дуры, резцовую планку отрегулировали на 5 мм выше межреберной линии ) 47. Крысы, получающие вирусные инъекции, также были приготовлены с двусторонними направляющими канюлями (23-калибр длиной 14 мм), расположенными над стриатумом (переднезадний, 2.8 мм от брегмы, медиолатеральный, ± 3.1 мм от средней линии, дорсовентрал, -2.4 мм от твердой мозговой оболочки) 48 и заполненный с 14-мм стилями. Четыре винта из нержавеющей стали и зубной акрил удерживали электрод и канюли на месте. Хирургическую рану обрабатывали местным антибиотиком один раз каждые 12 h для 5 d после операции. Крысам было позволено 7-10 d оправиться от операции и затем прошли обучение в процедуре порога BSR.

Процедура BSR.

Крыс обучали реагировать на стимуляцию BSR в соответствии с процедурой порогового тока с дискретным испытанием, аналогичной описанной в другом месте 10, 14. Вкратце, уровни тока BSR изменялись в чередующихся нисходящих и восходящих рядах по шагам 5-μA. На каждом тестовом сеансе были представлены четыре чередующиеся нисходящие / восходящие ряды. Порог для каждой серии был определен как средняя точка между двумя последовательными интенсивностями тока, для которых крысы ответили, по крайней мере, в трех из пяти испытаний, и двух последовательных интенсивностей тока, для которых крысы не ответили в трех или более из пяти испытаний. Общий порог сессии определялся как среднее пороговых значений для четырех отдельных рядов. Каждый сеанс тестирования составлял приблизительно 30 мин. Стабильные пороги BSR определялись как ≤10% изменения пороговых значений в течение 5 последовательных дней, обычно устанавливаемых после 10-14 d обучения. Задержка ответа для каждого тестового сеанса определялась как средняя латентность ответа всех испытаний, в течение которых произошел положительный ответ.

Вирусная упаковка и доставка.

Короткая шпилечная РНК доставлялась и конститутивно экспрессировалась с использованием векторной системы pRNAT-U6.2 / Lenti (GenScript). Вирусные частицы получали согласно протоколу производителя. Вкратце, клетки HEK 293FT трансфицировали вектором, содержащим вставку shRNA (5'-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTTCCAACTCGAG-3 ') или пустым вектором, плюс замененная среда ViraPower Packaging Mix 72 ч (Invitrogen) в течение 24 ч. Затем супернатант собирали и концентрировали ультрацентрифугированием (76,755 г, ротор Beckman Coulter SW 32 TI, 90 мин, 4 ° C) и титр вируса определяли путем сортировки клеток, активируемых флуоресценцией, в соответствии с инструкциями производителя. Вирус разделяли на аликвоты и хранили в защищенных от света ящиках при -80 ° C до использования.

Крысы со стабильными порогами BSR получали двусторонние вирусные инъекции на трех участках полости тела каждого полушария головного мозга (2 мкл на инъекцию, 1 мкл мин-1, 1 мин между инъекциями, в общей сложности шесть инъекций на крысу). Крысам разрешалось по крайней мере восстановление 2-3 d из интрастриальных инъекций до возобновления оценки порога BSR. Ежедневная оценка порогового уровня BSR продолжалась для 33 d после вирусных инъекций, чтобы обеспечить максимальный стриатальный нокдаун D2R, прежде чем разрешить крысам доступ к диете в кафетериях. Не было различий в пороговых значениях BSR между крысами Lenti и Lenti-D2Rsh во время этого 33 d (данные не показаны).

Иммуноблоттинг.

Крыс убивали приблизительно 1 h после их регулярного планового доступа к кафетерии, и мозг быстро удалялся. Мозговые секции толщиной ~ 1-2 мм были приготовлены с использованием матрицы коронального мозга (интервал среза 1-миллиметров, Plastics One) на ледяном блоке, и были удалены тканевые удары дорзальной полосатой (bregma: от 2.2 до -0.26 мм). Струйные тканевые пуанты быстро собирали, замораживали и хранили при -80 ° C до использования. Отдельные образцы оттаивали на льду, и равные количества полосатой ткани объединяли на основе взвешенного по весу срединного разделения групп доступа (крысы 7-10 на пул). Ткане ресуспендировали в 500 мкл ледяного буфера RIPA (Thermo Scientific), содержащего ортованадат натрия, ингибиторы коктейлей фосфатазы 1 и 2 (Sigma-Aldrich), лейпептин и пепстатин перед гомогенизацией. Лизаты тканей кипятили в течение 10 мин в буфере для образцов и загружали на 4% -20% или 10% трис-глицин-SDS-гели (Invitrogen). Белок переносили на нитроцеллюлозные мембраны, блокировали для 1 h при ~ 23-25 ° C (5% обезжиренного сухого молока и 0.2% Tween-20 в PBS, pH 7.4) и инкубировали в первичных антителах в течение ночи при 4 ° C. В блочном растворе разбавляли следующие первичные антитела: моноклональную мышь D2R (Santa Cruz, 1: 100) или моноклональную молекулу мышиной мыши (Santa Cruz, 1: 200). Хемилюминесцентный ECL-реагент добавляли после инкубации с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Amersham, 1: 2,000). Зрелая связанная с мембраной форма D2DR (~ 70 kDa) 17, 49 была нормирована на контроль белковой нагрузки (β-actin, 43 kDa) и количественно определялась с помощью денситометрии с использованием программного обеспечения NIH Image J.

Иммунохимический анализ.

Крыс анестезировали и транскрибиально перфузировали 4% параформальдегидом в PBS (pH 7.6). Мозги удаляли, добавляли в течение ночи и хранили в сахарозе (раствор 30% в PBS, pH 7.4) по меньшей мере на 72 ч. Секции замороженной ткани (толщина 30 μm) собирали из микротома и блокировали (3% BSA, 5% нормальной козьей сыворотки и 0.3% Triton X-100 в PBS) для 1 h при ~ 23-25 ° C. К блочному раствору добавляли следующие первичные антитела и инкубировали в течение ночи при 4 ° C: курица поликлональная до GFP (Abcam, 1: 1,000); кролик моноклональный к GFAP (Millipore, 1: 1,000); мышь моноклональная к NeuN (Millipore, 1: 1,000). Секции инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентным красителем, в ~ 23-25 ° C: краситель с анти-цыплят-488-нм (Jackson ImmunoResearch, 1: 1,000), краситель с анти-кроличьим 594-нм (Invitrogen, 1: 1,000 ) и антимышино-594-нм краситель (Invitrogen, 1: 1000). Разделы были установлены с помощью монтажных сред Vectashield, содержащих DAPI (Vector Labs) и с покровным покрытием. Изображения были сделаны с использованием флуоресцентного микроскопа Olympus BX61 (× 2) или конфокального микроскопа Olympus (× 10 и × 100 целей).

Процедура кормления.

Крыс размещали индивидуально на бумажных подстилках (альфа-подушечки, специализированные бумаги Shepherd), чтобы предотвратить загрязнение пищевых продуктов с помощью сыпучих материалов для постельных принадлежностей. Кафетерийная диета состояла из бекона, колбасы, чизкейка, пирога с фундуком, глазури и шоколада, которые были индивидуально взвешены до того, как их сделали доступными для крыс. Контейнерные диетические продукты были доставлены в небольших металлических сосудах. Все пищевые продукты, включая стандартную лабораторную чау, снова взвешивались по завершении сеанса кормления. Потребление калорий из различных макронутриентов рассчитывали с использованием информации о питании, предоставленной производителем.

Cue-индуцированное подавление поведения кормления.

Процедуры кормления происходили в звукопоглощающих оперантных камерах, идентичных по размерам тем, которые использовались в экспериментах с BSR. Крыс помещали в операционную камеру, и у них был доступ к диете в кафетерии или к корму в течение 30 минут. Пищевые продукты доставлялись в небольших металлических емкостях. Все продукты питания взвешивали до и после сеансов кормления, которые проводили в течение обычного периода кормления крыс. Потребление корма оценивали по потреблению гранул с кормом 45 мг, идентичных по составу корму, подаваемому в домашних клетках крыс. Затем крысам разрешался 30-минутный доступ к питанию в кафетерии до достижения стабильного потребления (определяемого как изменение суточного потребления <10%), на что требовалось 5-7 дней. После стабилизации потребления вкусной пищи в течение этого базового периода крысы в ​​каждом состоянии доступа были разделены на две группы: наказанные (получившие удар ногой) и безнаказанные (не получившие удар ступней). Затем крыс подвергали четырем сеансам кондиционирования в последовательные дни в той же операционной камере, в которой они ранее имели доступ к вкусной пище. Во время 30-минутных сеансов кондиционирования световой сигнал (условный раздражитель) был активирован на 10 минут, выключен на 10 минут, а затем снова включен на 10 минут. Наказанные крысы получали электрошок только во время предъявления светового сигнала (0.5 мА в течение 1.0 с; 10 стимуляций с интервалами ~ 1 мин). Безнаказанным крысам подавали световой сигнал таким же образом, но без удара ногой. В день тестирования, на следующий день после последнего сеанса кондиционирования, крысы в ​​наказанных группах получали периодический шок стопы (всего пять стимуляций) в сочетании с включением световой сигнализации на 5 мин. Безнаказанных крыс снова подвергали воздействию светового сигнала в отсутствие удара ногой. После 5-минутного периода наказания всем крысам был разрешен доступ к аппетитной пище на 30-минутный сеанс с периодической активацией условного стимула (10-минутный световой сигнал включен, 10-минутный световой сигнал отключен, 10-минутный световой сигнал включен).

Статистический анализ.

Исходные пороговые значения вознаграждения определялись как среднее пороговое значение для 5 d перед доступом к кафетерийной диете для каждого испытуемого. Пороги вознаграждения были выражены как процентное изменение от базового порогового значения. Данные о процентном отношении к пороговым значениям порогового значения, прибавлению массы тела, потреблению калорий и потреблению калорий из жира были проанализированы с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями с доступом (только чау, ограниченный доступ или расширенный доступ), источник калорий ( стандартная диета для чау или кафетерии), вирус (Lenti-control или Lenti-D2Rsh) и кий (парные или непарные с наказанием) как факторы между субъектами и время как фактор внутри предмета. Когда это необходимо, основные эффекты в анализе дисперсии были дополнительно проанализированы послеоперационными испытаниями Bonferroni. Все статистические анализы были выполнены с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.

Рекомендации

Рекомендации

Соответствие:

· Пол Дж. Кенни ([электронная почта защищена])