диабетология, 2017; 60 (8): 1502-1511.
Опубликован онлайн 2017 Май 20. DOI: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1Абстрактные
Цели / гипотезы
Переедание диетических жиров вызывает ожирение у людей и грызунов. Недавние исследования на людях и грызунах продемонстрировали, что зависимость от жиров имеет общий механизм с зависимостью от алкоголя, никотина и наркотиков в терминах дисфункции систем вознаграждения мозга. Было подчеркнуто, что диета с высоким содержанием жиров (HFD) ослабляет передачу сигналов дофамина D2 (D2R) в полосатом теле, ключевом регуляторе системы вознаграждения мозга, что приводит к гедоническому перееданию. Ранее мы сообщали, что коричневый специфический для риса биоактивный компонент γ-оризанол ослабляет предпочтение HFD посредством гипоталамического контроля. Поэтому мы исследовали возможность того, что γ-оризанол будет модулировать функционирование системы вознаграждения мозга у мышей.
методы
Самцы мышей C57BL / 6J, которым вводили HFD, перорально обрабатывали γ-оризанолом, а также оценивали уровни молекул в половых органах, участвующих в передаче сигналов D2R. Исследовано влияние γ-оризанола на метилирование ДНК промотора D2R и последующие изменения предпочтений для диетического жира. Кроме того, были исследованы эффекты 5-aza-2'-деоксицитидина, мощного ингибитора ДНК-метилтрансферазы (DNMT), на предпочтение пищи, сигнализацию D2R и уровни DNMT в полосатом теле. Ингибирующее действие γ-оризанола на активность DNMT ферментативно оценивали in vitro.
Итоги
В полосатом теле от мышей, которым вводили HFD, продуцирование D2R уменьшалось путем увеличения метилирования ДНК промоторной области D2R. Устное введение γ-оризанола уменьшало экспрессию и активность DNMT, тем самым восстанавливая уровень D2Rs в полосатом теле. Фармакологическое ингибирование DNMT 5-aza-2'-дезоксицитидином также улучшало предпочтение диетическому жиру. В соответствии с этими результатами ферментативные анализы in vitro продемонстрировали, что γ-оризанол ингибирует активность DNMT.
Выводы / интерпретация
Мы продемонстрировали, что γ-оризанол улучшает гиперметилирование ДНК, индуцированное HFD, промоторной области D2R в полосатом мозге мышей. Наша экспериментальная парадигма подчеркивает γ-оризанол в качестве многообещающего антибиотического вещества с четким свойством быть новым эпигенетическим модулятором.
Электронный дополнительный материал
В онлайн-версии этой статьи (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) содержится рецензируемый, но неотредактированный дополнительный материал, доступный авторизованным пользователям.
Введение
Переедание у людей с ожирением разделяет, по крайней мере частично, общие механизмы с зависимостью от алкоголя, никотина и наркотиков [1]. Как и гипоталамическая и гормональная регуляция аппетита, система вознаграждения мозга, в частности передача сигналов дофаминовых рецепторов, тесно связана с аддиктивным или гедоническим питанием [2]. Предыдущее исследование на крысах показало, что нокдаун полового дофаминового D2-рецептора (D2R) с помощью лентивирус-опосредованной короткой шпильки, мешающей РНК, быстро индуцировал наркомания как дефицит вознаграждения и стремление к пище,3]. Из-за уменьшенной плотности D2R дорсальная стриатум менее чувствительна к вознаграждению за питание по сравнению с группами контроля над жиром у людей с ожирением и грызунами [3–5]. В соответствии с этим понятием TaqIA аллель ANKK1 (кодирование DRD2 / ankyrin repeat и киназного домена, содержащего 1), которое уменьшает образование полосатого D2R, связано с ожирением фенотипом у людей [6], а эффекты потери веса после бариатрической хирургии связаны с повышенной стриатальной плотностью D2R [7]. Эти данные настоятельно свидетельствуют о важности полосатого D2R в качестве новой терапевтической цели для лечения ожирения. Тем не менее, некоторые препараты, которые были разработаны, которые действовали на систему вознаграждения мозга, вызвали значительные неблагоприятные последствия, включая серьезные психиатрические проблемы, что привело к их возможному уходу из клиник [8].
Эпигенетические модификации имеют решающее значение не только для развития и дифференциации, но также и потому, что они возникают в результате изменений окружающей среды, в том числе в рационе и образ жизни [9]. Метилирование ДНК является главным эпигенетическим событием для стабильности экспрессии гена [9]. У крыс материнское воздействие диеты с высоким содержанием жиров (HFD) между поколениями изменяет метилирование ДНК в центральной системе вознаграждения у потомства, что приводит к чрезмерному потреблению HFD щенками [10]. В частности, ДНК-метилтрансферазы (DNMT) играют критическую роль в регуляции как кормового поведения, так и физической активности [10, 11], предполагая, что DNMT могут быть перспективными терапевтическими целями для терапии синдрома ожирения-диабета. Важно отметить, что некоторые натуральные пищевые вещества, включая кофейную кислоту и эпигаллокатехин, как известно, действуют как ингибиторы DNMT [12, 13].
Недавно мы показали, что биоактивный, коричневый специфический для риса компонент γ-оризанол, смесь сложного эфира феруловой кислоты и нескольких фитостеролов, ослабляет предпочтение диетическому жиру за счет снижения напряжения гипоталамуса эндоплазматического ретикулума (ER) [14]. У мышей и кроликов устно вводимый γ-оризанол быстро абсорбировался из кишечника и распределялся главным образом в мозг [15, 16]. Принимая эти данные вместе, натуральные пищевые продукты, действующие на центральную нервную систему, могут быть альтернативой безопасному улучшению нарушенного поведения кормления при ожирении. В этом контексте мы протестировали гипотезу о том, что γ-оризанол изменит статус метилирования ДНК в системе вознаграждения головного мозга, что приведет к ослаблению предпочтения HFD у мышей.
методы
Животные
Семинедельные самцы мышей C57BL / 6J, полученные от Charles River Laboratories Japan (Канагава, Япония), содержались (по 3-4 на клетку) в условиях, свободных от специфических патогенов, при 24 ° C и 12-часовом освещении / 12-часовом освещении. темный цикл. После недели акклиматизации 8-недельных мышей подбирали по весу и разделяли на две или три группы для проведения каждого эксперимента. Мышам был предоставлен свободный доступ к пище и воде. Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Университета Рюкюс (№№ 5352, 5718 и 5943).
Введение γ-оризанола и 5-аза-2'-деоксицитидина
Для оценки предпочтения HFD γ-оризанол (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) вводили мышам 8-недельным путем через зонд во время теста на выбор пищи, как описано ранее [14, 17]. В других экспериментах HFD (D12079B, Research Diets, New Brunswick, NJ, USA), содержащие 0.4% -оризанол, получали в виде гранул. Компоненты рациона показаны в таблице электронных дополнительных материалов (ESM) 1. После 12 недель кормления собирали ткань из полосатого тела и гипоталамуса. Ежедневное потребление гамма-оризанола, рассчитанное по среднему потреблению пищи мышами, составляло приблизительно 320 мкг / г массы тела. Дозы гамма-оризанола определяли, как описано ранее [14]. 5-аза-2'-дезоксицитидин (5-аза-dC; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) вводили внутрибрюшинно (0.25 мкг / г веса тела) три раза в неделю в течение 12 недель [18].
Оценка предпочтения диетического жира
Чтобы оценить предпочтения для диетического жира, тесты на питание предоставили выбор между чау и HFD (D12450B и D12451, Research Diets), как описано ранее [14]. Компоненты диеты показаны в таблице ESM 1. Вкратце, мышам был предоставлен свободный доступ к корму и HFD. Потребление корма и HFD измеряли еженедельно и анализировали на предмет изменения предпочтения диетических жиров. Предпочтение HFD вычислялось по формуле: Предпочтение HFD = [(потребление HFD / общее потребление пищи) × 100].
Бисульфитное секвенирование для метилирования ДНК
ДНК очищали с использованием набора DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokyo, Japan). Раствор ДНК смешивали со свежеприготовленным 3 моль / л NaOH, инкубировали при 37 ° C в течение 15 минут и добавляли 5.3 моль / л мочевины, 1.7 моль / л бисульфита натрия и 4.9 ммоль / л гидрохинона. Раствор подвергали 15 циклам денатурации при 95 ° C в течение 30 с и инкубации при 50 ° C в течение 15 мин [19]. Обработанную бисульфитом ДНК очищали с использованием MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) и амплифицировали с помощью ПЦР с использованием набора для ПЦР KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA) и праймеров вокруг сайта CpG промоторной области D2R , Последовательности праймеров были следующими: прямой праймер, 5'-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 '; обратный праймер, 5'-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 '. Затем были добавлены и очищены последовательности адаптеров с использованием Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Затем образцы собирали и загружали в GS Junior (Roche Diagnostics, Tokyo, Japan) для последовательности в соответствии с протоколом производителя. Уровень метилирования выражали как процент метилированных цитозинов во всех остатках цитозинов.
Анализ активности DNMT
Анализ ферментативной активности DNMT проводили с использованием набора для анализа активности / ингибирования ДНК Methyltransferase ДНК EpiQuik (Epigentek Group, Brooklyn, NY, USA) и набора для анализа EPIgeneous Methyltransferase Assis (Cisbio Japan, Chiba, Japan) в соответствии с протоколами производителя.
Для оценки ингибирующей активности каждого соединения на метилировании ДНК образование S-аденозил-20-гомоцистеин (SAH) измеряли в присутствии каждого соединения (XNUMX мкмоль / л для скрининговых анализов), S-аденозилметионин (SAM; 10 мкмоль / л) и субстрат DNMT (4 нг / мкл) при 37 ° C в течение 90 мин. Для оценки кинетики Михаэлиса-Ментен DNMT1 (20 мкмоль / л) инкубировали с γ-оризанолом, SAM (5 мкмоль / л) и указанной концентрацией поли dI-dC при 37 ° C в течение 90 мин. DNMT3a (100 мкмоль / л) и DNMT3b (100 мкмоль / л) инкубировали с γ-оризанолом, SAM (5 мкмоль / л) и указанной концентрацией poly dG · dC при 37 ° C в течение 120 мин. Анализы проводили в четырех повторностях. Экстрагированный белок (0.75 мг / мл) инкубировали с SAM (5 мкмоль / л), poly dI-dC (5 мкг / мл) и poly dG · dC (5 мкг / мл) при 40 ° C в течение 120 мин, и Было измерено образование SAH.
Анализ активности рецептор-γ, связанный с эстрогеном
Потенциальную антагонистическую активность γ-оризанола в отношении эстроген-связанного рецептора-γ (ERRγ) оценивали с использованием системы анализа гамма-репортера человеческого эстрогенового рецептора (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, репортерные клетки млекопитающих, не относящиеся к человеку, конститутивно экспрессирующие активную ERRγ, подвергали воздействию указанных концентраций каждого соединения в течение 24 часов в трех повторностях.
Вестерн-блоттинг
Это было выполнено, как описано ранее [20] с антителами против D2R (1: 500, кролик), переносчика дофамина (DAT; 1: 500, кролик), тирозингидроксилазы (TH; 1: 1000, кролик) (AB5084P, AB1591P и AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, США), преобразователь сигнала и активатор транскрипции 3α (STAT3α; 1: 1000, кролик), DNMT1 (1: 1000, кролик), DNMT3a (1: 1000, кролик) (№№ 8768, 5032 и 3598; Cell Signaling Technology, Токио, Япония), DNMT3b (1 мкг / мл, кролик), ERRγ (1: 1000, кролик) и β-актин (1: 10,000 16049, мышь) (ab128930, ab6276 и abXNUMX; Abcam, Кембридж, Массачусетс, США).
Количественная ПЦР в реальном времени
Экспрессия гена была исследована, как описано ранее [14]. уровни мРНК были нормированы на Rn18s (18S рРНК). Наборы праймеров, используемые для количественного анализа ПЦР в реальном времени, суммированы в таблице ESM 2.
статистический анализ
Данные выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Там, где это применимо, использовали односторонний дисперсионный анализ ANOVA и дисперсионный анализ с повторными измерениями с последующими тестами множественного сравнения (метод Бонферрони-Данна). Ученики t тест использовался для анализа различий между двумя группами. Различия были признаны значимыми при p <0.05.
Итоги
Фармакологическое ингибирование DNMT с помощью 5-aza-dC уменьшало предпочтение диетического жира у мышей
У мышей, которым вводили HFD, метилирование ДНК в промоторной области D2R в полосатом теле было значительно увеличено по сравнению с мышами, кормившими диету чау-чау (рис. (Fig.1a) .1а). С другой стороны, метилирование гипоталамической ДНК в промоторной области D2R было, по-видимому, выше, чем в полосатом теле под диету чау (p <0.01) (рис. (Fig.1a, 1a, f) и не был изменен HFD (рис. (Fig.1f) .1е). У мышей, получавших HFD, усиленное метилирование ДНК в промоторной области D2R в полосатом теле было нормализовано обработкой 5-aza-dC, мощным ингибитором DNMT (фиг. (Fig.1a) .1а). Напротив, метилирование ДНК в промоторной области D2R в гипоталамусе не было существенно изменено обработкой 5-aza-dC (фиг. (Fig.1f) .1е). В полосатом теле 20-недельных мышей-самцов, получавших HFD в течение 12 недель, уровни мРНК и белка D2R были значительно снижены (рис. (Fig.1b, 1b, k, l). Напротив, уровни рецепторов дофамина D1 (D1Rs, кодируемые Drd1), которые действуют противоположно D2R на аденилатциклазу и цАМФ-опосредованную внутриклеточную сигнализацию, не изменялись (рис. (Fig.1c) .1с). Кроме того, не было изменений в уровнях других молекул, связанных с сигнализацией D2R, таких как TH и DAT на уровне мРНК и / или белка (рис. (Fig.1d, 1d, e, k, m). С другой стороны, никаких явных изменений в гипоталамусе не наблюдалось, в том числе для D2R (рис. (Fig.1g-м) .1г-м). Примечательно, что уровни белка D2R и TH в гипоталамусе были значительно ниже, чем уровни в полосатом теле (рис. (Fig.1l, 1л, м), возможно, отражая относительную важность передачи сигналов дофаминовых рецепторов в системе вознаграждения мозга по сравнению с гипоталамусом.
Чтобы проверить, изменит ли метилирование ДНК в промоторной области D2R предпочтение диетического жира, было проанализировано поведение кормления мышей, обработанных 5-aza-dC. Как и ожидалось, 5-aza-dC значительно увеличивал уровни мРНК и белка для D2R в полосатом теле мышей, получавших HFD (рис. (Fig.1b, 1b, k, l). С другой стороны, не было никакого влияния на уровни Drd1, Th и Slc6a3 (кодирование DAT) в полосатом теле или на уровнях Drd2, Drd1, Th и Slc6a3 в гипоталамусе (рис. (Fig.1c-е, 1c-e, g-m). Принимая во внимание, что мыши, обработанные носителем, предпочли HFD, предпочтение HFD было значительно снижено у мышей, обработанных 5-aza-dC (88% от значений для мышей, обработанных транспортным средством) (рис. (Fig.1n) .1п). Следовательно, лечение с помощью 5-aza-dC уменьшало прирост массы тела (рис. (Fig.11о).
γ-оризанол снижает уровни DNMT в полосатом теле мышей, получавших HFD
Как мы ранее сообщали [14], пероральное введение γ-оризанола мышам-самцам через зонд значительно ослабляло предпочтение HFD (93% от значений для мышей, обработанных транспортным средством) (фиг. (Fig.2a), 2а), что приводит к явному ослаблению прироста массы тела (рис. (Fig.2b) .2б). Поэтому мы исследовали потенциальное влияние γ-оризанола на эпигенетическую модуляцию D2Rs в полосатом теле.
У млекопитающих существуют три основных DNMT - DNMT1, 3a и 3b. DNMT1 поддерживает поддержание метилирования ДНК, в то время как DNMT3a и 3b играют роль в облегчении метилирования ДНК de novo [21]. Чтобы исследовать потенциальное воздействие γ-оризанола на DNMT in vivo, мы оценили уровни DNMT в мозге мышей, получавших HFD. Хотя HFD per se не влиял на уровни мРНК и белка DNMT в полосатом теле или гипоталамусе, добавление γ-оризанола значительно уменьшало уровни DNMT в полосатом теле, но не в гипоталамусе (рис. (Fig.2c-е, 2c-e, g-i, k-n). Эти данные повышают вероятность того, что γ-оризанол может регулировать уровни DNMT в полосатом-специфическом режиме. Аналогичным образом, 5-aza-dC значительно уменьшал уровни мРНК DNMT3a и 3b преимущественно в полосатом теле (ESM Рис. 1объявление).
На основании предыдущего исследования, показывающего, что уровень мРНК DNMT1 был положительно отрегулирован, по крайней мере частично, ядерным рецептором ERRγ [22], мы исследовали потенциальное влияние γ-оризанола на активность ERRγ. В клетках млекопитающих, отличных от человека, конститутивно экспрессирующих активный ERRγ, 4-гидрокситамоксифен, мощный обратный агонист ERRγ, заметно уменьшает активность ERRγ. Следует отметить, что γ-оризанол частично уменьшает активность ERRγ (приблизительно на 40% снижение врожденной величины) (фиг. (Fig.3a) .3а). Важно отметить, что ERRγ был высоко выражен в полосатом теле, но не в гипоталамусе (рис. (Fig.3b-д) .3б-д). Вопреки ситуации для стриатума γ-оризанол значительно увеличивал уровни белка DNMT1 только в гипоталамусе (рис. (Fig.2k, 2k, l). Эти результаты могут быть объяснены, по крайней мере частично, нашим нахождением, что STAT3α, положительный регулятор уровня DNMT1 [23], был обильно выражен в гипоталамусе, но не в полосатом теле (рис. (Fig.33например).
Для дальнейшей оценки воздействия γ-оризанола на активность DNMT in vivo образование SAH, побочного продукта метилирования ДНК, а также мощного ингибитора DNMT, оценивали у мышей, обработанных γ-оризанолом, которым вводили HFD. Существенных изменений в формировании САГ ни в полосатом теле, ни в гипоталамусе между HFD-кормящимися и чау-кормящими мышами (рис. (Fig.2f, 2f, j). Заметно, что γ-оризанол значительно уменьшал образование SAH в полосатом теле (рис. (Fig.2f) 2f), но не в гипоталамусе (рис. (Fig.2j), 2j), что указывает на то, что γ-оризанол может подавлять активность DNMT с помощью стриатум-специфического способа у мышей, получавших HFD.
Ферментативный анализ ингибирующих свойств γ-оризанола для DNMT in vitro
Затем мы оценили влияние γ-оризанола на активность DNMT in vitro. Были оценены ингибирующие потенции γ-оризанола, феруловой кислоты, 5-аза-dC, галоперидола (представитель-антагониста D2R), хинпирола (представительного агониста D2R) и SAH против DNMT. В качестве положительного контроля SAH сильно ослабляла активность DNMT дозозависимым образом (рис. (Fig.4a-е) .4а-е). Как и ожидалось, галоперидол и квинпирол не влияли на активность ДНМТ (ESM Fig. 2). Заметно, что γ-оризанол значительно ингибировал активность DNMT1 (IC50 = 3.2 мкмоль / л), 3a (IC50 = 22.3 мкмоль / л) и 3b (максимальное ингибирование 57%) (рис. (Fig.4d-е) .4д-е). Напротив, ингибирующая активность феруловой кислоты, метаболита γ-оризанола, была значительно ниже, чем ингибирование γ-оризанола (рис. (Fig.44д-е).
Мы дополнительно исследовали ингибирующие свойства γ-оризанола на DNMT. Образование SAH измеряли для оценки ингибирующей активности γ-оризанола на DNMT in vitro. Данные о формировании SAH во время DNMT-опосредованного метилирования ДНК указывают на насыщающую картину кинетики Михаэлиса-Ментена как для присутствия, так и отсутствия γ-оризанола (рис. (Fig.4g-я) .4г-я). В метилировании ДНК, опосредованной DNMT1, анализ Eadie-Hofstee показал, что γ-оризанол не оказывает никакого влияния на V Макс образования SAH (наполнитель, 597 пмоль / мин; γ-оризанол 2 мкмоль / л, 619 пмоль / мин; γ-оризанол 20 мкмоль / л, 608 пмоль / мин), тогда как γ-оризанол, по-видимому, увеличивал K m (наполнитель, 0.47 мкг / мл; γ-оризанол 2 мкмоль / л, 0.67 мкг / мл; γ-оризанол 20 мкмоль / л, 0.89 мкг / мл) (рис. (Fig.4j) .4к). Эти результаты показывают, что γ-оризанол ингибирует DNMT1, по крайней мере, частично конкурентным способом. С другой стороны, для опосредованного DNMT3a- и 3b метилирования ДНК γ-оризанол уменьшал V Макс образования SAH (DNMT3a: наполнитель, 85.3 пмоль / мин; γ-оризанол 2 мкмоль / л, 63.1 пмоль / мин; γ-оризанол 20 мкмоль / л, 42.5 пмоль / мин; DNMT3b: наполнитель, 42.3 пмоль / мин; γ -оризанол 2 мкмоль / л; 28.0 пмоль / мин, γ-оризанол 20 мкмоль / л, 15.0 пмоль / мин) и аналогично K m для этой реакции (DNMT3a: наполнитель, 0.0086 мкг / мл; γ-оризанол 2 мкмоль / л, 0.0080 мкг / мл; γ-оризанол, 20 мкмоль / л, 0.0058 мкг / мл; DNMT3b: наполнитель, 0.0122 мкг / мл; γ- оризанол 2 мкмоль / л, 0.0097 мкг / мл; γ-оризанол 20 мкмоль / л, 0.0060 мкг / мл) (рис. (Fig.4k, 4k, l). Эти результаты показывают, что γ-оризанол ингибирует DNMT3a и 3b по меньшей мере частично неконкурентным образом.
γ-оризанол увеличивает уровни D2R в полосатом теле мышей, получавших HFD
Затем мы проверили возможность того, что γ-оризанол увеличит содержание полосатого D2R через ингибирование DNMT. У мышей, получавших HFD, пероральное введение γ-оризанола значительно уменьшало метилирование стволовых ДНК в промоторной области D2R (рис. (Fig.5a), 5а), тогда как он не делал этого в гипоталамусе (рис. (Fig.5f) .5е). В соответствии с этими данными уровни мРНК и белка D2R были взаимно увеличены (рис. (Fig.5b, 5b, g, k, l). Подобно данным по обработке с помощью 5-aza-dC (рис. (Fig.1), 1), не было никаких очевидных эффектов на уровни РНК и белка Drd1, Th и Slc6a3 (DAT) в полосатом теле, и никакого влияния на уровни Drd1, Th и Slc6a3 в гипоталамусе (рис. (Fig.5c-е, 5c-e, h-k, m).
Предыдущие исследования показали, что уровни D2R и DNMT1 регулируются ER-стрессом и воспалением, по крайней мере частично, через NF-κB [17, 24, 25]. Поэтому мы изучили уровни связанных с ЭР стрессовых и связанных с воспалением генов. Как показано ранее [26], HFD увеличивала экспрессию генов, кодирующих TNF-α (TNFa), моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (MCP-1) (Ccl2), Гомологичный белок C / EBP (Рубить), ER-локализованный DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) и сплайсированной формы X-box-связывающего белка 1 (Xbp1s) в гипоталамусе, но не в полосатом теле (рис. (Fig.6) .6). Примечательно, что добавление HFD с γ-оризанолом значительно уменьшало расширенную экспрессию Ccl2, Рубить, Dnajb9 и Xbp1s исключительно в гипоталамусе, но не в полосатом теле (рис. (Fig.66).
Обсуждение
Основной вывод в настоящем исследовании состоит в том, что γ-оризанол действует как мощный ингибитор DNMT в полосатом теле мышей, тем самым ослабляя, по крайней мере частично, предпочтение HFD посредством эпигенетической модуляции полосатого D2R. В стриатуме у мышей, получавших HFD, уровни D2R были значительно уменьшены, тогда как уровни D1R, TH и DAT не изменялись (рис. (Fig.1b-е, 1b-e, k-m). Эти данные согласуются с представлением о том, что дисрегуляция полосатого D2R играет критическую роль в восприятии продовольственной награды, когда на HFD, что приводит к гедоническому чрезмерному потреблению HFD у тучных животных [3]. В настоящем исследовании лечение мышей, получавших HFD, с помощью 5-aza-dC значительно увеличивало уровни полосатого D2R (рис. (Fig.1b, 1b, k, l), возможно, путем снижения уровня метилирования ДНК в промоторной области D2R (фиг. (Fig.1a), 1а) и, следовательно, ослабляет предпочтение диетическому жиру (рис. (Fig.1n) .1п). Этот вывод также подтверждает критическую роль полосатых D2R в восприятии продовольственной награды, когда на HFD.
Наш анализ in vitro показал, что ингибирующая активность γ-оризанола против DNMT была, по-видимому, более сильной, чем ингибирующая его ферментативная кислота (Fig. (Fig.4d-е), 4d-f), что указывает на важность полной структуры γ-оризанола для его ингибирующего действия на DNMT. У мышей, получавших HFD, наши исследования показывают, что после перорального приема γ-оризанол достигает мозга как полная структура и предпочтительно уменьшает уровни и активность DNMT в полосатом теле с последующим уменьшением метилирования ДНК в промоторной области D2R в полосатом теле. Кроме того, наши исследования in vitro продемонстрировали, что γ-оризанол действует как частичный антагонист против ERRγ, который в основном служит в качестве положительного регулятора для продуцирования DNMT1 [22], и, следовательно, уменьшила активность DNMT1 (рис. (Fig.3a) .3а). Следует отметить, что ERRγ был высоко выражен в полосатом теле, но не в гипоталамусе у мышей (рис. (Fig.3b) .3б). Эти данные свидетельствуют о том, что γ-оризанол может снизить уровень мРНК DNMT1, по крайней мере частично, за счет ингибирования ERRγ. В отличие от стриатума, γ-оризанол не оказывал никакого влияния на уровень D2R в гипоталамусе от мышей, получавших HFD (рис. (Fig.5g, 5g, k, l).
С другой стороны, мы продемонстрировали, что γ-оризанол значительно увеличивает уровни DNMT1 в гипоталамусе, но не в полосатом теле (рис. (Fig.2k, 2k, l). Было показано, что STAT3 увеличивает содержание DNMT1 в злокачественных клетках Т-лимфомы [23]. Примечательно, что мы ранее продемонстрировали, что γ-оризанол значительно увеличивает фосфорилирование STAT3, вызванное лептином, в гипоталамусе от мышей, получавших HFD [14]. Следует также отметить, что STAT3 был существенно выражен в гипоталамусе, но не в полосатом теле у мышей (рис. (Fig.3e-г) .3например). Эти данные заставляют нас предположить, что кажущуюся разницу в действии γ-оризанола на уровни DNMT1 между гипоталамусом и полосатым течением можно отнести, по крайней мере частично, к региональному специфическому содержанию STAT3α и ERRγ в головном мозге мышей ( Инжир. (Fig.3b-г) .3б-г). В совокупности, по-видимому, существует обратная картина экспрессии ERRγ и STAT3α между стриатумом и гипоталамусом у мышей. Поэтому, исходя из наших результатов, разумно предположить, что в полосатом теле, где образование ERR в изобилии, γ-оризанол может предпочтительно снижать уровень мРНК и активность фермента DNMT1 в качестве отрицательного регулятора ERRγ. Напротив, в гипоталамусе, где продукция STAT3 является доминирующей, γ-оризанол может предпочтительно увеличивать уровни DNMT1.
Недавнее исследование показало, что ослабление транскрипции полосатого D2R, индуцированного HFD, приводит к нарушению режима питания [3], что указывает на потенциальную важность ингибирования стриатальных DNMT для лечения ожирения. С другой стороны, в предыдущем исследовании была продемонстрирована возможность того, что статус метилирования ДНК гена 4 рецептора меланокортина, экспрессируемого в конкретных ядрах гипоталамуса, может модулировать трансгенерационные формы ожирения у жизнеспособных желтых мышей agouti [27]. Несмотря на то, что необходимы дальнейшие исследования для выяснения основополагающих механизмов, эти исследования указывают на важность метилирования ДНК, специфичного для тканей и последовательностей, в патофизиологии ожирения, вызванного HFD.
Недавно мы сообщали, что HFD повышал уровень D2R в островках поджелудочной железы мышей [17, 24]. Вероятно, такое увеличение опосредуется, по крайней мере частично, напряжением ER и воспалением через NF-κB, поскольку в промоторной области D2R имеется несколько NF-κB-чувствительных элементов [17, 24]. Кроме того, недавнее исследование показало, что TNF-α и IL-1β увеличивают уровень и активность DNMT1 в жировой ткани у мышей, получавших HFD [25]. Важно отметить, что настоящее исследование показало, что HFD индуцировал ER-стресс и воспаление преимущественно в гипоталамусе, но не в полосатом теле (рис. (Fig.6) .6). Глубокие механизмы тканевой, регионарной и сайт-специфической метилирования и деметилирования ДНК в нашей экспериментальной парадигме должны ждать дальнейшего изучения.
Вместе с нашим предыдущим сообщением, показывающим, что γ-оризанол ослабляет предпочтение HFD посредством гипоталамической регуляции ER-стресса у мышей [14], γ-оризанол также представляет собой уникальное свойство улучшать как гедоническую, так и метаболическую дисрегуляцию поведения кормления. Поскольку некоторые лекарственные средства против ожирения, которые были разработаны, как известно, вызывают критические побочные эффекты [8], ожидается, что естественный пищевой подход к системе вознаграждения мозга будет безопасно лечить синдром ожирения-диабета [16]. В этой парадигме γ-оризанол является перспективным кандидатом против ожирения, обладающим особым свойством быть эпигенетическим модулятором.
Благодарности
Мы благодарны С. Окамото (Университет Рюкюса, Япония) за рассмотрение рукописи. Мы благодарим М. Хирату, Х. Канеширо, И. Асато и К. Ногучи (Университет Рюкюса, Япония) за секретарскую помощь.
Сокращения
| 5-аза-ПСТ | 5-аза-2'-дезоксицитидин |
| D1R | Дофамин D1 рецептор |
| D2R | Дофамин D2 рецептор |
| DAT | Транспортер допамина |
| DNMT | ДНК-метилтрансфераза |
| ER | Эндоплазматической сети |
| ERR | Эстрогеновый рецептор |
| HFD | Диета с высоким содержанием жиров |
| SAH | S-Adenosyl-L-гомоцистеин |
| SAM | S-Аденозилметионин |
| STAT3α | Преобразователь сигналов и активатор транскрипции 3α |
| TH | Тирозингидроксилаза |
Заметки
Доступность данных
Наборы данных, сгенерированные и / или проанализированные в ходе текущего исследования, доступны от соответствующего автора по разумным запросам.
Финансирование
Эта работа была частично поддержана грантами в помощь от Японского общества содействия науке (JSPS, KANENHI Grant Numbers 15K19520 и 24591338), Совета по науке, технологиям и инновациям (CSTI), Программы межконфессиональных стратегических инноваций (SIP) «Технологии для создания сельского хозяйства, лесного хозяйства и рыболовства следующего поколения», Фонда Лотте, Японского фонда прикладной энзимологии, организации по разработке новых энергетических и промышленных технологий (NEDO), проекта создания сети наук о жизни (Pharmaceutical Field ) (Префектура Окинава, Япония) и проект продвижения медицинской кластеризации префектуры Окинава, Япония, а также грант от префектуры Окинава для продвижения продвинутой медицины (префектура Окинава, Япония).
Двойственность интересов
Авторы заявляют, что нет двойственности интересов, связанных с этой рукописью.
Отчет о взносах
CK и HM разработали исследование. CK и TK провели эксперименты и проанализировали данные. TK, CS-O, CT, MT, MM и KA способствовали интерпретации данных. CK и HM написал рукопись. Все авторы способствовали интерпретации данных. Все авторы присоединились к пересмотру рукописи и утвердили ее окончательную версию. HM является гарантом этой работы, имеет полный доступ ко всем данным и несет полную ответственность за целостность данных и точность анализа данных.
Сноски
Электронный дополнительный материал
В онлайн-версии этой статьи (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) содержится рецензируемый, но неотредактированный дополнительный материал, доступный авторизованным пользователям.
Рекомендации
;
