Инсулин активирует инсулиновые рецепторы (InsRs) в гипоталамусе для подавления сытости после еды. Тем не менее, рост заболеваемости ожирением, что приводит к хронически повышенным уровням инсулина, подразумевает, что инсулин может также действовать в мозговых центрах, которые регулируют мотивацию и вознаграждение. Мы сообщаем здесь, что инсулин может усиливать действие потенциально-зависимого дофамина (DA) высвобождения в ядре accumbens (NAc) и хвостато-putamen через косвенный механизм, который включает половые холинергические интернейроны, которые экспрессируют InsRs. Кроме того, две разные хронические диетические манипуляции у крыс, ограничение питания (FR) и обезогенная диета (ОВ), напротив, изменяют чувствительность стриатального DA-выделения к инсулину, с повышенной отзывчивостью в FR, но потеря реакции в OB. Поведенческие исследования показывают, что интактные уровни инсулина в оболочке NAc необходимы для получения предпочтения вкуса парного раствора глюкозы. Вместе эти данные подразумевают, что полосатая инсулиновая сигнализация усиливает высвобождение DA, чтобы влиять на выбор продуктов питания.

Хорошо известно, что устойчивое увеличение плазменного инсулина во время и после еды активирует рецепторы инсулина (InsRs) в гипоталамусе, что обеспечивает отрицательную обратную связь с аппетитными схемами, которые уменьшают дальнейшее питание^{1, 2, 3}, Мозговый инсулин получают в основном из панкреатических β-клеток с активным переносом из плазмы в мозг в гематоэнцефалический барьер^{4, 5, 6, 7, 8}, хотя есть все больше свидетельств синтеза и высвобождения нейронального инсулина, а также^{1, 9}, Примечательно, что выражение InsRs не ограничивается гипоталамусом, хотя функция экстра-гипоталамических InsRs остается неразрешенной^{1, 2, 3}, Учитывая рост заболеваемости ожирением и диабетом типа II, при котором уровни циркулирующего инсулина постоянно повышаются, а перенос инсулинов мозга и чувствительность рецепторов снижаются^{3, 8, 10, 11}, важно понимать функцию инсулина в областях мозга, которые регулируют мотивацию и вознаграждение. Области мозга, представляющие особый интерес, включают ядро ​​accumbens (NAc), которое опосредует полезные эффекты как пищи, так и наркотиков^{12, 13}, и каудат-putamen (CPu), который играет роль в привычном поведении и тяге¹³, InsRs выражены во всех этих областях, причем самая высокая плотность, встречающаяся в NAc^{3, 14}; InsRs также экспрессируются нейронами допамина (DA) в среднем мозге, в том числе в брюшной тегментальной области (VTA) и substia nigra pars compacta (SNc)¹⁵, Уровни мозгового инсулина пропорциональны концентрациям плазменного инсулина и ожирению тела^{6, 7, 8}, что приводит к гипотезе о том, что инсулин может воздействовать на InsRs в этих областях мозга, чтобы влиять на награду за питание^{3, 16, 17}.

Предыдущие исследования в полосатых синаптосомах, гетерологичных клетках, срезах мозга и в естественных условиях показали, что инсулиновая активация InsR приводит к увеличению поглощения DA транспортером DA (DAT)^{18, 19, 20, 21, 22, 23}, Этот процесс включает в себя путь передачи сигналов киназы PI3^{19, 20}, и приводит к введению DAT в плазматическую мембрану¹⁹, Циркулирующие уровни инсулина динамически модулируют полосатую DAT-активность с уменьшенным поглощением DA и поверхностной экспрессией DAT, наблюдаемой на животных моделях диабета и после ограничения питания (FR)^{20, 21}, Показано, что инсулинзависимое увеличение активности DAT снижает вызванную внеклеточную концентрацию DA ([DA]_o) в VTA²³, что отражает сдвиг в балансе между выбросом и поглощением DA. В соответствии с установленной ролью инсулина в сытости, острая микроинъекция инсулина в VTA может снизить продовольственную награду^{23, 24}, тогда как мыши, лишенные InsRs в VTA и SNc DA нейронах, показывают увеличение потребления пищи и ожирение²⁵, Хотя инсулин может вызывать долговременную депрессию возбуждающего воздействия на нейроны VTA DA²⁴, снова согласующийся с ролью в сытости, воздействие инсулина также может увеличить скорость обжига нейронов DA, ​​возможно, путем уменьшения выделения DA и опосредуемого ауторецептором ингибирования²⁵, Таким образом, чистый эффект инсулина на стригальный выброс DA трудно предсказать. Действительно, результаты исследований влияния инсулина на стригальный выброс DA в бывших естественных условиях ломтики¹⁹ и влияние локального микроинъекции инсулина в NAc на питание²⁶ кажутся противоречивыми. Чтобы решить эту проблему, мы оценили выброс и поглощение аксонального DA в интактном микроокружении NAc и CPu в бывших естественных условиях полосатые срезы с использованием циклической вольтамперометрии с быстрым сканированием (FCV) и определяли влияние передачи сигналов инсулина в NAc на поведение вознаграждения в естественных условиях.

Наши исследования показывают, что первичный эффект инсулина в NAc и CPu заключается в увеличении высвобождения DA, несмотря на одновременное увеличение поглощения DA. Эта динамическая регуляция высвобождения DA включает в себя инсулинозависимое увеличение возбудимости половых холинергических интернейронов (ChIs), что приводит к усиленному высвобождению DA путем активации рецепторов никотиновых ацетилхолина (ACh) (nAChRs). Влияние инсулина на ChIs и на выброс DA опосредовано InsRs. Примечательно, что эффект инсулина на высвобождение DA усиливается в срезах от крыс FR, но притупляется у крыс на обезогенной (ОВ) диете. Эти данные показывают усиление высвобождения DA в бывших естественных условиях фрагменты инсулина приводят к предсказанию того, что инсулин может действовать как сигнал награды в естественных условиях, Действительно, параллельные поведенческие исследования демонстрируют роль инсулина в оболочке NAc при кондиционировании вкусовых предпочтений. Вместе эти данные указывают на новую роль инсулина в качестве сигнала награды, который может влиять на выбор пищи

Инсулин, действующий на InsRs, увеличивает вызванный стригальный выброс DA

Первоначальное исследование локально вызванного [DA]_o контролируется FCV в бывших естественных условиях полосатые ломтики крыс с вволю (AL) доступ к пище и воде показал неожиданный вывод о том, что острое применение инсулина в различных физиологически значимых концентрациях^{1, 4} увеличенный одноимпульсный [DA]_o (Рис. 1a-c), с инсулином ЕС₅₀ значения (концентрация, при которой эффект был полумаксимален) 2-12 nM (Рис. 1b). Увеличенный вызванный [DA]_o было особенно удивительно, учитывая, что это сопровождалось значительным увеличением максимальной скорости (V_Макс) для DAT-опосредованного поглощения в каждом субрегионе (Таблица 1), что приведет к конкурирующему снижению вызванного [DA]_o, как сообщалось ранее^{22, 23}, Вместо этого мы обнаружили, что вызванные [DA]_o был максимально усилен 20-55% 30 nM инсулином; область с наибольшим пропорциональным эффектом была оболочкой NAc, которая представляет собой полосатую субрегион с наивысшей экспрессией InsR^{1, 14}, Ломтики, подвергнутые инсулину 30 nM в идентичных условиях, не показали изменений в содержании стриата DA (Дополнительный рисунок 1a), подразумевая, что инсулин изменяет динамическую регуляцию высвобождения, а не просто регулирует синтез DA. Примечательно, что эффект инсулина на вызванный [DA]_o был потерян в супрафизиологических концентрациях ≥100 nM (Рис. 1b). Это не было результатом увеличения активности DAT, обгоняющего высвобождение, поскольку влияние инсулина на V_Макс также терялась при этих концентрациях (Таблица 1). В целом, эти данные показывают, что в интактном полосатом микроокружении преобладающий эффект инсулина на вызванный [DA]_o заключается в увеличении выпуска, несмотря на одновременное увеличение потребления DA.

  

  

(a) Среднее одноимпульсное [DA]_o в оболочке NAc, NAc и CPu до и после инсулина (Ins), показанного для 30 nM; ошибки опущены, но см. (b); стрелки указывают время стимула. Повышенный уровень инсулина [ДА]_o в оболочке (по 55 ± 10%), ядро ​​(по 37 ± 5%) и CPu (по 20 ± 4%) (***P<0.001). (b). Влияние инсулина зависит от концентрации в физиологическом диапазоне (1-30 nM) в оболочке (n= 22-24, F_5,133= 14.471, P<0.001), ядро ​​(n= 36-76, F_5,308= 16.318, P<0.001) и CPu (n= 30-62, F_5,253= 13.763, P<0.001), но потеряна при ≥100 нМ. (c) Репрезентативные записи пиковых сигналов [DA]_o по сравнению с временем в одном месте в ядре NAc при отсутствии применения лекарственного средства (Con) во время применения инсулина (30 nM) или при применении инсулина в присутствии ингибитора InsR HNMPA (5 мкМ). (d) Средняя пиковая частота [DA]_o данные, свидетельствующие о предотвращении влияния инсулина (30 nM) на HNMPA, антагониста InsR S961 (1 мкМ) и ингибитора PI3K LY294002 (1 мкМ), но не ингибитора IGF-1R PPP (1 мкМ) (n= 29-76; P> 0.9 по сравнению с одним инсулином). За Рис. 1a-d, n= количество сайтов на каждый субрегион от крыс 3-6 для каждого препарата или концентрации инсулина; односторонний ANOVA, Tukey честное значение теста (HSD). Увидеть Дополнительный рисунок 1b, c для данных NAc shell и CPu.

• Изображение полного размера (98 KB)

 

 

Поскольку инсулин может также действовать на рецепторы 1-рецептора с инсулиноподобным фактором роста (IGF-1R), хотя и в концентрациях, превышающих 100 nM (ref. 1), мы стремились подтвердить, что усиливающий эффект инсулина на вызванный [DA]_o была зависимой от InsR. Это подтвердилось, поскольку эффект был предотвращен внутриклеточным ингибитором InsR, гидрокси-2-нафталинилметилфосфоновой кислотой (HNMPA) и антагонистом InsR, S961, но не селективным ингибитором IGF-1Rs, пикоподофиллином²⁴ (ППС; Рис. 1c, d и Дополнительный рисунок 1b, c). Затем мы рассмотрели участие PI3 киназы, которая инициирует сигнальный путь, ответственный за инсулинзависимую регуляцию DAT¹⁹, При концентрации 1 мкМ ингибитор P13K LY249002 сам по себе не влиял на пик-вызванный [DA]_o or V_Макс (n= 29-76-сайты (ядро NAc) на один препарат, P> 0.05, односторонний дисперсионный анализ (ANOVA); данные не показаны), но предотвращает действие инсулина на вызванный [DA]_o во всех полосатых субрегионах (Рис. 1d и Дополнительный рисунок 1b, c).

Локализация InsRs на DA-аксонах и ChIs

Наблюдаемое увеличение V_Макс для поглощения DA с физиологическими уровнями инсулина подразумевается наличие InsRs на DA-аксонах, как и предыдущие результаты в различных полосатых препаратах^{18, 19, 20, 21, 22}, Хотя была продемонстрирована функциональная экспрессия InsRs на нейронах среднего мозга DA^{15, 23, 24, 25}, Экспрессия InsR на стригальных DA-аксонах не сообщается. Мы обратились к ней с использованием иммуногистохимии. Плотная InsR-иммунореактивность во всей ограниченной полосатой количественной оценке локализации InsR на DA-аксонах, которые были идентифицированы иммунореактивностью для DA-синтезирующего фермента, тирозингидроксилазы (TH). Поэтому мы приняли ранее сообщенный протокол²⁷, который включал подсчет InsR puncta, который перекрывался с профилями TH + в режиме обычного изображения и снова подсчитывался после того, как изображение InsR было повернуто только 90 °. Если кажущееся перекрытие профилей InsR и TH + было неспецифичным, эта процедура должна приводить к статистически подобным подсчетам, является ли нормальный или 90 ° неактивным. Однако этот анализ показал уменьшение перекрытия InsR puncta с профилями TH + 14 ± 9% (n= 42 полей, P<0.01, парный двусторонний t-тестовое задание; данные не показаны), подтверждающие присутствие InsR на DA-аксонах. Однако более интригующе, однако, InsR-иммунокалибровка полосатого тела выявила отчетливую экспрессию InsR на больших клеточных телах, которые были идентифицированы как стригальные ChIs путем совместного иммуноблока для холин-ацетилтрансферазы (ChAT), первичного фермента, необходимого для синтеза ACh. Использование электрофизиологических критериев²⁸ для идентификации ХИ в предварительных исследованиях цельной клетки, несколько нейронов были заполнены биоцитином и затем обработаны для иммуногистохимии; все из них (4 / 4) были иммуноположительными как для InsR, так и для ChAT (Рис. 2a). Последующая оценка со-локализации InsR и ChAT в NAc подтвердила, что практически все нейроны ChAT + выражены InsR (96%; n= 27 / 28 нейронов в четырех срезах от двух крыс).

  

  

(a) ChI, заполненный биоцитином, затем иммуноблоттинг для ChAT и InsR (представитель XIUMX / 4, заполненных биоцитином); объединенное изображение показывает совместную локализацию; масштабная шкала, 4 мкм. (b–e) Реакция стриатальных ИП на серию деполяризующих импульсов тока (длительность 3, 200, 300 и 400 pA, интервалы 120) до и после инсулина (30 nM). (b) Адаптация частоты спайка в ЧИ (верхняя) наблюдается при разрыве потенциала потенциального потенциала (АР) во время инъекции тока, тогда как пик сохраняется во всем импульсе тока в инсулине (ниже); полный набор данных, показанный в d, (c) Типичный временной курс индуцированного инсулином увеличения числа AP с каждым этапом для ChI в b, (d) Резюме номера AP во время импульсов тока, переданных до и при максимальном эффекте воздействия инсулина (n= 21 парные стимуляции, нейроны 7, крысы 5) (e) Средние ответы, показывающие действие инсулина (+ Ins) в условиях контроля (Con; n= 21 парные стимуляции, нейроны 7, ***P<0.001, парный двусторонний t-тест), в присутствии HNMPA (5 мкМ) (n= 12 парные стимуляции, нейроны 4, крысы 4, P>0.05, парный двухсторонний t-тест) и в присутствии PPP (1 мкМ) (n= 18 парные стимуляции, нейроны 6, крысы 6, **P<0.01, Wilcoxon, сопоставленная пара, подписанная оценка ранга). (f) Среднее одноимпульсное [DA]_o в ядре NAc до и после инсулина (30 nM) в мекамиламинах (Mec; 5 мкМ) или DHβE (1 мкМ), нормированном на контроль пика 100%n= Сайты 20-40 на каждый субрегион для каждого состояния у крыс 3-4, P> 0.05 по сравнению с контролем, непарные t-тестовое задание). (g) Среднее одноимпульсное [DA]_o в срезах переднего мозга от гетерозиготного контроля (Het) и ХАТ KO до и после инсулина (30 nM), нормированный на контрольный пик 100%. Повышенный уровень инсулина [ДА]_o у гетерозиготных мышей 190 ± 23% в оболочке NAc, 140 ± 8% в ядре NAc и 137 ± 12% в CPu (n= 15-25 сайтов на каждый субрегион от 3-4 мышей на генотип **P<0.01, ***P<0.001 по сравнению с контролем без пары t-test), но не повлиял на вызванный [DA]_o в любой полосатой субрегионе ХАТ KO мышей (P> 0.1).

• Изображение полного размера (167 KB)

 

 

Инсулин увеличивает возбудимость ChI

Чтобы проверить функциональность InsRs на стригальных ChIs, мы исследовали влияние инсулина на возбудимость ChI, используя запись цельного клеточного тока. Экспрессивность ChI оценивали с использованием серии импульсов деполяризующего тока 3, чтобы выявить потенциал действия поезда, который надежно обнаруживал адаптацию частоты спайка (Рис. 2b), часто с потерей пика по окончании текущего импульса. Поразительно, что инсулин (30 nM) ослабляет адаптацию частоты спайков, что приводит к постепенному увеличению количества потенциальных потенциалов действия во времени (Рис. 2c), с максимальным увеличением (Рис. 2d, e), обычно наблюдаемый между 20 и 50 минусом воздействия инсулина. В отсутствие инсулина контроль ChIs не показал изменения количества вызванных потенциалов действия (P> 0.05, парный двусторонний t-тестовое задание; данные не показаны); по сравнению с контрольными нейронами, контролируемыми за тот же промежуток времени, нейроны, подвергшиеся воздействию инсулина, показали значительно большее изменение количества вызванных потенциалов действия (контроль n= Пары стимулов 12 из четырех нейронов, инсулина n= Пары стимулов 21 из семи нейронов, F_1,25= 5.63, P<0.05, двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA со смешанными измерениями; данные не показаны). Действие инсулина на увеличение числа потенциалов действия предотвращалось HNMPA, но не селективным ингибитором IGF-1R PPP (Рис. 2e), демонстрируя, что повышенная возбудимость ЦИ инсулином была опосредована InsR.

Улучшение инсулина вызванного [DA]_o требует nAChRs и ACh

Предыдущие исследования показали, что ChIs и ACh эффективно регулируют полосатый DA-релиз через nAChRs на DA-аксонах^{29, 30, 31, 32, 33, 34}, Обильная экспрессия InsR на ChIs и усиление возбудимости ChI, наблюдаемое при остром воздействии инсулина, показало, что эти нейроны могут быть новыми мишенями для инсулина, которые могут привести к усиленному высвобождению DA. Чтобы проверить это, мы исследовали влияние инсулина в присутствии мекамиламина, неселективного антагониста nAChR или дигидро-β-эритроидина (DHβE), селективного антагониста для субъединиц, содержащих β2 (β2 *) nAChR, которые обогащены DA-аксоны³⁵, Вызванный [DA]_o был легко обнаружен в присутствии этих антагонистов, хотя оба препарата уменьшали амплитуду однократного (DA)_o (например, 13-26% в ядре NAc), как сообщалось ранее^{29, 30, 31, 32}, В поддержку роли ACh и nAChRs эффект инсулина на вызванный [DA]_o был предотвращен либо мекамиламином, либо DHβE (Рис. 2f). Чтобы подтвердить участие трансахаридной ACA-сигнальной передачи в увеличенном высвобождении DA, индуцированном инсулином, мы исследовали влияние инсулина в бывших естественных условиях полосатые срезы от мышей, в которых экспрессия ChAT была генетически удалена в структурах переднего мозга (передний мозг ХАТ KO), включая стриатум³², Несмотря на то, что у этих мышей нет интактных соединений, синтез ACh отменяется, что приводит к уменьшению, но все еще легко обнаруживаемому однократно импульсным [DA]_o, как описано ранее³², У контрольных гетерозиготных однопометников инсулин (30 nM) увеличивал вызванный [DA]_o в оболочке NAc и ядре и в CPu на 37-90% (Рис. 2g), превышающее усиление, наблюдаемое в стриатуме крысы (например, Рис 1). Однако эффект инсулина на вызванный [DA]_o отсутствовал во всем полосатом комплексе в переднем мозге ХАТ KO, демонстрируя, что инсулин-опосредованное усиление высвобождения DA требует стриатального ACh, но не со-освобожденные передатчики от ChIs, такие как глутамат³⁶.

Влияние инсулина на вызванное [DA]_o зависит от диеты

Концентрация инсулина в плазме и головном мозге пропорциональна ожирению тела^{6, 7, 8}, и может привести к компенсаторным изменениям чувствительности мозга к инсулину. Поэтому мы проверили гипотезу о том, что диета влияет на способность инсулина стимулировать высвобождение DA, используя полосатые ломтики крыс, поддерживаемых либо хронической диетой FR, либо OB в сравнении с контролем AL. Как и ожидалось, уровни инсулина в плазме коррелировали с массой тела с более низким инсулином в FR, чем у крыс AL или OB (Рис. 3a и Таблица 2). Несмотря на эти различия в циркулирующем инсулине, пик-вызванный [DA]_o в оболочке и сердечнике NAc, а CPu был значительно ниже в бывших естественных условиях полосатые ломтики обеих групп диеты по сравнению с AL (Рис. 3b и Дополнительный рисунок 2 a, b), подразумевая, что факторы, помимо инсулина, регулируют абсолютное вызванное [ДА]_o, Содержание стриатат DA не отличалось от диетических групп, что указывало на изменение регуляции высвобождения, а не на синтез DA (Дополнительный рисунок 2c). В соответствии с изменением динамического регулирования чувствительность к выделению полосатого DA для инсулина была сильно зависит от диеты. У крыс FR концентрация инсулина ≤1 nM, которая не оказывала влияния на AL (Рис. 1b), увеличенный вызванный [DA]_o (Рис. 3c), что отражает повышенную чувствительность к инсулину, с EC₅₀ значения в FR striatum (0.4-0.6 nM), которые были примерно на порядок ниже, чем в AL (сравните Рис. 1b и 3c). В поразительном контрасте эффект инсулина был потерян в ОВ стриатуме; даже 30 nM инсулин, который имел максимальный эффект в AL striatum (Рис. 1b), не влияло на OB (Рис. 3c).

  

  

(a) Концентрация плазменного инсулина положительно коррелирует с массой тела в группах питания (R= 0.76). (b) Среднее одноимпульсное [DA]_o в ядре NAc (см. Дополнительный рисунок 2a, b для оболочки NAc и CPu) была ниже в FR (38 ± 4%) и OB (25 ± 4%) по сравнению с AL (n= Сайты 50-60 от крыс 5-6 на группу диеты, F_2,156= 23.337, односторонний ANOVA, Tukey HSD; ***P<0.001); OB против FR (P<0.08). (c) Чувствительность вызванного [DA]_o к инсулину повышали в FR, но теряли в OB (n= 21-49 на одну субрегион на концентрацию от крыс 2-4 на одну группу диеты, односторонний ANOVA, Tukey HSD), с большей чувствительностью к FR у крыс AL во всех субрегионах (P<0.001 для каждого региона; двусторонний дисперсионный анализ; ЦПУ: F_{(conc × diet, 3,286)}= 10.253; ядро: F_{(conc × diet, 3,353)}= 6.166; ракушка: F_{(conc × diet, 3,195)}= 10.735).

• Изображение полного размера (124 KB)

 

 

Эти данные предполагают обратную связь между полосатой чувствительностью InsR и ожирением тела. Альтернативно, однако, эти различия, зависящие от диеты, могут отражать измененную чувствительность nAChR. Поэтому мы определили реакцию концентрации никотина в ядре NAc из каждой группы диеты. Никотин вызывает десенсибилизацию nAChR, которую можно количественно оценить путем сравнения отношения [DA]_o вызванный короткой поездкой из пяти импульсов на 100 Гц с одноимпульсным [DA]_o (5 p: 1 p ratio) в качестве индекса активации / десенситизации nAChR^{30, 31}, Используя этот подход, мы не обнаружили различий между группами диеты в чувствительности nAChR в ядре NAc (Дополнительный рисунок 3a-c). Кроме того, контроль соотношения 5 p: 1 p не отличался среди групп диеты в ядре NAc (Дополнительный рисунок 3d) или CPu (не показано), подразумевая, что диета не изменяет регуляцию высвобождения DA, зависящую от NACHR. Таким образом, полосатая чувствительность InsR, по-видимому, усиливается у FR против крыс AL, но отсутствует у крыс OB с потерей регуляции выпадения полосатого DA при физиологических концентрациях инсулина.

Инсулин оболочки NAc модулирует условный ароматизатор

Пищевые предпочтения генерируются как до, так и послепроникающими факторами; механизмы для каждого из них не полностью решены, но текущие данные подразумевают передачу сигналов NAc DA в обоих^{37, 38}, Учитывая, что уровни инсулина в плазме и цереброспинальной жидкости (CSF) быстро растут после периферического повышения уровня глюкозы⁶, и что увеличение инсулина в полосатом теле может быть обнаружено в течение 5 мин повышения плазменного инсулина⁷, логично предположить, что высвобождение периферического инсулина во время еды может улучшить высвобождение NAc DA и способствовать механизмам стимуляции после приема внутрь. Мы адаптировали ранее описанный протокол предпочтения вкуса³⁷ с сахарин-подслащенными растворами глюкозы у крыс, чтобы проверить гипотезу о том, что блокирование эффекта эндогенного инсулина путем локального применения инсулинового антитела (InsAb) в NAc уменьшит предпочтение парного аромата. Эффективность InsAb в блокировании эффектов инсулина была протестирована в в пробирке анализ поглощения DA в полосатые синаптосомы. Инсулин (30 nM) вызвал значительное увеличение V_Макс в синаптосомах из NAc или CPu (Дополнительный рисунок 4), в соответствии с нашими V_Макс данные из полосатых срезов (Таблица 1) и с предыдущими исследованиями^{18, 19, 20, 21, 22, 23}, В отсутствие инсулина ни InsAb, ни контрольный антитело иммуноглобулин G (IgG) не изменяли V_Макс для восприятия DA и контроля. В присутствии IgG инсулин все еще вызывал значительное увеличение V_Макс; однако, влияние инсулина на V_Макс был потерян в присутствии InsAb (Дополнительный рисунок 4).

Чтобы свести к минимуму повреждение тканей и сохранить чувствительность тканевой мишени, были испытаны две группы испытуемых, в которых мы чередовали интра-NAc-микроинъекцию с помощью макетной микроинъекционной процедуры, вместо того, чтобы использовать одну группу испытуемых и спаривать один ароматизированный раствор с InsAb, а другой с транспортное средство. Следовательно, во время сеансов с одной бутылкой экспериментальная группа получала микроинъекции InsAb в сочетании с одним из двух ароматов, а на чередующихся сеансах - ложные микроинъекции в паре с другим ароматом (Рис. 4a, оставил). Контрольная группа получала ложные микроинъекции, чередующиеся с микроинъекциями либо фосфатно-буферного солевого раствора (PBS), либо IgG. Оба ароматизированных раствора содержали глюкозу во время кондиционирования. В группе, контролирующей микроинъекцию, не ожидалось дифференцированного предпочтения между вкусами, в то время как предпочтение отдается предпочтению макетному вкусовому микроинъекционному аромату в группе MicroInjected от InsAb.

  

  

(a) Диаграмма, иллюстрирующая кондиционирования в одной бутылке (слева) и тест с двумя бутылками (справа). (b) Объем потребляется (мл) во время сеансов кондиционирования с одной бутылкой. Существовало значительное взаимодействие между сеансом кондиционирования инфузии и микроинъекционной обработкой (n= 19-20 крысы на группу, F_(3,111)= 3.088, P<0.05, 2 × 4 смешанный ANOVA с повторными измерениями во время сеанса инфузии-кондиционирования). Микроинъекция InsAb значительно снизила потребление по сравнению с контролем во время третьего (t(40) = 3.026, **P<0.01) и четвертый (t(40) = 3.052, **P<0.01, защищенный односторонний t-тестами) вливаний. Макеты инъекций не влияли на потребление в обеих группах (F_3,111= 1.110, 2 × 4 смешанный ANOVA с повторными мерами на сеансе кондиционирования). (c) Объем, потребляемый во время тестирования вкуса с двумя бутылками. Существовало значительное взаимодействие между вкусом и микроинъекционной обработкой при кондиционировании (F_1,37= 5.36, P<0.05, двухфакторный смешанный дисперсионный анализ с повторными измерениями вкуса). Группа InsAb потребляла значительно меньше вкуса с парным InsAb по сравнению с парным имитационным ароматом (t(18) = 2.82, **П<0.01, защищенный односторонний t-тестовое задание); контрольная группа не показала предпочтения вкуса (t(19) = 0.803, P> 0.05, защищенный t-тестовое задание). Сравнивая группы, крысы InsAb пили значительно меньше от инфузионно-парного вкуса (t(40) = 1.96, *P<0.05) и значительно больше вкусовых добавок (t(40) = 1.77, *P<0.05, защищенный односторонний t-test), чем элементы управления.

• Изображение полного размера (161 KB)

 

 

Во время сеансов кондиционирования с одной бутылкой микроинъекция InsAb значительно уменьшала потребление по сравнению с транспортным средством в течение третьего и четвертого вливаний (Рис. 4b). Напротив, обе группы потребляли один и тот же объем решения во время всех четырех сеансов инъекции инъекций (F_3,111= 0.127, P>0.05, смешанный двухсторонний ANOVA) (Рис. 4b). После проведения в общей сложности восьми сеансов кондиционирования предпочтение отдается предпочтениям в двухбуквенном тесте, в котором крысы имели доступ одновременно к ароматизированным растворам (например,Рис. 4a). Статистический анализ показал значительное взаимодействие между вкусом и микроинъекционной обработкой, полученной во время кондиционирования (Рис. 4c). Группа InsAb потребляла значительно меньше аромата, совместимого с InsAb, по сравнению с ароматизированным ароматом (Рис. 4c), тогда как группа транспортных средств не проявила предпочтения вкуса (Рис. 4c), подразумевая, что интактная инсулиновая сигнализация способствовала выбору сладкого калорийного раствора. По сравнению с транспортным средством крысы InsAb-microinjected выпивали значительно меньше аромата, вбиваемого в инфузию, и значительно больше аромата с матовым инъекционным соединением (Рис. 4c). Микроинъекция IgG (t(9) = 0.792. P>0.05, защищенный t-тестами) или PBS (t(9) = 0.442. P>0.05, защищенный t-тесты) не повлияли на предпочтение вкуса (данные не показаны), утверждая, что неспецифический эффект микроинъекции InsAb уменьшает потребление или предпочтение вкуса. Следует также отметить, что предпочтение группы InsAb при тестировании не является предпочтительным для менее романтичного вкуса, так как не было взаимодействия между сеансом и типом сеанса (фактическая инфузия против ложной инфузии) для группы InsAb (F_3,54= 1.584, P> 0.05, двусторонний дисперсионный анализ). То есть группа InsAb не потребляла больше ароматизатора, связанного с имитацией настойки, по сравнению с ароматизатором, объединенным в парную инфузию InsAb; скорее, различия между группами лечения проявлялись только во время сеансов инфузионного кондиционирования. В целом эти данные показывают, что инсулин в NAc играет роль в усилении предпочтения вкуса, который сигнализирует о гликемической нагрузке.

Мы сообщаем здесь, что инсулин усиливает стригальное высвобождение DA в зависимом от nAChR способе путем модуляции возбудимости ChI через InsRs. Наши результаты предполагают, что инсулин может служить сигналом вознаграждения в дополнение к его установленной роли в сигнальной сытости. Примечательно, что влияние инсулина на высвобождение DA модулируется диетой, с заметно повышенной чувствительностью к инсулину после FR, но полная потеря усиленного инсулином регуляции на диете OB. Эти изменения, по-видимому, отражают изменения чувствительности InsR, которые обратно связаны с циркулирующими уровнями инсулина, учитывая, что уровни инсулина в плазме оказались зависимыми от диеты, но чувствительность nAChR не была. Наконец, наши исследования вкусовых предпочтений у собак, ведущих поведение, подразумевают, что сигнализация инсулина в оболочке NAc влияет на предпочтение пищи, что не только подразумевает инсулин в обучении, связанное с питанием, но также подтверждает его роль в качестве сигнала награды.

Сеть [DA]_o отражает баланс между выпуском DA и поглощением DA через DAT. Предыдущие данные, свидетельствующие о том, что инсулин может регулировать активность DAT^{18, 19, 20, 21, 22, 23} привело к прогнозированию того, что увеличение инсулина должно приводить к чистому уменьшению вызванного [DA]_o через увеличенное поглощение DA. Однако мы обнаружили, что в полосатом теле эффект инсулина более сложный, чем этот. Хотя воздействие инсулина увеличилось V_Макс для DAT основной эффект инсулина был на выброс DA, а не на поглощение DA, с последовательным увеличением вызванного [DA]_o через физиологический диапазон концентраций инсулина в оболочке и сердцевине NAc и в CPu. Хотя увеличение вызванного [DA]_o вернулась к контрольным уровням при сверхфизиологической концентрации 100 nM, V_Макс также не изменилось из-за контроля, исключив преобладающее влияние на ДАТ в качестве объяснения. Вместо этого потеря эффекта на поглощение, а также высвобождение подразумевает десенситизацию InsRs или понижающую регуляцию каналов передачи вниз по потоку при высоких концентрациях инсулина. Действительно, InsRs подвергаются быстрому эндоцитозу и деградации после связывания инсулина в периферических тканях¹, с появляющимися доказательствами потери чувствительности к нейронам InsR после кратковременного воздействия высоких уровней инсулина или высококалорийных диет^{10, 11, 39}.

Преобладающий эффект инсулина для увеличения полосатого DA-релиза, сообщаемого здесь, контрастирует с результатами двух других недавних бывших естественных условиях исследования срезов. В первом случае инсулин приводил к уменьшению электрически вызванного переполнения [³H] DA из полосатых срезов, хотя увеличение [³H] DA переполнение было обнаружено, когда DAT был ингибирован²², Учитывая, что выпущено [³H] DA должна избегать DAT-опосредованного поглощения во всей ткани, которая должна быть обнаружена в растворе для супертестов, этот протокол особенно чувствителен к регулированию DAT. Наши результаты, показывающие, что инсулин усиливает высвобождение DA через ChIs и активацию nAChR, в дополнение к усилению DAT-опосредованного поглощения, объяснят кажущееся парадоксальное увеличение инсулинотерапии [³H] Переполнение DA наблюдалось, когда конкурирующие эффекты на DAT были заблокированы²², Второе исследование использовало FCV для прямого обнаружения выделения соматодендрита DA в VTA, но также обнаружило преобладающее влияние инсулина на поглощение DA, отраженное в уменьшенном вызванном [DA]_o (См. 23). Различия в ряде факторов: от локальных микросхем до соматодендритных и аксональных механизмов высвобождения DA⁴⁰, может способствовать этому региональному различию. Однако, как обсуждалось ниже, региональные зависимости от инсулина, скорее всего, будут взаимодополняющими, а не противоречивыми.

Раньше предполагалось, что любая роль инсулинзависимой регуляции передачи сигналов DA опосредована прямой активацией InsR на DA нейронах. Мы показываем здесь, что InsRs также экспрессируются на стриатальных ChIs, и что инсулин модулирует возбудимость ChI для усиления стригального выброса DA, который может играть ключевую роль в влиянии инсулина на диету. Striatal ChIs получают прогнозы от нейронов интраламинарных ядер таламуса, которые проявляют взрывную вспышку в ответ на выраженные сенсорные раздражители и помогают стимулировать всплески во время паузы в ChIs, которые важны для направления внимания, подкрепления и ассоциативного обучения⁴¹, Таким образом, действие инсулина на InsRs на стриатальные ChIs могло бы усилить эффект сенсорных пищевых сигналов на стриалальную отзывчивость к таламутическому обжигу, что способствовало усиленному восприятию ценности вознаграждения заглатываемой еды. Прямое продвижение полосатого DA-релиза благодаря активации ChI привело к предположению, что факторы, которые стимулируют ChIs, будут иметь привилегированную роль в качестве триггеров высвобождения DA³³, Наши данные дают первые подтверждающие данные для этого: с повышением чувствительности к инсулину, индуцируемым ChI, и передачей сигналов ACh, приводящими к динамическому увеличению выпуска DA.

Повышенное высвобождение DA в присутствии инсулина также противоречит усилению передачи сигналов ACh до такой степени, что вызывает активацию nAChR или активацию мускаринового ACh-рецептора (mAChR), любой из которых может подавлять однократно импульсные [DA]_o (рефов 29, 30, 31, 42). Таким образом, описанные здесь механизмы отличаются от ACh-активации mAChRs, которая была связана с отвращением и насыщением⁴³.

Одиночный импульс [DA]_o был ниже у крыс FR и OB, чем у крыс AL; хотя эти результаты согласуются с предыдущими отчетами^{44, 45, 46}, наши исследования обеспечивают первое систематическое сравнение трех полосатых субрегионов в двух группах диеты в течение постоянного периода времени. Механизмы, лежащие в основе диетически зависимых изменений в высвобождении DA, не были выяснены и выходят за рамки настоящих исследований. Однако, учитывая, что уровни инсулина в плазме противоположно изменены FR и OB диетами, маловероятно, что уменьшенный вызванный [DA]_o в обеих группах является следствием диетически зависимых уровней инсулина.

С другой стороны, изменения чувствительности InsR с диетой и последующими диетически зависимыми уровнями инсулина в плазме являются наиболее вероятным объяснением повышенной чувствительности к инсулину в FR и потерей чувствительности к инсулину в OB. Не было доказательств альтернативного объяснения измененной чувствительности nAChR у крыс FR или OB по сравнению с AL. Хотя наши данные являются одними из первых, которые указывают на повышенную стриальную чувствительность InsR с FR¹⁸, потеря веса может сопровождаться снижением уровня инсулина в CSF⁷, что будет способствовать повышению чувствительности высвобождения DA к инсулину в FR. И наоборот, потеря чувствительности к инсулину у крыс OB соответствует предыдущим свидетельствам снижения чувствительности мозга InsR, вызванной увеличением массы тела или диетами OB^{3, 10, 11}.

Наши бывших естественных условиях данные среза поддерживают гипотезу о том, что инсулин может сигнализировать о награде, а также о сытости. Мы протестировали эту гипотезу, заблокировав эффект эндогенного инсулина с помощью двусторонней микроинъекции InsAb в оболочке NAc во время кондиционирования предпочтений. В соответствии с ролью в награде, блокирование эффекта инсулина уменьшало предпочтение вкуса парного раствора, содержащего глюкозу, по сравнению с ароматом, связанным с интактной инсулиновой сигнализацией. Блокирование инсулина в оболочке NAc также уменьшало потребление парного раствора во время кондиционирования в одной бутылке, тогда как ложные или контрольные микроинъекции не влияли на потребление. Эти данные свидетельствуют о том, что инсулин в оболочке NAc играет роль в предпочтении пищи. Предыдущие исследования показали, что интактная DA-сигнализация в NAc необходима для приобретения кондитерской кондиции^{37, 38}, подтверждая роль NAc DA в опосредовании усиливающих эффектов питательных растворов. В этом свете предпочтение в отношении раствора глюкозы в сочетании с интактной инсулинорезистентностью указывает на первичный эффект инсулина на DAT-опосредованное поглощение DA в оболочке NAc, поскольку ожидается, что это уменьшит [DA]_o и, следовательно, уменьшают потребление парного аромата. Наши результаты также согласуются с результатами предыдущего исследования, в котором микроинъекция инсулина в оболочке NAc увеличивала время, в течение которого животные были вовлечены в самообслуживание орального сахарозы, с пограничным увеличением потребления сахарозы²⁶, что было противоположно ожидаемому последствию увеличения поглощения DA. В целом, эти поведенческие данные согласуются с прогнозируемым влиянием инсулина на стригальные ChIs и улучшенным высвобождением DA. Однако эти результаты не исключают участия других элементов полосатой микроциркуляции в контролируемом поведении, учитывая широко распространенную экспрессию InsR во всей полосатой^{1, 14}.

Представленные здесь исследования дают первое доказательство того, что инсулин играет роль в распространении ценности калорийности и, следовательно, полезный эффект еды, который имеет важные последствия для влияния инсулина как у пациентов с недостаточным весом, так и у людей с ожирением. Несколько исследований показывают, что послевкусственные эффекты пищи, независимо от того, являются ли пути трансдукции вкуса неповрежденными⁴⁷, увеличить выпуск NAc DA и положительное усиление поведения^{37, 47}, Таким образом, пост-абсорбирующий ответ на инсулин может кодировать гликемический выход пищи и способствовать усилению предпочтений и поведения в области питания, которые обеспечивают потребление. Тем не менее, экстремальные изменения в уровнях циркулирующего инсулина и центральной чувствительности InsR могут играть определенную роль в патологическом, а также адаптивном поведении. Например, гипоинсулинемия и компенсаторная регуляция чувствительности InsR в субъектах ФР могут быть фактором их склонности к выпивке⁴⁸, И наоборот, центральная нечувствительность к инсулину при диабете II типа или ожирении, отраженная здесь у крыс OB, может способствовать уменьшению чувства вознаграждения после приема внутрь, вождения потребления продуктов с высоким гликемическим индексом в качестве компенсации^{49, 50}, Следовательно, увеличение или уменьшение чувствительности к половому инсулину может способствовать патологическому питанию, приводящему к употреблению в пищу и / или ожирению.

В целом, наши результаты показывают новую роль инсулина в качестве сигнала награды. Такая роль контрастирует с ее известной функцией сигнала насыщения, включая недавние данные о том, что инсулин, микроинъективный в ВТА, может уменьшить гедоническое питание и предпочтение для сигналов, связанных с наградой за питание^{23, 24}, Это ставит вопрос о том, как можно противопоставить кажущиеся противоположные роли инсулина в этих DA-зависимых функциях. Ответ может заключаться в том, что эти эффекты являются дополнительными, а не противоречивыми. Настоящие результаты указывают на то, что инсулин в полосатом полотне сообщает ценность вознаграждения заглатываемой еды. Двойная роль в сигнальной сытости может просто позволить инсулину служить важной цели прекращения приема пищи, одновременно устанавливая память о его питательных и, следовательно, полезных качествах, тем самым усиливая повторение пищевого поведения.

Обработка животных

Процедуры животных проводились в соответствии с руководящими принципами NIH и одобрены Комитетом по уходу и уходу за животными NYU School of Medicine. Все животные были на 12 h свет: темный цикл, с подсветкой от 06: 00 до 18: 00; бывших естественных условиях срезы были подготовлены между 08: 00 и 12: 00. Механические исследования у крыс и мышей AL проводились в бывших естественных условиях ломтики животных помещались парами, тогда как крысы размещались отдельно для всех диетических групп и для поведенческих исследований.

Рат диеты схемы

Взрослым самцам крыс Sprague-Dawley (Taconic) предшествовали недели 8-10 при начале диеты, длительностью 21-30. Крыс полураспределенно распределяли на группы диеты: испытуемые оценивали по начальному весу, затем каждое последующее трио крыс распределялось случайным образом среди групп диеты. У крыс AL был свободный доступ к крысиной чау в течение того же периода, что и парные крысы на диетах FR или OB. У всех крыс был свободный доступ к воде. Ограничение питания было реализовано как ранее⁵¹; кратковременно крысы получали 40-50% от потребления AL стандартной чашки крысы ежедневно до тех пор, пока масса тела не уменьшилась на 20%, после чего пилюлю титровали для поддержания этого веса. Крысы OB имели свободный доступ к крысиной чау и шоколаду. Обеспечивают, очень приятную жидкость с умеренно высоким содержанием жира и сахара⁵².

передний мозг ХАТ нокаутные мыши

Мыши с условным псевдоожиженным слоем ХАТ (ХАТ^{жидкий кислород}) были пересечены с Nkx2.1^Cre трансгенную линию для продуцирования мышей, у которых абляция синтеза АХГ ограничена передним мозгом³², Не мутантными трансгенными однопометниками были контрольные группы; их генотипы Cre⁺;ХАТ^{Flox / +} и Cre^-;ХАТ^{Flox / Flox} называются «гетерозиготами». Взрослые самцы мыши, используемые для исследований на срезе, имели вволю доступ к чау и воде.

Ex vivo подготовка срезов и физиологические решения

Крыс или мышей глубоко анестезировали 50 мг кг^-1 пентобарбитал (внутрибрюшинный (ip)) и обезглавливают. Для вольтамперометрии кусочки коронального переднего мозга (толщина 300-400-μm) разрезали на микротоме вибрирующего лезвия Leica VT1200S (Leica Microsystems, Bannockburn, IL) в ледяном HEPES-буферированном искусственном CSF (aCSF), содержащем (в мМ): NaCl (120); NaHCO₃ (20); глюкоза (10); HEPES кислота (6.7); KCl (5); Натриевую соль HEPES (3.3); CaCl₂ (2); и MgSO₄ (2), уравновешенный 95% O₂/ 5% CO₂, Затем в этом растворе выдерживали срезы при комнатной температуре для 1 h перед экспериментом^{30, 32, 53}, Для электрофизиологии после обезболивания крысы перфузировали транскардиально ледяным раствором, содержащим (в мМ): сахарозу (225); KCl (2.5); CaCl₂ (0.5); MgCl₂ (7); NaHCO₃ (28); Неа₂PO₄ (1.25); глюкоза (7); аскорбат (1); и пирувата (3), и уравновешивается 95% O₂/ 5% CO₂, В этом растворе разрезали срезы, затем переносили в камеру для восстановления в модифицированном aCSF, содержащем (в мМ): NaCl (125); KCl (2.5); Неа₂PO₄ (1.25); NaHCO₃ (25); MgCl₂(1); CaCl₂ (2); глюкоза (25); аскорбат (1); пируват (3); а также мио-инозитол (4), уравновешенный 95% O₂/ 5% CO₂; этот раствор был первоначально на 34 ° C, затем давали постепенно охладиться до комнатной температуры⁵⁴, Все эксперименты по вольтамперометрии и физиологии проводили в погружной записывающей камере при 32 ° C, которая была суперзапущена при 1.5 мл мин^-1 с aCSF, содержащим (в мМ): NaCl (124); KCl (3.7); NaHCO₃ (26); CaCl₂ (2.4); MgSO₄ (1.3); KH₂PO₄ (1.3); и глюкозу (10), и бычий сывороточный альбумин (BSA, 0.05-0.1 мг мл^-1), уравновешенное 95% O₂/ 5% CO₂; срезам разрешалось уравновешивать в этой среде за 30 мин до экспериментов.

Циклическая вольтамперометрия с быстрым сканированием

Вызванные исследования высвобождения DA проводились с использованием FCV в срезах мозга^{32, 53} приготовленные из самцов крыс или ХАТ мышей с нокаутом переднего мозга и контроля гетерозигот (5-8 недель). Исследования в ХАТ нокаутные мыши были ослеплены, но группы диеты крысы имели очевидные фенотипы, которые не допускали ослепления. Вольтамперометрические измерения проводились с помощью вольтамперметра Millar (доступный по специальному запросу д-ру Джулиану Миллеру в Санкт-Бартоломью и Королевской лондонской школе медицины и стоматологии Лондонского университета). Обычный условный треугольный сигнал использовался для FCV с диапазоном сканирования от -0.7 до + 1.3 V (по сравнению с Ag / AgCl), скоростью сканирования 800 V s^-1, и интервал выборки 100 мс^{30, 32, 53}, Данные были получены с использованием платы A / D DigiData 1200B, управляемой программным обеспечением Clampex 7.0 (Molecular Devices). Выделение DA было вызвано с помощью концентрического стимулирующего электрода; амплитуда импульса стимула составляла 0.4-0.6 мА, а длительность составляла 100 мкс^{30, 32, 53}, Локальная одноимпульсная стимуляция была использована в ядре NAc и CPu; однако для усиления вызванного [DA] сигнала использовалась короткая высокочастотная последовательность импульсов (пять импульсов при 100 Гц)_o в оболочке NAc. Обе парадигмы стимулов вызывают высвобождение DA, которое является потенциалом действия и Ca²⁺ зависимые, не подверженные влиянию одновременно высвобожденного глутамата и ГАМК^{42, 55}, и облегчается одновременным выпуском ACh^{29, 30, 31, 32, 33, 34}, Для количественного определения вызванных [DA]_o, электроды калибровали с известными концентрациями DA при 32 ° C после каждого эксперимента в aCSF и в присутствии каждого лекарственного средства, используемого в ходе данного эксперимента⁵³.

Вольтамперометрические эксперименты для оценки влияния инсулина на вызванные [DA]_o были получены с использованием одного из двух протоколов. Начальные эксперименты по определению временного курса воздействия инсулина (Sigma, I5523) проводились путем мониторинга вызванного [DA]_o каждый 5 мин на одном сайте. Инсулин применяли после последовательного вызванного [ДА]_o (как правило, измерения 4-5); эффект инсулина был максимальным после 50-60 мин, а затем вызвал [DA]_o оставались на этом уровне в течение всего эксперимента (обычно 90 минус общее воздействие инсулина; Рис. 1c). Впоследствии эффект инсулина оценивали путем записи вызванного [DA]_o на 4-5 дискретных сайтах в срезах (+ 1.5 мм от брегмы) в каждой из трех полосчатых субрегионов в условиях контроля (aCSF или aCSF плюс лекарственный препарат) и снова во время максимального эффекта инсулина (выборка по 60-80 мин), затем эти образцы были усреднены для каждой подобласти. Эффект инсулина уменьшался со временем после приготовления среза; минимизировать время бывших естественных условиях и для оптимизации использования животных, как правило, два среза от данного животного были одновременно испытаны в записывающей камере. Препараты, используемые для борьбы с эффектом инсулина, были применены к 15 мин до инсулина путем суперфузии aCSF, включая трисацетоксиметиловый эфир HNMPA (HNMPA-AM_3; Enzo Life Sciences), S961 (Novo Nordisk), LY294002 (Sigma), пикоподофиллотоксин (PPP; Tocris), мекамиламин (Tocris) и DHβE (Tocris). Как описано в «Результаты», возможная измененная чувствительность никотиновых ACh-рецепторов среди групп диеты была проверена путем сравнения отношения пика [DA]_o вызванный 5 p (100 Гц) с вызванным вызванным 1 p (отношение 5 p: 1 p)^{30, 31} в ядре NAc в присутствии никотина 0-500 nM (Sigma).

Определение V _Макс из вызванного [DA]_o переходные процессы в полосатых срезах

Чтобы оценить индуцированные инсулином изменения в DAT-опосредованном поглощении DA, начальная часть падающей фазы вызванного [DA]_o кривые были установлены на уравнение Михаэлиса-Ментена для извлечения V_Макс (максимальная константа скорости поглощения)⁵⁶. K_m (которая обратно связана с сродством DAT для DA) была зафиксирована в 0.2 мкМ и, как известно, была сходной по полосатым субрегионам⁵⁷ и не зависит от инсулина (см. Дополнительный рисунок 4 подпись).

Запись цельной ячейки

Мозговые срезы готовили от крыс 29- до 35-дневных самцов; условия записи были идентичны условиям, которые использовались в исследованиях высвобождения DA. Записи цельного клеточного тока-зажима используют обычные методы⁵⁴, Striatal ChIs были визуализированы с использованием микроскопа Olympus BX51WI (Olympus America, Center Valley, PA) с инфракрасной дифференциальной контрастно-контрастной опцией и x 40 целью погружения в воду. Раствор пипетки содержал (в мМ): K-глюконат (129); KCl (11); HEPES (10); MgCl₂ (2); EGTA (1); не доступно₂-ATP (2); не доступно₃-GTP (0.3); и доводили до pH 7.2-7.3 с КОН. Для зарегистрированных нейронов, подлежащих оценке на иммунореактивность ChAT, 0.3% биоцитин был включен в раствор пипетки, а нейроны, записанные вкратце (~ 5 мин), чтобы минимизировать разведение внутриклеточного содержимого. Сопротивление пипете было ~ 3-5 MΩ. Записи были получены с использованием усилителя Axopatch 200B (Molecular Devices, Sunnyvale CA) и фильтра низких частот, фильтрованного на 2 кГц. КИ были идентифицированы установленными электрофизиологическими критериями²⁸; большинство из них первоначально были тонически активными, но после паттинга активность постепенно уменьшалась. Однако реакция на текущую инъекцию была в целом надежной и последовательной с течением времени и поэтому использовалась для исследования влияния инсулина на возбудимость ChI (см. Результаты). В экспериментах по изучению роли InsRs и IGF-1R в этом ответе либо HNMPA, либо PPP применяли по меньшей мере для 20 мин до того, как ChI был исправлен. Максимальные эффекты только инсулина наблюдались обычно через ~ 16 мин экспозиции, хотя в некоторых клетках увеличение не было максимальным до 50 мин или дольше. Более того, в четырех из шести нейронов, зарегистрированных в ППС, инсулин вызывал первоначальное снижение числа всплесков перед восстановлением и превышением начального числа спайков. Следовательно, во всех экспериментах влияние инсулина определяли количественно путем сравнения максимального эффекта на число спайков с числом спайков, вызванных непосредственно перед применением инсулина. Очевидная разница во времени достижения пикового эффекта может отражать ряд факторов, включая глубину записанной ячейки в срезе. Вызываемые потенциалы действия также регистрировались в ЦИ в отсутствие инсулина в сопоставимые моменты времени.

Высокоэффективная жидкостная хроматография

Содержание DA в полосатых полосках крысы (толщина 400-мкм) определяли с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием⁵⁸, Пары срезов уравновешивали для 30 мин при 32 ° C в aCSF, а затем один срез на пару инкубировали в течение дополнительного 60 мин при 32 ° C в aCSF, в то время как другой инкубировали в aCSF с 10 или 30 нМ инсулином. Для сопоставления диетических групп полосатая ткань собиралась между 30-60 мин после восстановления. После инкубации избыток aCSF осторожно удаляли из срезов, образец полосатой ткани (7-10 мг) взвешивали, замораживали на сухом льду и затем хранили при хранении при -80 ° C. В день анализа образцы обрабатывали ультразвуком в ледяном, элюенте, дезоксигенировали аргоном⁵⁸, центрифугировали в микроцентрифуге для 2 мин и супернатант вводили непосредственно в колонку ВЭЖХ (BAS, West Lafayette, IN); детектор был стеклянным углеродным электродом, установленным на 0.7 V по сравнению с Ag / AgCl.

Иммуногистохимия

Для иммуногистохимической маркировки крыс анестезировали пентобарбиталом натрия (50 мг кг^-1, ip), затем перфузировали транскрипционно с помощью PBS (154 мМ NaCl в 10 мМ фосфатном буфере, pH 7.2), а затем 4% параформальдегида в этом PBS; мозг удаляли, а корональные срезы (20 мкм) разрезали и обрабатывали условно^{27, 59}, Иммунофлуоресцентные изображения были получены с помощью конфокального микроскопа Nikon PM 800, оснащенного цифровой камерой, управляемой программным обеспечением Spot (Diagnostic Instruments Inc.) и с использованием объектива × 100 (числовая апертура = 1.4) или с конфокальным микроскопом Zeiss LSM 510 с использованием × 63 объектная (числовая апертура = 1.2). Лазерами были аргон (488 нм), He / Ne (543 нм) и He / Ne (633 нм). Соответствующие фильтры для каждого лазера были выбраны программным обеспечением конфокального микроскопа. Размер плунжера варьировался с использованием используемой цели и толщины сечения, выбранной в z-этажное поколение; мы выбрали оптимальное значение обводки, указанное программным обеспечением (обычно 30 мкм). Цифровые файлы были проанализированы с помощью программного обеспечения деконволюции (AutoQuant Imaging), с окончательными изображениями, обработанными с помощью Adobe Photoshop 7.0. Все изображения были настроены на яркость и контрастность; такие регулировки были сделаны равномерно ко всем частям изображения. Астраны стриатала DA были идентифицированы с использованием двух антител TH: поликлонального AB152 кролика-анти-TH (1: 800) и моноклональной мышиной мыши MAB318 против TH (1: 500) (оба из Chemicon). Использовались три антитела InsR: sc-57342 и sc-09 (1: 100, Santa Cruz) и PP5 (подарок от Pfizer). Специфика каждого из них была продемонстрирована ранее^{60, 61}, и было подтверждено в настоящих исследованиях отсутствием иммуноблока с антителами sc-57342 или PP5 в присутствии соответствующего блокирующего пептида. ХАТ антитело было AB144 (1: 200; Millipore), а биотин был из Vector (1: 200). В качестве вторичных антител использовали ослик-антикролик Alexa 488 (Invitrogen) или ослик-антикробик Cy2 (лаборатория Джексона, Bar Harbor, ME), осел-анти-козьи Cy3 (Джексон) и осел-анти-мышь Cy5 (Джексон).

Чтобы оценить совместную локализацию InsRs в аксонах TH +, мы использовали методы, описанные ранее для идентификации присутствия Kir6.2, порообразующей субъединицы ATP-чувствительного K⁺ каналов в DA-аксонах²⁷, Puncta, представляющие InsRs, распределялись по скорректированным изображениям, что указывает на то, что наложение с иммунореактивностью TH может произойти в некоторой степени случайно. Чтобы проверить это предположение, мы подсчитали insR / TH наложения в 42 независимых полях в трех участках иммуноблока NAc у двух крыс. Цифровые файлы InsR затем повернули 90 ° по часовой стрелке и повторили отсчеты; вращение уменьшило количество InsR puncta, которое было локализовано с TH в большинстве полей (см. Результаты). Уменьшение числа наложений с вращением²⁷ указала долю InsR puncta в каждом полосатом поле, связанном с DA-аксонами.

Кровь глюкозы и ИФА для инсулина

Магистральная кровь была собрана во время обезглавливания для исследований среза. Уровень глюкозы в крови определяли сразу со стандартным монитором уровня глюкозы в крови. Для инсулина дополнительную кровь собирали в ЭДТА-содержащих пробирках и центрифугировали в 1,500g для 15 мин; супернатант (плазма) собирали и хранили при -80 ° C до обработки с помощью набора ELISA для инсулина крысы ALPCO.

Размещение канналы и гистологическая проверка

Сорок один взрослый самцов крыс Sprague-Dawley (Taconic и Charles River), первоначально взвешивающих 350-425 g, были подвергнуты анестезии с помощью кетамина (100 мг кг^-1, ip) и ксилазин (10 мг кг^-1, ip) и стереотаксически имплантированы двумя хронически расположенными направляющими канюлями (26-калибр), размещенными на двустороннем расстоянии от 2.0 мм до вливаний в медиальную оболочку NAc⁶² (1.6 мм впереди bregma, 2.1 мм боковая к сагиттальному шву, наконечники под углом 8 ° к средней линии, 5.8 мм вентрально к поверхности черепа). Крысам давали банамин (2.0 мг кг^-1, подкожный) в качестве постхирургического анальгетика после выздоровления после анестезии и послезавтра. Через неделю после операции крыс помещали в FR (описано выше) и поддерживали на 80% от их послеоперационного веса для восстановления в течение оставшейся части исследования. Размещение каннулы определяли гистологически после завершения поведенческого тестирования. Каждая крыса была убита СО₂, декапитировали, мозг извлекали и фиксировали в 10% забуференном формалине в течение> 48 часов. Замороженные коронковые срезы (толщиной 40 мкм) вырезали на криостате Reichert-Jung, размораживали на стеклянных предметных стеклах, покрытых желатином, и окрашивали крезиловым фиолетовым. Данные от данной крысы использовались только в том случае, если обе канюли находились внутри медиальной оболочки NAc.⁶² (включая оболочку / сердцевину или оболочку / обонятельную бугорковую границу) (Дополнительный рисунок 5); исходя из этих критериев, две крысы были исключены из окончательного анализа.

Предварительная экспозиция кондиционирования предпочтений

Крысы получали одну ночь (в домашней клетке) и шесть сеансов предварительной экспозиции (в тестовых камерах) 30-min-per-day с 0.2% сахарином натрия (Sigma) в воде с интервалом 48-h между сеансами. Затем крысам было проведено два сеанса 5-min-per-day, подвергнутых воздействию 0.2% сахарина натрия в 0.05% несладкого винограда или вишни Kool-Aid (Kraft Foods) в воде. Для первого сеанса предварительного воздействия Kool-Aid половина крыс получила раствор с вишневым ароматом, а другая половина получала виноградное ароматизированное решение. Ароматизаторы были отменены на второй предварительной сессии Kool-Aid, чтобы убедиться, что все крысы пробовали каждый аромат. Прием измеряли для всех сеансов предварительной экспозиции. Испытательные камеры были прозрачными пластиковыми клетками со свежими постельными принадлежностями. Для всех сеансов предварительной экспозиции крысы имели доступ к тому же решению по обеим сторонам камеры. За исключением сеанса предварительной досрочной проверки, все сеансы проводились в комнате с поведенческой процедурой, с периодом привыкания 30-min до любого обучения или тестирования.

Кондиционирование с одной бутылкой

Предыдущие исследования показали, что микроинъекция InsAb в вентромедиальный гипоталамус может блокировать действие инсулина на поведение кормления и секрецию глюкагона^{63, 64}, Здесь мы использовали этот подход для оценки возможной роли инсулина в усилении выбора пищи. Крысы были полу-случайным образом назначены на основе среднего объема до экспозиции на две группы, контрольные или экспериментальные (InsAb). В контрольной группе крысы получали носитель (микроинъекционный PBS, 137 мМ NaCl и 2.7 мМ KCl в 10 мМ фосфатном буфере) или IgG (Abcam ab81032; 0.5 мкг мкл^-1 в PBS, как получено) микроинъекцию в оболочке NAc перед употреблением одного из двух ароматизированных растворов и ложную микроинъекцию перед употреблением другого ароматизированного раствора. В экспериментальной группе крысы получали микроинъекцию оболочки NAc из InsAb (Abcam ab46707; 0.5 мкл 1 мкг мкл^-1 в PBS, как получено) перед воздействием одного ароматизированного раствора и издеваться над микроинъекцией перед другим. Использовались два набора испытуемых с чередованием между микроинъекцией жидкости и ложной микроинъекцией, так что общее количество микроинъекций было ограничено четырьмя, что сводило к минимуму возможное повреждение ткани и потерю чувствительности на участке микроинъекции⁶⁵, Для жидкостной микроинъекции контрольный раствор или InsAb загружался в две длины трубки из полиэтилена PE-30 длиной 50-см, прикрепленные на одном конце к 5 мкл гамильтоновых шприцев, заполненных дистиллированной водой, а с другого конца - к канюлям инжектора 31, которые удлиняли 2.0 мм вне имплантированных направляющих. Объем инфузии 0.5 мкл был доставлен по 90 s со скоростью 0.005 мкл s^-1; инжектор остался на месте для ~ 60 s, чтобы дать время для диффузии, затем инжектор был заменен стилетом.

Крыс переносили непосредственно в поведенческие камеры в течение 2 мин после завершения микроинъекции или ложной микроинъекции. Кондиционирующие растворы содержали 0.2% сахарин натрия, 0.05% несладкого винограда или вишневого Kool-Aid и 0.8% глюкозы. Доступ к решениям ограничивался 30 min за сеанс. Парный аромат и сторона камеры с доступом к питьевой воде были полураспределены и уравновешены в каждой группе. Интервал между микроинъекциями был, по меньшей мере, 72 h, чередуясь между инфузией и макетными сеансами для в общей сложности восьми сеансов кондиционирования.

Тест с двумя бутылками

Спустя 48 часов после последнего сеанса кондиционирования крыс помещали в испытательные камеры с одновременным доступом к кондиционным ароматизаторам; растворами был 0.2% сахарин натрия в 0.05% винограда или вишневого Kool-Aid без глюкозы. Тестирование происходило в течение 2 дней (60 min в день). Положение питьевой трубки, содержащей парно-парный или инфузионно-парный раствор, чередовалось, чтобы гарантировать, что каждая крыса была испытана на потребление каждого раствора по обеим сторонам клетки. Взятие каждого ароматизированного раствора усредняли в течение двух испытательных дней для определения предпочтения.

[³H] DA в полосатых синаптосомах для оценки эффективности InsAb

Струйные синаптосомы^{21, 66} были получены из крыс AL (самца, 350-400 g), с NAc (оболочка и сердцевина) и CPu расчленены и приготовлены отдельно. Ткань из каждой области гомогенизировали в объемах 15 охлажденного льдом раствора 0.32 M сахарозы в стеклянном гомогенизаторе с моторным тефлоновым пестиком; после промывки и центрифугирования конечный осадок снова суспендировали в охлажденной льдом 0.32 M сахарозе^{21, 66}, Перед запуском [³H] DA анализ поглощения⁶⁶, синаптосомные аликвоты в общем объеме 180 мкл буфера для поглощения инкубировали в шейкере для 15 мин при 30 ° C в присутствии или в отсутствие инсулина 30 нМ в транспортном средстве (PBS) или в InsAb (конечное разведение 1: 500) , в IgG (конечное разведение 1: 500) или в транспортном средстве. Буфер для поглощения, содержащий (в мМ): NaCl (122); не доступно₂HPO₄ (3); Неа₂PO₄ (15); KCl (5); MgSO₄ (1.2); глюкозы (10), CaCl₂ (1); ниаламид (0.01); tropolone (0.1); и аскорбиновой кислоты (0.001), pH 7.4. Поглощение [³H] DA инициировали быстрым распределением 20 мкл каждой синаптосомной суспензии в планшеты 96-лунок с различными концентрациями DA (0.003-1.0 мкМ) и [³H] DA (5 nM); после 5 мин в пластинчатом шейкере при 25 ° C поглощение прекращалось холодной, быстрой вакуумной фильтрацией⁶⁶, Графы на лунку были преобразованы в pmoles, а затем скорректированы до мг общего белка в минуту. Все анализы проводили в трех повторностях и повторяли по меньшей мере четыре раза; V_Макс и K_m были рассчитаны с использованием программного обеспечения Biosoft Kell Radlig (Кембридж, Великобритания).

статистический анализ

Данные приведены как средства ± sem; значимость оценивалась с использованием парного или непарного студенческого t-tests или ANOVA, если не указано иное. Для вольтамперометрических данных, n является числом участков записи, учитывая, что изменчивость между сайтами внутри полосатой субрегиона больше, чем изменчивость между животными или между срезами^{30, 32, 55, 56}; для каждого набора данных указывается номер животного. ЕС₅₀ для воздействия инсулина и никотина на пик-вызванный [DA]_o был рассчитан с использованием Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Для электрофизиологических данных статистическая значимость оценивалась с использованием парных t-тесты или тест Wilcoxon в Prism 6.0 или смешанный двухсторонний ANOVA в SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Для оценки участия инсулина в кондиционировании вкусовых предпочтений были завершены два полных исследования с использованием протоколов, которые были идентичны, за исключением используемой обработки. В первом исследовании крысы 10 получили вливания в PBS, а 9 получали инфузии InsAB. Во втором исследовании крысы 10 получали вливания в IgG, а 10 получали инфузии InsAb. Не было существенной разницы между двумя группами транспортных средств (PBS или IgG) во время сеансов кондиционирования (F₁₉= 0.619, смешанный двухсторонний ANOVA) с повторными мерами на сеансе кондиционирования) или при тестировании (F₁₉= 0.012, двухсторонний смешанный ANOVA с повторными мерами по вкусу). Следовательно, два эксперимента были объединены для анализа. Для этого анализа для определения эффектов микроинъекционной обработки при кондиционировании использовался 2 × 4 смешанный ANOVA (с повторными мерами в день введения инфузионного кондилома), за которым следовали защищенные t- тесты (один хвост, чтобы определить, в какой кондиции сеансы микроинъекции снижают объем потребления). Тот же анализ был завершен для макетирования сеансов кондиционирования. Чтобы определить влияние кондиционирующего лечения во время теста с двумя вкусовыми предпочтениями с двумя бутылками, данные анализировали с использованием смешанного двухстороннего ANOVA (с повторными мерами по вкусу), а затем защищали t-tests (один хвост, чтобы проверить гипотезу, что InsAb уменьшит предпочтение).

Как процитировать эту статью: Stouffer, MA и др., Инсулин усиливает освобождение полосатого дофамина, активируя холинергические интернейроны и тем самым сигнализируя о награде. Туземный Commun, 6: 8543 doi: 10.1038 / ncomms9543 (2015).

1. Schulingkamp, ​​RJ, Pagano, TC, Hung, D. & Raffa, RB Рецепторы инсулина и действие инсулина в мозге: обзор и клинические последствия. Neurosci. Biobehav. Ред. 24, 855–872 (2000).
   • CAS
   • ISI
   • PubMed
   • Статья
   • Показать контекст
2. Gerozissis, K. Brain инсулин, энергетический и глюкозный гомеостаз; генов, окружающей среды и метаболических патологий. Евро. J. Pharmacol. 585, 38-49 (2008).
3. CAS
4. PubMed
5. Статья
6. Показать контекст
7. CAS
8. PubMed
9. Статья
10. Показать контекст
11. CAS
12. PubMed
13. Статья
14. Показать контекст
15. CAS
16. PubMed
17. Статья
18. Показать контекст
19. CAS
20. ISI
21. PubMed
22. Статья
23. Показать контекст
24. ISI
25. PubMed
26. Статья
27. Показать контекст
28. CAS
29. PubMed
30. Статья
31. Показать контекст
32. Показать контекст
33. CAS
34. ISI
35. PubMed
36. Статья
37. Показать контекст
38. CAS
39. ISI
40. PubMed
41. Статья
42. Показать контекст
43. CAS
44. ISI
45. PubMed
46. Показать контекст
47. ISI
48. PubMed
49. Статья
50. Показать контекст
51. CAS
52. ISI
53. PubMed
54. Статья
55. Показать контекст
56. CAS
57. ISI
58. PubMed
59. Статья
60. Показать контекст
61. Показать контекст
62. CAS
63. ISI
64. PubMed
65. Статья
66. Показать контекст
67. CAS
68. ISI
69. PubMed
70. Статья
71. Показать контекст
72. CAS
73. ISI
74. PubMed
75. Статья
76. Показать контекст
77. PubMed
78. Статья
79. Показать контекст
80. Показать контекст
81. CAS
82. PubMed
83. Статья
84. Показать контекст
85. ISI
86. PubMed
87. Статья
88. Показать контекст
89. CAS
90. ISI
91. PubMed
92. Статья
93. Показать контекст
94. CAS
95. ISI
96. PubMed
97. Статья
98. Показать контекст
99. CAS
100. PubMed
101. Статья
102. Показать контекст
103. Показать контекст
104. CAS
105. ISI
106. PubMed
107. Статья
108. Показать контекст
109. CAS
110. ISI
111. PubMed
112. Статья
113. Показать контекст
114. CAS
115. ISI
116. PubMed
117. Статья
118. Показать контекст
119. CAS
120. ISI
121. PubMed
122. Статья
123. Показать контекст
124. PubMed
125. Статья
126. Показать контекст
127. CAS
128. ISI
129. PubMed
130. Статья
131. Показать контекст
132. CAS
133. PubMed
134. Статья
135. Показать контекст
136. CAS
137. ISI
138. PubMed
139. Статья
140. Показать контекст
141. CAS
142. PubMed
143. Статья
144. Показать контекст
145. ISI
146. PubMed
147. Статья
148. Показать контекст
149. Показать контекст
150. Показать контекст
151. CAS
152. ISI
153. PubMed
154. Статья
155. Показать контекст
156. CAS
157. ISI
158. PubMed
159. Статья
160. Показать контекст
161. CAS
162. ISI
163. PubMed
164. Статья
165. Показать контекст
166. CAS
167. ISI
168. PubMed
169. Статья
170. Показать контекст
171. CAS
172. ISI
173. PubMed
174. Показать контекст
175. CAS
176. ISI
177. PubMed
178. Статья
179. Показать контекст
180. PubMed
181. Статья
182. Показать контекст
183. CAS
184. ISI
185. PubMed
186. Статья
187. Показать контекст
188. CAS
189. ISI
190. PubMed
191. Статья
192. Показать контекст
193. CAS
194. ISI
195. PubMed
196. Статья
197. Показать контекст
198. CAS
199. ISI
200. PubMed
201. Статья
202. Показать контекст
203. Показать контекст
204. CAS
205. ISI
206. PubMed
207. Показать контекст
208. Показать контекст
209. Показать контекст
210. Показать контекст
211. CAS
212. ISI
213. PubMed
214. Статья
215. Показать контекст
216. CAS
217. PubMed
218. Статья
219. Показать контекст
220. CAS
221. ISI
222. PubMed
223. Показать контекст
224. Показать контекст
225. CAS
226. PubMed
227. Статья
228. Показать контекст
229. ISI
230. PubMed
231. Статья
232. Показать контекст
233. Показать контекст
234. ISI
235. PubMed
236. Статья
237. Показать контекст
238. Показать контекст
239. CAS
240. ISI
241. PubMed
242. Статья
243. Показать контекст
244. Показать контекст
245. Vogt, MC и Bruning, JC. Передача сигналов инсулина в ЦНС в контроле энергетического гомеостаза и метаболизма глюкозы - от эмбриона до старости. Тенденции Endocrinol. Метаб. 24. С. 76–84 (2013).
246. Гавранкова Д., Шмехель Д., Рот Дж. И Браунштейн М. Идентификация инсулина в мозге крысы. Proc. Natl Acad. Sci. USA 75, 5737–5741 (1978).
247. Кинг, Г.Л. и Джонсон, С. Рецептор-опосредованный транспорт инсулина через эндотелиальные клетки. Science 227, 1583–1586 (1985).
248. Strubbe, JH, Porte, D. Jr & Woods, SC. ​​Ответы инсулина и уровни глюкозы в плазме и спинномозговой жидкости во время голодания и повторного кормления у крыс. Physiol. Behav. 44, 205–208 (1988).
249. Бэнкс, WA и Kastin, AJ Дифференциальная проницаемость гематоэнцефалического барьера для двух пептидов поджелудочной железы: инсулина и амилина. Peptides 19, 883–889 (1998).
250. Banks, WA Источник церебрального инсулина. Евро. J. Pharmacol. 490, 5-12 (2004).
251. Nemoto, T. и др., Новые представления о синтезе инсулина и его секреции в гиппокампе крысы и коре головного мозга: амилоид-β1-42-индуцированное снижение уровня проинсулина через гликогенсинтаза-киназу-3β. Сотовый сигнал. 26, 253-259 (2014).
252. De Souza, CT и др., Потребление богатой жиром диеты активирует провоспалительный ответ и индуцирует резистентность к инсулину в гипоталамусе. Эндокринология 146, 4192-4199 (2005).
253. Энтони, К. и др., Ослабление вызванных инсулином ответов в сетях головного мозга, контролирующих аппетит и вознаграждение при резистентности к инсулину: мозговая основа для нарушенного контроля приема пищи при метаболическом синдроме? Диабет 55, 2986-2992 (2006).
254. Келли, А.Э. и Берридж, К.С. Неврология естественных вознаграждений: отношение к наркотикам, вызывающим зависимость. J. Neurosci. 22, 3306–3311 (2002).
255. Кооб, Г.Ф. и Волков, Н.Д. Нейросхема зависимости. Нейропсихофармакология 35, 217–238 (2010).
256. Вертер, Джорджия и др., Локализация и характеристика рецепторов инсулина в головном мозге крысы и гипофизе с использованием в пробирке авторадиография и компьютерная денситометрия. Эндокринология 121, 1562-1570 (1987).
257. Фиглевич, Д. П., Эванс, С. Б., Мерфи, Дж., Хоэн, М. и Баскин, Д. Г. Экспрессия рецепторов инсулина и лептина в вентральной тегментальной области / черной субстанции (VTA / SN) крысы. Brain Res. 964. Т. 107. С. 115–2003.
258. Daws, LC и др., Инсулиновая сигнализация и наркомания. Нейрофармакология 61, 1123-1128 (2011).
259. Figlewicz, DP & Sipols, AJ Energy Регулирующие сигналы и пищевое вознаграждение. Pharmacol. Biochem. Behav. 97, 15–24 (2010).
260. Паттерсон, ТА и др., Лишение пищи снижает мРНК и активность переносчика дофамина крысы. Нейроэндокринология 68, 11-20 (1998).
261. Carvelli, L. и др., PI 3-киназная регуляция поглощения дофамина. J. Neurochem. 81, 859-869 (2002).
262. Williams, JM и др., Гипоинсулинемия регулирует индуцированную амфетамином обратную передачу дофамина. PLoS Biol. 5, e274 (2007).
263. Жень, Дж., Рейт, М. Е. и Карр, К. Д. Хроническое ограничение пищи и функция транспортера дофамина в полосатом теле крысы. Brain Res. 1082, 98–101 (2006).
264. Schoffelmeer, AN и др., Инсулин модулирует коациночувствительную моноаминную транспортерную функцию и импульсивное поведение. J. Neurosci. 31, 1284-1291 (2011).
265. Mebel, DM, Wong, JC, Dong, YJ & Borgland, SL. Инсулин в вентральной тегментальной области снижает гедоническое питание и подавляет концентрацию дофамина за счет повышенного обратного захвата. Евро. J. Neurosci. 36, 2336–2346 (2012).
266. Labouebe, G. и др., Инсулин вызывает длительную депрессию вентральных тегментальных дофаминовых нейронов через эндоканнабиноиды. Туземный Neurosci. 16, 300-308 (2013).
267. Коннер, AC и др., Роль для передачи сигналов инсулина в катехоламинергических нейронах в управлении энергетическим гомеостазом. Cell Metab. 13, 720-728 (2011).
268. Фиглевич, Д.П., Беннет, Дж. Л., Алиакбари, С., Завош, А. и Сиполс, А. Дж. Инсулин действует на разные участки ЦНС, уменьшая острое потребление сахарозы и самовведение сахарозы у крыс. Am. J. Physiol. Regul. Интегр. Комп. Physiol. 295, R388 – R394 (2008).
269. Patel, JC, Witkovsky, P., Coetzee, WA & Rice, ME Субсекундная регуляция высвобождения дофамина полосатым телом пресинаптическим K_АТФ каналы. J. Neurochem. 118, 721-736 (2011).
270. Теппер, Дж. М. и Болам, Дж. П. Функциональное разнообразие и специфичность неостриатальных интернейронов. Curr. Мнение. Neurobiol. 14. С. 685–692 (2004).
271. Zhou, FM, Liang, Y. & Dani, JA. Эндогенная никотиновая холинергическая активность регулирует высвобождение дофамина в полосатом теле. Nat. Neurosci. 4. С. 1224–1229 (2001).
272. Райс, М.Э. и Крэгг, С.Дж. Никотин усиливает сигналы дофамина в полосатом теле. Nat. Neurosci. 7. С. 583–584 (2004).
273. Чжан, Х. и Зульцер, Д. Частотно-зависимая модуляция высвобождения дофамина никотином. Nat. Neurosci. 7. С. 581–582 (2004).
274. Патель, Дж. К., Россиньол, Э., Райс, М. Е. и Махольд, Р. П. Противодействие регулированию высвобождения дофамина в полосатом теле и исследовательского моторного поведения холинергическими входами переднего мозга и ствола мозга. Nat. Commun. 3, 1172 (2012).
275. Threlfell, S. и др., Выделение стриатального дофамина инициируется синхронной активностью в холинергических интернейронах. Neuron 75, 58-64 (2012).
276. Cachope, R. и др., Селективная активация холинергических интернейронов увеличивает ускорение высвобождения дофамина ускорения: установка тона для обработки вознаграждения. Ячейка 2, 1-9 (2012).
277. Джонс, И. В., Болам, Дж. П. и Воннакотт, С. Пресинаптическая локализация иммунореактивности субъединицы бета2 никотинового ацетилхолинового рецептора в нигростриатальных дофаминергических нейронах крыс. J. Comp. Neurol. 439, 235–247 (2001).
278. Higley, MJ и др., Холинергические интернейроны опосредуют быструю VGluT3-зависимую глутаматергическую передачу в полосатом теле. PLOS ONE 6, e19155 (2011).
279. Touzani, K., Bodnar, R. & Sclafani, A. Активация дофаминовых D1-подобных рецепторов в прилежащем ядре имеет решающее значение для приобретения, но не для выражения вкусовых предпочтений, обусловленных питательными веществами, у крыс. Евро. J. Neurosci. 27, 1525–1533 (2008).
280. Склафани, А., Тузани, К. и Боднар, Р. Дж. Допамин и изученные пищевые предпочтения. Physiol. Behav. 104, 64–68 (2011).
281. Mayer, CM & Belsham, DD. Центральная передача сигналов инсулина ослабляется длительным воздействием инсулина через фосфорилирование серина субстрата-1 инсулинового рецептора, протеасомную деградацию и лизосомную деградацию рецептора инсулина. Эндокринология 151, 75–84 (2010).
282. Rice, ME, Patel, JC & Cragg, SJ Высвобождение допамина в базальных ганглиях. Неврология 198, 112–137 (2011).
283. Смит, Ю., Сюрмайер, Д. Д., Редгрейв, П. и Кимура, М. Вклад таламуса в переключение и подкрепление поведения, связанное с базальными ганглиями. J. Neurosci. 31, 16102–16106 (2011).
284. Threlfell, S. и др., Строящие мускариновые рецепторы способствуют активности зависимости передачи дофамина через различные рецепторные подтипы холинергических интернейронов в брюшном и спинном полосатом теле. J. Neurosci. 30, 3398-3408 (2010).
285. Хобель, Б.Г., Авена, Н.М. и Рада, П. Accumbens, баланс допамина и ацетилхолина при приближении и избегании. Curr. Мнение. Pharmacol. 7. С. 617–627 (2007).
286. Pothos, EN, Creese, I. и Hoebel, BG. Ограниченное питание с потерей веса выборочно снижает внеклеточный дофамин в прилежащем ядре и изменяет реакцию дофамина на амфетамин, морфин и прием пищи. J. Neurosci. 15, 6640–6650 (1995).
287. Гейгер, БМ и др., Дефицит мезолимбической дофаминовой нейротрансмиссии при диетическом ожирении крыс. Neuroscience 159, 1193-1199 (2009).
288. Моррис, JK и др., Инсулинорезистентность нарушает функцию догэмина. Exp. Neurol. 231, 171-180 (2011).
289. De Araujo, IE и др., Награда за питание в отсутствие сигнализации рецептора вкуса. Neuron 57, 930-941 (2008).
290. Стайс, Э., Спур, С., Бохон, С. и Смолл, Д.М. Связь между ожирением и притуплением стриатарной реакции на еду регулируется аллелем TaqIA A1. Science 322, 449–452 (2008).
291. Ванг, Дж. Дж. и др., Мозговое допамин и ожирение. Lancet 357, 354-357 (2001).
292. Джонсон, П.М. и Кенни, П.Дж. Дофаминовые рецепторы D2 при зависимой дисфункции вознаграждения и компульсивном переедании у тучных крыс. Nat. Neurosci. 13, 635–641 (2010).
293. Карр, К.Д., Ким, Г.-Й. & Cabeza de Vaca, S. Вознаграждающие и активирующие локомотор эффекты прямых агонистов дофаминовых рецепторов усиливаются хроническим ограничением пищи у крыс. Психофармакология (Berl.) 154, 420–428 (2001).
294. Левин Б.Е. и Кизи Р.Э. Защита различных заданных значений массы тела у крыс с ожирением и резистентных крыс, вызванных диетой. Am. J. Physiol. 274, R412 – R419 (1998).
295. Патель, Дж. К. и Райс, М. Е. Мониторинг высвобождения аксонального и соматодендритного дофамина с использованием циклической вольтамперометрии с быстрым сканированием в срезах мозга. Методы Мол. Биол. 96. С. 243–273 (2013).
296. Lee, CR, Witkovsky, P. & Rice, ME Регулирование активности GABAergic нейронов черной субстанции pars reticulata посредством H₂O₂ через чувствительные к флуфенамовой кислоте каналы и К_АТФ каналы. Фронт. Сист. Neurosci. 5, 14 (2011).
297. Чен, Б.Т., Моран, К.А., Авшалумов, М.В. и Райс, М.Э. Ограниченное регулирование высвобождения соматодендритного дофамина с помощью чувствительного к напряжению Ca²⁺ каналов, контрастирующих с сильной регуляцией высвобождения аксонового дофамина. J. Neurochem. 96, 645-655 (2006).
298. Li, X. и др., Усиленная трансплантация полосатого дофамина и моторные характеристики с избыточной экспрессией LRRK2 у мышей устраняются семейной мутацией болезни Паркинсона G2019S. J. Neurosci. 30, 1788-1797 (2010).
299. Wu, Q., Reith, MEA, Wightman, RM, Kawagoe, KT & Garris, PA Определение параметров выброса и поглощения на основе электрически вызванной динамики дофамина, измеренной с помощью вольтамперометрии в реальном времени. J. Neurosci. Методы 112, 119–133 (2001).
300. Чен Б.Т., Авшалумов М.В. и Райс, М.Е.₂O₂ представляет собой новый эндогенный модулятор высвобождения синаптического дофамина. J. Neurophysiol. 85, 2468-2476 (2001).
301. Витковский, П., Патель, Дж. К., Ли, С. Р. и Райс, М. Е. Иммуноцитохимическая идентификация белков, участвующих в высвобождении дофамина из соматодендритного компартмента дофаминергических нейронов нигранной кислоты. Neuroscience 164, 488–496 (2009).
302. Сугимото, К. и др., Рецептор инсулина в периферическом нерве крысы: его расположение и альтернативно сплайсированные изоформы. Диабет Метаб. Местожительство Rev. 16, 354-363 (2000).
303. Санчес-Алавез, М. и др., Инсулин вызывает гипертермию путем прямого ингибирования чувствительных к теплу нейронов. Диабет 59, 43-50 (2010).
304. Паксинос, Г. и Уотсон, К. Мозг крысы в ​​стереотаксических координатах, 6-е изд. Academic (2007).
305. Strubbe, JH & Mein, CG Увеличение количества корма в ответ на двустороннюю инъекцию антител к инсулину в VMH. Physiol Behav. 19, 309–313 (1977).
306. Paranjape, SA и др., Влияние инсулина в вентромедиальном гипоталамусе на секрецию глюкагона поджелудочной железы в естественных условиях, Диабет 59, 1521-1527 (2010).
307. Уайз, Р.А. и Хоффман, Д.К. Локализация механизмов поощрения лекарств с помощью внутричерепных инъекций. Synapse 10, 247–263 (1992).
308. Zhen, J., Maiti, S., Chen, N., Dutta, AK & Reith, MEA Взаимодействие между гидроксипиперидиновым аналогом 4- (2-бензгидрилоксиэтил) -1- (4-фторбензил) пиперидина и аспартатом 68 в переносчик дофамина человека. Евро. J. Pharmacol. 506, 17–26 (2004).

Скачать ссылки

Эти исследования были поддержаны грантами NIH DA033811 (MER, KDC и MEAR), NS036362 (MER), DA03956 (KDC) и NARSAD Independent Investigator Award (KDC). S961 был щедрым подарком от доктора Лауге Шаффера, Ново Нордиск. Антитела PP5 были щедрым подарком от Pfizer. Мы благодарим д-ра Чарльза Николсона, Школы медицины NYU, за программное обеспечение для извлечения V_Макс значения из данных FCV.