Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2011 Apr; 300 (4): R876-R884.
Опубликован онлайн 2011 Feb 9. DOI: 10.1152 / ajpregu.00655.2010
PMCID: PMC3075076
1,2 Абстрактные
Ранее сообщалось, что введение инсулина в дугообразное ядро гипоталамуса снижает мотивацию сахарозы, которую оценивают по задаче самообучения у крыс. Поскольку структура активации центральной нервной системы (ЦНС) в сочетании с сахарозным самоуправлением не оценивалась, в настоящем исследовании мы измеряли экспрессию c-Fos как показатель активации нейронов. Мы тренировали крыс для прессования сахарозы в соответствии с графиком с фиксированным отношением (FR) или прогрессивным соотношением (PR) и отображали экспрессию иммунореактивности c-Fos в ЦНС по сравнению с экспрессией c-Fos в контролируемых манипуляциях. Мы наблюдали уникальное выражение c-Fos в медиальном гипоталамусе (дугообразном, паравентрикулярном, ретрохиазматическом, дорсомедиальном и вентромедиальном ядрах) в связи с началом PR-эффективности и экспрессией c-Fos в латеральном гипоталамусе и ядре кровати stria terminalis в сочетании с началом работы FR. Экспрессия c-Fos была увеличена в прилежах ядра как крыс FR, так и PR. В нашем исследовании подчеркивается важность как схемы гомеостаза энергии гипоталамуса, так и лимбической схемы при выполнении задачи вознаграждения за питание. Учитывая роль медиального гипоталамуса в регуляции энергетического баланса, наше исследование показывает, что эта схема может способствовать регулированию вознаграждения в более широком контексте энергетического гомеостаза.
мезолимбическая дофаминергическая (DA) схема, включая вентральную тегментальную область (VTA) и проекции на полосатый и кортикальный участки, была определена как играющая решающую роль в мотивационных или полезных аспектах многочисленных классов наркотических средств (например,13, 22–24, 26, 48). Недавние исследования, проведенные в нашей лаборатории и другие, показывают, что эта схема также играет важную роль в мотивационных или полезных аспектах питания. Функциональное и анатомическое взаимодействие с электрической схемой, которая регулирует энергетический гомеостаз, предложено сообщениями о модуляции вознаграждения за питание по питательному статусу животных (10, 14, 16, 43). Модуляция вознаграждения, включая вознаграждение за питание, по питательному или метаболическому статусу, сильно зависит от нервных и эндокринных сигналов, включая инсулин (15), лептин (11, 18, 21, 30, 32), грелин (35), меланин-концентрационный гормон (MCH) (45) и орэксин (5, 7): присутствие рецепторов, биохимическая и клеточная эффективность, а также in vivo или поведенческая эффективность этих сигналов в центральной нервной системе (ЦНС) были в изобилии продемонстрированы в последние годы.
Аналогично показано, что расширенная лимбическая схема играет роль в кормлении и вознаграждении за питание (2, 19, 28). Тем не менее, есть дополнительные сайты CNS. Примечательно, что латеральный гипоталамус (ЛГ) уже давно известен как сайт, опосредующий поведение кормления и самостимуляции (4, 31). Орексинергические нейроны и сигнализация лептина в ЛГ были идентифицированы как важные для кормления и получения пищи (5, 29, 30). Недавно мы заметили, что инсулин, вводимый либо в третий желудочек головного мозга, либо в дугообразное ядро гипоталамуса (ARC), может уменьшать сахарозное самоуправление, но введение инсулина в VTA или ядро accumbens не влияло на эту специфическую парадигму награды (15). Таким образом, кажется, что множественные сайты гипоталамуса могут играть значительную роль в мотивированном поиске и приобретении пищи, и в соответствии с этим можно предположить, что области гипоталамуса в значительной степени активируются в связи с самообслуживанием пищи. Чтобы начать проверять эту гипотезу, мы отобразили выражение c-Fos в ЦНС крыс, обучающихся в парадигме самоуправляемости сахарозы, после тренировки с фиксированными коэффициентами (FR) или после прогрессивных отношений (PR), более строгая задача для оценки мотивации (20).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Предметы.
Испытуемыми были самцы крыс-альбиносов (325–425 г) от Simonsen (Гилрой, Калифорния). Крыс содержали на корме ad libitum. Их поддерживали в 12: 12-часовом цикле свет-темнота с включением света в 6 утра, и их тренировали и тестировали с 7 утра до полудня в постпрандиальном и постабсорбтивном состояниях. Все процедуры, выполняемые на крысах, следовали рекомендациям Национального института здоровья по уходу за животными и были одобрены Подкомитетом по уходу за животными и их использованию Комитета по исследованиям и разработкам в системе здравоохранения VA Puget Sound Health Care System.
Самоуправление сахарозой.
Процедуры были основаны на нашей опубликованной методологии (15) и проводили на кормящих крысах. Эксперимент включал три этапа: автоматическое обучение для начала обучения, тренировки FR и прогрессивные отношения (PR) с использованием алгоритма PR Ричардсона и Робертса (38). Алгоритм PR требует 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437, 575, 759, 999, 999 ( и т. д.) рычажные прессы для последующего вознаграждения в рамках сессии (38). Крыс обучали самообслуживанию 5% сахарозы (вознаграждение 0.5 мл), доставленному в емкость для жидких капель. Операторские ящики, контролируемые системой Med Associates (Грузия, VT), имели два рычага, но только один рычаг (активный, выдвижной рычаг) активировал инфузионный насос. Также были записаны прессы на другом рычаге (неактивный неподвижный рычаг). Как мы уже отмечали ранее, количество прессов на неактивном рычаге было очень низким (меньше, чем 10 нажатие / сеанс). Раствор сахарозы доставляли в емкость для приема жидкости для перорального потребления (Med Associates, St. Albans, VT). Начальное обучение проводилось в течение сеансов 1-h по непрерывному графику подкрепления (FR1: каждый рычажный пресс был усилен). Каждый сеанс начинался с вставки активного рычага и освещения белого дома, который оставался на всю сессию. Звук 5 (2900 Гц, 20 дБ выше фона) и свет (белый свет 7.5 W над активным рычагом) дискретный составной сигнал сопровождались каждой доставкой вознаграждения с тайм-аутом 20, начинающимся с доставки сахарозы. Обучение FR проводилось в течение 10 дней; стабильная реакция достигается на пятой сессии. PR-тренинг проводился для максимально возможного 3 h / day для дней 10. PR-сессии закончились после того, как 30 мин не нажал активного нажатия рычага, и в этот момент свет дома был отключен автоматически, и активный рычаг был отведен; крыс вывозили из палат и возвращали в свои домашние клетки. «Время остановки», о котором сообщается в Таблица 2 представляет время, в которое система была выключена; поэтому последним активным нажатием рычага был бы 30 мин до момента остановки. Поведенческие данные (Таблица 2) представляют средние значения сеансы 6–10 для обучения FR и сеансы 1–9 для обучения PR. Крысы с контрольной обработкой были взяты из жилого помещения и помещены в чистую камеру операнда с лампой для дома в течение 60 мин в процедурной комнате для имитации обработки и опыта помещения сахарозы, управляемой самцами. Им не давали ничего, чтобы есть или пить, находясь в коробках операндов, и не имели доступа к рычагам.
В последний день крыс помещали в камеры на тренировочные дни и держали в камерах в течение 90 минут, после чего их удаляли для анестезии, перфузии и последующей иммуногистохимии. Контрольных крыс аналогичным образом вводили в процедурную комнату и держали в чистой рабочей камере в течение дней обучения в течение 90 минут, после чего их анестезировали и перфузировали. Сразу после этого последнего 90-минутного сеанса крыс подвергали глубокой анестезии с помощью ингаляции изофлурана и перфузировали 0.9% NaCl, а затем холодным 4% раствором параформальдегида. Время для анестезии и эвтаназии основывалось на известной динамике пика экспрессии белка c-Fos через 90–120 мин после события. Таким образом, экспрессия c-Fos будет отражать активацию ЦНС в начале поведенческой задачи, а не быть результатом того, что животные испытывают эту задачу и глотают сахарозу. Мозги удаляли и подвергали последующей фиксации в параформальдегиде на несколько дней; затем их помещали в 20% раствор сахароза-PBS, после чего их помещали в 30% раствор сахароза-PBS. Мозг подвергали срезу на криостате (криостат Leica CM 3050S) для иммуногистохимии.
c-Fos иммуногистохимия и количественное определение.
Мы использовали нашу установленную методологию для количественного определения иммунореактивного белка c-Fos в срезах мозга (12). Первоначальный качественный экран всего мозга был проведен для выражения c-Fos. Скользящие 12-мкм цельные мозговые секции были промыты 3 раз в PBS (Oxoid, Hampshire, UK). Затем секторы блокировали для 1 h при комнатной температуре в PBS, содержащем нормальную косу или ослиную сыворотку 5%. Затем срезы промывали несколько раз в PBS и инкубировали в течение ночи при 4 ° C в растворах первичных антител, образованных в PBS. Разделы промывали три раза в PBS и затем инкубировали в темноте при комнатной температуре в растворе вторичных антител, образованном в PBS для 1 h. После этого срезы снова промывали в PBS и устанавливали и закрывали в монтажной среде Vectashield с твердым набором (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Цифровые изображения секций были получены с использованием флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse E-800, подключенного к оптической фотокамере, и программного обеспечения Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).
Впоследствии мы сосредоточили внимание на ограниченном числе областей, показывающих кажущуюся разницу между условиями, для количественного определения и фенотипированием нейронов. В частности, мы сосредоточились на ядре и силе ядра (NAc); переднее и заднее ядро постели стрии (aBNST, pBNST); медиальные области гипоталамуса [вентромедиальное ядро (VMH), дорсомедиальный гипоталамус (DMH), паравентрикулярное ядро (PVN), ретрохиазматическая область (RCh) и ARC]; латеральный гипоталамус (ЛГ), включая дорсальную и вентральную области и периморфную (peF) область; ВТ; ствола головного мозга [низшего оливкового, гипоглоссального (nXII) ядро уединенного тракта, бокового ретикулярного ядра и ядер адреналина / норадреналина C1 / A1]. Атласные сопоставленные секции 12-μm оценивали на выражение c-Fos и количественное определение в согласованных разделах и областях на основе атласа Paxinos и Watson (34). Посмотри пожалуйста Таблица 1 для конкретных стереотаксических координат. Основное внимание в анализах было сравнить каждую поведенческую задачу с ее соответствующим контролем (PR против PRC; FR против FRC). Для оптимизации возможных различий, основанных на поведении и контрольных условиях, для анализа были выбраны пиковые исполнители из групп PR и FR. Таким образом, были проанализированы крысы 4 / 12 PR и 3 / 12 FR: у этих крыс был активный номер пресс-рычага (первичная конечная точка поведения), которая превышала одно стандартное отклонение выше среднего для их соответствующей поведенческой группы. Был также проанализирован подкодр контрольных крыс (крысы 5 PRC и 3 FRC, присутствующие в процедурной комнате одновременно с крысами FR или PR). Еще одна группа из трех крыс была взята по процедуре FR («FRext»), чтобы имитировать добавленную продолжительность процедуры PR (т. Е. В общей сложности 20-дней, когда PR-крысы проходят через FR, а затем PR) для оценки того, различия между FR и PR были связаны с поведенческой задачей или продолжительностью процедуры. Фрагментные анализы не анализировались и не подвергались скринингу систематически, но конкретные области, представляющие интерес, анализировали с другими четырьмя группами, чтобы обеспечить сравнительное количественное определение, как конкретно указано в результатах.
Для количественного определения (при увеличении 40 ×) были выбраны атласные области. Программное обеспечение ImagePro Plus (Media Cybernetics) использовалось для захвата изображения нужной области. Для подсчета была определена область, и был установлен порог для положительного подсчета клеток. Одинаковая область и фон (порог) использовались для секций из соответствующих экспериментальных групп, а подсчет программных количеств положительных клеток (количественное определение) проводился в том же сеансе для всех экспериментальных групп, чтобы предотвратить межсессионные изменения в настройке фона. Для статистического анализа подсчет был взят у отдельной крысы только в том случае, если соответствующие или полные разделы по каждой области (как определено в Таблица 1); данные для конкретной области не были взяты у крысы, если было неполное двустороннее представительство в этой области.
Качественный двухметочный иммунофлюоресцентный анализ.
У крыс брали срезы мозга, у которых количественно определяли c-Fos, для иммуногистохимии с двойной меткой. Поскольку мы не хотели нарушать поведенческие характеристики животных, они не получали предварительной обработки колхицином для оптимизации визуализации пептидных нейротрансмиттеров. Следовательно, визуализация фенотипов нейронов, активированных в связи с задачей самоуправления, была ограничена. Однако, чтобы начать оценку фенотипов активированных нейронов в ряде участков ЦНС, были сделаны цифровые изображения (полученные, как описано в разделе выше) при 20-кратном, 40-кратном или 60-кратном (как указано в подписях к рисункам) увеличении. . Процедура двойного окрашивания на глутаматдекарбоксилазу (GAD), тирозингидроксилазу (TH), CRF, нейропептид Y (NPY), агути-родственный пептид (AgRP) и триптофангидроксилазу была сопоставима с анализом c-Fos-иммунореактивности на его собственные, за исключением того, что смесь c-Fos-Ab и одного из других первичных антител использовали для инкубации в течение ночи при 4 ° C; аналогично оба вторичных антитела находились в одном растворе и инкубировались в течение 1 ч в темноте при комнатной температуре. Для анализа орексина использовали 20-минутную промывку 50% этанолом перед стадией блокирования. Первоначальные анализы оптимизации были выполнены для определения подходящего разведения первичных антител. В качестве первичных используемых антител были кроличьи анти-c-Fos (1: 500) (sc-52) и мышиные анти-c-Fos (1: 800) (оба от Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния); мышиное антитело против GAD (1: 1,000), мышиное антитело против тирозингидроксилазы (1: 500) и овечье антитело против триптофангидроксилазы (все от Chemicon, Temecula, CA); кроличьи анти-CRF (1: 500) (подарок от доктора Вайли Вейл, Институт Солка, Калифорния); кроличьи анти-NPY (1: 1,000), кроличьи анти-AGRP (1: 1,000) и козий анти-орексин А (1: 5,000) - все от Phoenix Pharmaceutical (Сент-Джозеф, Миссури). В качестве вторичных антител использовали Cy3-конъюгированные козьи антикроличьи или антимышиные (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), козьи антимышиные или антикроличьи или ослиные антитела против овечьих IgG Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Юджин, ИЛИ) ; все вторичные антитела разводили 1: 500. Двойное иммуноокрашивание c-Fos / MCH анализировали серийно; во-первых, для MCH (первичное антитело 1: 2,500, Millipore) с вторичным антителом Alexa-488-goat против кролика (1: 500). Слайды повторно блокировали 5% нормальной козьей сывороткой и окрашивали на анти-c-Fos (1: 500) и cy3-козлиные антикроличьи антитела в качестве вторичных антител. Для анализа MCH использовали 20-минутную промывку 50% этанолом перед этапом блокирования.
Статистический анализ.
Групповые данные представлены в виде средств ± SE в тексте, таблицах и рисунках. Значение определяется как P ≤ 0.05. Статистические сравнения выполняются между экспериментальными группами (FR против PR) или между экспериментальными группами и соответствующими контролями (PR против PRC; FR против FRC) с использованием непарных критериев Стьюдента. t-контрольная работа. Коэффициенты корреляции Пирсона между активными нажатиями на рычаг и экспрессией c-Fos в различных областях мозга, а также корреляция экспрессии c-Fos между различными областями мозга в идентичных экспериментальных условиях были рассчитаны с использованием программы статистического анализа StatPlus: mac LE для версии Mac OS. 2009 г., компания AnalystSoft. Мы проверили линейные корреляции (Пирсона R статистика) между выражением c-Fos в разных областях ЦНС. Мы также рассмотрели корреляции между выражением c-Fos в разных активированных областях ЦНС и поведением. Для этих корреляций использовались данные FR и PR от крыс, для которых было проведено количественное определение c-Fos.
РЕЗУЛЬТАТЫ
c-Fos.
Как мы уже отмечали ранее, количество активных рычажных прессов было значительно больше для PR и FR-характеристик (Таблица 2), а количество вознаграждений сахарозы было больше во время работы FR. Длительность сеанса для PR-крыс составляла около 90 мин (время остановки - 30). Таблица 3 списки c-Fos иммунореактивных клеток во всех областях ЦНС, где проводилось количественное определение. Модель экспрессии c-Fos для крыс FR и PR суммирована в Рис 1, Существовала значительная активация медиального гипоталамуса (MHкарапуз, композиция ARC, PVN, RCh, DMH и VMH) крыс, вовлеченных в PR-рычаг, прессование для сахарозы, но без общей активации у крыс, вовлеченных в FR-рычаг, прессование для сахарозы по сравнению с соответствующими контрольными средствами. В медиальном гипоталамусе PR-крыс эта активация происходила в PVN, ARC и VMH (Рис 2). Нажатие рычага FR, но не прессование PR-рычага, было связано со значительной активацией внутри LH (основанной преимущественно на активации в периморфной области). Оба активных рычажных пресса и гипоталамическая экспрессия c-Fos были сопоставимы между FRext и FR группами (MHкарапуз, 946 ± 26 и 911 ± 118; ARC, 176 ± 18 и 186 ± 10; LHкарапуз, 468 ± 79 и 378 ± 34; LHpeF, 200 ± 31 и 173 ± 15 соответственно), что указывает на то, что разница в структуре выражений между группами FR и PR связана не с продолжительностью обучения / опытом, а с характером инструментальной задачи. Для FR-группы наблюдалось значительное увеличение экспрессии c-Fos в BNST, наблюдаемое как в aBNST, так и в pBNST. Как прессование FR, так и PR было связано с увеличением c-Fos-иммуноположительных нейронов в оболочке NAc; Количество c-Fos было значительно увеличено в ядре NAc у крыс, участвующих в нажатии FR-рычага, с незначительной тенденцией к увеличению экспрессии c-Fos у крыс, вовлеченных в нажатие рычага PR. c-Fos не был увеличен в VTA с задачей PR, хотя незначительная тенденция к увеличению наблюдалась с задачей FR. Наконец, c-Fos был значительно увеличен в ягодичном (черепном нерве XII) ядре в стволе мозга крыс, обученных для ОР, но не для FR.
Экспрессия c-Fos наблюдалась в других областях ЦНС, включая амигдала и кору головного мозга (Рис 3). Однако экспрессия наблюдалась как в контрольных условиях, так и в сочетании с задачами PR и FR, что указывало на то, что неспецифические аспекты процедуры (обработка, перемещение в процедурный кабинет) могли привести к этой активации. Количественное определение в этих регионах не проводилось. Аналогично, наблюдалась активация в областях ствола мозга, отличная от nXII, но возникала в связи как с контрольными, так и с задачами, также указывающими на роль неспецифического возбуждения или поведенческой активации.
Мы проверили корреляцию между экспрессией c-Fos в разных областях ЦНС. Объединив данные из групп, нажимающих на рычаг, мы обнаружили отрицательную корреляцию между экспрессией c-Fos в LH и VMH; таким образом, активация VMH была связана со снижением общей активации LH (Pearson's R, -0.7986; t = -3.7534; P = 0.0056). Кроме того, мы наблюдали значительную положительную корреляцию между экспрессией c-Fos в перифорникальной области LH и VTA (синдром Пирсона). R, 0.7772; t = 3.493; P = 0.0082), что соответствует известной моносинаптической связности между этими двумя областями (см. Обсуждение в [ 2 и 13). Мы обнаружили значительную отрицательную корреляцию между экспрессией c-Fos в VTA и NAc-оболочкой, независимо от того, тестировались ли отдельно на производительность FR (Пирсона R, -0.9262; t = -4.9125; P = 0.008) или для PR-выступления (Pearson's R, -0.9897; t = -9.7624; P = 0.0103), что согласуется с известными взаимными входами между полосатыми областями в основной нигр и VTA (2, 13). Мы также проверили корреляцию между экспрессией c-Fos в разных областях ЦНС и поведением. Комбинируя данные из групп нажатий на рычаг, мы наблюдали значительную положительную корреляцию между c-Fos в ARC и активными рычажными прессами (Pearson's R, 0.8208; t = 3.8017; P = 0.0067).
Идентификация нейронов, активированных в результате приема сахарозы и стимуляции сахарозы.
В стволе мозга c-Fos-положительные нейроны не показали положительного иммунного окрашивания для TH, ограничивающего скорость фермента для эпинефрина и норадреналина (и допамина); таким образом, эти катехоламинергические нейроны, по-видимому, не активировались с помощью FR или PR-задач. Однако некоторые c-Fos-положительные нейроны показали положительное иммунное окрашивание для триптофангидроксилазы, что указывает на активизацию популяции серотониновых нейронов. Как показано в Рис 4, в ARC c-Fos-позитивные клеточные тела были окружены волокнами, окрашенными AGRP, и наблюдалась аналогичная картина для иммунного окрашивания NPY-волокна / c-Fos (не показана). В PVN c-Fos-положительные нейроны, по-видимому, окружали CRF-положительные нейроны, но не наблюдалась колокализация (данные не показаны). Рис 5 показывает иммуноокрашивание как для orexin, так и для MCH в ЛГ. Орексиновые нейроны были обнаружены как в dLH, так и в peLH. Хотя мы наблюдали MCH-положительные нейроны в peLH, в этой области ЛГ по-прежнему не было колокализации с c-Fos. Однако мы наблюдали colocalization c-Fos в orexin-положительных нейронах в peLH (Рис 6, топ), и очень ограниченная c-Fos колокализация с MCH в vLH (Рис 6, нижний). Следует еще раз подчеркнуть, что как локализация, так и колокализация с помощью c-Fos могут быть недооценены для пептидных нейротрансмиттеров, таких как CRH, потому что крысы не были предварительно обработаны колхицином. Наконец, в ядре укладывается ядро и оболочка (Рис 7), c-Fos coimmunostaining с GAD, синтетическим ферментом для нейротрансмиттера GABA, наблюдали как для FR, так и для PR-крыс. Внутри VTA было устойчивое окрашивание для TH; однако c-Fos-положительные нейроны редко наблюдались и, по-видимому, не только колокализуются с TH.
ОБСУЖДЕНИЕ
В текущем исследовании мы использовали экспрессию раннего раннего гена c-Fos для оценки картины острой активации ЦНС, связанной с началом активности прессования рычага сахарозы, либо как относительно нетребовательная задача (FR), либо прогрессивно более сложную задачу, которая, как считается, отражает мотивированный поиск вознаграждения, такого как сахароза, и сильное вовлечение в лимбическую схему (22, 24, 49) (PR). Гипоталамические закономерности активации различались между двумя задачами: преобладание ЛГ / лимбической активации в задаче FR и медиальная гипоталамическая / лимбическая активация преобладали в PR-задаче (см. Рис 1). Для этого есть несколько возможных причин. Во-первых, эти парадигмы могут «отображать» как качественно разные переживания в ЦНС. Крысы, прошедшие тренировку в исполнении FR, ожидали бы легкой, высокой награды. Ожидание полезной пищи должно сильно влиять на картину c-Fos, наблюдаемую у крыс FR. Очевидное качественное различие в схеме активации позволяет предположить, что вторая вероятность того, что пиар-животные просто имеют больший опыт работы с задачей, менее вероятна, и это подтверждается нашим измерением c-Fos в гипоталамусе крыс, которые получали сеансы 20 FR , который показал активность, подобную группе FR, а не группу PR. Обе эти возможности могут быть протестированы путем систематического увеличения сложности обучения FR и оценки изменений в активации ЦНС, и в этом случае можно было бы предсказать качественное изменение в шаблоне активации. Однако, хотя количество опытов по обучению не учитывает схему активации ЦНС, среднее количество вознаграждений сахарозы в сеансе может: задача PR может быть просто изучена как «менее полезный» опыт, и это может быть функционально связано с отсутствие активации ЛГ. Таким образом, схема активации ЦНС в начале сеанса может отражать интероцептивное состояние, такое как парадигма условного места: сила активации в лимбической схеме связана с обучением и мотивацией. Мы наблюдали изменчивость экспрессии c-Fos в медиальном гипоталамусе животных FRC. В частности, в пределах PVN эта изменчивость может маскировать активацию у крыс FR, для которых наблюдалась тенденция к увеличению крыс c-Fos против FRC (Таблица 3). Однако общая медиальная гипоталамическая активация не отличалась между животными FR и FRC.
Следует отметить, что, хотя наша цель заключалась в том, чтобы идентифицировать сайты ЦНС, которые способствуют началу поведения, временное разрешение в некоторой степени является предметом рассмотрения. Как обсуждается ниже, теперь стало понятно, что различные подкомпоненты инструментального или оперантного поведения опосредуются активацией различных популяций нейронов (13, 23, 33, 49). Мы не можем полностью исключить, что активация из-за очень быстрого прессования или лизания вознаграждений, возможно, несколько способствовала активационным закономерностям, которые мы наблюдали. Наши результаты дают основание для дальнейшего изучения роли конкретных сайтов ЦНС в разных аспектах или компонентах задачи самоорганизации, а также для таких исследований, измерения других немедленных ранних генов с различными «включенными» и «выключенными» временными циклами (36) будет очень полезна.
Корреляции, обнаруженные в экспрессии c-Fos между различными областями мозга, поддерживают известную функциональную связность гипоталамических и первичных лимбических областей для этой конкретной задачи вознаграждения, например, между ЛГ и ВМГ, а также между периморфной областью ЛГ и ВТА (см. обсуждение в [ 2 и 13). Мы также рассмотрели корреляции между выражением c-Fos в разных активированных областях и поведением. Корреляция между c-Fos в ARC и активными рычажными прессами соответствует четко определенной роли активности ARC в потреблении пищи (1); с нашим предыдущим наблюдением, что инъекция инсулина специфически в ARC уменьшала сахарозу самоуправление (15); с предшествующими сообщениями о критической роли АРК и его эндорфинергических нейронов при приобретении и эффективности самообслуживания кокаина (40–42); и с идентифицированными проекциями от ARC к NAc (17). Таким образом, ARC, вероятно, играет ключевую роль в мотивированном поведении, чтобы искать и получать множество видов полезных стимулов, включая, помимо прочего, пищу. Наконец, мы наблюдали значительную активацию PVN и VMH с началом поиска PR сахарозы. Это согласуется с хорошо охарактеризованной ролью этих медиальных ядер гипоталамуса в регуляции потребления пищи, прямой синаптической связности с АРК и идентифицированных связей с лимбической схемой (1, 27, 37).
Мы обнаружили значительную отрицательную корреляцию между выражением c-Fos в VTA по сравнению с NAc-оболочкой, независимо от того, были ли они проверены на эффективность FR или PR. Было несколько удивительно, что более сильная активация VTA не наблюдалась в связи с самоуправлением PR или FR сахарозы (по сравнению с соответствующими контрольными средствами). Возможно, этот вывод отражает сроки нашего измерения, сосредоточив внимание на потенциальных сайтах ЦНС, активных в начале задачи, для которых эти животные были хорошо обучены. Это соответствовало бы наблюдениям и тезису Шульца (44), что активация допамин-нейронов служит маркером неожиданных стимулов или вознаграждений, и эта активация уменьшается в связи с обучением. Тем не менее, стриатальное высвобождение допамина во время приема сахарозы у обученных животных было показано как очень точное и временное дискретное событие (39). Таким образом, возможно, что тенденции, которые мы наблюдали, были бы сильно значимыми с более крупной исследовательской группой (т. Е. Большей статистической мощностью). Мы наблюдали активацию NAc в связи с началом приема сахарозы FR и PR. Сообщалось, что как активация, так и ингибирование нейронов NAc связаны с производительностью инструментального вознаграждения, а структура активации / активности зависит от обучения и окружающей среды и связана с различными компонентами поведения (например, ориентирование, подход, потребление) (6, 33, 50). Как обсуждалось выше, измерение c-Fos не будет фиксировать такую специфическую активность. Карлезон предположил, что «вознаграждение» преимущественно связано с уменьшением активности нейронов NAc, то есть средних колючих нейронов (3). Это не согласуется с нашими наблюдениями - существенно улучшенным NAc c-Fos по сравнению с контролем управления и c-Fos-положительными нейронами, colocalized с GAD, согласующимися с активацией средних колючих нейронов (GABAergic), - но мы специально не оценивали нейронное «ингибирование NAc» ». Активация и ингибирование NAc могут возникать во время инструментальных задач с анатомической и временной характеристикой. С точки зрения этого исследования можно сделать вывод, что NAc участвует в начале инструментальной сахарозы, а ядро NAc способствует активации моторики и оболочке NAc, способствуя как двигательным, так и мотивационным аспектам задачи.
Мы также наблюдали активацию обеих основных областей BNST (переднего и заднего) у крыс FR. BNST представляет собой часть лимбической схемы, которая модулирует нейроэндокринные ответы на повторные стимулы (8, 9), и в большем смысле связано с изучением повторяющихся стимулов. Хотя его роль была выяснена наиболее полно в отношении повторных стрессовых переживаний, наш вывод предполагает более широкую роль BNST: BNST может модулировать ответы ЦНС на повторяющиеся положительные, а также негативные или стрессовые стимулы. Поскольку мы наблюдали эту активацию в начале FR, но не PR, производительность, вербовка BNST может быть привязана к повышенным сахарозным вознаграждениям обучения FR. Наше наблюдение отсутствия прямой активации нейронов CRF свидетельствует о том, что инструментальное реагирование на сахарозу не является основным стрессором; однако экспрессия c-Fos в других нейронах PVN согласуется с модуляцией схемы напряжения (46). Фактически, Ульрих-Лай и его коллеги сообщили, что, используя другую диету / кормовую парадигму, потребление сахарозы модулирует функцию PVN (47). Наконец, мы наблюдали активацию ядра гипоглоссального нерва в сочетании с PR, но не с эффективностью FR. Значение этого можно только предположить; одна из возможностей заключается в том, что вкус сахарозы может быть повышен у крыс, которые поглощают меньше сахарозы.
Поиск сахарозы и сахароза следует рассматривать как мультимодальный опыт, динамический по времени, поскольку при проглатывании будут возникать периферические сигналы, связанные с калорийностью сахарозы, а также привыкание и внутрисессионная аллергия (25). В то время как в наших исследованиях основное внимание уделялось влиянию периферических эндокринных сигналов, то есть инсулина и лептина, чтобы модулировать награду за питание, их воздействие, в свою очередь, может быть непосредственно опосредованно централизованно передатчиками и нейропептидами, которые играют роль в краткосрочной или долгосрочной перспективе кормление или питание (см. обсуждение в [ 14). Настоящее исследование дает некоторое представление об этом; мы наблюдали некоторую активацию нейронов, которые экспрессируют либо MCH, либо orexin, два нейропептида, которые являются orexigenic. Эти данные могут, по сути, недооценивать роль MCH или orexin в вознаграждении за питание, поскольку иммуноцитохимия у крыс, не получавших колхицин, без сомнения ограничивает визуализацию обоих этих нейропептидов. Идентификация активированных нейронов нейронов в ЛГ в целом согласуется с многочисленными исследованиями, в которых участвуют нейроны ориксина при кормлении, вознаграждении за питание и более общем вознаграждении за стимулы (например, 5, 7, 29). Мы наблюдали активацию нейронов перефлексина. Астон-Джонс и его коллеги (5) расчленяли роли разных популяций нейронов LH orexin в поощрительном поведении и участвовали в нейронах peFLH orexin в возбуждении, в отличие от вознаграждения как такового. Таким образом, наш вывод указывает на роль LH-орексина в возбуждении и, возможно, ориентацию на активный рычаг или сигналы для приема сахарозы.
Достойным будущего рассмотрения является уникальность или обобщаемость сахарозы в качестве полезного стимула. Остается еще неизвестным, будет ли определяться модель ранней активации ЦНС, которую мы сообщаем здесь, для пищи в качестве стимула или обобщения других полезных стимулов. Как упоминалось выше, в частности, в задаче FR, ожидается, что прием ряда сахарозных вознаграждений будет иметь метаболические последствия с модуляцией высвобождения гормонов (например, холецистокинин, грелин, инсулин) и изменениями периферической и нейронной активации ЦНС. Эти изменения, как ожидается, не будут играть прямую роль в ранних стадиях активации ЦНС, которые мы измеряли, но можем играть определенную роль в изучении вознаграждения сахарозы во время обучения. Опять же, нейропептиды, такие как орэсин, могут быть критически связаны.
Наше исследование представляет, насколько нам известно, первую демонстрацию активации конкретных медиальных клеток гипоталамуса в начале сахарозы, включая как PVN, вовлеченный в гомеостаз и стрессовую чувствительность, так и ARC, что имеет решающее значение для энергетического гомеостаза, чувствительность питательных веществ и регулирование приема пищи. Важно отметить, что мы наблюдали активацию медиального гипоталамуса и NAc в сочетании с началом ОР, что указывало на то, что как гомеостатические, так и некоторые лимбические сайты играют роль в инициировании сахарозы самообслуживания. Дополнительные участки конечной схемы могут быть завербованы на более поздний момент времени в задаче.
Перспективы и значение
В то время как исторически исследования мотивационного и поощрительного поведения наиболее сильно влияют на лимбическую схему ЦНС, накоплено большое количество доказательств, что подчеркивает критическое функциональное взаимодействие между цепями лимбического и энергетического гомеостаза. Нынешнее исследование теперь предполагает вероятную важность конкретных медиальных ядер гипоталамуса в мотивированной работе для сахарозы. Экстраполируя из этого исследования, будущие исследования могут оценить, необходима ли роль медиального гипоталамуса и связана ли его активация с мотивированным поиском других вознаграждений, таких как наркотики злоупотребления. Кроме того, результаты этого исследования дают обоснование для изучения изменений мотивированного поведения в обстоятельствах, связанных с измененной медиальной гипоталамической физиологией, например, при ожирении.
ГРАНТЫ
Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения Грант DK40963. Д-р Диана Фиглевич Латтемэнн - старший научный сотрудник по научной работе, Биомедицинская исследовательская лаборатория, Департамент по делам ветеранов. Система здравоохранения Пьюджет-Саунд, Сиэтл, Вашингтон. Д-р Sipols поддерживается Латвийским Советом Наук Грант 04.1116.
Авторы
Мы благодарим доктора. Явин Шахам, Стивен Бенуа, Кристин Турениус и Дж. Б. Блевинс за советы и полезные обсуждения.
Ссылки
;
