Физиол Бехав, Авторская рукопись; доступно в PMC 2014 Apr 10.
Physiol Behav. 2013 Apr 10; 0: 21-31.
Опубликован онлайн 2013 Мар 13. DOI: 10.1016 / j.physbeh.2013.03.005
PMCID: PMC3648600
NIHMSID: NIHMS455916
Сильви Ларде, Джеймс Дж. Кимкачества Салеем М. Никола*
Абстрактные
Расстройства пищевого поведения, вызванные пищей, характеризуются дискретными эпизодами быстрого и чрезмерного потребления пищи. У крыс, предоставляя прерывистый доступ к сладкой жирной пище, имитирует этот аспект выпивки. Эти модели обычно используют твердую пищу; однако общее количество потребляемого вещества зависит от мотивации, вкуса и сытости, которые трудно отделить от твердой пищи. Напротив, лизать микроструктурный анализ можно использовать для диссоциации этих параметров, когда глотатель является жидкостью. Поэтому мы разработали модель выпивки с использованием жидкой эмульсии, состоящей из кукурузного масла, тяжелых сливок и сахара. Мы показываем, что крысы, получающие прерывистый доступ к этой эмульсии с высоким содержанием жиров, развивают подобное поведению поведение, сравнимое с тем, которое ранее наблюдалось с твердой высокожирной пищей. Одной из особенностей этого поведения была постепенная эскалация потребления в течение 2.5 недельного прерывистого доступа, который не наблюдался у крыс, которым давали жидкость с низким содержанием жира в том же графике доступа. Анализ микроструктуры лижет свидетельствует о том, что эта эскалация была обусловлена, по крайней мере, частично увеличением как мотивации к потреблению, так и потреблению вкуса.
1. Введение
Расстройства пищевого поведения являются самыми распространенными и сложными психическими заболеваниями [1, 2]. Поиск эффективных методов лечения зависит от более глубокого понимания лежащих в основе нейронных механизмов. С этой целью было разработано несколько животных моделей выпивки. Хотя они существенно различаются по своим деталям, общим для многих из них является прерывистое представление высокоприменимых жирных и / или сладких пищевых продуктов [2–4]. В течение нескольких недель доступа потребление крыс вкусной пищи во время периодов доступа постепенно возрастает [5–12], так что калория в дни доступа приближается к тому, что крысы получают непрерывный доступ к той же калорийно-плотной пище [7, 8, 10, 13–15]. Кроме того, если доступ к обезжиренной пище предоставляется через день, крысы сокращают потребление менее калорийной пищи, доступной в другое время [10, 11, 16]. Эта картина похожа на цикл выпивки-абстиненции, характерный для расстройств расстройства пищевого поведения, и соответствует оперативному определению употребления выпивки: потребление большего количества пищи, чем в противном случае было бы потреблено за аналогичный период при отсутствии прерывистого графика доступа [3, 4].
Хотя модели грызунов выпивки не отражают сложные социальные и психологические проблемы, которые способствуют расстройствам питания человека, они предоставляют средства для изучения эффектов прерывистого перелета на мозговые процессы, которые регулируют потребление. Ряд нейрохимических изменений был связан с периодическим потреблением прерывистого доступа в течение длительных периодов (т. Е. Несколько недель) [17, 18]. Например, в ядре accumbens (NAc), bingeing на сладком или высокожировом пище приводит к повышенному выходу дофамина [14, 19, 20], усиление транспортера допамина [21], снижение связывания рецептора дофаминового D2 [22] и повышенной экспрессии дофаминовых рецепторов D1 [8]. Поскольку NAc допамин способствует пищевым потребностям [23], эти результаты показывают, что мотивация искать пищу может быть изменена в bingeing предметов. Кроме того, экспрессия μ-опиоидных рецепторов в NAc увеличивается у животных-бингвинов. Поскольку поведенческая роль опиоидергической нейротрансмиссии в NAc может заключаться в регулировании вкусовых качеств потребляемой пищи [24, 25] или для ограничения эффектов насыщения [26], изменения в нейронных механизмах, ответственных за потребление и насыщение вкуса, могут также способствовать регулированию потребления во время bingeing. Поэтому, чтобы получить дальнейшее понимание поведенческих и нейронных процессов, лежащих в основе bingeing, необходимо отделить вклад мотивации, вкуса и насыщенности в потребление алкоголя.
Для достижения этой диссоциации доступны несколько средств. Например, фиктивное питание [27] и внутрижелудочную загрузку питательных веществ [28, 29] можно использовать для выделения эффектов насыщения; тест на реактивность на вкус оценивают вкусовые качества [30]; и оперативные задачи, такие как графики прогрессивных соотношений, обеспечивают прямые меры мотивации [31–33]. Альтернативно, временная структура потребления в периоды доступа может быть детально измерена, обеспечивая понимание всех трех процессов в одном простом эксперименте. В частности, скорость снижения потребления с начала приема пищи, латентность для начала потребления и начальная норма потребления являются относительно независимыми показателями сытости, мотивации и вкуса соответственно [34–37]. Эти параметры наиболее легко измеряются для жидких поглотителей, поскольку коммерчески доступные ликерометры обеспечивают недорогое и эффективное средство для получения точных временных меток консистентного поведения. Кроме того, этот метод позволяет анализировать количество и длину лизкового пакета, которые связаны с мотивацией и вкусовыми способностями соответственно [36–38]. Таким образом, использование крыс с выпивкой с жидким глотателем в ликерометрах позволило бы экспериментатору быстро получить доказательства дифференциального влияния манипуляций с нейронными цепями (например, микроинъекций мозга) на конкретные аспекты потребления выпивки.
Поэтому целью этого исследования является разработка модели прерывистого доступа, использующей плотную жидкость с калорийностью. Хотя в предыдущих исследованиях использовались растворы сахарозы для установления bingeing [7, 39, 40], долгосрочная цель наших экспериментов состоит в том, чтобы исследовать вклад μ опиоидных рецепторов в потребление пива, и эти рецепторы могут преимущественно регулировать вкусовые качества и потребление жира [25]. Для обезжирения использовались жиры с высоким содержанием жиров, включая укорочение, смеси укорочения и сахара, а также обогащенный жирами чау-чау [5, 10, 11, 13, 16, 41, 42]. Однако, хотя предыдущие исследования обеспечивали периодический доступ к жиру с высоким содержанием жиров [35], насколько нам известно, модель выпивки, использующая сладкую жирную жидкость, не была подробно описана. Здесь мы демонстрируем такую модель, основанную на протоколе, разработанном Корвином и его коллегами, в котором крысам дают доступ через три дня в неделю к смесям твердого жира и сахара [16]. Мы модифицировали эту процедуру, используя жидкую эмульсию тяжелых сливок, кукурузного масла и сахара (COS), которые поставлялись в пробирках с липкометром, а не в твердой смеси жиров и сахара. Потребление Chow и COS, а также вес тела сравнивались с контрольной группой, получавшей непрерывный доступ к COS или без доступа к COS.
Мы предсказали, что потребление в группе прерывистого доступа будет быстро увеличиваться с первого до последующего периодов доступа, так как крысы учатся потреблять жидкость и преодолевать неофобию. Тем не менее, длительный прерывистый доступ к высоким содержанием жиров приводит к постепенному увеличению потребления, которое явно возникает после первоначального обучения [5, 6, 10–12]. Неизвестно, обусловлена ли эта постепенная эскалация изменением мотивации, вкуса или сытости. Чтобы проверить гипотезу о том, что повышенное потребление, по крайней мере, частично связано с повышенной мотивацией и вкусом, мы сравнили образцы лиза у крыс, получавших COS, с контрольной группой с учетом менее калорийного раствора крема и сахара (CS) в рамках того же графика доступа. Хотя обе группы показали быстрый быстрый рост потребления, группа COS продемонстрировала дальнейшее постепенное увеличение в периоды прерывистого доступа 7, и это постепенное увеличение было по меньшей мере частично результатом повышения мотивации и вкуса. Результаты показывают, что поглощение высококалорийными продуктами глотания связано с повышенным потреблением стимулов и вкуса, и что эти увеличения являются результатом длительного процесса, отличного от первоначального обучения и сокращения неофобии.
2. материалы и методы
Животные 2.1
Самцы Long-Evans крысы (n = 144), взвешивающие 275-300 g, были получены из Harlan и размещены в комнате с 12 h, 12 h off light cycle. Эксперименты проводились во время легкой фазы. Животные привыкли к ежедневному обращению в течение как минимум одной недели перед началом экспериментов. За это время ежедневное потребление чау и вес тела измерялось ежедневно. До начала эксперимента три группы крыс соответствовали среднему количеству потребляемой чау и средней массе тела. Все процедуры на животных были совместимы с Руководством Национального института здравоохранения США по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетом по уходу и использованию в учреждениях медицинского колледжа Альберта Эйнштейна.
Поведение 2.2
2.2.1. Операнные камеры
Все поведенческие эксперименты проводились в стандартных оперантных камерах Med Associates (30 x 25 см). Камеры были освещены одним светом белого света 28 V, и во время эксперимента белый шум (65 dB) воспроизводился через специальный громкоговоритель. Это и меламиновый шкаф, вмещающий каждую коробку, гарантировали, что минимальный внешний шум отвлекает животных. Оперантные камеры были оснащены двумя ликометрами, один пустым и одним заполненным жидкой эмульсией масло-масло-сахароза (COS). Во всех экспериментах фотобумаги на ликометрах использовались для определения времени лизиса с временным разрешением 1 msec.
2.2.2. Ingestants
Густые сливки, используемые для COS и CS, содержали 5 г жира, 1 г углеводов и 1 г белка на 15 мл. Эмульсию COS готовили ежедневно, смешивая по 500 мл жирных сливок и кукурузного масла с 80 г сахарозы и 1 г стеароиллактилата натрия (Niacet Corporation), эмульгатором. Эмульсия, приготовленная с использованием проволочного венчика, была стабильной в течение> 24 часов; через 24 часа можно было наблюдать видимое разделение масляной и водной фаз. Менее жирный и менее калорийный раствор крем-сахарозы (CS) использовали в отдельной группе животных; CS получали смешиванием 1 л жирных сливок с 80 г сахарозы. Калорийность COS составляла 5.99 кКал / мл; значение CS составило 3.65 ккал / мл; а для корма (PMI LabDiet 5001) - 3.02 кКал / г.
2.2.3. Процедура прерывистого доступа
Крысы были разделены на три группы: группа прерывистого доступа (выпивка) (ICOS; n = 46), группа непрерывного доступа (CCOS; n = 36), а контрольная группа не имеет доступа к COS (NCOS; п = 38). (Количество крыс было большим, потому что крысы впоследствии использовались для фармакологических экспериментов для сравнения эффектов лекарств в разных группах, эти результаты здесь не сообщаются.) В течение 5 недель ICOS и CCOS группы имели доступ к лизометру, содержащему COS в оперантных камерах три раза в неделю (понедельник, среда и пятница, MWF) для 90 мин. СCOS группа также вволю доступ к COS всегда в их домашних клетках. Временные метки Лика и потребление COS были записаны во время сеансов доступа. Масса тела, потребление пищи и (для СCOS группа) Потребление COS в домашней клетке регистрировалось ежедневно с понедельника по пятницу; поэтому измерения 25 сообщаются для недельного эксперимента 5 (Рис. 2A, D, В, Е; 3A, С). По понедельникам эти меры были разделены на три для нормализации на выходные. Сравнение потребления чаутов за день до дня после сеанса доступа (Рис. 2C, F; 3B, D) были сделаны два раза в неделю (для сравнения 10 в 5 неделях). ЗатемCOS крысы были приобретены одновременно с другими группами и содержались в одной колонии, но им не был предоставлен доступ к COS. вволю доступ к чау и воде всегда в домашней клетке.
В отдельном эксперименте использовалось менее калорическое решение CS вместо COS. В этом эксперименте использовались три группы крыс (n = 8 каждый), ICS, CCS и нCS, и их обрабатывали точно так же, как ICOS, CCOS и нCOS группы, описанные выше, за исключением того, что CS был заменен COS. NCOS и нCS группы обрабатывались одинаково (без доступа к COS или CS); разница заключалась в том, что NCOS группа была сохранена в колонии одновременно с ICOS и CCOS групп, тогда как NCS группа поддерживалась одновременно с ICS и CCS группы.
2.3. Анализ данных
2.3.1. Статистика
Повторные измерения ANOVA с одним фактором (днями) или двумя факторами (дни и группы) использовались для сравнения эффектов bingeing и контрольных процедур. За ANOVA последовал Холм-Сидак Постфактум тесты; скорректированный p <0.05 считалось значимым различием. Результаты ANOVA представлены в Таблица 1, Чтобы определить, увеличилось ли потребление в течение последовательных сеансов доступа, данные с дня 2 до дня 8 были установлены на линейную модель с использованием регрессии наименьших квадратов. Наклон в эти дни был оценен для значительного отличия от 0, а склоны сравнивались между ICOS и яCS групп, использующих ANCOVA. Все анализы выполнялись с использованием программной среды R [43].
2.3.2. Ликающая микроструктура
Лик было определено как количество ликов в секунду. Начальная скорость лиза определялась как скорость лизать в течение минуты, начинающейся с первого лиза первого всплеска сеанса [35–37, 44], а латентность до первого лиза определялась как время от начала сеанса до этого лиза. Всплески были определены как группы лизаний, разделенных ИЛИ> 1 с (т. е. прекращение всплеска определялось началом ИЛИ> 1 с). Длительность и размер пакета относятся к времени, охватываемому пакетом и количеством ликов в этом пакете, соответственно. Рассматривались только очередные три или более лиза. Поскольку наибольшее потребление приходилось на начало сеанса, анализы микроструктуры облизывались не только для сеанса в целом, но и отдельно для двух фаз: начало сеанса (первый квартал или 22.5 мин) сеанса 90 min ) и конец сеанса (последние кварталы 3).
3. Результаты
3.1. Общий расход и вес тела
Крысы в ICOS (Временный доступ к COS) группа имела 5 недель доступа к крему (50% об. / Об.), Маслам (50% об. / Об.) И жидкой эмульсии сахара (8% мас. / Об.) В дни испытаний: по понедельникам , Средам и пятницам (и никакого доступа к COS в любое другое время). COS был доставлен ликометром в периоды доступа 90 min в оперантных камерах. В течение 5 недель прерывистого доступа объем потребляемой COS неуклонно возрастал: в день доступа 15 (в конце 5th неделя), потребляемая сумма была значительно выше, чем в дни 1 до 10, а количества, потребляемые в дни 6 до 15, были больше, чем в дни 1, 2 или 3 (Рис. 1A). В отличие от ICOS группы, крыс в СCOS группа (непрерывный доступ к COS) имела доступ к COS не только в оперантной камере во время периода доступа 90, но также и в домашней клетке в любое другое время. Как и ожидалось, CCOS группа потребляла гораздо меньше COS, чем ICOS группа в оперантных камерах во всех сеансах после первого и не показывала различий потребления в днях доступа 15 (Рис. 1A).
В отличие от эффектов, наблюдаемых в ICOS группе, потребляемая сумма не увеличилась за несколько недель за ICS группа, которая имела доступ к CS, раствор с низким содержанием жира / сахара. Эти крысы демонстрировали низкий уровень потребления в первой сессии доступа, и хотя потребление на большей части последующих сессий (как правило, больше, чем внутрикамерное потребление на CCS группа), не было никаких дополнительных увеличений в течение нескольких дней (1B). Отсутствие статистически значимого эффекта дней в ICS группа контрастирует с сильным эффектом дней в ICOS группа (Таблица 1); однако это различие может, теоретически, возникнуть из меньшего числа субъектов (и, следовательно, статистической мощности) в ICS группа. Поэтому мы сломали ICOS группы в подгруппы 6 сопоставимого размера с ICS group (N = 8 для 5 ICOS подгруппы, N = 6 для одной подгруппы; предметы в каждой подгруппе обучались вместе). Значительное увеличение потребления COS в 5 6 ICOS подгруппы (эффект дней: группа 1: F(14,211) = 5.87, P <0.001; группа 2: F(14,210) = 4.06, р <0.001; группа 3: F(14,200) = 4.83, р <0.001; группа 4: F(14,196) = 7.98, р <0.001; группа 5: F(14,74) = 1.87, р <0.05); в оставшейся подгруппе эффект приблизился к значимости (F(14,141) = 1.72, p = 0.058). В ICS однако, не было доказательств даже тенденции к существенному эффекту (p = 0.56; Таблица 1). Поэтому отсутствие значительного эффекта дней в ICS крыс вряд ли будет из-за отсутствия статистической мощности.
Эти результаты показывают, что яCS крысы научились потреблять КС и преодолевать неофобию в течение одной сессии, в результате чего их потребление достигло плато на второй сессии. Поскольку начальное обучение и эффекты неофобии должны быть одинаковыми для ICOS и яCS групп, значительное увеличение потребления в ICOS группа с дня 1 до дня 2 (Рис. 1A), вероятно, связано с начальным обучением и сокращением неофобии. Однако более постепенное увеличение в последующие дни несовместимо с этими процессами. Поэтому, чтобы изолировать постепенное увеличение потребления (Рис. 1A) и другие завершающие меры (Рис. 5 и and6) 6) от начального обучения и эффектов неофобии, мы сравниваем потребление на все отдельные дни с базовым потреблением в дни 2 и 3.
Ранний эффект плато в ICS группа резко контрастирует с постепенной эскалацией, наблюдаемой в ICOS группа, которая достигла плато в день 8. Чтобы прямо сравнить скорость увеличения потребления после первого дня в ICOS и яCS групп, мы рассчитали наклон увеличения от дня 2 до дня 8 (Рис. 1C). В то время как наклон был положительным и значительно отличался от 0 для ICOS группа, она не сильно отличалась от 0 для ICS группа. Кроме того, в 5 6 I наблюдался значительно положительный наклонCOS подгруппы, описанные выше (не показаны). Кроме того, сравнение наклонов в ICOS и яCS группы, использующие ANCOVA, показали значительное различие между двумя группами (Рис. 1C). Поэтому ICOS группа продемонстрировала постепенную эскалацию потребления в периоды прерывистого доступа, которые нелегко объяснить из-за начального обучения или уменьшения неофобии. Эта постепенная эскалация аналогична наблюдаемой ранее для крыс с периодическим доступом к твердой высокожирной пище [5, 6, 10–12].
Потенциальное альтернативное объяснение постепенной эскалации потребления в ICOS группа состоит в том, что крысы постепенно научились получать больше COS за лижу. Чтобы проверить эту гипотезу, мы сравнили количество лиз на мл жидкости, потребляемой через ICOS и яCS групп и через дни доступа, используя двухфакторный ANOVA. ЯCOS группа лизала более эффективно, чем яCS группа (общее среднее значение в сеансах 15: COS: 315.0 ± 52.3 licks / mL; CS: 418.3 ± 106.4 licks / mL; F(1,719) = 13.6; p <0.001) и влияние дней доступа (F(14,719) = 1.8; p = 0.04), но никакого взаимодействия (F(14,719) = 0.5; p = 0.9). Пост-ходовые тесты показали, что эффект дней был обусловлен значительным повышением эффективности с первого дня до второго, но дальнейшее увеличение в последующих сеансах не увеличилось. Поэтому постепенная эскалация потребления в ICOS группа не может быть отнесена к изменениям эффективности лизать.
Другим потенциально смешающим фактором является наличие эмульгатора (натрийстеароиллактилата) в COS, но не CS: ICOS крысы могли изначально избегать COS из-за присутствия эмульгатора. Поскольку невозможно получить COS без эмульгатора, мы проверили гипотезу о том, что крысы избегают эмульгатора, используемого для приготовления COS, сравнивая потребление CS и CS + 0.1% стеароиллактилата натрия (вес / объем). Шести наивным крысам-самцам одновременно давали бутылочки, содержащие обе жидкости, на 1 час в домашней клетке. Этот опыт был повторен дважды после одного дня привыкания; относительное положение бутылок менялось между днями, чтобы избежать бокового смещения. В последних двух сеансах доступа крысы пили одинаковое количество CS (4.2 ± 0.8 мл) и CS + эмульгатор (5.4 ± 0.4 мл; t-критерий p> 0.05). Поэтому крысы не избегают эмульгатора.
В течение 5 недель ICOS и CCOS группы потребляли постепенно менее свободно доступную чау в домашней клетке. СCOS группа потребляла относительно небольшую чау (Рис. 2A), но из-за потребления больших количеств COS все еще потреблялось больше калорий в день, чем NCOS контрольная группа, которая не имела доступа к COS (2B). ЯCOS группа продемонстрировала большие и регулярные колебания потребления чау-чау (Рис. 2A), причем крысы в этой группе потребляют больше чау за день до доступа к COS и меньше в 24 hr после доступа COS (Рис. 2C). Напротив, ни NCOS ни CCOS группы отличались своим потреблением в чае непосредственно до и после периода доступа (Рис. 2C). Для меняCOS крысы, результатом был то, что в дни доступа COS эта группа потребляла общее количество калорий, подобных количеству, потребляемому CCOS группы, а в дни без COS, яCOS группа потребляется немного меньше, чем NCOS группа. Большое количество калорий, потребляемых ICOS группа в дни доступа была связана с потреблением COS: к концу 5 недель ICOS группа, потребляемая в 90 мин чуть более половины объема COS, что CCOS группа, потребляемая за целый день (в день доступа 15: ICOS: 54.2 ± 4.0 kCal COS потребляется; СCOS: 97.7 ± 5.7 kCal COS потребляется). Эти эффекты привели к модели «пильного зуба» общего калорийного потребления в течение нескольких дней в ICOS группа (2B). Последний эффект можно также увидеть в Рис. 2C (ICOS потребление чаутов группы до дней выпивки было ниже, чем у NCOS группа). Эти результаты согласуются с выводами других людей, использующих прерывистый доступ к твердым жирам с высоким содержанием жира в качестве модели грызунов поведения по поводу выпивки [5, 10, 11, 16, 41, 42].
Важно отметить, что эта схема питания не наблюдалась в ICS крысы, у которых был доступ к раствору с низким содержанием жира / сахара вместо эмульсии COS: их ежедневное потребление чау не зависело от того, имели ли крысы сеанс доступа к CS (Рис. 2D, F). Кроме того, картина «пильного зуба» потребления калорий была гораздо менее выражена в ICS крыс, чем в ICOS крысы (ср. Рис. 2E 2B). Таким образом, наблюдалась картина, похожая на выпивку, с прерывистым доступом к COS, но не с CS.
Хотя масса тела крыс во всех группах увеличивалась в течение 5 недель, CCOS вес группы увеличивался быстрее, чем у других групп (Рис. 3A). Поразительно, несмотря на доступ к COS 3 дней / неделю, ICOS группа не получила больше веса, чем NCOS группа (Рис. 3A). ЯCOS крыса, казалось бы, нормальная регуляция массы тела может быть связана с их сокращенным потреблением чау после приема COS (Рис. 2C): их увеличение веса было значительно больше за день до доступа к COS, чем на следующий день после доступа (3B). Напротив, CCOS и нCOS группы набирали вес с постоянной скоростью (3B). Аналогично, с раствором крема / сахара CCS вес группы увеличивался быстрее, чем у ICS и нCS групп (Рис. 3C, D). Эти результаты согласуются с предшествующими наблюдениями с твердой пищей с высоким содержанием жиров [10, 11, 41]. Они показывают, что, как это часто бывает при расстройствах пищевого поведения человека [45, 46], bingeing крысы могут ограничить свое потребление после большого потребления высококалорийной пищи даже после повторного прерывистого доступа к такой пище через 5 недель.
3.2. Внутрисессионный курс потребления
При доступе к высокопривлекаемой жидкости, изначально жадное потребление крыс сужается, поскольку поглощаемое питательное вещество (и связанный с ним условный стимул вкуса) активирует механизмы сытости [34]. Поэтому мы спросили, было ли потребление COS аналогичным. Как показано на графиках временного курса лизания в течение сеанса 90 min (в 5 min bin), ICOS группа продемонстрировала значительно увеличенную общую скорость лизания в первый 20 мин сессии в неделю 5 по сравнению с неделей 1 (Рис. 4A, B). ЯCOS потери личинок крыс вернулись к низким, спорадическим уровням примерно на 30 мин после начала сеанса (Рис. 4A, B), что согласуется с предыдущими наблюдениями [34]. Из-за резкого различия в значениях лизать в начальных и последующих частях сеанса доступа, в последующих анализах лизать картины мы рассмотрим потребление в первом квартале сессии (22.5 мин) и последние три квартала (68.5 мин) отдельно.
Как и ожидалось, рост ставок потребления в первом квартале сессии был значительно меньшим по величине в CCOS группа (4B). Действительно, несколько удивительно, что CCOS крысы вообще пили много COS в камерах ликометра, так как COS был в свободном доступе в их домашних клетках. Одна из возможностей заключается в том, что свежий COS потреблялся более активно, чем COS в домашней клетке, возраст которой составлял до 24 часов. Однако наивная группа из 6 крыс, которым давали свежий COS и суточный COS в течение 1 часа в тестах на выбор двух бутылок в домашней клетке, не показала предпочтения свежему COS (свежий COS: 2.9 ± 0.9 мл; дневной COS: 6.0 ± 1.8 ; t-критерий p> 0.05). Следовательно, повышенное начальное потребление COS в CCOS группа может быть функцией поведенческой активации после размещения в относительно новую (по сравнению с домашней клеткой) ликометровую камеру.
3.3. Задержка до первого лизания и начальная скорость лизать
Постепенная эскалация потребления через прерывистый доступ к COS (Рис 1) может быть обусловлено, в частности, увеличением мотивации к потреблению и / или увеличению потребления, обусловленного вкусом. Чтобы проверить эти гипотезы, мы исследовали латентность до первого лиза сеанса (индекс мотивации) и начальную скорость лизать (думали, чтобы отразить потребление, управляемое вкусом) [35–37]. В течение последовательных сеансов доступа ICOS задержка группы для инициирования потребления КОС стала короче, тогда как CCOS латентность группы не изменилась (Рис. 5A). Кроме того, латентность до первого лиза была последовательно значительно дольше в СCOS группы, чем ICOS группа (Рис. 5A), что согласуется с различиями в мотивации, которые ожидаются между животными при непрерывном и ограниченном доступе к любимому продукту. Примечательно, однако, что начальная скорость лиза увеличилась на всех сеансах в обоих ICOS и CCOS крыс и, как правило, не были существенно различны по группам в определенный день (Рис. 5C). Таким образом, в отличие от меры мотивации, мера потребления, обусловленная вкусом, увеличивалась параллельно в двух группах.
Как и ожидалось, из-за отсутствия эскалации потребления в ICS группы, ни ICS ни CCS группы продемонстрировали значительное снижение первой латентности лиза (5B) или увеличение начальной скорости лизать (Рис. 5D). Таким образом, прерывистый доступ к COS (но не CS) привел к очевидному увеличению мотивации и вкуса, которые сопровождали увеличение потребления COS.
3.4. Номер и длина серийной серии
Крысы лижут со стереотипной частотой ~ 7 Гц. Во время еды последовательные облизывания с такой скоростью прерываются паузами, которые обычно составляют более 1 секунды [36, 37]. Со второго дня доступа к пятнадцатому, интенсивность инжекции для ICOS группа оставалась стабильной (6.7 ± 0.2 против 6.9 ± 0.1 Гц, p> 0.05), указывая на то, что постепенное увеличение потребления очевидно в этой группе (Рис. 1A) не было связано с изменением центрального генератора шаблонов, который контролирует скорость обрезки внутри пакета.
Количество всплесков при доступе к приемлемой жидкости зависит от мотивации к потреблению, тогда как длина всплесков более сильно зависит от вкуса жидкости [36, 37]. В соответствии с этой идеей CCOS крысы, как правило, демонстрировали более низкие импульсы, чем ICOS крыс (Рис. 6A, C). В ICOS группа, количество всплесков сильно зависело от времени в сеансе доступа: в первом квартале число пакетов значительно увеличилось в течение 5 недель доступа, тогда как в последние три квартала оно уменьшалось (Рис. 6A, C). Напротив, яCS крыс, которые не эскалировали их потребление (1B), не показывал изменений в номере пакета в ранней или поздней фазе (Рис. 6B, D).
В отличие от номера пакета, длительность пакета не сильно отличалась между ICOS и CCOS групп в любой день (Рис. 6E). Действительно, как для ICOS и CCOS групп, длительность пакета увеличилась в течение 5 недель прерывистого доступа (Рис. 6E). Эти эскалационные эффекты отсутствовали в ICS и CCS крыс (Рис. 6F).
В целом, результаты показывают, что недели прерывистого доступа к COS привели к постепенному увеличению потребления на ранней стадии каждой сессии доступа. Это увеличение сопровождалось более короткой латентностью, чтобы начать потребление и большее количество разрывов лизы (в соответствии с повышенной мотивацией к потреблению), а также более высокую начальную скорость лизать и более длительную продолжительность порции (в соответствии с повышенным потреблением вкуса). Ни постепенное увеличение потребления, ни увеличение показателей мотивации и вкусовых предпочтений не наблюдалось, когда крысам давали CS вместо COS. В совокупности результаты показывают, что потребление, напоминающее выпивку, по меньшей мере частично обусловлено постепенной эскалацией мотивации и вкусовой привлекательности, превышающей ожидаемые от начального обучения и уменьшения неофобии.
4. обсуждение
4.1. Резюме
Поедание пищей характеризуется дискретными эпизодами (2 часов или менее) быстрого и чрезмерного потребления пищи, которое не зависит от потребности в голоде или метаболизме [2]. Чтобы изучить влияние потребления, подобного употреблению, на нервные процессы, регулирующие потребление пищи, предыдущие исследования на животных использовали прерывистый доступ к продуктам с высоким содержанием калорий, особенно жиров [5, 10, 11, 16, 41], потому что люди, страдающие расстройством пищевого поведения или булимией, обычно выпивают сладкую жирную пищу [47–49]. Потребление богатых питательными веществами продуктов питания и напитков регулируется тремя взаимосвязанными процессами: мотивацией, вкусом и сытости. Для изучения нейронных механизмов, лежащих в основе потребления бинго с использованием инвазивных методов (таких как внутричерепная микроинъекция лекарств), было бы полезно изучить эти процессы изолированно. Один из способов сделать это - изучить временную структуру потребления, процедуру, которая значительно облегчается путем доставки жидкости через ликеометр. Таким образом, мы разработали модель прерывистого доступа к потреблению с высоким содержанием жиров в выпивке, основанную на моделях выпивки, первоначально разработанных Корвином и его коллегами с использованием твердого жира [11, 12], а затем распространены на твердые жирные / сахарные смеси [10, 13, 16]. Поскольку проглатывание состоит из недорогих, широко доступных ингредиентов (супермаркет-крем, кукурузное масло и сахар) и не требует специального оборудования для подготовки, наша модель может быть использована в последующих экспериментах для получения доказательств влияния нейронных манипуляций на сытость, мотивацию и вкусовые качества при употреблении алкоголя.
4.2. Структура потребления и отношение к предыдущим моделям прерывистого доступа
Наши результаты аналогичны тем, которые были установлены ранее для крыс при периодическом доступе к твердым пищевым продуктам с низким содержанием жира. В частности, когда крысам давали прерывистый доступ к COS (сливки / масло / сахар, ICOS группа), потребление в период доступа постепенно увеличивалось в течение дней доступа, в соответствии с предшествующими наблюдениями [5–12]. Кроме того, яCOS крысы показали образец «пильного зуба» потребления калорий с уменьшенным потреблением чаунов после доступа к COS. Эти эффекты наблюдались, несмотря на процедурные отличия от более ранних моделей, в том числе прерывистый доступ к домашней клетке для высококалорийной проглатывающей и одновременной доступности чау-чау в предыдущем исследования, но не наши (в которых доступ COS был предоставлен в отдельных камерах). Интригующе, что потребление калорий в прерывистых днях доступа к COS достигло уровней, аналогичных тем, которые наблюдались в 24 hr у крыс при непрерывном доступе к COS, а потребление чау после доступа COS было снижено до уровней ниже уровней, наблюдаемых у крыс, при отсутствии доступа к COS вообще. Эти результаты согласуются с предыдущими результатами с использованием твердого высокожирного питания [5, 10, 13, 50]. Большие колебания в потреблении калорий вызвали параллельные колебания веса, с чистым результатом, что ICOS крысы набирали вес не быстрее, чем крысы, у которых был доступ только к чау. В совокупности эти результаты отражают предыдущие наблюдения с использованием прерывистого доступа к твердой высокожирной пище [5, 10–13, 50] и предполагают, что прерывистый доступ к жидким COS индуцирует поведение выпивки, которое удивительно похоже на вызванное использованием твердой пищи с высоким содержанием жиров.
Поразительно, что крысы получали прерывистый доступ к менее калорийному раствору крема и сахара (CS; ICS группа) не показали ни постепенной эскалации потребления, ни выраженной картины пила, наблюдаемой у крыс, получавших COS. Эти результаты свидетельствуют о том, что высокое содержание жира и / или калорийности необходимо для развития поведенческого поведения по этому графику. Однако результаты не исключают, что разработка bingeing является функцией эффективности лизать (количество жидкости, полученной на лижу), что было больше для COS, чем для CS. Причина этого различия неизвестна, но, вероятно, имеет отношение к различным физическим свойствам COS и CS. Более высокий уровень потребления калорий, способствуемый большей эффективностью лизать, может способствовать повышению эскалации потребления в ICOS группа. Кроме того, определенные типы жира, найденные в кукурузном масле, могут способствовать восприимчивости крыс к развитию bingeing, а также форме жира (эмульсии). Действительно, крысы потребляют эмульсии кукурузного масла еще более жадно, чем 100% кукурузного масла, эмульсии кукурузного масла вызывают аналогичную степень потребления в виде твердого жира, а эмульсии подслащенных кукурузных масел вызывают еще больший расход [51–53]. Таким образом, поскольку во многих предыдущих исследованиях bingeing использовалась смесь твердого жира и сахара [5, 16], наличие эмульгированного кукурузного масла может быть критическим фактором, который придает COS, но не CS, способность вызывать потребление перегоревшего вещества. Эта гипотеза может быть проверена путем определения того, стимулирует ли подслащенные эмульсии кукурузного масла / воды (без сливок) подобное поведению поведение, подобное тому, которое индуцируется COS. Однако, даже если бы это было так, COS может быть предпочтительным для использования в будущих экспериментах, поскольку подготовка эмульсий кукурузного масла / воды с долговременной стабильностью требует дорогостоящего оборудования (микрофлюидизатора), тогда как для COS-препарата требуется не более сложный аппарат, чем проволочный венчик.
Поскольку наша модель COS binge предоставляет крысам доступ к высокоурожайному поглощающему три дня в неделю, мы смогли наблюдать снижение потребления чаунов в течение следующего 24 hr, которое затем восстанавливалось в течение последующего 24 hr. Потребление чаев в 24 hr после прерывистого доступа к COS (но не CS) было значительно ниже, чем потребление 24 hr контрольной группой без доступа к COS вообще (NCOS группа), в соответствии с более ранними сообщениями с жирными и обезжиренными пищевыми продуктами [10, 12, 13]. Вместе с нашими результатами эти результаты показывают, что приливное потребление активирует длительный процесс насыщения, который ограничивает потребление в течение нескольких часов после очень короткого эпизода потребления в период доступа. Эти результаты интригуют в свете выводов о том, что крысы чрезмерно потребляют жирную пищу по сравнению с высокоуглеводными пищевыми продуктами с равной плотностью калорий [28, 29, 54–58]. Внутрижелудочная предварительная нагрузка с жиром приводит к меньшему ингибированию последующего потребления, чем предварительная нагрузка с изокалорийной дозой углеводов [29], и эти эффекты длительны (до одного дня) [28]. Таким образом, крысы чрезмерно потребляют жир из-за того, что жир менее эффективен (за калорийность) при активации механизмов послеуборочной сытости. Эти исследования показывают, что содержание сахара в COS и других смесях жиров и сахара, используемых в процедурах прерывистого доступа, может значительно повлиять на ингибирование потребления кишечника после выпивки. Дальнейшие исследования, которые непосредственно сравнивают последствия употребления сахара и жиров, являются необходимыми для уточнения дифференцированных ролей жира и сахара в долгосрочной насыщенности, вызванной потреблением выпивки.
Потребление COS постепенно увеличивалось в течение первых дней 8 (2.5 недель) прерывистого доступа. Примечательно, что крысы, получавшие прерывистый доступ к CS, не демонстрировали подобного постепенного увеличения, хотя как группы COS, так и CS с прерывистым доступом значительно увеличивали потребление в течение первого-второго дня доступа. Поскольку крысы в обеих группах должны научиться обращаться к ликометрам и преодолевать первоначальную неофобию, начальный (день 1 в день 2) рост потребления может быть приписан этим процессам. Однако дальнейшее постепенное увеличение ICOS группа не согласуется с этими процессами, поскольку она не наблюдалась в ICS группа. Аналогичное постепенное увеличение было зарегистрировано у крыс, получавших сладкие и / или высокожирные пищевые продукты или жидкости в расписании 3 дней / недель или ежедневных прерывистых доступов [9–12, 14, 59]. Эти результаты значительно контрастируют с крысами, получающими постоянный доступ к высококалорийным продуктам питания: ежедневное потребление либо постепенно снижается от первоначального пика [5, 6, 10], как в нашем исследовании (Рис 3) или остается постоянным [12, 14]. Таким образом, чрезмерное потребление во время прерывистых запретов доступа частично объясняется эскалацией потребления, которая отсутствует у неограниченных субъектов; потому что этот эффект зависит от содержания жира и / или калорийности проглатывания, наши результаты показывают, что увеличение не является простым следствием обучения потреблению или преодолению неофобии. Скорее, постепенно возрастающее потребление, вероятно, связано с другими процессами, которые являются следствием физических и / или питательных свойств COS, которые отличает его от CS.
Предыдущие модели binge крысы использовали ежедневный прерывистый доступ к высококалорийным пищевым продуктам в качестве контроля для доступа к дням в неделю 3 [binge]6, 11, 12, 15, 16, 40, 42, 60–63]. Тем не менее, в других исследованиях ежедневно использовался прерывистый доступ к модели bingeing [9, 10, 13, 14, 35, 59]; в частности, потребление высококалорийного проглатывания часто увеличивается в периоды ежедневного доступа, хотя эта эскалация может быть менее выраженной, чем для доступа 3 в день / неделю [6]. Таким образом, существует некоторая путаница в отношении того, что составляет идеальные протоколы доступа к запрету и контролю. Наши результаты дают потенциальное разрешение: они указывают на то, что контрольная группа, получающая прерывистый доступ к CS в том же расписании, что и группа BOS, не демонстрирует повышенного потребления. ОпытныйCOS крысы потребляют больше калорий во время периодов доступа, чем яCS крыс, и поэтому сравнение между этими группами позволяет сделать вывод о том, что ICOS крысы отвечают оперативному определению выпивки (потребление более калорий в течение ограниченного периода времени, чем не-бингеры потребляют в аналогичный период). Таким образом, использование COS и CS (или, в более общем случае, высоко- и низкокалорийных или высоко- и обезжиренных жидкостей) может оказаться полезным для дальнейших экспериментов, в которых требуется контроль потребления биения. Эта модель обладает дополнительным преимуществом, что она отражает выпивку человека, когда люди выпивают жирную высококалорийную пищу, в то время как не-выпивка обычно включает потребление менее калорийно-плотной пищи. С другой стороны, люди, потребляющие выпивку, потребляют твердую и полутвердую пищу, тогда как COS и CS являются жидкостями.
4.3. Мотивация, вкусовые качества и сытость в потреблении выпивки
В широком смысле изменения в трех отдельных процессах могут стать причиной постепенного увеличения потребления в периоды прерывистого доступа: (1) потребление с учетом вкуса может увеличиться; (2) мотивация начать потребление может увеличиться; и / или (3) механизмы насыщения могут быть снижены в эффективности, тем самым продлевая «прием пищи», полученный в течение периода доступа. Наши результаты дают наводящие на размышления данные о повышении потребления и мотивации потребляемого вкуса. В частности, постепенная эскалация потребления COS в течение нескольких дней прерывистого доступа сопровождалась уменьшением латентности до первого лиза, большего количества лизких всплесков, повышенной скоростью лизания в первую минуту доступа и более длительными лизкими всплесками. Первые два являются показателями мотивации, а последние два являются показателями вкуса [36, 37, 64]. Каждый из них значительно увеличился за несколько дней, поскольку потребление резко возросло. Поскольку каждое из этих изменений в лизовом узоре будет иметь тенденцию к увеличению потребления, мы делаем вывод, что увеличение потребления на сеансах доступа является по меньшей мере частично следствием этих структурных изменений и, следовательно, повышенной мотивации и вкусовой привлекательности. Кроме того, эти повышения показателей мотивации и вкусовых качеств в I не наблюдалисьCS группа, которая не показала повышенного потребления. Следовательно, повышенная мотивация и вкусовая привлекательность, вероятно, будут следствием высокой калорийности и / или содержания жира в COS по сравнению с CS.
Что может стать следствием наблюдаемого постепенного повышения мотивации и вкуса? Мотивация - это не сингулярный мозговой процесс, а психологическая конструкция, отражающая деятельность множества нейронных механизмов. Например, голод побуждает к подходу к пище, но одно и то же мотивированное поведение может быть вызвано стимулом, связанным с пищей, даже у людей, которые не голодны, как в условном приеме [65]. Специфический нейронный механизм, лежащий в основе повышенной мотивации у борющихся крыс, неизвестен. Конечно, возможно, что процесс кондиционирования задействован, так что стимулы в доступной камере становятся связанными с COS и, следовательно, на последующих сессиях побуждают к поиску, приближению и инициированию потребления COS, как только животное помещается в камера. Таким образом, постепенно возрастающая мотивация, проявляемая ICOS крысы могут быть функцией усиливающей силы безусловного стимула (COS); решение CS может быть недостаточно усиливающим, чтобы способствовать увеличению потребления за пределы начального обучения.
Стимулируемое поведением стимулирующее поведение часто зависит от проекции допамина на ядро accumbens [66–69], а потребление алкоголя сахарозой сопровождается подъемами внеклеточного допамина в аккбенах [19]. Кроме того, потребление, напоминающее выпивку, вызывает несколько долгосрочных изменений в системе допамина accumbens, включая повышенную экспрессию транскриптора D1 и допамина и уменьшенную экспрессию рецептора D2 [8], что говорит о том, что долгосрочные изменения активности допамина связаны с потреблением выпивки. Действительно, крысы с длительным прерывистым доступом к жиру проявляли более высокие контрольные точки в прогрессивном расписании распределения жира [70]. Это наблюдение не только подтверждает наш вывод о том, что мотивация для вкусной пищи усиливается при употреблении в пищу, но и дает дополнительные доказательства участия мезолимбического дофамина, поскольку выполнение задач с прогрессивным соотношением зависит от допэмина акцепнов [71]. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, существует ли причинная связь между активностью допамина в акцепменах и повышенной мотивацией к потреблению, поскольку развивается bingeing.
В дополнение к поведенческим изменениям, согласующимся с повышенной мотивацией, мы также наблюдали эффекты, которые наиболее легко объясняются увеличением потребления вкусовых качеств (увеличение начальной скорости лизиса и увеличение длины лизания). Ряд структур головного мозга участвует в потреблении, ориентированном на вкус, включая ядро укрытия, ядро уединенного тракта, миндалину, вентральный паллидум, вентральную тегментальную область и боковой гипоталамус [72–74]. В частности, μ опиоидные рецепторы, особенно в акцепменах [44, 75–78] может способствовать потреблению вкуса. Интересно, что потребление, напоминающее выпивку, связано с повышающими рецепторами μ в accumbens [8], предполагая, что повышенная опиоиргическая нейротрансмиссия может отвечать за повышенное потребление при потреблении, наблюдаемое во время доступа к выпивке. Эти гипотезы ожидают дальнейшего тестирования с помощью инвазивных манипуляций с функцией опиоидных рецепторов у животных-бингвинов.
Интригующе, меры вкуса увеличились не только в ICOS крыс, но в CCOS группы. Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что это длительный доступ к COS, а не прерывистость доступа, что приводит к увеличению потребления при потреблении. Одно отличие между СCOS и яCOS групп является то, что CCOS крысы набрали вес, как и следовало ожидать, учитывая, что вволю доступ к диете с высоким содержанием жиров вызывает ожирение [41, 79, 80]. Таким образом, наши результаты свидетельствуют о том, что потребление жирных продуктов с высоким содержанием жира может быть увеличено у пациентов с ожирением. Предыдущие исследования показали комплексные эффекты ожирения на вкус. В одном случае более низкие концентрации жира и сахарозы были менее приемлемы при ожирении, чем у худых крыс, тогда как более высокие концентрации были немного более приемлемыми [79]. В другом исследовании показатели вкусовых качеств сахарозы (размер пакета) не были затронуты вообще ожирением [81], и в еще одном, меры вкуса были уменьшены при напряжении тучных крыс [82]. Важное различие между нашим исследованием и предыдущими исследованиями заключается в том, что мы тестировали вкусовые качества одного и того же высокожирного проглатывания, которым животные имели непрерывный доступ к 24 hr (т.е. мы тестировали вкусность диеты, которая вызывала ожирение), тогда как другие исследования дали животные с высоким содержанием жиров в домашней клетке, но проверяют вкусовые качества растворов масла или сахарозы. Эти конструкции могут создавать отрицательные контрастные эффекты, которые могут препятствовать обнаружению усиленного механизма вкуса. Экспериментальные конструкции, которые минимизируют эффекты контраста, должны использоваться для более тщательного тестирования гипотезы о том, что потребление, стимулируемое вкусом, усиливается у пациентов с ожирением.
Наблюдение за тем, что крысы, получившие постоянный доступ к COS, демонстрируют повышенное потребление, обусловленное вкусом, но показало снижение общего потребления калорий (и потребления COS) с первого дня (Рис 2) предполагает, что какой-то другой процесс, такой как сытость, противодействует повышению вкуса, чтобы ограничить общее потребление. Это ставит вопрос о том, более эффективны ли механизмы сытости у опытных бингеров, чем у крыс, наивных для COS. К 5th неделя прерывистого доступа, яCOS у крыс было резкое снижение потребления в первый 20-30 мин после начала доступа. Это снижение, вероятно, обусловлено условным и безусловным насыщением [34], и демонстрирует, что механизмы сытости являются устойчивыми у борющихся крыс, состоят из находок у пациентов с булимией человека [83]. Хотя скорость снижения быстрее на неделе 5, чем в предыдущие недели (особенно на неделе 1), на эту меру могут влиять разные темпы первоначального приема на ранних и поздних сессиях (которые являются функциями мотивации и вкуса). Поэтому для оценки того, могут ли различия в механизмах насыщения способствовать постепенному увеличению потребления в периоды прерывистого доступа, необходима дополнительная работа, возможно, с использованием внутрижелудочной предварительной загрузки. Тем не менее, устойчивое внутрисеминарное снижение потребления может быть использовано в будущих исследованиях в качестве меры насыщения при изучении эффектов нейронных манипуляций на установленное потребление выпивки.
4.4. Выводы
Мы демонстрируем, что сладкая жир-жир может использоваться у крыс, чтобы вызвать подобную выпивке потребление, подобное тому, которое наблюдалось ранее в моделях с прерывистым доступом с использованием твердых продуктов с высоким содержанием жиров. Использование жидкого загустителя выгодно несколькими способами. Во-первых, менее калорийная жидкость может быть предоставлена в том же графике доступа, что и контроль потребления бинга. Во-вторых, временная точность, обеспечиваемая измерением потребления ликометрами, будет способствовать дальнейшим исследованиям поведения выпивки, особенно с использованием электрофизиологии у животных. Наконец, использование жидкого высокожирного проглатывания позволяет провести анализ микроструктуры лиза, который может быть использован для сбора данных о наличии или против различий в сытости, мотивации и вкусовой привлекательности у борющихся крыс после инвазивных нейронных манипуляций (например, локальная микроинъекция нейроактивных соединений). Здесь мы используем микроструктурный анализ, чтобы продемонстрировать, что постепенная эскалация потребления в течение последовательных периодов доступа объясняется, по меньшей мере, частично повышением мотивации к инициированию потребления и увеличению потребления, ориентированного на вкус. Дальнейшее исследование этих процессов у крыс COS bingeing приведет к усиленному пониманию нейронных механизмов, лежащих в основе потребления выпивки.
Галерея
- Мы устанавливаем модель прерывистого доступа для выпивки, используя сладкую жирную жидкость
- Крысы увеличивают потребление в течение 2.5 недель прерывистых сеансов доступа
- Лик микроструктурный анализ отделяет мотивацию и вкусовые качества
- Эскалированное потребление связано с увеличением как мотивации, так и вкуса
- Крысам, получающим непрерывный жирный доступ к жидкости, страдает ожирением и демонстрирует повышенную вкусовость
Благодарности
Мы благодарим доктора. Гэри Шварц и Николь Авена за полезные обсуждения, д-р Шварц и ядро фенотипического баланса энергии животных в Нью-Йоркском научно-исследовательском центре ожирения для использования оперантных палат и Niacet Corporation за их щедрый подарок натрия стеароиллактилата. Это исследование было поддержано грантами семейного фонда Klarman, NARSAD и NIH (MH092757) для SMN, а также стипендией Фонда Хильды и Престона Дэвиса для SL.
Заметки
Эта статья была поддержана следующими грантами:
Сноски
Отказ от ответственности издателя: Это файл PDF из неотредактированной рукописи, который был принят для публикации. В качестве сервиса для наших клиентов мы предоставляем эту раннюю версию рукописи. Рукопись будет подвергаться копированию, набору и обзору полученного доказательства до его публикации в его окончательной форме. Обратите внимание, что во время производственного процесса могут быть обнаружены ошибки, которые могут повлиять на содержимое, и все юридические заявления об отказе от ответственности, которые применяются к журналу.
Рекомендации
;
