Передняя психиатрии, 2018; 9: 81.
Опубликован онлайн 2018 Мар 12. DOI: 10.3389 / fpsyt.2018.00081
PMCID: PMC5858605
PMID: 29593587
Минхо Ли,1,† Hyeyoung Cho,2,3,† Seung Hyun Jung,2,4 Seon-Hee Yim,2 Сун-Мин Чо,2,3 Цзи-Вон Чунь,5 Су-Хен Пайк,5 Парк Yae Eun,6,7 Донг Хьюи Чон,7,8 Джи Юн Ли,7 Юнг-Сёк Чой,9 Дай-Цзинь Ким,5,* и Yeun-Jun Chung1,2,3,*
Абстрактные
проверка данных
Захватывающее использование Интернета и онлайн-игр - потенциальное психическое расстройство, называемое расстройством интернет-игр (IGD). Измененные профили экспрессии микроРНК (miRNA) были зарегистрированы в крови и мозговой ткани пациентов с определенными психическими расстройствами и предложены в качестве биомаркеров. Однако в IGD не было сообщений о профилях miRNA крови.
методы
Чтобы обнаружить IGR-ассоциированные miRNAs, мы проанализировали профили экспрессии miRNA образцов 51 (элементы управления 25 IGD и 26) с использованием miRNA Array с низкой плотностью TaqMan. Для проверки мы провели количественную ПЦР с обратной транскрипцией с независимыми образцами 36 (элементы управления 20 IGD и 16).
Итоги
Благодаря открытию и независимой проверке мы идентифицировали три miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p), которые были значительно понижены в группе IGD. Лица со всеми тремя изменениями miRNA имели гораздо более высокий риск IGD, чем те, у которых нет изменений [отношение шансов (OR) 22, 95% CI 2.29-211.11], а ORs увеличивала дозу в зависимости от количества измененных miRNA. Прогнозируемые гены-мишени трех miRNAs были связаны с нейронными путями. Мы исследовали экспрессию белка из трех генов-мишеней, расположенных ниже по потоку вестерн-блоттинга, и подтвердили, что экспрессия GABRB2 и DPYSL2 была значительно выше в группе IGD.
Заключение
Мы наблюдали, что у пациентов с ИГД были снижены экспрессии hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p и hsa-miR-652-3p. Наши результаты будут полезны для понимания патофизиологии ИГД.
Введение
Захватывающее использование Интернета и интернет-игр - это не просто социальный феномен в странах с обширной инфраструктурой доступа в Интернет, но потенциальное психическое расстройство называется расстройством интернет-игр (IGD) (1–3). Согласно эпидемиологическим сообщениям, уровень распространенности ИГД у подростков варьируется в разных странах: от 0.8 до 26.7% (4). В частности, исследования показывают, что показатели распространенности выше 10% у подростков во многих азиатских странах, таких как Южная Корея, Китай, Тайвань, Гонконг и Сингапур (4). IGD связан с нарушением познания, психосоциальных отношений и повседневной жизни; например, снижение академических или профессиональных показателей (4–7). IGD теперь включен в раздел III (условия для дальнейшего изучения) пятого пересмотра Диагностического и статистического руководства по психическим расстройствам (DSM-V) (8). Однако, несмотря на его клинико-социальное значение, мало известно о молекулярно-генетическом механизме IGD.
Недавние крупномасштабные исследования близнецов предложили генетический фон IGD (9, 10). Vink et al. исследовали индивидуальные различия в компульсивном использовании Интернета с монозиготными и дизиготными подростками-близнецами 5,247 в Нидерландах Twin Register и сообщили, что 48% различий объяснялись генетическими факторами (9). Li et al. наблюдали пары 825 китайских подростков-близнецов и сообщали, что генетические факторы объясняют 58-66% различий (10). Соответственно, полиморфизмы генов, вовлеченных в нейротрансмиссию, познание и внимание, такие как ген D2 рецептора допамина (DRD2), ген катехоламин-O-метилтрансферазы (СОМТ), ген транспортера серотонина (5HTTLPR) и холинергический рецептор никотинового альфа-гена 4 (CHRNA4), как сообщается, значительно связаны с интернет-зависимостью (11–13). Недавно Ким и др. экранированные варианты более чем генов-кандидатов 100, связанных с производством, действием и метаболизмом нейротрансмиттеров при анализе секвенирования следующего поколения, и сообщили, что rs2229910 NTRK3 ген связан с IGD (14).
В дополнение к генетическим факторам также хорошо известно, что нейроповеденческие фенотипы эпигенетически контролируются некодирующими РНК, включая микроРНК (miRNAs) (15, 16). miRNAs представляют собой небольшие некодирующие одноцепочечные молекулы РНК (приблизительно длиной 20-23 нуклеотидов), которые отрицательно регулируют экспрессию белок-кодирующих генов путем деградации мРНК и играют критическую роль в патофизиологическом процессе различных заболеваний (17). Линии доказательств показали, что miRNAs в изобилии в центральной нервной системе человека (CNS) и действуют для точной настройки уровней экспрессии их целевых генов, которые участвуют в развитии и созревании системы ЦНС (15). Действительно, недавние исследования показали, что профили экспрессии miRNA изменяются в мозговой ткани пациентов с психическими расстройствами, предполагая, что их профили экспрессии могут быть биомаркерами для психических расстройств (15, 16, 18). Например, после посмертного анализа Lopez et al. сообщил, что экспрессия miR-1202, которая регулирует экспрессию метаботропного гена глутаматного рецептора-4 и предсказывает реакцию на антидепрессант, была подавлена в префронтальных тканях коры крупных пациентов с расстройством депрессии (19). Что касается скрининга биомаркеров, то этот подход имеет четкое ограничение, поскольку проведение биопсии ткани ЦНС для скрининга невозможно. Поскольку miRNAs могут быть обнаружены в крови (плазме или сыворотке), циркулирующие miRNAs имеют определенное преимущество как неинвазивные биомаркеры при нейропсихиатрических расстройствах. Однако до настоящего времени не проводилось исследований по циркулированию профилей miRNA в IGD. Лучшее понимание циркулирующих профилей экспрессии miRNA могло бы помочь прояснить механизм развития IGD и облегчить клинический перевод.
В этом исследовании мы стремились идентифицировать маркеры миРНК, связанные с IGD, наблюдая дифференциально выраженные плазменные miRNAs между IGD и контрольными группами и исследовали их биологические последствия.
Материалы и методы
Предметы исследования
Мы опросили подростков 3,166 (в возрасте 12-18 лет) с использованием оценки DSM-V IGD. Среди них 251 (самцы 168 и самки 83) были диагностированы как IGD в соответствии с критериями DSM-V (8). В общей сложности люди 91 (49 IGD и 42) предоставили информированное согласие на это исследование. Среди них четыре человека были исключены в соответствии с критериями исключения. Наконец, для этого исследования были зачислены индивидуумы 87 (субъекты 45 IGD и здоровые люди контроля 42). Среди них участники 51 (пациенты 25 IGD и элементы управления 26) были набраны как набор обнаружений от 2014 до 2016. Остальные участники 36 (20 IGD и 16) были набраны как независимая проверка, установленная 2016. Все участники были корейскими людьми, зачисленными из больницы Сеула Св. Марии (Сеул, Южная Корея) и Сеульского национального университета Борамее (Сеул, Южная Корея). Все участники прошли структурированное интервью психиатра, основанного на корейском расписании киди для аффективных расстройств и шизофрении (K-SADS-PL) (20). Все участники завершили подтесты блочного дизайна и словаря шкалы интеллекта Кореи-Векслера для детей, 4th edition (K-WISC-IV) (21). Импульсивность оценивали по шкале импульсивности Barratt (BIS) (22). Оценки поведенческой системы ингибирования (BInS) и системы поведенческой активации (BAS) измерялись для оценки индивидуального измерения (23). Критерии исключения включали прошлые или текущие основные медицинские расстройства (например, сахарный диабет), неврологическое расстройство (например, приступы судорог, травма головы), психические расстройства (например, основное депрессивное расстройство, нарушения тревоги), умственная отсталость или любое злоупотребление психоактивными веществами (например, , табак, каннабис, алкоголь). Общие характеристики субъектов исследования суммированы в таблице Table1.1, Это исследование было одобрено Институциональным советом по обзору Колледжа католического медицинского колледжа Кореи (MC16SISI0120). Все участники и их родители дали письменное информированное согласие.
Таблица 1
Общие характеристики исследуемых предметов.
| Открытие | Проверка | Комбинированный | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Control | ИГД | P-value | Control | ИГД | P-value | Control | ИГД | P-value | |
| N | 26 | 25 | 16 | 20 | 42 | 45 | |||
| Age (years) | |||||||||
| Медиана (мин-макс) | 13 (12-17) | 13 (12-15) | 0.759 | 15 (13-18) | 14.5 (12-18) | 0.628 | 14 (12-18) | 14 (12-18) | 0.509 |
| Еженедельные часы интернет-игр (h) | |||||||||
| Медиана (мин-макс) | 5.25 (2-17) | 18 (6-46) | 1.27E-6a | 5.5 (2-23) | 8 (1-112) | 0.374 | 5.5 (2-23) | 14 (1-112) | 1.63E-5a |
| Ежемесячный доход домохозяйства (млн. KRW) | |||||||||
| Медиана (мин-макс) | 5 (1-9) | 3 (1-9) | 0.588 | 4 (4-4) | 2 (2-2) | 1.000 | 5 (1-9) | 3 (1-9) | 0.460 |
| Образование (лет) | |||||||||
| Медиана (мин-макс) | 8 (7-9) | 8 (7-9) | 0.584 | 12 (12-12) | 6 (6-13) | 0.305 | 8 (7-12) | 8 (6-13) | 0.269 |
| K-WISC: дизайн блока | |||||||||
| Медиана (мин-макс) | 10.5 (4-17) | 10 (4-16) | 0.544 | 10 (3-16) | 12.5 (4-15) | 0.125 | 10 (3-17) | 11 (4-16) | 0.598 |
| K-WISC: лексика | |||||||||
| Медиана (мин-макс) | 9 (5-17) | 7 (5-13) | 0.174 | 9.5 (8-15) | 11.5 (5-15) | 0.595 | 9 (5-17) | 9 (5-15) | 0.527 |
| KS | |||||||||
| Медиана (мин-макс) | 24 (17-36) | 37 (22-51) | 3.81E-6a | 29 (17-34) | 59 (22-108) | 1.2E-5a | 25 (17-36) | 40 (22-108) | 2.05E-10a |
| BIS | |||||||||
| Медиана (мин-макс) | 63 (35-75) | 67.5 (45-81) | 0.080 | 61 (45-79) | 63 (32-82) | 0.835 | 62 (35-79) | 65 (32-82) | 0.240 |
| BAS | |||||||||
| Медиана (мин-макс) | 31 (15-40) | 31 (13-51) | 0.558 | 36.5 (22-48) | 34 (27-52) | 1.000 | 32 (15-48) | 34 (13-52) | 0.637 |
| закрома | |||||||||
| Медиана (мин-макс) | 18 (10-26) | 17.5 (13-27) | 0.642 | 18.5 (12-25) | 20 (13-21) | 0.138 | 18 (10-26) | 19 (13-27) | 0.302 |
IGD, пациенты с нарушением интернет-игр; KS, Корейская шкала чести интернет-зависимости; BIS, Шкала импульсивности Barratt; BAS, система поведенческой активации; BInS, система поведенческого ингибирования; KRW, корейский вон.
aP <0.05 (критерий Манна – Уитни – Вилкоксона).
Эксперименты miRNA с малой плотностью TaqMan (TLDA)
Периферическую кровь собирали у каждого участника и переносили в лабораторию в течение 4 h, чтобы минимизировать лизис клеток крови. Образец центрифугировали при 3,000 об / мин для 10 мин при комнатной температуре. Затем супернатант (слой плазмы) собирали без загрязнения клеток крови. Циркулирующие miRNAs экстрагировали с использованием TaqMan miRNA ABC Purification Kit (Human Panel A, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США) в соответствии с инструкцией производителя. Короче говоря, 50 мкл образца плазмы и 100 мкл буфера ABC смешивали. После гибридизации с целевыми антимикронными магнитными гранулами ограниченные циркулирующие miRNAs элюировали из шариков 100 мкл буфера для элюирования. На этапе обнаружения микроРНК 381 исследовали из образцов плазмы 51 (контрольные образцы 25 IGD и 26) с использованием набора для очистки miRNA ABC TaqMan (Human Panel A, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США) в соответствии с инструкциями производителя. Реакции обратной транскрипции Megaplex и реакции до амплификации проводили для увеличения количества кДНК для экспрессионного анализа miRNA с использованием MegaplexPreAmp Primers Human Pool A и TaqManPreAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific). Панель TLDA A v2.0 (Thermo Fisher Scientific) была запущена в системе PCR ViiA7 в режиме реального времени (Thermo Fisher Scientific) для оценки экспрессии miRNAs. Сырые данные обрабатывались с использованием ExpressionSuite Software v1.0.4 (Thermo Fisher Scientific) для определения значений Ct для каждой miRNA.
Анализ данных для TLDA
Сначала мы измерили пороговые циклы (значение Ct) каждой миРНК. miРНК со значением Ct> 35 считались необнаруживаемыми и исключались из последующего анализа. Все значения Ct были нормализованы до значения Ct miR-374b (значение ΔCt), одной из наиболее стабильно экспрессируемых miRNA, циркулирующих в плазме крови человека (24). Коэффициент смены фонового сигнала log2 (значение ΔΔCt) рассчитывали с использованием средних значений контрольных образцов в качестве калибратора в пакете HTqPCR в Bioconductor (25). Относительная количественная оценка (RQ) каждой миРНК-мишени была определена как 2-ΔΔCt, Для гипотетического тестирования разницы в выражении между двумя группами мы применили суррогатный переменный анализ (SVA) для регистрации неоднородностей, таких как периодические эффекты в экспериментах с использованием каждый пакет в Bioconductor (26). miRNAs с P-значение <0.05 считалось значимым между двумя группами.
Анализ обогащения генов
Для анализа обогащения генов мы использовали ToppFun в ToppGene Suite (27) для вывода значительно обогащенной генной онтологии (GO) (28) термины, пути и термины болезни. В качестве входных данных для этого подхода мы использовали предсказанные геномные гены 1,230 потенциальных miRNAs. Анализ пути использовался для нахождения значительных путей предсказанных генов-мишеней в соответствии с KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP и MSigDBin в путях ToppGene. Значение терминов функционального обогащения определялось на основе скорректированного Bonferroni P-значение.
Количественная обратная транскрипция ПЦР (qRT-PCR) Проверка и репликация
Чтобы проверить микроРНК 10, которые были дифференциально экспрессированы на стадии обнаружения, qRT-PCR выполняли с использованием анализа микроРНК TaqMan (miR-15b-5p, #000390; miR-26b-5p, #000407; miR-29b-3p, # 000413; miR-125b-5p, #000449; miR-200c-3p, #002300; miR-337-5p, #002156; miR-411-5p, #001610; miR-423-5p, #002340; miR-483 -5p, #002338 и miR-652-3p, #002352) и систему ViiA7 (Life Technologies) в соответствии с протоколом производителя. Десять нанограмм полной РНК превращали в первую цепь кДНК с miRNA-специфическими праймерами с использованием набора обратной транскрипции TaqMan MicroRNA (#4366596, Life Technologies) с последующей ПЦР в реальном времени с помощью TaqMan Probes. RQ каждой miRNA определяли как 2-ΔCt, где ΔCt - разность пороговых циклов для рассматриваемого образца, нормированная против эндогенной miRNA (miR-374b-5p, #001319). Все реакции ПЦР проводили в трех повторностях, и их значения Ct были усреднены. Мы вычислили коэффициент изменения смены log2 (ΔΔCt) каждой miRNA таким же образом, как и в анализе на основе массива. Был проведен непараметрический тест Манна-Уитни-Вилкоксона для проверки различий в уровнях экспрессии miRNAs в двух группах с порогом P-значение 0.05.
Вестерн-блот-анализ
Каждый образец сыворотки был сначала обеднен верхними белками с высоким содержанием 14 (альбумин, иммуноглобулин G, иммуноглобулин A, серотрансферрин, гаптоглобин, альфа-1-антитрипсин, фибриноген, альфа-2-макроглобулин, гликопротеин α-1, иммуноглобулин M, аполипопротеин AI , аполипопротеин A-II, комплемент C3 и транстиретин) с использованием колонки MARS-14 (4.6 × 50 мм, Agilent Technology, Санта-Клара, Калифорния, США) перед вестерн-блот-анализом. Несвязанную фракцию, полученную из колонки MARS-14, концентрировали, используя центрифужный фильтр Amicon Ultracel-3 (обрезание 3 kDa), а затем концентрацию белка определяли с использованием метода бисинхониновой кислоты. Те же количества (от 10 до 30 мкг) контрольных образцов и образцов сыворотки IGD отделяли на гель-сборнике Mini-PROTEAN TGX 4-20% (Bio-Rad, CA, США) и переносили на мембрану из поливинилидендифторида. Затем мембрану блокировали в TBS-T (190 мМ NaCl, 25 мМ Tris-HCl, pH 7.5 и 0.05% Tween 20) с содержанием сухого молока без содержания жира 5% при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем мембраны инкубировали с первичными антителами против DPYSL2 (1: 500, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), GABRB2 (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) и CNR1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology , Inc., Санта-Крус, Калифорния, США), DUSP4 (1: 500, MybioSource, Сан-Диего, Калифорния, США) и PI15 (1: 500, MybioSource, Сан-Диего, Калифорния, США) в TBS-T с 5 % обезжиренного сухого молока при 4 ° C в течение ночи, а затем с соответствующими вторичными антителами либо бычьей антимышиной (1: 1,000, Santa Cruz Biotechnology) или козьего кролика (1: 1,000, Cell Signaling, Beverly, MA, USA ), конъюгированных с пероксидазой хрена при комнатной температуре для 1 h. Обнаружение сигнала проводили с использованием хемилюминесценции с реагентом ECL (GE healthcare, Piscataway, NJ, USA). Мы подсчитали результаты вестерн-блоттинга с использованием программного обеспечения для анализа TotalLab 1D (нелинейная динамика, Ньюкасл-апон-Тайн, Великобритания). Затем значение отношения денситометрии рассчитывали путем деления значения денситометрии каждого образца, как описано в другом месте (29). В качестве контроля для нормализации образец сыворотки, собранный из 46 IGD и контрольных образцов, использовался для каждого эксперимента. Статистическую значимость определяли с помощью непараметрического теста Манна-Уитни-Вилкоксона с пороговым значением P-значение 0.05.
Итоги
Характеристика предметов исследования
Демографические и клинические особенности субъектов исследования показаны в таблице Table1.1, Когда мы сравнивали IGD и контрольные группы в соответствии с корейской шкалой чести интернет-наркомании (K-Scale), как описано в другом месте (20, 30), группа IGD показала значительно более высокое среднее значение K-шкалы, чем контрольная группа (37 против 24, P = 3.81 × 10-6) (Таблица (Table1) .1). Среднее еженедельное время, проведенное на интернет-играх в группе IGD, было значительно больше, чем у элементов управления (18 против 5.25 h, P = 1.27 × 10-6). В то время как не было существенной разницы между двумя группами по возрасту, месячным доходом домашних хозяйств, продолжительностью обучения, блочным дизайном и подтестами из результатов лексики К-WISC, BIS, BInS и BAS.
Дифференциально выраженные miRNAs между IGD и элементами управления
Чтобы обнаружить связанные с IGD miRNAs, мы приняли двухэтапный подход (открытие и независимая проверка). Дизайн исследования и общая стратегия показаны на рисунке S1 в дополнительном материале. На этапе обнаружения мы проанализировали профили экспрессии miRNA образцов 51 (25 IGD и 26) с использованием массива miRNA, содержащего miRNAs 384. Было обнаружено, что уровни экспрессии микроРНК 10 существенно различаются между IGD и контрольными группами (таблица (Table2) .2). Уровни относительной экспрессии этих микроРНК 10 показаны на рисунке Figure1.1, Среди них два (hsa-miR-423-5p и hsa-miR-483-5p) были усилены и восемь (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-411-5p и hsa-miR-652-3p) были подавлены в группе IGD.
Таблица 2
Дифференциально выраженные микроРНК (miRNAs) и складки.
| микроРНК | Открытие | Проверка | Комбинированный | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| P-value | Сменить смену | P-value | Сменить смену | P-value | Сменить смену | |
| HSA-микроРНК-15b-5p | 0.033 | 0.829 | 0.694 | 1.119 | 0.381 | 0.947 |
| HSA-микроРНК-26b-5pa | 0.008 | 0.871 | 0.049 | 0.841 | 0.013 | 0.857 |
| HSA-микроРНК-29b-3p | 0.005 | 0.400 | 0.560 | 1.187 | 0.089 | 0.647 |
| HSA-микроРНК-125b-5p | 0.021 | 0.582 | 0.290 | 0.950 | 0.069 | 0.723 |
| HSA-микроРНК-200c-3pa | 0.011 | 0.336 | 0.003 | 0.542 | 2.93 × 10-5 | 0.415 |
| HSA-микроРНК-337c-5p | 0.009 | 0.385 | 0.582 | 0.872 | 0.020 | 0.553 |
| HSA-микроРНК-411-5p | 0.004 | 0.322 | 0.336 | 1.282 | 0.158 | 0.595 |
| HSA-микроРНК-423-5p | 0.026 | 1.387 | 0.189 | 0.955 | 0.518 | 1.175 |
| HSA-микроРНК-483-5p | 0.018 | 1.861 | 0.765 | 1.413 | 0.211 | 1.647 |
| HSA-микроРНК-652-3pa | 0.019 | 0.715 | 0.049 | 0.877 | 0.011 | 0.782 |
amiRNAs значительно изменены как в наборах обнаружения, так и в валидации.
qRT-PCR Проверка кандидатских miRNAs
Для проверки кандидатских miRNAs 10 мы выполнили qRT-PCR с независимым набором проверки (20 IGD и 16) (таблица S1 в дополнительном материале). Три из этих miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p и hsa-miR-652-3p) были значительно понижены в группе IGD набора валидаций (Таблица (Table2) .2). Три другие miRNAs (hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-125b и hsa-miR-423-5p) также были подавлены в группе IGD, но не значительно. Остальные четыре miRNAs (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p и hsa-miR-423-5p) были выражены противоположно в наборе валидаций. Когда мы объединили наборы обнаружения и проверки (в общей сложности 45 IGD субъектов и 42 контроля), три проверенных miRNAs были последовательно значимыми (Таблица (Table2) .2). Подробная информация, хромосомные местоположения, зрелые последовательности и уровни экспрессии в ЦНС этих трех miRNAs доступны в таблице S2 в дополнительном материале.
Синергетический эффект одновременного изменения трех miRNAs на риск IGD
Для оценки комбинированного эффекта трех miRNAs мы наблюдали отношения шансов (ORs) четырех подгрупп (с изменениями 0, 1, 2 или 3 miRNA). изменение miRNA определялось значением RQ, как описано в разделе "Материалы и методы. Поскольку все три маркера miRNAs были подавлены в IGD-группе, miRNA, значение RQ которой было ниже единицы, было отклонено как измененное. Подробную информацию о RQ каждого предмета исследования для трех miRNAs можно найти в таблице S3 в дополнительном материале. Для каждой подгруппы коэффициенты вычислялись как отношение количества контролей к числу IGD, тогда каждый OR вычислялся путем деления коэффициентов каждой подгруппы на коэффициенты подгруппы без каких-либо изменений miRNA. Лица с тремя изменениями miRNA показали, что риск в 22 раз выше, чем без изменения miRNA (OR 22, 95% CI 2.29-211.11). ORs показали растущую тенденцию с количеством измененных miRNAs от 0 до 3 (r2 = 0.996) (рисунок (Figure22).
GO и анализ путей генов-мишеней потенциальных миРНК
Чтобы получить представление о функциях трех маркеров miRNA, значительно снизившихся в группе IGD, их целевые гены были предсказаны с использованием базы данных miRWalk 2.0 (31). В общей сложности гены 1,230 были последовательно предсказаны как исходные цели по четырем алгоритмам (miRWalk, miRanda, RNA22 и Targetscan) с использованием базы данных miRWalk (32–34) (Таблица S4 в дополнительном материале). Анализ генного обогащения с использованием ToppFun в ToppGene Suite показал, что гены-мишени этих miRNAs были в значительной степени связаны с нейронными тропами развития, такими как «руководство Axon» и GO, такие как «нейрогенез» (таблица S5 в дополнительном материале).
Выражение предсказанных генов-мишеней
Среди нижестоящих генов-мишеней трех miRNAs 140 были предсказаны одновременно для двух или более miRNAs (таблица S4 в дополнительном материале). Чтобы выяснить, отличаются ли уровни экспрессии белков генов, расположенных ниже по течению, между IGD и контрольными группами, мы выбрали гены 2 (DUSP4 и PI15), которые прогнозируются как нисходящие мишени всех микроРНК 3 и дополнительных генов 3 (GABRB2, DPYSL2качества CNR1) от предсказанных для XRUMX miRNAs и проводили анализ вестерн-блоттинга с образцами плазмы из IGN 2 и контроля 28, доступных для эксперимента. Мы сравнили выражения пяти целей между IGD и контрольными группами, измеряя интенсивность полосы и площадь, как описано в другом месте (29). Среди них уровни экспрессии DPYSL2 (28 IGDs и 28 контролируют, P = 0.0037) и GABBR2 (27 IGD и 28 контрольных, P = 0.0052) были значительно выше в группе IGD (рисунок (Figure3) .3). Однако мы не могли наблюдать дифференциальные выражения CNR1 (P = 0.0853), DUSP4 (P = 0.5443) и PI15 (P = 0.6346).
Обсуждение
Сообщалось, что miRNAs участвуют в развитии нейронов (35, 36), а дифференциальная экспрессия miRNAs мозга наблюдается при психических заболеваниях, таких как шизофрения (37). Поэтому вполне вероятно, что циркулирующие профили miRNA могут быть полезными биомаркерами для IGD. Циркулирующие miRNAs были предложены в качестве биомаркеров для различных нейропсихиатрических расстройств (38–40); однако молекулярные механизмы развития ИГД по-прежнему в значительной степени неизвестны, несмотря на его клиническую и социальную значимость. В частности, не было исследований по IGR-ассоциированным miRNAs. Цель этого исследования была двоякой. Сначала мы попытались обнаружить плазменные miRNAs, связанные с IGD. Во-вторых, мы оценили биологическую импликацию кандидатов miRNA, исследуя экспрессию белка и GO генов-мишеней, расположенных ниже по течению. Через скрининг геномных профилей экспрессии miRNA и последующую проверку кандидатов мы обнаружили, что экспрессия трех miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p и hsa-miR-652-3p) была значительно ниже у пациентов с IGD, чем у контрольных. Хотя образцы экспрессии других семи кандидатов miRNA не были реплицированы в валидацию, это может быть ложным отрицательным из-за небольшого размера выборки в этом исследовании. Насколько нам известно, это первый отчет о возможности того, что профили экспрессии miRNA крови могут быть полезными биомаркерами для IGD. Комбинация трех маркеров miRNA может служить в качестве минимально инвазивного инструмента для раннего выявления людей, подверженных риску ИГД.
Сообщалось, что миРНК, идентифицированные в этом исследовании, участвуют в различных нейропсихиатрических расстройствах. Сообщалось, что экспрессия hsa-miR-200c в крови ослабляется в нескольких психических расстройствах, таких как шизофрения (41) и основных депрессивных эпизодов (42). miR-200c, как сообщается, более выражен в синаптических фракциях, чем в общем переднем мозге (43), а также быть связанными с гибелью нейронных клеток (44). Основываясь на этих предыдущих сообщениях, miR-200c участвует в нейроразвитии и может быть связан с нейропсихиатрическими нарушениями, если его выражение нарушено. В нескольких исследованиях была предложена связь между miR-652 и риском развития нейропсихиатрических расстройств. Подобно нашему подходу, для идентификации биомаркеров крови для шизофрении Lai et al. проводили анализ TLDA с пациентами с шизофренией и нормальным контролем и обнаружили, что семь miRNAs, включая hsa-miR-652, были дифференциально выражены у пациентов с шизофренией (45). В последующем исследовании они разработали модель прогнозирования с использованием данных экспрессии miRNA и успешно распознали шизофрению от нормального контроля (46). Измененная экспрессия hsa-miR-652 наблюдалась также у алкоголиков (47). Было обнаружено, что Hsa-miR-26b активируется при дифференцировке нейрональных клеток (48). Perkins et al. сообщили, что hsa-miR-26b был подавлен в префронтальной коре головного мозга пациентов с шизофренией (49).
Хотя нет прямых доказательств для поддержки взаимосвязи между возмущенной экспрессией этих miRNAs и патофизиологией IGD, мы можем заключить, что дисрегуляция этих miRNAs может быть связана с патофизиологией IGD на основе различных предыдущих отчетов о нижележащих генах, которые мы предсказали , Некоторые из нижестоящих генов трех миРНК, таких как GABRB2, CNR1, NRXN1качества DPYSL2 как сообщается, связаны с нейропсихиатрическими расстройствами. Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) является основным ингибирующим нейротрансмиттером в ЦНС. Дисрегуляция ГАМК-рецептора связана с нейропсихиатрическими расстройствами, включая зависимость, тревогу и депрессию (50), которые также являются основными особенностями IGD (8). Сообщается, что генетические полиморфизмы в генах рецептора ГАМК связаны с алкогольной зависимостью и шизофренией (51, 52). Дигидропиримидиназа-подобный 2 (DPYSL2) является членом семейства белков-посредников рецепта коллапсина, который играет роль в сборке микротрубочек, синаптической сигнализации и регуляции роста аксонов. Следовательно, эта молекула была предложена как биомаркер для психических расстройств (53, 54). Полиморфизм в DPYSL2 ген, как сообщается, ассоциируется с расстройством употребления алкоголя (55). Предыдущие отчеты и наши данные свидетельствуют о том, что избыточная экспрессия GABRB2 и DPYSL2, расположенных ниже по течению мишеней с пониженной регуляцией, имеет последствия для патогенеза нейропсихиатрических расстройств, включая IGD. Каннабиноидный рецептор типа 1 (CNR1) представляет собой пресинаптический гетерорецептор, который модулирует высвобождение нейротрансмиттера и нарушения в каннабиноидной сигнализации связаны с различными нейропсихиатрическими нарушениями (56). Генетический полиморфизм CNR1 ген, как известно, связан с зависимостью веществ у кавказцев (57). В модели крысы активация вентрального гиппокампа CNR1 нарушает нормальное социальное поведение и познание (58). Известно, что генетическое изменение в семействе NRXN связано с различными нейропсихиатрическими расстройствами, включая зависимость (59).
Чтобы исследовать биологическую импликацию трех кандидатов miRNA более прямым образом, мы исследовали экспрессию белка их генов-мишеней. Из-за ограниченной доступности образцов плазмы, общих кандидатов 140 (предсказанных как ниже 2 или более miRNAs), мы исследовали цели 5 (GABRB2, DPYSL2, CNR1, DUSP4 и PI15) вестерн-блоттингом и подтвердили, что экспрессия GABRB2 и DPYSL2 был значительно выше в группе IGD. Предыдущие отчеты и наши данные свидетельствуют о том, что избыточная экспрессия GABRB2 и DPYSL2, нисходящих мишеней для подавляемых миРНК, может иметь последствия для патогенеза нейропсихиатрических расстройств, включая ИГД. Результаты анализа GO и пути развития нейронных путей развития также поддерживают нейробиологическое значение маркеров miRNA. Еще один интересный вывод - синергетический эффект одновременного изменения miRNAs. У индивидуумов с пониженной регуляцией всех микроРНК 3 риск 22 раз выше, чем у пациентов, у которых нет нисходящей регуляции, а ОР увеличились дозозависимым образом. Хотя CI для этих трех изменений были широкими из-за ограниченного размера выборки, явная положительная корреляция (r2 = 0.996) поддерживает синергетический эффект трех miRNA.
Хотя мы обнаружили обнаруженные IGD маркеры miRNA, а индивиды со всеми тремя изменениями miRNA имели риск в 22 раз выше, чем у тех, у которых нет изменений miRNA, в этом исследовании есть несколько ограничений. Во-первых, небольшой размер выборки увеличил вероятность отсутствия других значимых маркеров miRNA. Во-вторых, поскольку наших данных было недостаточно для выяснения того, являются ли профили miRNA плазмы либо причиной, либо эффектом, мы не можем подтвердить биологическую роль этих неинвазивных маркеров в клинических условиях. Дальнейшее профилирование miRNA и анализ их нижестоящих генов с использованием ткани мозга человека из банка тканей головного мозга могут дать более прямой ответ. Анализ мозговой ткани с моделью животных разного типа также был бы полезен. В-третьих, из-за ограниченного количества образцов плазмы мы исследовали только пять молекул-кандидатов ниже по потоку. Изучение большего количества целей вниз по течению с большим набором проб будет полезно для дальнейшего понимания молекулярного механизма ИГД.
Таким образом, путем скрининга профилей экспрессии miRNA и независимой валидации мы обнаружили три IGR-ассоциированные miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p и hsa-miR-652-3p). Сообщается, что многие из их нижестоящих генов участвуют в различных нейропсихиатрических расстройствах, а экспериментальная валидация измененной экспрессии этих нижерасположенных генов подтверждает импотенцию miRNAs, идентифицированных в этом исследовании. Мы обнаружили, что люди с пониженной регуляцией всех трех miRNA подвергаются высокому риску IGD. Вместе с известными клиническими или экологическими факторами риска и диагностическими критериями наши результаты могут способствовать раннему вмешательству, чтобы помочь людям с повышенным риском ИГД.
Заявление о этике
Это исследование было одобрено Институциональным советом по обзору Колледжа католического медицинского колледжа Кореи (MC16SISI0120). Все участники и их родители дали письменное информированное согласие.
Авторские вклады
ML и HC в равной степени способствовали этому документу. ML, D-JK и Y-JC разработали исследование. SJ, S-MC, YP, DC и JL выполняли эксперименты и генерировали данные. J-WC, S-HP, J-SC и D-JK собирали образцы крови и клиническую информацию. ML, HC, S-HY и Y-JC проанализировали данные. ML, HC, S-HY и Y-JC описали рукопись. Проект Y-JC контролировал проект.
Заявление о конфликте интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Сноски
Финансирование. Эта работа была поддержана грантом Программы исследований мозга через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемый Министерством науки и ИКТ и будущим планированием (NRF-2015M3C7A1064778).
Дополнительный материал
Дополнительный материал для этой статьи можно найти в Интернете по адресу http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.
Рекомендации
;
