Гипокретин (orexin) способствует вознаграждению за счет смягчения антиретровирусных эффектов его дистрофина cotransmitter в брюшной тегментальной области (2014)

Джон В. Мушамп,^a,1 Джонатан А. Холландер,^b Дженнифер Л. Томпсон,^c Джордж Ворен,^b Линда Хассинджер,^a Сара Онвани,^a Теодор М. Каменецкий,^b Стефани Л. Боргланд,^c Пол Дж. Кенни,^b и Уильям А. Карлезон-младший^a

Информация об авторе ► Информация об авторских правах и лицензии ►

Гипокретин (орексин) и динорфин являются нейромодуляторами, которые играют важную роль в регулировании аффекта и мотивации. Орексин имеет решающее значение для вознаграждения и участвует в поиске наркотиков, в то время как динорфин опосредует негативное настроение и участвует в депрессивных состояниях. Учитывая эти противоположные эффекты, сообщения о том, что оба пептида экспрессируются в одних и тех же нейронах и освобождаются от сердцевины, противоречивы. Здесь мы демонстрируем, что орексин и динорфин коэкспрессируются в одних и тех же синаптических везикулах и что эта колокализация оказывает глубокое влияние на вознаграждение, прием лекарств и импульсивное поведение. Тот факт, что орексин перекрывает депрессивные антидепрессивные эффекты динорфина, существенно меняет наше представление о функциональной роли орексина в мозге.

Гипокретин (орексин) и динорфин являются нейропептидами с противоположными действиями в отношении мотивированного поведения. Орексин участвует в состояниях возбуждения и вознаграждения, тогда как динорфин участвует в депрессивных состояниях. Мы показываем, что, несмотря на их противоположные действия, эти пептиды упакованы в те же синаптические пузырьки в гипоталамусе. Нарушение функции орексинов притупляет полезные эффекты латеральной стимуляции гипоталамуса (ЛГ), устраняет индуцированную кокаином импульсивность и снижает самоуправление кокаином. Сопутствующее нарушение функции динорфина полностью изменяет эти поведенческие изменения. Мы также показываем, что орексин и динорфин оказывают противоположное действие на возбудимость дофаминовых нейронов вентрально-сегментарной области (VTA), основной мишени для орексинсодержащих нейронов, и что внутри-VTA антагонизм с орексином вызывает снижение самостоятельного введения кокаина и самостимуляции ЛГ которые обращены вспять антагонизмом динорфинов. Наши результаты идентифицируют уникальный клеточный процесс, с помощью которого орексин может перекрывать эффекты повышения порога динорфина, повышающего порог, и, таким образом, действовать разрешающим образом для облегчения вознаграждения.

Орексин и динорфин являются котрансмиттерами.

Мы подтвердили совместную экспрессию орексина и динорфина в одних и тех же нейронах мышечного латерального, перифорического и дорсомедиального гипоталамуса с помощью флуоресцентной микроскопии (18) (Рис 1A). Существование нейронов, которые экспрессируют несколько передатчиков, было описано в других мозговых цепях и может представлять нейронную основу для механизмов фильтрации, с помощью которых высвобождение коэкспрессированных нейротрансмиттеров происходит с различной частотой срабатывания (19). Используя ЭМ, мы обнаружили, однако, что орексин и динорфин колокализуются в одних и тех же синаптических пузырьках. Большинство случаев соупаковки наблюдались при немиелинизированных варикозных аксональных процессах, где иммунная метка была обнаружена в везикулах или рядом с ними. В нейрональных клеточных телах значительная метка была связана с комплексом Гольджи, тогда как в соседних ядрах не было обнаружено ни одного (Рис 1 B и C). Дендриты также содержали метки, ассоциированные с везикулами для обоих пептидов, что свидетельствует о потенциальном дендритном высвобождении этих передатчиков. Небольшое количество микроструктурных профилей захватывало аксонные терминалы с маркировкой для обоих пептидов, расположенных в больших (N100 нм) везикулах, расположенных вне зоны высвобождения асимметричных синапсов (Рис 1 B и C), подтверждая вывод о том, что орексин и динорфин функционируют как котрансмиттеры и что при нормальных условиях они выделяются вместе, а не дифференциально, в зависимости от частоты срабатывания клеток.

 

Рис. 1.

Орексин и динорфин являются котрансмиттерами в нейронах гипоталамуса. (A, крайний левый) Микрофотография светлого поля показывает область гипоталамуса, исследованную на предмет иммунореактивности орексина (красный) и динорфина (зеленый). (A, крайний правый) Объединенное двухканальное изображение ...

Вознаграждение, повышающее пороговые эффекты блокады Орексина, устраняется блокадой динорфина.

Чтобы исследовать функциональную значимость этого уникального паттерна экспрессии передатчика, мы исследовали, могут ли нарушения в передаче сигналов орексин и динорфин влиять на сложное поведение, отражающее нормальную и аберрантную мотивацию. У мышей C57BL / 6, обученных выполнять внутричерепную самостимуляцию (ICSS), усиленную латеральной стимуляцией гипоталамуса (LH) (20), блокада ОХ₁Rs от N- (2-метил-6-бензоксазолил) -N '' -1,5-нафтиридин-4-илмочевины (SB334867) во время легкой фазы вызывал зависимое от дозы увеличение порогов вознаграждения (Рис 2A; односторонние повторные измерения ANOVA для дозы: F_3,12 = 4.44, P <0.02). Повышение пороговых значений ICSS отражает вызванное лечением снижение положительного воздействия стимуляции, депрессивный признак, указывающий на снижение чувствительности к вознаграждению (20). Этот эффект не был вызван седацией или другими неспецифическими нарушениями поведения, потому что частота ответов ICSS не была затронута (Рис 2B; односторонние повторные измерения ANOVA для дозы: F_3,24 = 0.33, P > 0.80).

 

Рис. 2.

Возникающие из-за пороговых эффектов эффекты блокады орексинов устраняются блокировкой динорфинов. (A) Блокада передачи сигналов орексинов в OX₁R по SB334867 (0 – 30 мг / кг, внутрибрюшинно) повышает пороги вознаграждения в тесте ICSS, указывая на снижение вознаграждения. Этот эффект ...

Повышение порогов вознаграждения, вызванных SB334867, было предотвращено предварительной обработкой нор-биналторфимином (norBNI) [двусторонние повторные измерения ANOVA для лекарственного средства (между субъектами) × дозовое SB (в пределах субъекта): F_3,24 = 3.98, P <0.01], что вызывает длительную блокаду действия динорфина на KOR (10). Эти данные позволяют предположить, что потеря передачи сигналов орексинов выявляет скрытые анти-вознагражденные эффекты динорфина с кор-лизингом. Администрация только norBNI не снизила пороговые значения вознаграждения. Хотя этот эффект может быть связан с уникальной фармакодинамикой norBNI и других прототипов антагонистов KOR (10), это также может указывать на то, что имеется избыточность в процессах, которые модулируют активность цепей вознаграждения мозга, или что фазовое увеличение одного тона орексина (не противопоставляемое динорфином, содержащимся в ядре) недостаточно для передачи сигнала вознаграждения от места стимуляции в латеральном гипоталамусе. Эти результаты могут сначала показаться несовместимыми с работой других, которые исследовали SB334867 на пороге ICSS во время темной фазы (21). Тем не менее, существует немало свидетельств того, что снижение функции орексинов может иметь последствия, которые зависят от того, тестируются ли животные в светлой или темной фазе. Например, пища и вода сохраняют свои полезные эффекты у мышей с орексином КО, когда тестирование проводится во время темной фазы, но не во время светлой фазы (22) время, когда мы выполнили все наши поведенческие тесты.

Чтобы локализовать эффекты системного введения SB334867 и norBNI на ICSS, отдельной когорте мышей были имплантированы LH стимулирующие электроды и VTA направляющие канюли. Микроинфузия SB334867 в VTA вызывала заметное увеличение порогов вознаграждения, что указывает на снижение чувствительности вознаграждения. Хотя внутри-VTA norBNI не влиял на пороги ICSS, он блокировал эффекты повышения порога последующей инфузии SB334867 (Рис 2C; односторонние повторные измерения ANOVA для лекарств: F_3,9 = 10.98, P <0.01). Хотя внутричерепные инфузии лекарств имели тенденцию вызывать умеренное снижение максимальной скорости ответа по сравнению с системными инъекциями лекарств, эти эффекты не достигли статистической значимости (Рис 2D; односторонние повторные измерения ANOVA для лекарств: F_3,9 = 1.03, P = 0.112).

Импульсивность регулируется передачей орексинов и динорфинов.

Импульсивность характеризуется недостатком подавления поведения, направленного на получение вознаграждения, при этом высокий уровень импульсивности является общей чертой многих психических заболеваний (23). Наркотики злоупотребления, включая кокаин, могут также вызвать увеличение импульсивности, которая, как предполагается, стимулирует развитие зависимости (24). Учитывая ключевую роль корелизированного орексина и динорфина в контроле чувствительности к полезному эффекту стимуляции ЛГ в тесте ICSS, мы предположили, что взаимодействия между этими двумя нейропептидами могут влиять на базовую импульсивность и вызванные кокаином дефициты в этом поведении. Импульсивность может быть определена количественно у грызунов путем измерения преждевременных реакций в задаче времени последовательной реакции выбора 5 (5-CSRTT) (25), модель на животных, аналогичная непрерывному тесту производительности, используемая для изучения внимания у людей. Преждевременное реагирование в этом тесте имеет тенденцию быть низким в нормальных условиях и усугубляется лекарствами, которые повышают передачу DA (26). Мы использовали 5-CSRTT для изучения вклада системы орексин-динорфин в спонтанное и вызванное кокаином импульсивное поведение. При введении отдельно SB334867 еще больше уменьшал и без того небольшое количество спонтанных преждевременных реакций (Рис 3A; F_3,21 = 4.89, P <0.01). Эти сокращения произошли в отсутствие влияния на точность отклика (F_3,21 = 1.45, P = 0.25), задержка извлечения гранул (F_3,21 = 0.91, P = 0.44) или количество завершенных испытаний стимула (F_3,21 = 1.46, P = 0.25), что указывает на то, что они не были связаны с ухудшением бдительности или двигательных способностей. Администрация norBNI, однако, полностью изменила влияние SB334867 на преждевременное реагирование (Рис 3B; F_3,18 = 0.45, P = 0.71), что свидетельствует о том, что передача неопосредованного динорфина имеет решающее значение в обеспечении этих антиимпульсных эффектов. Учитывая отдельно или в сочетании с SB334867, norBNI не оказывал влияния на показатели точности ответа (F_3,18 = 0.66, P > 0.58), задержка (F_3,18 = 3.09, P > 0.06) или количество завершенных испытаний стимулов (F_3,18 = 2.38, P > 0.10). Предварительная обработка SB334867 также предотвратила двукратное увеличение преждевременной реакции, вызванной кокаином (Рис 3C; F_6,24 = 5.84, P <0.01). Эти данные свидетельствуют о том, что нейротрансмиссия орексина может регулировать импульсивное поведение как в исходных условиях, так и в условиях, стимулированных кокаином, чувствительным к динорфину образом.

 

Рис. 3.

Импульсивное поведение регулируется балансом орексинов и динорфинов. (A) SB334867 ослабляет преждевременные реакции в модели двигательной импульсивности у крыс 5-CSRTT. Показатели точности, задержки для получения пищевой гранулы и количества пропущенных испытаний были ...

Dynorphin опосредует снижение самостоятельного введения кокаина в OX₁R-нулевые мыши.

Уязвимость к наркозависимости заметно повышается у импульсивных индивидуумов, и предполагается, что вызванное кокаином увеличение импульсивности способствует возникновению зависимости (23, 27). Кроме того, передача орексина и передача динорфина были независимо вовлечены в регулирование полезных эффектов кокаина и других наркотиков злоупотребления (28–32). Мы предположили, что взаимодействие между передачей орексина и динорфина может напрямую контролировать прием лекарств. Чтобы исследовать эту возможность, мы исследовали внутривенное введение кокаина у генетически модифицированных мышей, лишенных ОХ.₁Rs (OX₁R^{- / -}). Мыши этого генотипа демонстрируют значительно более низкое самостоятельное введение кокаина в широком диапазоне доз (0.1 – 1 мг / кг на одну инфузию), но демонстрируют неизменный ответ на вознаграждение за пищу при тех же схемах подкрепления (33), предполагая, что снижение потребления кокаина не является вторичным по отношению к дефициту поведенческих характеристик. Кроме того, OX₁R^{- / -} мыши демонстрируют нормальную частоту самостоятельного введения кокаина в течение приблизительно трех начальных сессий доступа кокаина, но затем быстро показывают снижение потребления кокаина (33). Мы подтвердили этот фенотип в дозе 0.3 мг / кг на одну инфузию, что указывает на передачу сигналов через OX₁RS играет решающую роль в установлении и поддержании поведения самоуправления кокаина [Рис 4; двукратные повторные измерения ANOVA, генотип (между субъектами-факторами) × медикаментозное лечение (в пределах субъектов-факторов): F_1,12 = 12.91, P <0.01]. Подобно тому, как предварительное лечение с помощью norBNI восстановило нормальный ICSS и импульсивное поведение у мышей, получавших SB334867, оно также частично восстановило самовведение кокаина в OX.₁R^{- / -} мыши, предоставляя уникальный пример, в котором поведенческий дефицит, вызванный генетической абляцией в функции одной нейротрансмиттерной системы, устраняется путем блокады другой. Эти результаты показывают, что в OX₁R^{- / -} у мышей противодействующие действия динорфина ослабляют полезные свойства кокаина и тем самым снижают самостоятельное введение лекарственного средства. Интересно, что в ОХ₁R^{+ / +} У (контрольных) мышей norBNI неожиданно снижал самоуправление кокаином. Одним из возможных объяснений этого эффекта является то, что динорфин, высвобождаемый нонорексиновыми нейронами, такими как так называемые «прямые» колючие нейроны стриатонигральной среды, оказывает противоположное влияние на потребление кокаина и может фактически способствовать полезным эффектам кокаина. Существование двух популяций KOR с противоположными ролями в вознаграждении кокаином также объясняет, почему norBNI лишь частично обращал вспять дефицит поведения при приеме кокаина, обнаруженный в OX.₁R KO мышей. Кроме того, антагонизм KOR уменьшает неприятные или стрессовые эффекты отмены кокаина (34), которые способствуют потреблению наркотиков (17). Несмотря на это, эти данные свидетельствуют о том, что депрессорно-подобные эффекты динорфина преобладают в отсутствие интактной передачи сигналов орексинов, вызывая уменьшение полезных эффектов кокаина, тогда как эффекты орексинов облегчают полезные эффекты кокаина, увеличивая их продолжительность в отсутствие передача сигналов динорфинов.

 

Рис. 4.

Снижение самостоятельного введения кокаина в OX₁R KO мышей восстанавливается путем блокады KOR. Нарушение передачи сигналов орексинов в OX₁Генетическая делеция этого рецептора снижает внутривенное введение кокаина (0.3 мг / кг на одну инфузию). Этот дефицит частично ...

Орексин и динорфин могут оказывать сбалансированное противоположное влияние на возбудимость нейронов VTA DA.

Структуры мозга, которые получают входные данные от нейронов гипоталамуса орексин и динорфин, потенциально подвержены воздействию обоих пептидов и, следовательно, подвержены их противоположному влиянию на возбудимость нейронов (35, 36). Степень, в которой эффекты одного пептида преобладают над эффектами другого, вероятно, зависит от многочисленных факторов, включая относительную распространенность каждого пептида, продолжительность жизни во внеклеточном пространстве и экспрессию рецепторов в различных популяциях нейронов-мишеней, а также взаимодействия между рецепторы и их внутриклеточные сигнальные механизмы в постсинаптических клетках. Импульсивность и вознаграждение кокаином регулируются, по крайней мере частично, DA нейронами в VTA (26), видная цель клеток, содержащих гипоталамус и орексин (37). Кроме того, вливание орексина в ВТА усиливает поиск лекарств (6). Чтобы оценить относительный вклад каждого пептида в активность нейронов VTA, мы сделали электрофизиологические записи клеток DA в срезах мозга мышей C57BL / 6, подвергнутых воздействию орексина и динорфина, применяемых по отдельности или вместе. Как и ожидалось, при применении по отдельности орексин был равномерно возбуждающим, тогда как динорфин оказывал только ингибирующее действие (Рис 5 A и B; F_2,50 = 18.95, P ≤ 0.01). В популяции зарегистрированных нейронов DA большинство ответили на насыщающие концентрации обоих пептидов, хотя небольшое количество было избирательно реагирующим только на орексин или динорфин (Рис 5B). Примечательно, что когда оба пептида были применены к нейронам с двойной чувствительностью (n = 10), нет чистого влияния на скорость стрельбы (Рис 5A), предполагая, что противоположные эффекты каждого пептида при насыщающих концентрациях эффективно нейтрализуют друг друга при кореазе. Четыре из 10 нейронов продемонстрировали преимущественное ингибирование динорфином, несмотря на присутствие орексина, тогда как одна клетка преимущественно возбуждалась (более чем в 1.5 раза) орексином, несмотря на присутствие динорфина (Рис 5 A и C). В целом, хотя больше клеток было чувствительным к орексину, чем к динорфину, те клетки, которые были чувствительны к обоим пептидам, не имели общего изменения в скорости стрельбы при совместном применении орексина и динорфина, предполагая, что противоположные влияния каждого пептида были сбалансированы в наборе VTA DA нейроны изучены.

 

Рис. 5.

Орексин и динорфин оказывают сбалансированное, но противоположное воздействие на нейроны VTA DA. (A, левый) Совместно применяемые орексин и динорфин не приводят к общему изменению скорости запуска нейронов VTA DA (n = 10). При применении по отдельности динорфин был тормозящим, а орексин - возбуждающим. ...

Для дальнейшего выяснения потенциальных взаимодействий орексин-динорфин в нейронах VTA DA, которые были чувствительны как к орексину, так и к динорфину, мы, в качестве альтернативы, попытались усилить ингибирующее действие применяемого в ванне динорфина обработкой SB334867 (Рис. S2A; F_5,25 = 2.13, P <0.01) или для усиления возбуждающего действия орексина, нанесенного в ванну, путем обработки норБНИ (Рис. S2B; F_3,27 = 5.48, P <0.01). В обоих экспериментах OX₁Блокада R и KOR не дала этих эффектов, предполагая, что SB334867 и norBNI не оказывают эффектов через неспецифические действия. Что еще более важно, эти данные предполагают, что тонус каждого пептида in vitro недостаточен, чтобы на него влияло применение низкомолекулярных антагонистов, таких как SB334867 и norBNI. Это открытие согласуется с предыдущими работами, указывающими на то, что экзоцитоз больших пептидсодержащих везикул обычно происходит только при высоких частотах непрерывного запуска, обычно не присутствующих в препаратах срезов (38).

Чтобы убедиться, что norBNI не влиял на поведение через «нецелевые» действия непосредственно в OX₁Rs, мы затем изучили влияние этого антагониста на OX₁R сигнализация. В частности, мы использовали анализ с помощью флюорометрического считывающего планшета (FLIPR) для определения способности наносимого в ванне орексина A, SB334867 или norBNI индуцировать внутриклеточные переходные процессы кальция в культивируемых клетках CHO, экспрессирующих OX человека.₁Rs. Хотя орексин А вызывал ожидаемое увеличение внутриклеточного кальция (ЕС₅₀ = 0.01 мкМ) и SB334867 дозозависимо ослабили этот эффект (EC₅₀ = 0.035 мкМ), norBNI не оказал какого-либо влияния на увеличение внутриклеточного кальция, вызванное как базовым уровнем, так и вызванным орексином А. Это говорит о том, что эффекты norBNI на физиологию нейронов VTA DA обусловлены исключительно предлагаемыми механизмами передачи сигналов KOR, и препарат не оказывает прямого воздействия на OX.₁Р (39) (Рис. S3 A–C).

Взаимодействие Орексин-Динорфин в VTA регулирует самоуправление кокаином.

Наши электрофизиологические исследования показывают, что динамическое взаимодействие между орексином и динорфином регулирует активность VTA DA, и что нейроны VTA, вероятно, служат ключевым субстратом для воздействия системы орексин-динорфин на мотивированное поведение. Чтобы проверить эту гипотезу напрямую, мы изучили влияние внутривенного введения SB334867 на внутривенное введение кокаина у крыс. По сравнению с внутривенной инфузией носителя SB334867 внутри VTA вызывал заметное снижение потребления кокаина, которое блокировалось норБНИ (Рис 6; односторонний ANOVA: F_3,24 = 11.56, P <0.01), предполагая, что неограниченное действие динорфина в этой области мозга ослабляет кокаиновую награду. Эти результаты, по-видимому, расходятся с теми, которые продемонстрировали отсутствие SB334867 внутри VTA при самостоятельном введении кокаина в легких схемах подкрепления с фиксированным соотношением 1 (FR1) (40). Тем не менее, несколько отчетов показали, что с увеличением требований к задачам SB334867 более эффективен в снижении потребления наркотиков (2, 33). Поскольку крысы в ​​этом эксперименте выполняли график FR5 с большим усилием, настоящие результаты согласуются с этой литературой. Эти данные являются прямым доказательством того, что противоположная природа орексина и динорфина в физиологии нейронов VTA DA может оказывать существенное влияние на поведение, ориентированное на вознаграждение.

 

Рис. 6.

Взаимодействие орексин-динорфин в VTA опосредует прием лекарств. Самостоятельное введение кокаина снижается при внутривенном введении SB334867 (3 мкг на сторону), в то время как этот эффект устраняется предварительной обработкой norBNI (10 мг / кг, внутрибрюшинно) (n = 9). ***P < ...

Животные.

Взрослые самцы мышей C57BL / 6J (8 wk возраста; лаборатория Джексона), используемые в экспериментах по ЭМ, содержались в группах (по три-пять на клетку); те, которые использовались для ICSS, были размещены отдельно после операции. Взрослых самцов (350 g) крыс Sprague-Dawley (Charles River Laboratories) использовали в экспериментах по самостоятельному введению 5-CSRTT и кокаина и помещали в группы по четыре человека. Взрослых самцов мышей C57BL / 6J (в постнатальные дни 19 – 21), используемых для электрофизиологических экспериментов, размещали в группах (по три-пять на клетку). OX1^{- / -} мыши и их OX1^{+ / +} Однопометники (6 wk возраста), использованные для исследований по самостоятельному введению, были получены из лаборатории Джексона и подвергались обратному скрещиванию более семи поколений с мышами C57BL / 6. Эти мыши были размещены в группе (по две на клетку). Все животные содержались в условиях с контролируемой температурой в цикле свет / темнота 12-h, а поведенческое тестирование происходило в течение цикла освещения 4-5 h; еда и вода были доступны ad libitum, если не указано иное. Процедуры проводились в соответствии с национальными институтами здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных (50) и были одобрены Институциональными комитетами по уходу и использованию животных при больнице Маклин, Университете Британской Колумбии и Scripps Florida.

Иммуногистохимия и микроскопия.

Флуоресценцию и усиленную серебром иммунную метку золота для орексина А или продинорфина проводили на альтернативных срезах мозга мыши в соответствии с ранее описанными процедурами (51) и обрабатывается в соответствии со стандартными протоколами EM. Неперекрывающиеся участки иммунолеченой ткани затем случайным образом отбирали и фотографировали для количественного определения частиц с использованием программного обеспечения ImageJ (National Institutes of Health) (СИ Материалы и методы, иммуногистохимия и микроскопия).

Электрофизиологии.

Патч-пипетки (3-5 MΩ) были заполнены 143 мМ глюконатом калия, 10 мМ Hepes, 0.2 мМ EGTA, 2 мМ MgATP, 0.3 мМ NaGTP (с рН 7.2) и 270-280 мМ мМ. Данные были получены при 20 кГц и отфильтрованы при 2 кГц с использованием программного обеспечения pClamp 10.0 (Molecular Devices). После получения конфигурации для целых ячеек ячейки зажимались под напряжением при -70 мВ, и для обнаружения гиперполяризации применялась серия шагов напряжения (250 мс, от -60 до -130 мВ с шагом 10-мВ).I_h) токи. I_h был определен как изменение тока между N30 мс и 248 мс после применения шага напряжения. Собственная активность нейронов VTA DA измерялась в режиме токовой фиксации. Эксперименты начались, когда была достигнута стабильная базовая скорость стрельбы; субстраты затем наносили на 5 min и затем промывали искусственной спинномозговой жидкостью. Последние 3 мин каждого сегмента 5-мин были использованы для анализа данных. Динорфин A (1 – 17; 200 нМ) и орексин A (100 нМ) были получены из американского пептида и растворены в дистиллированной воде. Ранее было обнаружено, что эти концентрации оказывают насыщающее влияние на активность клеток VTA (5, 52). Тиорфан (1 мкМ) и бестатин (10 мкМ) были получены от Sigma-Aldrich, растворены в дистиллированной воде и нанесены вместе с динорфином A (СИ Материалы и методы, электрофизиология).

FLIPR Assay.

OX₁Активность R оценивали путем измерения внутриклеточных уровней кальция с помощью FLIPR-анализа, как описано ранее (53) (Материалы и методы СИ, Флюорометрический анализ считывающих устройств).

ИКСИ.

Мышам имплантировали монополярные стимулирующие электроды или канюли (PlasticsOne) под кетамином / ксилазином (80 и 10 мг / кг, соответственно, ip; Sigma), направленными стереотаксически в LH (18) и / или контралатеральная VTA [от bregma: переднезадний (AP), -3.2 мм; медиолатеральный (ML), -0.5 мм; дорсовентральный (DV), -4.7 мм от твердой мозговой оболочки]. После периода восстановления 7-d мышей обучали отвечать на стимуляцию мозга, как описано ранее (18). Самая низкая частота, которая поддерживала ответ (порог), была рассчитана с использованием анализа линии наилучшего соответствия наименьших квадратов. Когда мыши удовлетворяли критериям стабильности для порогов ICSS (± 10% в течение 5 последовательных дней), измеряли эффекты лекарственного лечения. Носитель SB334867 (Scripps Florida) или DMSO вводили в разные дни, используя шприц Гамильтона (0.1 мл / кг внутрибрюшинно), и пороговые значения немедленно определяли количественно в сеансах теста 15-min. NorBNI (10 мг / кг внутрибрюшинно; Sigma) вводили в физиологическом растворе (10 мл / кг) 48 за час до начала испытания ICSS.

5-CSRTT.

Крысы были ограничены в еде (до 85% от веса при естественном вскармливании) и обучались в управляемых компьютером оперных камерах, размещенных внутри вентилируемых, шумопоглощающих кабинетов (Med Associates), и процедуры 5-CSRTT выполнялись, как описано (25). SB334867 (в ДМСО, 0.1 мл / кг) и / или кокаин (в физиологическом растворе, 1 мл / кг; Sigma) вводили внутрибрюшинной инъекцией 10 мин перед тестированием, как в других экспериментах, и norBNI давали по меньшей мере 48 ч до начало тестирования (Материалы и методы СИ, Так, –Выбор последовательного времени реакции).

IV Кокаин Самоуправление.

Крыс и мышей анестезировали смесью из паров кислорода изофлюран (1 – 3% об. / Об.) И хирургически готовили с помощью катетеров Silastic (VWR Scientific) в яремной вене в соответствии с установленными процедурами (54). Сразу после имплантации катетера крысам в VTA были имплантированы двусторонние направляющие канюли из нержавеющей стали (калибр 23, длина 17 мм) (от bregma: AP, 5.3 мм; ML, ± 0.7 мм; DV, −7.5 мм от твердой мозговой оболочки). ). Тестирование с SB334867 или norBNI в течение 60-минутных ежедневных сеансов проводилось после достижения стабильного приема кокаина (<20% вариации ответа в течение 3 дней подряд; СИ Материалы и методы, И.В. Кокаин Самоуправление).

Статистика.

Данные выражены как среднее ± SEM. Для экспериментов ICSS были использованы двусторонние повторные измерения ANOVA для сравнения средних между состояниями, обработанными SB334867 и норбНИ + SB334867. Для сравнения средних значений в условиях SB334867 и norBNI + SB334867 использовались односторонние повторные измерения ANOVA с апостериорными тестами Ньюмена-Кеулса. Односторонние повторные измерения Тесты ANOVA и Newman – Keuls также использовались для сравнения средних значений во всех экспериментах 5CSRTT. Двусторонние повторные измерения ANOVA использовали для сравнения средних значений между группами лечения в экспериментах по самостоятельному введению кокаина с ОХ.₁R KO мышей. Односторонние повторные измерения Тесты ANOVA и Ньюмена-Кеулса использовались для сравнения средних ответов на орексин и динорфин от VTA DA нейронов. Односторонние повторные измерения Тесты ANOVA и Newman – Keuls также использовались для сравнения средств потребления кокаина у крыс, получавших SB334867 и norBNI. Различия считались значительными, если P <0.05.

Мы благодарим доктора Гарретта Фицмориса за полезные комментарии к рукописи, а также Миранду С. Галло и Мелиссу Чен за помощь в сборе данных. Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения F32-DA026250 и K99-DA031767 (для JWM), F32-DA024932 и K99-DA031222 (для JAH), R01-DA023915 (для. PJK) и R01 (для R063266 ) и грантом на открытие Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям (SLB).

Заявление о конфликте интересов: WAC имеет патент (патент США 6,528,518; правопреемник: McLean Hospital), связанный с использованием каппа-опиоидных антагонистов для лечения депрессивных расстройств. Все остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Эта статья является прямым представлением PNAS.

Смотрите комментарий на странице 5765.

Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1315542111/-/DCSupplemental.