高度可食性食物對雌性大鼠早期生活應激經歷引起的行為和神經逆境的有益影響（2015）

Jin Young Kim,¹ Jong-Ho Lee,^1,✉ Doyun Kim,^1,2 Soung-Min Kim,¹ JaeHyung Koo,² 和 Jeong Won Jahng^1,✉

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本研究探討了青春期高度可口的食物對雌性大鼠早期生活壓力經歷引起的心理 - 情緒和神經紊亂的影響。 在出生的前兩週（MS）或未受干擾的（NH），每天將雌性Sprague-Dawley幼崽與大壩分開3 h。 一半的MS女性除了可以免費獲得巧克力餅乾 隨意 來自產後日28的食物。 在成年期間，幼崽接受了行為測試。 分析血漿皮質酮對腦區急性應激，ΔFosB和腦源性神經營養因子（BDNF）水平的反應。 在整個實驗期間，總熱量攝入和體重增加在實驗組之間沒有差異。 青春期和青少年期間的Cookie訪問通過MS經驗改善了焦慮/抑鬱樣行為。 ΔFosB表達降低，但MS雌性伏核中BDNF增加，ΔFosB表達正常化，並且在cookie進入後BDNF進一步增加。 皮質酮對急性應激的反應因MS經驗而減弱，並且cookie訪問沒有改善它。 結果表明，青春期的cookie訪問改善了MS女性的心理 - 情緒障礙，伏隔核中的ΔFosB和/或BDNF表達可能在其潛在的神經機制中發揮作用。

動物

購買Sprague-Dawley大鼠（Samtako Bio，Osan，Korea），並在無特定病原體的屏障區域照顧，恆定控制溫度（22±1℃），濕度（55％）和12 / 12小時亮/暗循環（在07上點亮：00 AM）。 可獲得標準實驗室食品（Purina Rodent Chow，Purina Co.，Seoul，Korea）和膜過濾的純淨水 隨意。 根據韓國醫學科學院編輯的動物實驗指南2000對動物進行護理，該指南符合NIH實驗動物護理和使用指南，修訂後的1996。 所有動物實驗均經首爾國立大學實驗動物護理和使用委員會批准。

實驗方案

在動物設施的實驗室中將未經處理的雌性和經過驗證的種雞用於繁殖，並且以受控的方式飼養幼仔以最小化和標準化來自的不需要的環境刺激。 在子宮內 生活。 在確認分娩[產後日（PND）1]後12小時，如前所述對幼崽進行操作 ^{13, 14, 33 - 35}。 每個產仔分配給母體分離（MS）組或未處理（NH）組。 將MS幼犬從其水壩和家禽籠中取出，並在9：00h至12：00h內緊密放置在一個用木屑鋪成的新籠子中（白楊刨花，Animal JS Bedding，韓國青陽市），然後返回家中籠子和水壩。 在分離期間未提供任何額外的處理來保持幼犬的溫暖。 每天從PND 1到14進行MS，然後將幼崽的壩保持原狀，直到PND 22斷奶。NH組保持斷奶，直到斷奶，每週例行兩次清潔籠子。 在斷奶當天，分別從每個NH或MS產仔中隨機選擇2只NH和4個MS雌性幼崽，並將2個NH或2個MS幼崽一起放入每個籠子中。 兩隻一起生活在MS中的雌性幼崽可免費獲得高度美味的食物（HPF）（奧利奧餅乾，卡夫食品全球有限公司，美國新澤西州東漢諾威） 隨意 來自PND 28（MS + HPF組）的食物，以及每窩（MS組）和NH幼崽（NH組）中的其餘2雌性幼崽僅接受標準食物。 標準食物和奧利奧曲奇餅的營養成分配方如表所示 Table1.1。 從PND 29記錄每日食物攝入量和體重增加。 為了評估24 h食物攝入量，提供了預先測量的食物和餅乾量，並且在第二天，稱量剩餘的食物和餅乾量並從前一天提供的值中減去。 特別注意包括溢出物。 根據食物和餅乾的營養成分公式計算熱量攝入量。 每籠中幼仔消耗的食物總量除以每個籠中幼仔的數量，每個計算值被認為是n = 1。 所有實驗組都可以免費獲得水，並且在整個實驗期間繼續食物條件。 圖中提供了實驗方案的示意圖 Figure11.

 

圖1

實驗方案。

 

表1

標準食物和奧利奧餅乾中的營養成分（％）

門診活動

NH，MS和MS + HPF雌性（n =每組8不同窩的4;來自24不同窩的總8幼仔）在PND 54上進行走動測試。 在每次試驗中，將大鼠置於活動室的中心（43.2 cm長，42.2 cm寬，30.5 cm高，MED Associates，VT，USA），透明的丙烯酸室，配備兩個水平面。 16紅外光電管 - 探測器對放置在 x, y 尺寸，間隔2.5厘米，其走動活動由計算機化系統監測30 min。 在日光條件下，測試室的光照條件與動物室保持相同的強度。 在每個連續的5 min會話期間測量動態活動作為水平傳感器中的光束中斷的總計數。 在每隻大鼠的步行試驗期間，對排便活動，糞便的重量進行評分。 進一步分析了修飾活動; 即，前爪和頭部修飾被認為是頭部修飾，身體，腿部和尾部/生殖器修飾作為尾部修飾 ³⁶。 每次使用後用70％乙醇清潔活性室以消除先前測試的大鼠的任何嗅覺提示。

高架加迷宮

在走動活動測試（PND 56）後兩天，對大鼠進行高架十字迷宮的行為評估，一個帶有兩個相對的開放臂（50 cm長度和10 cm寬度）的正形丙烯酸迷宮和兩個相對的閉合臂（50 cm長，10 cm寬，31 cm高），從中央平台伸出（10 cm x 10 cm）。 整個裝置在地板上方50厘米處升高。 如前所述進行測試程序 ³⁷。 將每隻大鼠置於面向其中一個開放臂的迷宮的中心，然後允許探測迷宮的開放或閉合臂，持續5 min。 記錄了在不同武器上花費的時間。 四個爪子必須在每個臂的入口線內，這標誌著在特定臂中花費的時間的開始，然後在所有四個爪子再次在線外時記錄結束時間。 在每次測試後用70％乙醇清潔迷宮以防止先前測試的大鼠的影響。

強迫游泳測試

在高架十字迷宮測試（PND 59）後三天，根據先前描述的方法對大鼠進行強迫游泳測試。 ³⁸。 允許每隻大鼠在裝有水的玻璃圓筒（高54厘米，直徑24厘米）中游泳，深度40厘米（23-25℃），持續5分鐘，並用攝像機記錄下測試時間。圓柱體的側面。 使用秒錶通過錄像帶對大鼠在水中的不動持續時間進行評分。 靜止被定義為一種狀態，在這種狀態下，老鼠被認為僅在進行必要的運動以使其頭部保持在水面以上。

在每次測試之前將大鼠放置在測試室中至少2 h以最小化不想要的應激效應，並且在當天的9：00 AM和12：00 PM之間進行所有行為評估以避免晝夜變化的影響。 用觀察者對大鼠的治療進行行為評分。

血漿皮質酮測定

行為訓練結束後一周，將大鼠放置在約束箱中2小時，其中大鼠能夠移動其四肢，但不能改變其身體方向。 在限制期間，在0、30、60和120分鐘的時間點收集尾巴血，並以2,000 rpm離心20分鐘。 將血漿樣品冷凍在液氮中，並保存在– 80°C下，直至用於測定。 通過放射免疫分析法測定血漿皮質激素水平 ¹²⁵I標記的Coat-A-Count試劑盒（Siemens，CA，USA）。 測定的靈敏度為5.7ng / ml。 批內變異係數是4-12.2％。

蛋白質印跡分析

行為測試未成熟的大鼠（每組6個不同窩中的n = 3； 18個不同窩中的6隻幼犬）處死於PND 62上，用於腦區域ΔFosB和BDNF水平的蛋白質印跡分析。 處死時收集腹膜後脂肪墊，並在斬首後立即取出大腦。 將伏隔核（NAc）和海馬的組織樣本在冰上快速解剖，在液氮中冷凍，並在– 80°C下保存直至使用。 根據我們先前研究中使用的方法，使用細刀片進行NAc組織解剖 ^{28, 39}; 然而，無法避免可能包含附近的腹內側紋狀體。 將組織在單一洗滌劑裂解緩衝液（50 mM Tris，pH 8.0; 150 mM NaCl; 1％Triton X-100;蛋白酶和磷酸酶抑製劑混合物0.5％）中勻漿，然後在13,000下以20 g離心4 min^oC.使用蛋白質測定試劑盒（Biorad DC，Biorad，Inc.，Hercules，CA）測量轉移到新試管中的上清液的蛋白質含​​量，將其以80μg/ 20μl的濃度在裂解緩衝液中分裝，並保存在– 80 °C，否則在同一天使用。 將樣品與上樣緩衝液（100 mM Tris，pH 6.8; 200 mM二硫蘇糖醇; 4％​​SDS; 20％甘油; 0.2％溴酚藍）以1：1稀釋液混合，煮沸5分鐘，在冰上快速冷卻，然後在12％SDS-聚丙烯酰胺Tris-甘氨酸凝膠上進行電泳。 將蛋白轉移到硝酸纖維素膜（Hybond-C，Amersham，Bucks，英國）上，並用5％脫脂奶粉在1X Tris緩衝鹽水Tween（10 mM C）中處理。₄H₁₁沒有₃; 0.145 M NaCl; 0.2％SDS; 0.1％Tween 20）在4過夜⁰C.膜與多克隆兔抗∆FosB（1：1000稀釋度;美國加利福尼亞州達拉斯的聖克魯斯生物技術）或抗BDNF（1：500稀釋度;美國加利福尼亞州密理博市的密理博）反應，然後根據製造商的說明（Lumi-light Western印跡底物； Roche，印第安納州印第安納州，羅氏），用化學發光法檢測結合的抗體，並使用數字圖像分析系統（LAS-1000，Fuji film，日本東京）進行定量。 將每個樣品的數字化值相對於上樣對照β-肌動蛋白標準化，然後將所有值轉換為相對值，作為NH組的平均值。

統計分析

通過單向或雙向[皮質酮數據分析數據; 處理（處理或食物條件，每個2水平）X時間（4水平）]方差分析（ANOVA），以及組間預先計劃的比較通過 事後 必要時使用StatView軟件（Abacus，伯克利，加利福尼亞，美國）進行Fisher的PLSD測試。 通過重複測量方差分析（ANOVA）進一步分析體重和食物攝入數據，然後進行Bonferroni校正 P 價值調整。 意義水平設定為 P <0.05，所有值均表示為平均值±SEM

食物攝入量和體重增加

MS女性似乎比年齡匹配的NH女性輕，直到PND 39，此後未觀察到體重差異（圖 （Figure2A）.2一個）。 統計上顯著的差異（P在PND 0.05 – 32期間，除PND 39和36以外，在NH和MS雌性之間觀察到<37）。通過MS經驗，可口的食物獲取減少了體重差異，並且PND 36之後，NH和MS + HPF之間的統計學意義消失了。測量方差分析顯示，MS和MS + HPF之間隨時間的體重增加是不同的[F（1,780）= 2.146; P= 0.0008]，但不在NH和MS之間。 MS女性的每日食物攝入量與年齡匹配的NH女性沒有差異（圖 （Figure2B）.2B）。 曲奇的獲取抑制了MS女性的日常食物攝入量，但曲奇的獲取卻增加了每日熱量的攝入，但無統計學意義。 通過重複測量ANOVA分析熱量攝入，未發現孕婦分離和食物狀況的影響。 整個實驗期間（PND 28 – 62）的總熱量攝入在實驗組之間沒有差異（圖 （Figure2C）.2C）。 關於MS + HPF女性消耗的總卡路里的40％來自餅乾（來自食物的3259.921±211.657 kcal，來自餅乾的2184.641±186.077 kcal）。 PND 62上MS女性的腹膜後脂肪墊與年齡匹配的NH女性沒有差異，並且隨著cookie訪問而增加趨於增加而沒有統計學意義（P= 0.0833，MS與MS + HPF）（圖 （Figure22d）。

 

圖2

體重增加（A），每日攝入的食物和卡路里（B），總熱量攝入（C）和腹膜後脂肪墊的重量（D）。 NH; 非處理只餵食，MS; 僅用食物餵養的母體分離，MS + HPF; 用母豬餵養的母系分離 ...

行為評估

在PND 54上的計算機活動室中測量了NH，MS和MS + HPF女性的門診活動。與之相比，在第一時間（0 – 15分鐘）和以後的會話（15 – 30分鐘）內，MS女性的門診計數顯著降低。與NH女性； 但是，P僅在MS + HPF組的後期階段觀察到相對於NH的<0.05）（圖 （Figure3A）.3一個）。 在第一次15 min會話期間行進的總距離在MS中顯著降低（P<0.05），但與NH相比，在MS + HPF中沒有（圖 （Figure3B）.3B）。 在走動活動測試期間對整容行為和排便活動進行評分（圖 （Figure3C3C＆D）。 MS經驗顯著增加了眼部修飾（P<0.05，NH vs. MS），而Cookie訪問降低了它（P<0.05，MS vs.MS + HPF）（圖 （Figure3C）.3C）。 MS女性的排便活動相對於NH而言往往會增加而沒有統計學意義，並且cookie訪問顯著降低了它（P<0.05，MS vs.MS + HPF）（圖 （Figure33d）。

 

圖3

在PND 54上進行的動態活動測試。 在每個5分鐘會話中，動態計數連續得分。 在走動活動測試的30 min期間的梳理行為和排便活動得分。 總動態計數（A）和旅行次數 ...

為了進一步評估焦慮樣行為，在走動活動試驗（PND 2）後，對大鼠進行56升高的加迷宮測試。 MS女性在開放臂中花費的時間顯著減少（P <0.05），但與NH相比，在MS + HPF中沒有（圖 （Figure4A）.4一個）。 開放臂進入百分比在實驗組之間沒有差異（圖 （Figure4B）.4B）。 為了評估抑鬱樣行為，在高架十字迷宮測試（PND 3）後對大鼠進行59天的強迫游泳測試。 強迫游泳測試期間5分鐘期間的不動性持續時間在MS女性中顯著增加（P <0.05）與NH相比，MS + HPF女性的固定性評分與NH無差異（圖 （Figure44C）。

 

圖4

在升高的迷宮測試（A，B）期間在開放臂中進入和進入的時間以及在強迫游泳測試期間的不動（C）。 在PND 56上對大鼠進行高架十字迷宮測試，並在PND 59上進行強迫游泳測試。 NH; 非處理只餵食， ...

血漿皮質酮水平

游泳試驗後一周，大鼠受到束縛應激，在0，30，60和120最小時間點收集尾靜脈，在約束期2小時，並用於血漿皮質酮測定（圖 （Figure5）.5）。 各組間基礎皮質酮水平（0時間點）無差異; 然而，在應激發作後，應激誘導的女性皮質酮水平升高低於30和60最小時間點的NH值（P<0.05，每個時間點的NH vs. MS）。 應激開始後30分鐘，血漿MS + HPF的皮質酮水平與NH並無差異，但在60分鐘時點低於NH（P <0.05； 在NH中為394.29±38.35 ng / ml，而在MS + HPF中為247.48±24.57 ng / ml）。 用2通方差分析分析應激誘導的皮質酮水平，揭示了產婦分離的主要作用[F（1,56）= 8.814， P= 0.0045]和時間[F（3,56）= 9.335， P<0.0001]，並且對食物狀況沒有影響。 未發現產婦分居與時間之間或食物狀況與時間之間存在明顯的相互作用。

 

圖5

在約束期的2期間血漿皮質酮水平。 在強迫游泳試驗恢復一周後，使大鼠受到束縛應激。 在恢復期間繼續餵養。 將大鼠置於約束盒中 ...

ΔFosB和BDNF蛋白質印跡

用Western印跡分析檢查NAc中的ΔFosB和BDNF水平（圖2） （Figure6）.6）。 ΔFosB顯著降低，但MS女性的NAc中BDNF增加（P <0.05）與NH（圖 （Figure6A6A和B）。 MS女性NAc中的ΔFosB水平通過cookie訪問進行了標準化； 即NH和MS + HPF之間沒有差異，並且BDNF水平進一步提高（P <0.05，MS vs. MS + HPF）。 相對於NH，MS女性海馬中的BDNF水平明顯降低（P <0.05），並且無法通過Cookie訪問來恢復（圖 （Figure66C）。

 

圖6

Western印跡分析海馬中NAc（A，B）和BDNF水平的ΔFosB和BDNF水平（C）。 將來自行為測試的天真的大鼠在PND 62上處死以收集組織樣品用於蛋白質印跡分析。 NH; ...

可口的食物獲取改善了MS女性的心理 - 情緒行為

在這項研究中，行為評分代表焦慮和抑鬱，如活動測試期間的走動活動，延髓梳理和排便活動; 高架加迷宮測試期間張開雙臂; 強迫游泳測試期間的不動性在MS女性中得到改善，在青春期和青年期間可以自由獲取Oreo餅乾。 如MS男性所報導，MS女性皮質酮對急性應激的反應減弱 ¹⁴。 鈍化的皮質酮反應似乎是MS經驗的結果; 即經歷重複應激，因為HPA軸對急性應激激發的反應似乎在慢性重複應激經歷後變鈍 ^{40, 41}。 研究表明，高脂肪飲食高度優選的飲食可以改變基礎HPA軸活動和內分泌對急性應激的反應 ⁹，改善壓力反應 ^{17, 19} 並減少焦慮樣行為 ^{18, 20}。 此外，在青春期和青少年期間免費獲取奧利奧餅乾（~21％脂肪含量;中度脂肪飲食），使HPA軸功能減弱，並改善男性MS大鼠的焦慮樣行為 ¹⁴。 也就是說，青少年cookie訪問可能會通過MS經驗，早期生活中的反复壓力以及改善行為逆境來改善平滑的HPA軸功能。 然而，在這項研究中，青春期和青年期間的cookie進入並沒有改善HPA軸活性，這反應了雌性MS大鼠的急性應激。 有人提出雌性MS大鼠青春期曲奇通路的抗焦慮和/或抗抑鬱作用可能與HPA軸功能無關，儘管它在雄性MS大鼠中。 雄性和雌性大鼠在許多神經內分泌和行為參數方面存在差異，並且對壓力的易感性取決於性別 ^{42, 43}。 先前的研究報導，7天中度脂肪飲食方案導致急性應激後男性選擇性誇大的皮質酮釋放 ⁶.

可食性的食物進入和雌性大鼠NAc的神經功能

本研究通過MS經驗證明雌性大鼠的NAc中ΔFosB表達降低，BDNF升高。 據報導，心理或代謝應激增加了NAc中的ΔFosB表達 ^{44 - 46}。 研究表明，轉錄因子ΔFosB與NAc神經元中的BDNF表達有關 ^{32, 47 - 49}。 總之，提示NAc中ΔFosB降低和BDNF表達增加可能是早期MS應激的長期後果，可能調節NAc神經元功能。 NAc神經元功能被建議通過行為壓力範例進行調節 ^{24, 25} 其功能障礙與抑鬱症和焦慮症有關 ^{22, 23, 26, 27}。 實際上，已經在壓力誘導的抑鬱症模型中報導了NAc中增加的BDNF信號傳導 ^{50 - 52}在紋狀體中過度表達ΔFosB的小鼠中，應激誘導的抑鬱作用被削弱 ⁵³。 因此，雌性MS大鼠的抑鬱和/或焦慮樣行為可能與NAc中ΔFosB降低和BDNF表達增加有關。

在這項研究中，青春期的cookie訪問增加了雌性MS大鼠的ΔFosB和BDNF表達。 該結果與之前的報告一致，表明暴露於可口的飲食導致NAc中ΔFosB水平增加 ³¹並且高脂肪飲食增加ΔFosB過表達小鼠的NAc中的BDNF水平 ³²。 考慮到先前的報導揭示紋狀體中ΔFosB表達增加對應激誘導的抑鬱作用具有彈性 ⁵³，結論是我們的MS女性的NAc中ΔFosB增加，具有cookie訪問; 即歸一化到其基礎水平，可能有助於青春期cookie訪問的抗抑鬱和/或抗焦慮功效。 然而，尚不清楚具有cookie訪問的MS女性NAc中BDNF水平的增加是否與其抗抑鬱和抗焦慮作用有關，因為NAc中BDNF信號的增加主要在抑鬱模型中報導。 ^{50 - 52}，但很少在抗抑鬱模型中。 有必要進一步研究。

MS和HPF對海馬BDNF水平的影響

已報導在本研究中使用類似MS方案的雄性和雌性大鼠中海馬中BDNF水平降低 ^{54, 55}。 同時，在該研究中，相對於NH對照，在我們的雌性MS大鼠的海馬中BDNF水平降低。 海馬神經發生與焦慮和抑鬱的症狀有關 ^{56, 57}Africa，海voltage體Directors參與HP Mt軸活cozy的反饋調節。 回顧在我們的MS女性中HPA活性減弱，海馬中BDNF水平的降低可能與MS經驗中的焦慮和/或抑鬱症有關，可能與平滑的HPA軸活性有關。 我們的MS女性中海馬BDNF水平與HPA軸活性之間的關係進一步得到以下事實的支持：在該研究中，cookie訪問並未改善它們兩者。 先前的研究表明，長時間攝入高脂肪飲食（32％脂肪）可增加雄性MS大鼠海馬中BDNF的表達，該MS大鼠受到本研究中使用的類似MS方案的影響。 ⁵⁸。 目前正在研究在青春期（~21％脂肪）中的cookie進入對雄性MS大鼠的海馬BDNF水平的影響。

奧利奧餅乾中脂肪/糖含量的行為影響

在這項研究中，免費獲取奧利奧餅乾改善了具有早期生活壓力體驗的雌性大鼠的心理 - 情緒逆境。 奧利奧餅乾是一種巧克力餅乾，不僅脂肪含量高，而且含糖量高，如表所示 Table1.1。 在人類研究中，與飲用水相比，吃巧克力減少了消極情緒，而對中性和積極情緒沒有影響 ⁵⁹。 巧克力的情緒改善效果取決於巧克力（牛奶巧克力與純巧克力）的適口性，這表明吃甜美可口的食物改善了實驗誘導的負面情緒狀態。 據報導，患有慢性輕度壓力的抑鬱動物的蔗糖渴望增加，並且在情緒低落的受試者中特別增加了對牛奶巧克力的渴望 ⁶⁰。 除了食物之外，自由選擇蔗糖和/或豬油均調節應激軸對急性應激的反應 ⁶¹。 此外，短期接觸中等脂肪飲食（20％玉米油;與奧利奧餅乾類似的脂肪含量）以性二態方式誘導神經內分泌和行為改變 ^{4 - 6}。 總之，可以得出結論，奧利奧餅乾的糖和脂肪含量可能有助於改善MS女性的神經和行為逆境。 有必要進一步研究，以檢查與奧利奧餅乾獲取相同量的脂肪或糖供應是否會對本研究中觀察到的MS女性產生類似的改善。

最後，在本研究中，通過cookie訪問，腹膜後脂肪庫在MS女性中趨於增加。 除了對應激軸功能的調節作用外，可口的食物通路顯著增加循環瘦素和胰島素水平隨著脂肪庫增加 ^{15, 61}。 瘦素和胰島素都被認為在中 - 邊緣獎勵系統中發揮調節作用，尤其是胰島素增加腹側被蓋區多巴胺轉運蛋白的表達 ^{62, 63}。 如上所述，中度邊緣獎勵系統與壓力軸功能相關的心理 - 情緒障礙高度牽連 ^{22 - 27}。 因此，建議通過增加瘦素和/或增加脂肪庫的胰島素在中 - 邊緣獎勵系統中進行試驗性調節（如果有的話），通過可口的食物進入在情緒升高中發揮作用。 事實上，長期食用高脂肪飲食（32％脂肪含量）可減少焦慮樣行為，增加血漿瘦素和胰島素水平，同時在本研究中使用類似MS方案的雌性大鼠顯著增加脂肪庫。 ¹¹。 然而，目前尚不清楚在我們的MS女性中觀察到的行為改善（具有~21％脂肪含量的中度脂肪飲食）是否與增加的脂肪庫有關，因為通過cookie訪問增加了腹膜後脂肪庫沒有達到統計學意義，並且在當前的研究中沒有測量循環瘦素和胰島素。

總之HPA軸，NAc神經元和海馬的功能障礙似乎與年輕雌性MS大鼠的精神 - 情緒逆境有關，這是通過出生後頭兩週的母體分離經驗得出的。 在青春期和青年期間免費獲得高度可口的食物，適度的脂肪飲食，改善MS女性的焦慮和抑鬱樣行為，而不影響體重增加，NAc神經元的功能調節可能在其潛在的神經機制中發揮作用。

作者感謝SB Yoo博士對統計分析的幫助以及JY Lee博士的實驗技術。 這項研究得到了國家研究基金會（2013R1A1A3A04-006580）和韓國政府（科學，信息通信技術和未來規劃部）資助的首爾國立大學老年人口蹄面功能障礙研究中心（2014050477）的資助。