神經科學雜誌，6九月2006，26（36）：9196-9204; doi：10.1523 / JNEUROSCI.1124-06.2006
彼得奧勞森1, J. David Jentsch2, Natalie Tronson1, Rachel L. Neve3, Eric J. Nestler4和 簡·泰勒1
1.通訊應發送給耶魯大學醫學院精神病學系精神病學系Jane R. Taylor，康涅狄格州心臟健康中心，康涅狄格州34公園街，康涅狄格州06508。[電子郵件保護]
抽象
動機的改變與幾種精神疾病的病理生理學有關，包括藥物濫用和抑鬱症。 已知反复暴露於濫用或應激的藥物會持續誘導伏隔核（NAc）和背側紋狀體中的轉錄因子ΔFosB，假設其有助於多巴胺調節的信號傳導中的神經適應。. 然而，鮮為人知的是，ΔFosB特異性地參與了對出乎動機的動機行為的調節。 我們在這裡顯示ΔFosB在轉基因小鼠的NAc和背側紋狀體中的誘導性過表達，或者特別是通過使用病毒介導的基因轉移在大鼠的NAc核心中，增強了食物增強的器械性能和漸進比率響應。 在先前反复暴露於大鼠中的可卡因，苯丙胺，MDMA [（+） - 3,4-亞甲二氧基甲基苯丙胺]或尼古丁之後發現了非常相似的行為效應。 這些結果揭示了ΔFosB對動力過程的強大調節，並提供證據表明藥物誘導的基因表達改變通過誘導NAc核心內的ΔFosB可能在激勵影響對器樂行為的影響中起關鍵作用。
簡介
反复的藥物暴露導致基因轉錄的暫時動態改變，在伏核（NAc）內產生持久的神經適應（Nestler，2004）。 這個大腦區域在藥物和天然強化過程中起著關鍵作用（Kelley和Berridge，2002雖然很少有人知道影響由非藥物，食物等食慾增強劑所驅動的行為的轉錄因子。 ΔFosB是通過慢性藥物暴露在NAc和背側紋狀體內激活的轉錄因子（Konradi等人，1994; Nye等，1995; 陳等人，1997; Pich等，1997; Shaw-Lutchman等人，2003）和強迫性車輪行駛（Werme等人，2002）。 它也在這些地區被幾種形式的慢性壓力誘導（Perrotti等，2004）。 與誘導紋狀體ΔFosB相關的藥物強化過程的增強已得到很好的證實（Kelz等，1999; Colby等人，2003; Zachariou等人，2006）。 然而，這些區域中ΔFosB水平升高對由天然增強物驅動的器械行為的影響尚不清楚。
工具性反應的表現是吸毒行為的必要組成部分，隨著向成癮的過渡進展，這些行為可能會失調或不靈活（Jentsch和Taylor，1999; 伯克和海曼，2000; Berridge和Robinson，2003; Everitt和Robbins，2005）。 NAc涉及與成癮相關的工具行為的多個方面 (Balleine和Killcross，1994; Corbit等，2001; de Borchgrave等，2002; Di Ciano和Everitt，2004b; Everitt和Robbins，2005）。 因此，NAc內藥物誘導的神經適應可能會影響器樂行為的表現。 事實上，慢性可卡因暴露增強了蔗糖增強的器樂表現（Miles等，2004和操作被認為阻止NAc核心內的神經可塑性，包括抑制PKA（蛋白激酶A）或蛋白質合成，干擾食物獎勵的器樂反應（Baldwin等，2002a; Hernandez等，2002）。 NAc核心還調節條件影響對工具行為的動機影響（Parkinson等，1999; Corbit等，2001; Hall等人，2001; Di Ciano和Everitt，2004a; Ito等，2004），提供神經生物學基質，其中ΔFosB誘導可能有力地影響器官性能和食物，水或濫用藥物等食慾增強劑的動機。
在這裡，我們使用兩種互補的遺傳方法研究了ΔFosB對食物驅動的器官行為的影響：（1）NAc內的ΔFosB和轉基因小鼠的背側紋狀體（NSE-tTA×TetOp-ΔFosB）和（2）過表達的誘導性過表達。特異性地通過在大鼠中使用病毒介導的基因轉移，在NAc核心中的ΔFosB. 我們還評估了在報告增加ΔFosB的條件下，先前反復接觸可卡因，苯丙胺，（+） - 3,4-亞甲二氧基甲基苯丙胺（MDMA）或尼古丁是否會增加食物增強的器械響應和/或使用漸進比例計劃的動機，正如已經證明的藥物強化自我管理（Horger等，1990, 1992; Piazza等人，1990; Vezina等，2002; Miles等，2004）。 我們的結果證明了ΔFosB對儀器行為的持續影響，並表明該轉錄因子可能在NAc核心中作為激勵功能的調節劑起作用。
材料和方法
動物和動物護理
從Charles River Laboratories（Wilmington，MA）獲得實驗天真的Sprague Dawley大鼠。 雄性轉基因11A小鼠來自表達神經元特異性烯醇化酶（NSE）-tTA四環素反式激活蛋白（A系）的純合轉基因小鼠和表達TetOp（四環素響應啟動子）-ΔFosB（11系）的小鼠之間的雜交; 親本系保持在遠交混合背景（50％ICR和50％C57BL6×SJL）（陳等人，1998; Kelz等，1999）。 這些雙轉基因11A小鼠僅在以下情況下表達ΔFosB:( 1）兩種轉基因存在於同一細胞中，並且（2）tTA的轉錄激活不受四環素抗生素如強力黴素的存在的抑制。 因此，對這些小鼠施用多西環素可以對ΔFosB的表達進行時間控制，並用於預防發育過程中的表達; 事實上，強力黴素給藥與ΔFosB的可檢測的洩漏表達無關（陳等人，1998; Kelz等，1999）。 此外，選擇11A系列轉基因小鼠用於本實驗，因為它們顯示出主要限於含有強啡肽的紋狀體神經元（NAc和背側紋狀體）的表達模式，非常類似於慢性藥物誘導ΔFosB的模式。暴露（Kelz等，1999）。 此外，ΔFosB的這種紋狀體表達的量化已經量化（陳等人，1998; Kelz等，1999）。 這些小鼠在德克薩斯大學西南大學生成，並在耶魯大學的設施中進行維護和測試。 在整個妊娠和發育過程中，將所有小鼠維持在多西環素上直至飲用水中8-9週齡濃度為100μg/ ml，已知TetOp驅動的轉基因處於“關閉”狀態，並使用起始6當ΔFosB表達變得最大時，多周可以使用多西環素Kelz等，1999）。 所有實驗都涉及對同窩異基因轉基因小鼠與對多西環素的比較，這本身對動機行為沒有影響（Kelz等，1999; McClung和Nestler，2003; Zachariou等人，2006).
所有實驗受試者在受控溫度和濕度條件下在12 h光/暗循環下成對（大鼠）或成組（小鼠;每籠4至5只）飼養（在7上點亮：00 AM並在7處關閉：00下午）。 在任何研究之前，他們被允許至少7 d適應住房設施。 動物隨時可隨意獲取水，並且如下所述，獲取食物的機會有限。 所有動物使用均按照美國國立衛生研究院實驗動物護理和使用指南進行，並得到德克薩斯大學西南分校和耶魯大學動物護理和使用委員會的批准。
毒品
可卡因鹽酸鹽[由國家藥物濫用研究所（NIDA）友情提供]，d-苯丙胺硫酸鹽（Sigma，St.Louis，MO），MDMA鹽酸鹽（由NIDA友情提供）和（ - ） - 尼古丁酒石酸氫鹽（Sigma）將其溶於無菌生理鹽水（0.9％）中，並以5 ml / kg（小鼠）或2 ml / kg（大鼠）的體積腹膜內註射。 在註射前用碳酸氫鈉調節尼古丁溶液的pH。
病毒載體
如前所述進行病毒介導的基因轉移（Carlezon等，1998; Perrotti等，2004）。 簡而言之，將編碼特定蛋白質的cDNA插入單純皰疹病毒（HSV）擴增子HSV-PrPUC中，並使用輔助5d11.2將其包裝到病毒中。 隨後根據實驗方案將驅動編碼對照蛋白β-半乳糖苷酶的HSV-LacZ或編碼ΔFosB的HSV-ΔFosB表達的載體注入NAc核心。
實驗程序
大綱。
實驗1檢查了先前重複藥物暴露對食物增強器械性能和進行比率響應的影響。 將大鼠隨機分成5個實驗組（n = 9-10 /組）。 這些組每天兩次注射（腹膜內; 9：00 AM和5：00 PM）用生理鹽水或下列藥物之一：尼古丁，0.35 mg / kg; MDMA，2.5 mg / kg; 可卡因，15 mg / kg; 或連續苯胺，2.5 mg / kg連續15天。 根據我們之前公佈的數據選擇劑量（泰勒和Jentsch，2001; Olausson等人，2003在治療日1和15監測藥物誘導的運動刺激。 在停藥5後，對動物進行連續10的儀器響應訓練，隨後在第二天進行累進比率測試。 兩隻動物被排除在統計分析之外，因為它們沒有獲得儀器響應，在三個最終訓練課程中的每一個訓練課程中只有一個活躍的槓桿響應。
實驗2和3檢測了轉基因小鼠中ΔFosB的誘導性紋狀體過表達對器械性能的影響以及對增強的漸進比率的響應。 先前已經證明ΔFosB在這些小鼠中的可誘導的過表達模擬了在運動活動和條件性位置偏好範例中重複藥物暴露的影響（Kelz等，1999; Zachariou等人，2006）。 這些小鼠可以提供關於紋狀體ΔFosB對特定行為過程的貢獻的關鍵信息。 將基因型雄性小鼠維持在多西環素上或在8週齡時轉換為自來水。 在6週停用多西環素後開始實驗，此時轉基因表達最大（Kelz等，1999）。 在實驗2中，對於16連續天，動物（n = 10）受食物限制並且在下述儀器程序（見下文，儀器響應和漸進比測試）下訓練。 在儀器測試完成後，在這些小鼠中評估可卡因誘導的運動刺激。 在實驗3中，在18連續天數的儀器響應下訓練一組獨立的小鼠（n = 10），在此期間遞送最多的50增強物。 在第11天，對所有小鼠進行累積比率測試。 在12當天，我們通過預先進行比例反應來確定強化物貶值的影響。
實驗4和5檢測了病毒介導的ΔFosB特異性在NAc內的過表達的影響。 實驗4測試了ΔFosB過表達對儀器性能的影響。 在這裡，大鼠在NAc核心中輸注HSV-ΔFosB（n = 8）或HSV-LacZ（n = 8），並且在稍後開始40 h時進行儀器操作的訓練。 在10每日訓練課程之後，如下所述評估運動活動監測設備中所有動物的基線活動水平（參見下文，運動活動）。 實驗5特別評估了NAcΔFosB過表達對進行性比率響應的影響。 這裡，最初訓練大鼠連續15天，分配到實驗組，隨後在NAc核心中輸注HSV-ΔFosB（n = 8）或HSV-LacZ（n = 7）。 對於4 d，動物未經測試且未經處理以允許ΔFosB表達達到峰值。 在輸注後的第5天，對所有動物按漸進比例計劃進行槓桿按壓測試。 在測試的最後一天之後，殺死所有大鼠並且在組織化學上驗證輸注套管在NAc核心中的放置。 基於輸注套管的放置，將兩隻大鼠從實驗4和一隻來自實驗5的大鼠中排除。
基因表達的表徵在另一組動物中進行。 在此，將HSV-LacZ注入NAc核心，並且稍後將動物殺死3。 隨後用免疫組織化學方法評估β-半乳糖苷酶的表達。
運動活動.
使用活動計（Digiscan動物活動監測器; Omnitech Electronics，Columbus，OH）測量運動活動。 活動計配有兩排紅外光電傳感器，每排由16傳感器組成，2.5傳感器相距XNUMX厘米。 活動計量表由PC計算機使用Micropro軟件（Omnitech Electronics）收集的活動計量表控制和數據。
將實驗動物置於透明塑料盒（25×45×20 cm）中，將其放入活動計量器中。 最初使動物適應於運動活動記錄設備的30 min。 在一些實驗中，隨後取出動物，根據實驗設計注射可卡因，苯丙胺，尼古丁或媒介物，並放回盒子中。 然後記錄60 min的運動活性，在藥物注射後開始5 min以避免非特異性注射誘導的運動過度。 所有實驗均在動物的輕相期間（9：00 AM和6：00 PM之間）進行。
樂器響應和漸進比率測試。
使用由MedPC軟件（Med Associates，St.Albans，VT）控制的大鼠標準操作室（30×20×25 cm）或小鼠（16×14×13 cm）評估儀器響應。 每個腔室都安裝在一個聲音衰減的外室中，配有白噪聲發生器和風扇，以減少外部噪音的影響。 安裝在後牆上的房屋燈照亮了房間。 顆粒分配器將食品顆粒（20或45 mg; Bio-Serv，Frenchtown，NJ）作為增強劑送入雜誌。 通過安裝在加強件容器上方的光電池檢測頭部入口。 在這本雜誌中是一個刺激的光。 對於老鼠，在彈匣的每一側放置一個槓桿。 對於小鼠，將兩個鼻子孔放置在腔室的後壁上（即，與加強器盒相對）。
在訓練開始前的5期間，動物被限制在每天90 min食物中並且在其家籠中暴露於基於穀物的食物顆粒（小鼠，20 mg;大鼠，45 mg）。 在測試期間，根據行為方案（見下文）在操作室中間歇地獲得食物顆粒以及在90 min的家籠中無限量地食用顆粒，在每日測試期後開始30分鐘。 該食物進入時間表允許每隻個體動物達到其個體飽腹點並減少由優勢動物和下屬動物之間的競爭引起的變化。 在我們的手中，這個時間表允許在初始體重減輕後體重增加緩慢 〜85-90％的自由進食重量。 在整個實驗中監測動物重量。
所有受試者最初習慣於2 d的測試裝置; 在這些會議期間，食品顆粒以固定時間15（FT-15）時間表送到增強劑盒中。 從第二天開始，受試者每天接受10的每日訓練。 根據先前發表的儀器調節程序測試食物的響應（Baldwin等，2002b）。 對正確（即，主動）槓桿/鼻託的響應得到了加強，而對另一個（無效）槓桿/鼻託的響應則沒有編程後果。 對於所有實驗組，活動鼻託或槓桿（左/右）的位置是平衡的。 完成響應要求（見下文）導致雜誌刺激光的開始，隨後1隨後通過遞送單個食物顆粒。 兩秒鐘後，刺激燈關閉。 根據固定比率（FR10）計劃成功完成響應後獲得第一批1增強劑，之後在可變比率（VR2）時間表響應後可獲得顆粒。 會議持續了15分鐘。
實驗3（小鼠）和5（大鼠）使用替代訓練計劃以避免訓練期間器械性能差異對隨後的進行性比率響應的潛在影響（詳述如下）。 在實驗3中，小鼠在針對1 d的FR2方案上訓練，然後在針對2的FR8方案上訓練d。 第一次測試的3使用了60 min會話。 在最近的7訓練日，當50強化劑被收購時，會議終止。 在實驗5中，如上所述，對於所有其他實驗，在1 min會話中對大鼠進行FR2 / VR15時間表訓練，但有兩個例外。 首先，提供了最大數量的150顆粒/會話。 其次，這些動物接受5額外的訓練天數（即，總共15 d），以允許在任何實驗操作之前建立穩定的表現。
還以漸進比例的增強方案測試動物對食物的響應。 在該測試中，獲得食物的響應要求以FR1計劃開始，但是逐漸增加2以獲得隨後的增強劑（即，1，3，5，7 ......，X + 2響應）。 在使用大鼠的藥物治療實驗中，通過5逐步增加時間表，產生1，6，11，16 ......，X + 5的最終時間表。 所有其他參數保持與上面詳述的訓練程序相同。 當沒有對5 min作出積極響應時終止測試。
增強劑貶值。
使用強化劑特定的餵食來檢查強化物貶值的影響。 在此之前，允許小鼠在3 h期間在其家籠中食用無限的基於穀物的食物顆粒，然後如上所述在增強的漸進比例計劃上進行測試。
手術技巧.
使用Equithesin [含有戊巴比妥（35 mg / kg）和水合氯醛（183.6 mg / kg）在乙醇（10％v / v）和丙二醇（39％v / v）中的混合物麻醉動物; 以4.32 ml / kg，ip]給藥。 使用Kopf立體定向設備，將套管（Plastics One，Roanoke，VA）手術植入NAc核心上方。 相對於前囟使用的立體定位坐標如下：前/後，+ 1.5 mm; 側面/內側，±1.5 mm; 腹側/背側，-6.0 mm（Paxinos和Watson，1986）。 使用螺釘和牙科粘固劑將套管固定到顱骨上。 將閉孔器放入導管中以防止阻塞。 手術後，對動物進行標準的術後護理，並在任何實驗開始前讓其恢復5 d。
輸液。
在訓練開始前雙側40 h進行病毒載體的腦內輸注（見下文）。 注射注射器（31測量儀），在引導插管尖端下方延伸1 mm，同時緩慢降低到左側和右側NAc，並且1.0μl/側在4微秒期間以0.25μl/輸注速率輸注min使用微量輸注泵（PHD-5000; Harvard Apparatus，Holliston，MA）。 在輸注完成後將輸注針留在適當位置1 min，並更換假插管。 在行為實驗完成後對插管放置進行組織學驗證（參見圖6B），並且在實驗數據的統計分析中僅包括具有正確放置的插管的動物。
組織學分析和免疫染色。
在實驗完成後，將作為實驗一部分接受外科手術的動物用Equithesin麻醉，並根據標準程序用0.1 m PBS（5 min）和10％福爾馬林（10 min）經心臟灌注。 將腦在福爾馬林中後固定，隨後置於磷酸鹽緩衝的蔗糖溶液（30％）中。 然後在切片機上以40μm切片切割所有腦，並用於套管放置和蛋白質表達的組織學分析。
套管放置在用中性紅複染的切片中，並在乙醇脫水後安裝在二苯乙烯增塑劑和二甲苯（DPX）的顯微鏡載玻片上。 如前所述進行免疫組織化學（Hommel等，2003）。 簡而言之，HSV-LacZ輸注後β-半乳糖苷酶的表達通過使用山羊抗β-半乳糖苷酶一抗（1：5000; Biogenesis，Kingston，NH）的免疫熒光染色來確定。 孵育過夜後，沖洗切片，隨後與綴合Cy2的熒光驢抗山羊二抗（1：200; Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）一起溫育。 再次洗滌切片，然後用乙醇脫水並在DPX中固定。 相鄰處理相鄰的對照切片而不包含一抗。 使用a在520 nm評估免疫熒光 蔡司 （德國Oberkochen）帶有FITC濾光片的顯微鏡和在相同曝光時間下拍攝的圖像 蔡司 Axiovision數字成像系統。
統計
使用單向，雙向或三向方差分析，然後進行舍弗或鄧內特的事後檢驗，對所有實驗的數據進行評估，並在適當的情況下使用霍爾姆的順序剔除檢驗對多個比較進行校正。 p≤0.05的值被認為具有統計學意義。
成績
實驗1：重複藥物暴露對器械性能和漸進比率響應的影響
為了證實我們的重複藥物暴露範例產生功能上顯著的神經適應，我們首先評估運動致敏作為慢性藥物作用的原型行為測量。 每天兩次給大鼠注射尼古丁（0.35 mg / kg），MDMA（5 mg / kg），可卡因（15 mg / kg）或安非他明（2.5 mg / kg），並在第一次注射後測試運動活性。治療日1和15（補充圖片1A-E，可在 www.jneurosci.org 作為補充材料）。 統計分析揭示了通過日間相互作用的顯著治療（F.(4,42) = 9.335; p≤0.0001）。 除MDMA（p = 0.62）外，與15天（尼古丁，p≤1;可卡因，p≤0.001;苯丙胺，p≤0.001）相比，所有藥物在0.01日誘導顯著更高的運動活性（即致敏）。 重複鹽水注射沒有效果。 沒有一種藥物治療改變了15日適應期間測量的基線運動活動（補充圖2A，可在 www.jneurosci.org 作為補充材料）。
在最後一次注射藥物後五天，我們檢查了先前重複尼古丁，搖頭丸，可卡因或安非他明暴露對食物增強器械行為的影響。 每種藥物的數據分別列出 圖1A-H使用相同的鹽水對照組進行比較。 我們發現，之前暴露於這些藥物中的每一種都顯著且有選擇性地增加了食物增強的器械響應（訓練日通過槓桿治療，F(36,378) = 1.683; p≤0.01; 事後分析：尼古丁，p≤0.01; MDMA，p≤0.05; 可卡因，p≤0.01; 苯丙胺，p≤0.001）。 在漸近表現中觀察到的儀器響應的持續升高表明動機可能增強，與之前報告的反复精神興奮劑暴露後的增加一致（見討論）。 因此，我們測試了先前的重複藥物暴露是否使用累進比率計劃增強了動機 先前的藥物暴露對主動槓桿的響應有統計學影響（通過槓桿相互作用治療，F(4,42) = 3.340; p≤0.05）（圖。 2A）以及最終斷點（F.(4,42) = 5.560; p≤0.001）（圖。 2B）。 另外的分析表明，所有處理都增加了活性反應的數量（尼古丁，p≤0.001; MDMA，p≤0.05;可卡因，p≤0.001;苯丙胺，p≤0.001）和斷裂點（尼古丁，p≤0.001; MDMA） ，p≤0.01;可卡因，p≤0.0001;苯丙胺，p≤0.0001）與這些治療對動機的影響一致。 鑑於藥物對基線運動活動缺乏影響，並且對無效槓桿按壓沒有影響，在這些條件下對食物的響應增加不太可能反映運動活動的非特異性增加。
圖1。
先前對0.35 d每日兩次重複注射尼古丁（2.5 mg / kg），MDMA（15 mg / kg），可卡因（2.5 mg / kg）或安非他明（15 mg / kg）對隨後的器械行為的影響。 一起測試動物，但為了清楚起見，使用相同的鹽水處理對照組分別呈現每種藥物的作用。 A（主動反應）和B（無效反應）顯示先前尼古丁暴露的影響; C，D，MDMA; E，F，可卡因; G，H，苯丙胺。 數據表示為平均值±SEM。
圖2。
先前用鹽水，尼古丁（15 mg / kg），搖頭丸（0.35 mg / kg），可卡因（2.5 mg / kg）或苯丙胺（15 mg / kg）重複治療（每天兩次，每天2.5天）對儀器反應的影響逐步增加配比。 數據表示為平均值±SEM。 *** p <0.001； ** p <0.01； * p ＜0.05。 Sal，鹽水； 尼古丁；尼古丁； 可可，可卡因; 安非他命，安非他明； 公關，進步比率。
以前的藥物暴露對食物限制前，器械訓練的第一天或最後一天或者在進行性比率測試之前記錄的體重也沒有影響（補充圖2B，可在 www.jneurosci.org 作為補充材料）。 3 d限制食物進入確實最初將體重減少到平均91-92％的自由進食重量。 在行為測試結束時，體重已經恢復到預先限制體重的97-99％，並且在藥物暴露的和鹽水處理的動物之間沒有觀察到差異。 因此，體重的改變以及飢餓或食慾的差異不應對觀察到的器械表現或動機的增強作出顯著貢獻。
實驗2：轉基因小鼠中ΔFosB的誘導性過表達; 工具性能
我們接下來檢查了在轉基因小鼠中器官性能是否也增加，其在NAc和背側紋狀體中具有顯著的選擇性誘導性過表達ΔFosB（Kelz等，1999）。 在該實驗中，將ΔFosB過表達小鼠與不過度表達ΔFosB的同窩對照進行比較，因為它們維持在多西環素上（參見材料和方法）。 我們發現ΔFosB的過表達顯著增加了食物強化的反應（通過訓練日的槓桿基因表達，F(9,126) = 3.156; p≤0.01）（圖。 3一個）。 非活動孔徑中的鼻子反應數量在兩組之間沒有差異（圖。 3B）。 總之，這些數據表明NAc和背側紋狀體中的ΔFosB過表達選擇性地增加了器械性能
圖3
轉基因小鼠誘導紋狀體過度表達ΔFosB對器械性能的影響。 A，主動回應。 B，不活躍的回應。 數據表示為平均值±SEM。
為了排除ΔFosB過表達動物的器官表現的增強可以通過食慾或飢餓的改變來解釋，在食物限制之前以及訓練的第一天和最後一天記錄體重。 ΔFosB在食物限制前對體重沒有影響，在行為測試期間也沒有對體重的影響。 在這裡，限制食物進入3 d將體重減少到平均87-89％的自由進食重量。 在行為測試結束時，動物體重為預先限制體重的97-99％，在ΔFosB和對照小鼠中觀察到相同的變化（補充圖片3A，可在 www.jneurosci.org 作為補充材料）。 因此，ΔFosB過表達對飢餓或食慾的潛在影響不太可能導致觀察到的儀器響應增強。
當儀器性能測試完成後，ΔFosB過表達不會改變30最小時期內測量的基線運動活性（補充圖3B，可在 www.jneurosci.org 作為補充材料）。 該觀察結果支持這樣的觀點，即活性的非特異性改變不會有助於在這些動物中觀察到的增強的器械性能。 然而，據報導，ΔFosB過表達的轉基因小鼠對急性和重複的可卡因表現出增強的運動反應（Kelz等，1999）。 因為我們使用稍微不同的從多西環素中撤出以誘導基因表達的方案（6週與食物限制），我們開始確認這種表型。 事實上，ΔFosB過表達的小鼠在註射可卡因時表現出明顯更大的運動活性增加，與在多西環素上維持的同窩對照相比（通過基因表達進行治療，F）(1,44) = 4.241; p≤0.05）（補充圖3C，可在 www.jneurosci.org 作為補充材料）。
實驗3：轉基因小鼠中ΔFosB的誘導性過表達; 進步比率
鑑於先前的藥物暴露誘導紋狀體ΔFosB（Nestler等，2001並且在這裡發現增加進行性比率響應，我們接下來測試ΔFosB的轉基因紋狀體過表達是否也增加了漸進比例增強的表現。 一組新的小鼠在條件下（參見材料和方法）接受了儀器響應訓練，這些小鼠在測試漸進比率響應之前沒有產生儀器性能的顯著差異（F(1,16) <1）。 但是，在漸進比率測試中，我們觀察到通過槓桿相互作用引起的顯著基因表達（F(1,16) = 5.30; p≤0.05）（圖。 4A）並且發現ΔFosB過表達小鼠與在多西環素上維持的同窩對照小鼠相比，產生更多數量的活性反應（p≤0.05），而無活性槓桿反應的數量沒有差異。 ΔFosB過表達的小鼠也達到了更高的斷裂點（F(1,16) = 5.73; p≤0.05）（圖。 4B）。 這些數據表明，與先前的精神興奮劑暴露一樣，ΔFosB的紋狀體過度表達增加了動力。 因為在ΔFosB過表達小鼠中無活性反應的數量沒有改變，所以活性的非特異性增加不可能促成這些效應。 基線運動活動的評估進一步支持了這一觀點，其中在過量表達ΔFosB的小鼠和在多西環素上維持的同窩對照小鼠之間沒有差異。 在測試當天測量，ΔFosB過表達和對照動物之間的體重沒有顯著差異。 因此，雖然ΔFosB過表達的動物會發出更多以食物為動機的器樂反應，但它們在免費提供時似乎不會消耗更多的食物。 對這一觀察結果最可能的解釋是，儘管動機決定了動物獲得強化物的力度，但許多其他因素（食慾，飽腹感，代謝狀態等）會影響攝食行為和食物的實際消耗。
圖4。
在飽腹感引起的增強子貶值之前和之後，雙轉基因小鼠中FosB的誘導型過表達對增強器進行反應的儀器響應的影響。 A，B，基線：槓桿響應（A），斷點（B）。 C，D，在增強材料貶值之後：槓桿響應（C），斷裂點（D）。 數據表示為平均值±SEM。 * p ＜0.05。
這裡使用的ΔFosB轉基因小鼠在整個紋狀體中表達ΔFosB。 雖然腹側紋狀體（包括NAc）與動機過程有牽連，但背側紋狀體被認為參與了器樂習慣的獲得（Yin等人，2004; Faure等人，2005）。 雖然我們沒有觀察到在訓練階段使用低比率時間表和最大加固限制的儀器性能差異，但條件相對抵抗了器樂習慣的發展（Dickinson，1985），習慣的建立可能會影響累進比率計劃下的響應。 通過預測進步比率響應來評估強化物貶值的影響，直接測試了這種可能性。 這種餵食消除了ΔFosB對進行性比率反應的影響，在ΔFosB過表達和對照小鼠之間觀察到的反應或斷裂點沒有差異（F(1,16) <1）（圖。 4光盤）。 總之，這些數據表明，ΔFosB的紋狀體過度表達並未改變使用該測試計劃對獎勵結果值變化的敏感性。 相反，在漸進比率測試中觀察到的儀器響應似乎是目標導向的，並且在ΔFosB過表達小鼠中觀察到的增加的斷裂點可能歸因於增強的動機而不是升高的習慣樣響應。
實驗4：病毒介導的NAc核心中ΔFosB的過度表達：儀器性能
為了評估NAc中ΔFosB過表達是否能夠解釋在轉基因小鼠中觀察到的行為，我們將HSV-ΔFosB或HSV-LacZ作為對照選擇性地註入大鼠的NAc核心並研究該操作對食物的影響。 - 增強樂器演奏（圖。 5A，B）。 在雜誌訓練之後，在行為測試開始之前將HSV-ΔFosB或HSV-LacZ注入NAc核心40 h。 輸注的位置和病毒介導的基因表達的程度顯示在 圖6，A和B.對HSV-ΔFosB的NAc輸注產生了活性反應數量的持續增加（基因表達由槓桿，F(1,12) = 8.534; p≤0.05）（圖。 5A），在整個實驗過程中持續存在。 這些影響具有選擇性，因為NAc核心內ΔFosB過表達對無活性反應數量沒有顯著影響（圖。 5B）或基線運動活動在實驗完成後的第二天記錄（數據未顯示）。 因此，NAc中ΔFosB的過表達模擬了先前藥物暴露或紋狀體過度表達ΔFosB的行為效應。
圖5。
在儀器響應訓練前輸注HSV-ΔFosB對NAc核心的影響。 A，主動回應。 B，不活躍的回應。 數據表示為平均值±SEM。
圖6。
A，用於病毒載體實驗的輸注位點的放置。 頂部，填充的黑色圓圈對應於預期的輸注部位。 只有在〜內進行輸液如圓圈所示，該區域的0.5 mm（即，在NAc核心內）被認為是可接受的。 在該區域之外進行輸注的動物被排除在統計分析之外。 底部，NAc內的代表性動物的輸液部位。 B，輸注HSV-LacZ後蛋白質表達的免疫組織化學驗證。 上圖顯示NAc核心內的β-半乳糖苷酶表達（2.5和10×放大倍數）。 下圖顯示使用相同的免疫組織化學方法在相鄰對照切片中缺乏免疫熒光而不包含第一抗體。
實驗5：病毒介導的NAc核心中ΔFosB的過表達：進行性比率
最後的實驗直接確定了使用病毒介導的基因轉移方法在NAc核心中限制性過表達ΔFosB是否足以增強大鼠的動力。 這裡，HSV-ΔFosB僅在完成器械訓練後輸注，消除了訓練期間ΔFosB過表達對隨後的漸進比測試的任何潛在影響。 如前所述，訓練一組新的大鼠，並根據他們在訓練的最後幾天的表現分成平衡的實驗組。 隨後動物接受HSV-ΔFosB或HSV-LacZ的雙側輸注到NAc核心中，並且在過表達的5 d後進行累積比率測試。 統計分析揭示了槓桿相互作用的顯著基因表達（F.(1,12) = 14.91; p≤0.01）（圖。 7一個）。 與輸注HSV-LacZ的大鼠相比，輸注HSV-ΔFosB的大鼠產生更多的主動反應（p≤0.01），而對無活性槓桿的反應不受影響。 與這種增加一致，輸注HSV-ΔFosB的大鼠也具有更高的斷裂點（F.(1,12) = 18.849; p≤0.001）（圖。 7B）比注入HSV-LacZ的動物。 在進行性比率測試之前，ΔFosB對測試1 h的基線運動活性沒有影響（補充圖4A，可在 www.jneurosci.org 作為補充材料）。 在進行性比率測試的當天，體重也沒有差異（補充圖片4B，可在 www.jneurosci.org 作為補充材料）。 這些發現支持了我們對轉基因ΔFosB過表達小鼠的觀察，並表明在NAc中選擇性過表達ΔFosB足以增強與食物相關的動機。
圖7。
測試前5 d輸注HSV-ΔFosB對儀器的反應（按漸進配比方案）的影響。 A，槓桿反應。 B，斷點。 數據表示為平均值±SEM。 *** p <0.001； ** p <0.01。
討論區
本研究表明，NAc中ΔFosB的過度表達增強了食物增強的器樂行為河 之前暴露於可卡因，安非他明，搖頭丸或尼古丁增強了後續器樂表現的持續增長。 這些藥物暴露也在漸進的加強比例計劃下增加了食物動機行為. 使用可誘導的轉基因（NSE-tTA×TetOP-ΔFosB）小鼠或使用新型病毒載體在NAc中選擇性地表達ΔFosB，通過限制性紋狀體中ΔFosB的過表達來模擬先前藥物暴露的這些作用。。 值得注意的是，在已經獲得儀器響應之後，在NAc核心中過表達ΔFosB，在漸進比例計劃下增強了對食物的動機。 總之，我們的研究結果確定了NAc核心中的ΔFosB作為藥物誘導的神經適應的潛在介質，可以促進器官行為，擴展該轉錄因子的作用，包括與對食物增強行為表現的動機影響相關的過程。 他們還提出了誘導NAc中ΔFosB表達的條件可能影響天然和藥物增強劑的動機特性的可能性。.
在慢性但非急性暴露於濫用藥物後，ΔFosB在表達強啡肽的中等多刺神經元中累積NAc和背側紋狀體。 這種區域表達模式在這裡使用的可誘導的轉基因ΔFosB過表達小鼠中再現。 在這些老鼠中， 通過條件性位置偏愛測量，升高的紋狀體水平ΔFosB會增加動物對可卡因和嗎啡的敏感性 (Kelz等，1999; Zachariou等人，2006）。 它還增加了對可卡因的進步比率的反應，表明紋狀體ΔFosB過表達增強了自我管理可卡因的動機（Colby等人，2003）。 在這裡，我們發現在這些小鼠中紋狀體ΔFosB過表達也增加了對食物增強劑的反應的進展比率，並且這些效果通過在大鼠的NAc核心中受限的病毒介導的ΔFosB的過表達而再現。 我們的數據表明，ΔFosB可能作為初級強化物的動力轉錄調節劑，無論是食物，藥物，還是運動，這一觀點與慢性車輪運動或蔗糖飲用後ΔFosB的紋狀體表達增加的初步觀察一致（McClung等人，2004). 這些數據表明，NAc過度表達ΔFosB可以增強天然和藥物強化劑的動機影響。
NAc的子區域被認為可以區別地調解帕夫洛或工具激勵過程對工具性能的影響 (Corbit等，2001; de Borchgrave等，2002），對器樂表現的更一般的動機影響可能由其他區域編碼，如杏仁核的中央核 (Corbit和Balleine，2005）。 然而，NAc核心也被提議成為獲得目標導向的器樂學習的關鍵場所（Smith-Roe和Kelley，2000; Baldwin等，2002a,b; Kelley，2004）。 我們顯示先前藥物暴露和轉基因紋狀體ΔFosB過表達對增強儀器行為的等效影響。 限制在NAc核心的HSV-ΔFosB輸注也增加了食物增強的器械響應。 儘管這些實驗並未排除背側紋狀體在這些行為中的貢獻，但它們強烈表明ΔFosB誘導的NAc內基因表達的改變足以增加食物激發的反應。 因為在先前已經達到穩定的儀器性能之後表達ΔFosB時，漸進比率響應也得到了增強，因此似乎可能出現激勵對工具行為影響的作用。 然而，我們的操作也可能影響工具學習過程的可能性不能完全排除。 為支持我們的結論，先前口服可卡因暴露後觀察到的器械性能增加（Miles等，2004）一直被認為涉及動機改變與慢性尼古丁治療的能力一致，以增加小鼠的進行比率反應（Brunzell等，2006). 此外，多巴胺轉運蛋白敲除小鼠，其中細胞外多巴胺水平增加，顯示出增強的ΔFosB免疫反應性和食物強化動機，但沒有改變學習（Cagniard等，2006). 而且，我們發現小鼠紋狀體ΔFosB的過度表達並不影響食物因餵食而“貶值”的表現。 這些數據表明動物對強化劑的動機價值敏感，並且響應是目標導向的.
之前的重複藥物暴露也可以增強與天然增強劑相關的條件刺激所施加的行為控制，通過pavlovian方法測量（Harmer和Phillips，1998; 泰勒和Jentsch，2001; Olausson等人，2003），條件強化（泰勒和霍格，1999; Olausson等人，2004）和pavlovian-to-instrumental transfer（Wyvell和Berridge，2001）。 現在有令人信服的證據表明，與殼相反，NAc核心參與了帕洛維亞條件刺激對藥物激發行為的控制（Parkinson等，1999, 2002; Hall等人，2001; Dalley等人，2002; Ito等，2004）。 我們的結果可能表明藥物誘導的NAc中ΔFosB的誘導可能是這些程序中行為控制得到增強的一種機制。 作為條件強化物的帕夫洛條件刺激也可能有助於目前的行為效果。 通過紋狀體ΔFosB的增加介導的這種條件刺激對行為的增強控制也可能有助於蛋白質對藥物誘導的條件性位置偏好的影響。 (Kelz等，1999; Zachariou等人，2006）和可卡因的累進比率（Colby等人，2003）。 已經假設激勵過程的改變有助於成癮行為的發展和維持（Robinson和Berridge，1993; Jentsch和Taylor，1999; Robbins和Everitt，1999; Nestler，2004）。 目前的數據也與強調成癮行為中的多種工具和帕夫洛文過程的其他理論一致（Everitt和Robbins，2005）。 現在需要進一步的工作來確定藥物和ΔFosB誘導的神經適應在NAc和其他邊緣 - 紋狀體亞區域中的作用，這些因素可能有助於器械表現並促成強迫行為的特定聯想或動機因素。
儘管NAc中的變化影響由初級或條件強化物驅動的行為的精確分子機制尚不清楚（Kelley和Berridge，2002），NAc的GABAergic中型多刺神經元被認為是藥物和經驗依賴性可塑性的關鍵底物。 在這裡，來自腹側被蓋區的多巴胺能輸入和來自皮質輸卵管傳入的谷氨酸能輸入會聚到常見的樹突和樹突棘上。 (Sesack和Pickel，1990; 史密斯和Bolam，1990）。 慢性精神興奮劑暴露 增加NAc殼和核心中神經元上的這種刺的密度 (Robinson和Kolb，1999; Robinson等，2001; Li等人，2003, 2004）。 最近，行為致敏的誘導與NAc核心內樹突棘的增加有關（Li等人，2004）。 值得注意的是，可卡因引起的脊柱密度增加僅在D中持續存在1共表達ΔFosB的陽性神經元（Robinson和Kolb，1999; Lee等人，2006). 因此，NAc核心中的ΔFosB可能有助於持久的突觸可塑性，這可能影響器樂行為. 實際上，多巴胺 - 谷氨酸神經傳遞的關鍵作用（Smith-Roe和Kelley，2000），蛋白激酶A活性（Baldwin等，2002a）和從頭合成蛋白質（Hernandez等，2002在先前已經報導了NAc核心內的儀器性能。 我們現在將ΔFosB鑑定為轉錄因子，其在NAc核心中過表達時可持續增強食物強化響應。 涉及這些作用的特定基因或蛋白質仍有待精確定義。 ΔFosB調節參與神經可塑性的NAc中多種蛋白質的表達 (McClung和Nestler，2003）。 最近的微陣列分析表徵了在此使用的表達ΔFosB的轉基因小鼠的NAc中的基因表達模式，並鑑定了由ΔFosB的相對短期表達調節的基因子集（McClung和Nestler，2003）。 BDNF就是這樣一種基因，已知這種神經迴路中的BDNF可以增強對藥物和食物相關線索的響應（Horger等，1999; Grimm等，2003; Lu等人，2004）。 另一個感興趣的基因是 細胞週期蛋白依賴性激酶5（Bibb等，2001），也是由ΔFosB引起的， 並且可以調節可卡因誘導的結構可塑性（Norrholm等，2003）通過對天然或藥物強化劑的漸進比率測量來測量動機（JR泰勒，未發表的觀察結果）。 另外的候選物是AMPA谷氨酸受體的GluR2亞基 (Kelz等，1999）和轉錄因子NFκB（核因子κB）（Ang等人，2001）。 評估NAc亞區域中的這些和其他受調節的蛋白質作為調節ΔFosB對器械性能和動機的行為影響的候選者將是重要的。
目前的一系列實驗提供的證據表明，NAc中ΔFosB的過表達可以增強食物動機行為，從而調節器官表現，正如之前已經顯示的藥物獎勵。 這些數據提供了新的證據，表明ΔFosB可以作為一般分子開關，與強化目標導向行為的激勵方面的增強相關聯。 我們的研究結果提出，通過上癮藥物，壓力或高回報食物誘導NAcΔFosB可能是一種關鍵機制，通過這種機制，功能失調的動機狀態導致與強迫行為相關的精神疾病。.
腳註
o 收到了三月15，2006。
o 修訂於6月收到23，2006。
o 8月接受2，2006。
這項工作得到了國家藥物濫用研究所，國家精神衛生研究所和國家酒精濫用和酒精中毒研究所的資助。 我們非常感謝Daleja Krueger，Drew Kiraly，Ralph DiLeone博士，Robert Sears和Jonathan Hommel博士在耶魯大學精神病學系的寶貴幫助。 我們也感謝Jennifer Quinn博士和Paul Hitchcott博士對本手稿提供了有益的評論。
通訊應發送給耶魯大學醫學院精神病學系精神病學系Jane R. Taylor，康涅狄格州心臟健康中心，康涅狄格州34公園街，康涅狄格州06508。[電子郵件保護]
版權所有©2006神經科學學會0270-6474 / 06 / 269196-09 $ 15.00 / 0
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