（人類）對慢性可卡因的行為和結構反應需要在伏核中使用ΔFosB和鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II的前饋環（2013）

J Neurosci。 2013 Mar 6;33(10):4295-4307.

羅賓遜AJ, Vialou V, Mazei-Robison M., 馮傑, Kourrich S., 柯林斯, We S, Koob G., Turecki G., 尼夫河, 托馬斯M., 雀巢EJ.

資源

Fishberg神經科學與弗里德曼腦研究所，紐約州紐約西奈山醫學院，10029，明尼蘇達州明尼阿波利斯市明尼蘇達大學人類遺傳學研究所神經科學與心理學系55455，成癮性疾病神經生物學委員會，斯克里普斯研究所，加州拉霍亞92037抑鬱障礙項目，道格拉斯心理健康大學研究所和麥吉爾大學，蒙特利爾，魁北克，加拿大，H4H 1R3，以及麻省理工學院腦與認知科學系，馬薩諸塞州劍橋市02139 。

抽象

轉錄因子ΔFosB和富含腦鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II（CaMKIIα）在伏隔核（NAc）中通過長期暴露於可卡因或其他精神興奮藥物濫用而被誘導，其中兩種蛋白質介導致敏藥物反應。 儘管ΔFosB和CaMKIIα均調節NAA中的AMPA谷氨酸受體表達和功能，NAc培養基多刺神經元（MSN）上的樹突棘形成，以及對可卡因的運動敏化，但迄今為止尚未探索這些分子之間的直接聯繫。 在這裡，我們證明ΔFosB在穩定蛋白質的Ser27上被CaMKIIα磷酸化，並且CaMKII是 在大鼠NAc中可卡因介導的ΔFosB積累所需的。

相反，我們證明ΔFosB對於體內CaMKIIα基因表達的可卡因誘導是必要和充分的，對D具有選擇性的作用。1NAc shell子區域中的類型MSN.

此外，在NAc過表達ΔFosB後，NAc MSN上樹突棘的誘導和對可卡因的行為反應性增加都是CaMKII依賴性的。

重要的是，我們首次證明了ΔFosB和CaMKII在NAc中的誘導 人類可卡因成癮者，建議未來治療干預的可能目標。 這些數據證實ΔFosB和CaMKII參與細胞類型和腦區特異性陽性前饋循環，作為調節響應慢性可卡因的大腦獎賞迴路的關鍵機制。

簡介

越來越多的證據支持這樣的觀點，即基因表達的變化會導致藥物成癮的機制（Robison和Nestler，2011）。 這些變化的一個重要調節因子是ΔFosB，一種Fos家族轉錄因子（Nestler，2008）。 實際上任何濫用藥物的慢性給藥誘導了伏隔核（NAc）中ΔFosB的長期累積，這是一種對於獎賞行為必不可少的邊緣區域。 小號uch誘導似乎特異於表達D1多巴胺受體的NAc中型多刺神經元（MSN）。 這些D1型NAc MSN中ΔFosB的誘導性過表達增加了對可卡因和嗎啡的運動和獎賞反應 (Kelz等，1999; Zachariou等人，2006），包括增加可卡因自我管理（Colby等人，2003). 此外，ΔFosB轉錄活性的遺傳或病毒阻斷降低了這些藥物的獎賞效果（Zachariou等人，2006），表明ΔFosB的這種持續誘導是慢性藥物給藥在NAc中誘導的持久變化的關鍵介質.

由於全長FosB中存在的degron結構域的截短，ΔFosB（相對於所有其他Fos家族蛋白）的異常穩定性是該分子的固有特性（Carle等人，2007）和受監管的過程。 ΔFosB被磷酸化 體外 和 体内 在Ser27，這種反應進一步穩定細胞培養和NAc中的ΔFosB，~10倍數 体内 (Ulery-Reynolds等，2009）。 儘管Ser27-ΔFosB已被證明是酪蛋白激酶-2的底物 體外 (Ulery等，2006），其機制 体内 磷酸化仍然未知。

鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II（CaMKII）是高度表達的絲氨酸/蘇氨酸激酶，其α和β同種型形成十二聚體同源和異型全酶。 体内，對於多種形式的神經可塑性至關重要 (Lisman等人，2002; Colbran和Brown，2004）。 慢性安非他明在NAc殼中選擇性誘導CaMKIIα（Loweth等，2010）和NAc殼中CaMKII活性的藥理學阻斷降低了苯丙胺的行為敏感性（Loweth等，2008）和可卡因（Pierce等人，1998），在該NAc亞區中病毒過表達CaMKIIα可增強對苯丙胺的運動致敏和自我給藥（Loweth等，2010）。 CaMKIIα可能通過調節AMPA谷氨酸受體亞基影響獎賞行為（Pierce等人，1998），因為CaMKIIα活性長期與AMPA受體功能和幾種神經可塑性形式的突觸靶向相關（Malinow和Malenka，2002).

該文獻證明了ΔFosB和CaMKII之間的幾個相似之處：兩者對於濫用藥物的多種行為影響都是必要和充分的，都可以上調各種神經細胞類型中的樹突棘。 体内 (Jourdain等，2003; Maze等，2010），兩者都通過調節AMPA受體發揮其至少一些行為影響（Kelz等，1999; Malinow和Malenka，2002; Vialou等，2010）。 儘管存在這些相似之處，但ΔFosB和CaMKII之間沒有功能聯繫。 在這裡，我們建立ΔFosB和CaMKII之間的相互調節，並證明這兩種蛋白在NAc殼中形成D1型MSN特異性前饋環，其由可卡因誘導並調節一系列可卡因反應。 体内.

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材料和方法

實驗1：可卡因處理後NAc殼和核心的iTRAQ蛋白質組學分析（圖1A)

成年（8週）雄性大鼠每天一次施用20 mg / kg可卡因或鹽水載體IP，持續七天。 最後一次注射後的24小時，NAc殼和核被顯微切割（圖1A）并快速冷凍。 iTRAQ分析如前所述進行（Ross等人，2004; Davalos等，2010).

圖1

圖1

殼體特異性誘導可卡因在NAc中的CaMKII

實驗2：量化可卡因處理後大鼠NAc核心和殼中的蛋白質變化（圖1B-D)

成年（8週）雄性大鼠在運動記錄室中每天一次施用10mg / kg可卡因或鹽水載體IP一次，持續七天。 先前用可卡因治療的動物（稱為“慢性”）和一部分用鹽水治療的動物（稱為“急性”）記錄了對單次注射可卡因（5 mg / kg IP）的運動反應，以及對生理鹽水的運動反應單獨記錄在剩餘的慢性鹽水處理動物（稱為“鹽水”）中。 如所述進行運動活性測定（Hiroi等，1997）。 簡而言之，將成年雄性大鼠置於18“×24”PAS開放式野外記錄盒（San Diego Instruments）中以30 min進行習慣，給予單次IP注射鹽水並監測另外的30 min，並給予單次IP注射5 mg / kg可卡因並監測30 min。

在最後一次注射後的24小時，在沒有麻醉的情況下將大鼠斷頭以避免麻醉劑對神經元蛋白質水平和磷酸化狀態的影響。 將腦在1.2 mm基質（Braintree Scientific）中連續切片，並在含有蛋白酶（Roche）和磷酸酶（Sigma Aldrich）抑製劑的磷酸鹽緩衝鹽水中使用14計量沖頭（NAc核心）和剩餘的12計量沖頭除去靶組織。 NAc殼的組織（見 圖1A）並立即在乾冰上冷凍。 通過在改良的RIPA緩衝液中光照超聲均化樣品：10 mM Tris鹼，150 mM氯化鈉，1 mM EDTA，0.1％十二烷基硫酸鈉，1％Triton X-100，1％脫氧膽酸鈉，pH 7.4，蛋白酶和磷酸酶抑製劑如上。 加入Laemmli緩衝液後，在4-15％聚丙烯酰胺梯度凝膠（Criterion System，BioRad）上分離蛋白質，並根據製造商的方案使用Odyssey系統（Li-Cor）進行Western印跡。

實驗3：在可卡因戒斷後量化大鼠NAc核心和殼中的蛋白質變化（圖1E)

成年（8週）雄性大鼠每天一次施用10 mg / kg可卡因或鹽水載體IP，持續七天。 最後一次注射後14天，用鹽水處理的動物再給予鹽水注射（稱為“生理鹽水”），給予用可卡因治療的動物另外注射生理鹽水（稱為14天撤藥或“14d WD”）或單次注射可卡因（稱為“14d WD Chal”用於挑戰）。 最後一次注射後1小時，將動物斷頭並進行Western印跡，如同 實驗2.

實驗4：在可卡因自我給藥後量化大鼠NAc核心和殼中的蛋白質變化（圖2A-C)

訓練大鼠在固定比率0.5方案中在1小時內自我施用1 mg / kg /輸注可卡因9天。 在九個基線期後，將大鼠分成兩組，在最後兩個療程中通過可卡因攝入平衡。 允許一組大鼠在1小時的會話中自我施用可卡因（0.5 mg / kg /輸注）（短途訪問，ShA），而另一組大鼠在6小時的時間段內自我施用可卡因（長期訪問，LgA） ）再增加十天（升級會議）。

如所描述的那樣處理腦切片用於免疫組織化學（Perrotti等，2004）。 在最後一次暴露於藥物後，腦灌注18-24小時，導致任何殘留的全長FosB蛋白的降解，使得所有剩餘的免疫反應性反映ΔFosB。 通過Western印跡證實了這種降解，其顯示沒有針對不識別ΔFosB的全長FosB的C末端的抗體的顯著染色（數據未顯示）。 在切成35μm切片後，通過盲法觀察者通過每隻大鼠的NAc在兩個切片中定量ΔFosB免疫陽性細胞的數量，然後通過每隻動物的區域計算每40×場的平均值。 每隻動物被認為是用於統計分析的個體觀察。 使用Paxinos和Watson識別感興趣的區域（Paxinos和Watson，2007).

使用如所述的Licor系統進行CaMKIIα免疫反應性的定量（Covington等，2009）。 用Odyssey軟件測定CaMKII和GAPDH的綜合強度。 結果表示為每毫米的積分強度值2 並表示為平均值±sem（n =每組4-10）。 GAPDH的值用作參考以使切片厚度和條件的CaMKII強度標準化。

圖2

圖2

在自我給藥大鼠和人可卡因成癮者的NAc殼中誘導CaMKII

實驗5：量化可卡因依賴性人類的蛋白質水平（圖2D)

程序

死後的人腦組織來自魁北克自殺腦庫 （加拿大魁北克省蒙特利爾道格拉斯心理健康大學研究所）。 組織的保存基本上按照描述進行（Quirion等，1987）。 簡而言之，一旦被提取，將大腦置於聚苯乙烯泡沫塑料盒中的濕冰上並衝到魁北克自殺腦庫工廠。 半球立即被大腦，腦乾和小腦中間的矢狀切口分開。 通常從左半球切下血管，松果腺，脈絡叢，半小腦和半腦幹，然後在冷凍前將其冠狀切割成1cm厚的切片。 在冷凍前將後半部分小腦切成切成1cm厚的切片。 將組織在-2℃下在40-甲基丁烷中快速冷凍~60秒。 將所有冷凍組織分別保存在-80°C的塑料袋中，以便長期保存。 從不銹鋼板上的冷凍冠狀切片中切出特定的腦區域，周圍用乾冰控制環境溫度。 如在中所述進行蛋白質印跡 實驗2.

隊列

該隊列由37男性和3女性受試者組成，年齡在15-66年之間。 所有受試者突然死亡，沒有長期的agonal狀態或長期的醫學疾病. 在每種情況下，魁北克驗屍官辦公室確定死因，並使用組織樣本進行毒理學篩查，以獲得死亡時藥物和非法物質使用的信息。 受試者組由符合SCID-I可卡因依賴標準的20個體組成。 對照組由20受試者組成，沒有可卡因依賴史且沒有重大精神病學診斷。 所有受試者突然死於對腦組織沒有直接影響的原因。 將組匹配平均受試者年齡，冷藏延遲和pH。 對於所有受試者，如前所述進行心理解剖（Dumais等人，2005），使我們能夠獲得有關精神病史和病史的詳細病例信息，以及其他相關的臨床和社會人口統計學數據。 簡而言之，一位訓練有素的面試官進行了 DSM-IV的結構化臨床訪談 精神疾病（SCID-I）與死者的一個或多個線人。 一組臨床醫生審查了SCID-I評估，病例報告，驗屍官筆記和醫療記錄，以獲得一致的精神病診斷。

實驗6：大鼠NAc的染色質免疫沉澱（圖3A-C)

成年（8週）雄性大鼠每天一次施用10 mg / kg可卡因或鹽水載體IP，持續七天。 最後一次注射後的24小時，NAc殼和核心被顯微切割。 染色質免疫沉澱（ChIP）在14總組（98動物總數，7可卡因池，7鹽水池）中匯集來自每組7隻大鼠的殼或核的雙側NAc沖孔。 將組織交聯，洗滌並在-80℃下儲存，直到通過超聲處理染色質剪切。 將剪切的染色質與先前與磁珠結合的抗體（Dynabeads M-280，Invitrogen）孵育過夜。 非免疫IgG用作對照。 在反向交聯和DNA純化後，qPCR用於測量CaMKIIα啟動子DNA的水平。 設計引物以擴增含有在轉錄起始位點之前位於~1 bp的AP-450共有序列的區域（正向：ACTGACTCAGGAAGAGGGATA;反向：TGTGCTCCTCAGAATCCACAA）。

圖3

圖3

細胞類型和區域特異性ΔFosB誘導CaMKIIα 体内

實驗7：用細胞類型特異性ΔFosB過表達測量CaMKII轉錄物和蛋白質表達（圖3D)

雄性轉基因小鼠來源於 NSE-的tTA （A行）× TetOp-ΔfosB （11行）和 NSE-的tTA （B行）× TetOp-FLAG-ΔfosB （品系11）小鼠（陳等人，1998; Kelz等，1999; Werme等人，2002; Zachariou等人，2006）在100μg/ ml多西環素上構思和產生以抑制發育過程中ΔFosB的表達。 斷奶仔豬在斷奶時分開：一半留在多西環素上，一半轉為水，幾週後，當ΔFosB的轉錄效應最大時，動物使用8至11（Kelz等，1999; McClung和Nestler，2003）。 對於轉錄分析，將小鼠快速斷頭，取出腦並置於冰上。 用14-gauge針刺取出NAc的解剖，並在乾冰上快速冷凍直至提取RNA。 如前所述進行RNA分離，qPCR和數據分析（LaPlant等，2009）。 簡言之，用TriZol試劑（Invitrogen）分離RNA，用Qiagen的RNAeasy微量試劑盒進一步純化，用Agilent生物分析儀檢查質量。 使用iScript（BioRad）進行逆轉錄。 用Applied Biosystems 7900HT RT PCR系統進行qPCR，其具有以下循環參數：10℃，95℃; 40循環為95°C，1 min，60°C，30 sec，72°C，30 sec; 分級加熱至95°C以產生解離曲線以確認單個PCR產物。 如下所述進行ΔFosB和CaMKIIα蛋白表達的免疫組織化學分析 實驗4.

實驗8：NAc內D1和D2多巴胺受體拮抗劑對可卡因介導的蛋白質變化的影響（圖3H)

成年（8週）雄性大鼠每天一次施用10 mg / kg可卡因或鹽水載體（“載體”組）IP，持續七天。 在每次注射可卡因之前的30分鐘，給大鼠IP施用D1受體拮抗劑SCH 23390（0.5 mg / kg，“D1 Ant”組）或D2受體拮抗劑依替必利（0.5 mg / kg，“D2 Ant”組）。 ，或鹽水對照注射（“可卡因”組）。 最後一次注射後的24小時，將動物斷頭並通過Western印跡定量蛋白質 實驗2.

實驗9：AAV介導的ΔFosB過表達對蛋白質表達的影響（圖4 A-C)

對成年雄性大鼠（8週）進行立體定向手術以注射AAV-GFP（綠色熒光蛋白）或AAV-GFP-ΔFosB（Maze等，2010）。 33針頭針（Hamilton）用於所有手術，其中0.5μl純化的高滴度病毒在5最小時間段內雙側輸注，然後在輸注後休息期間另外5分鐘。 相對於前囟測量所有距離：10°角，AP = + 1.7 mm，Lat = 2.5 mm，DV = -6.7 mm。 手術後14天，動物在運動監測室中單次IP注射10 mg / kg可卡因，以評估ΔFosB過表達的行為效應。 在最後一次注射後的24小時，將大鼠按照斬首斷頭 實驗2在熒光顯微鏡下進行組織顯微切割，得到GFP陽性的NAc組織。 然後按照蛋白質印跡進行 實驗2。

圖4

圖4

ΔFosB對NAc殼中可卡因介導的D1受體依賴性CaMKIIα誘導是必要和充分的

實驗10：AAV介導的ΔJunD過表達對可卡因依賴性蛋白表達的影響（圖4 D-F)

按順序進行AAV-GFP或AAV-GFP-ΔJunD的立體定位注射 實驗8。 手術後14天，在運動記錄室中每天一次給動物施用10 mg / kg可卡因或鹽水載體IP一次，持續七天。 記錄單次注射可卡因（5 mg / kg IP）或鹽水的運動反應。 在最後一次注射後24小時，將大鼠斷頭，收穫組織，並按照如下進行蛋白質印跡 實驗9。

實驗11： 體外 蛋白激酶檢測（圖5A-D)

從昆蟲細胞中純化重組CaMKIIα和ΔFosB（Brickey等，1990; Jorissen等，2007），並進行蛋白激酶檢測（Colbran，1993），如前所述。 簡言之，CaMKII在冰上與2.5μM（或指示濃度）的ΔFosB，1 mM Ca預溫育。2+，40 mM Mg2+，15μM鈣調蛋白和200 mM HEPES pH 7.5。 通過添加200μMATP啟動磷酸化，有或沒有[γ-32P] ATP並允許在室溫下進行10分鐘（圖5A和B）或冰上2分鐘（圖5C＆D）。 通過蛋白質印跡解析產物（圖5A和B）或通過放射自顯影和閃爍計數（圖B-D）。

圖5

圖5

ΔFosB是CaMKIIα的有效底物

實驗12：Ser27ΔFosB磷酸化的鑑定（圖5E)

體外 按照進行激酶測定 實驗11通過SDS-PAGE分離蛋白質，切出對應於ΔFosB的條帶並進行串聯質譜分析。 所有面板中相應離子片段的m / z分配在離子峰頂部標記。 由於空間限制，並非所有碎片離子都被標記。 通常，片段離子標記的文本用黑色著色，除非它們直接證實或添加了感興趣的磷酸化位點存在的證據，在這種情況下它們用紅色標記。 骨架斷裂產物的證據呈現在磷酸肽的序列讀數中，檢測到的磷酸化殘基位點用紅色表示，具有單個氨基酸字母標記。 觀察到的碎片離子的數字描述也在肽序列上標記為b和y離子。 顯示較低強度碎片離子的m / z軸部分的縮放因子標記在每個碎片質譜的頂部。 圖H中所示的碎片離子證實了Ser27磷酸化同種型的存在，然而，在Ser28，Ser31，Ser34和Thr37位點的其他磷酸化同種型的混合物中。 pa5，pa5-P，pb5和pb5-P離子的存在唯一地證實了Ser27殘基的磷酸化。

實驗13：Ser27磷酸化的定量（圖5F)

設計標準肽，模擬Ser27ΔFosB的磷酸和非磷酸形式。 在合成和純化後，將每種“重”獨特型肽溶解在50 / 50乙腈/水緩衝液中並送去氨基酸分析以確定合成肽儲備溶液的絕對濃度。 然後將每個“重”肽直接注入4000 QTRAP質譜儀（MS）中以確定用於MS / MS碎裂和2至4個MRM轉變的最佳碰撞能量。 接下來，將純“重”肽在4000 QTRAP上進行LCMS以確保肽分離。 儀器以三重四極桿模式運行，其中Q1設定在特定前體m / z值（Q1不掃描），並且Q3設定為對應於該肽的特定片段的特定m / z值。 在MRM模式中，依次測量一系列單個反應（前體/碎片離子躍遷，其中調節碰撞能量以優化目標碎片離子的強度），並且循環（通常為1-2秒）在整個循環中循環HPLC分離的整個時間。 MRM躍遷由現有肽的MS / MS譜確定。 然後選擇每個肽的兩個轉變，對應於高強度碎片離子，並且使用自動化軟件優化碰撞能量以最大化MRM轉變的信號強度。 然後比較暴露於CaMKII或對照的標準肽和ΔFosB樣品產生的峰，以確定反應中每種肽形式的絕對豐度。 使用AB Multiquant 1.1軟件進行LC-MRM數據的數據分析。

實驗14：CaMKII過表達小鼠中ΔFosB的誘導（圖5G＆H)

過表達T286D CaMKII的轉基因小鼠（Mayford等，1996; Kourrich等，2012並且在沒有多西環素的情況下培養野生型同窩仔畜以允許轉基因表達。 對於20天，每天一次給予成年小鼠14mg / kg可卡因或鹽水IP。 最後一次注射後的24小時，將動物斷頭並進行免疫組織化學和ΔFosB表達的定量，如同 實驗4.

實驗15：HSV介導的ΔFosB過表達和CaMKII抑制對NAc樹突棘的影響（圖6A-E)

成年雄性小鼠（8週）立體定位注射NAc與HSV-GFP，HSV-GFP-ΔFosB（Olausson等人，2006），HSV-GFPAC3I，或HSV-GFPAC3I-ΔFosB。 在這些構建體中，AC3I（一種基於肽的CaMKII活性抑製劑）與GFP的C末端融合。 使用含有GFPAC3I的pMM400載體作為模板，通過PCR克隆GFPAC3I，其具有以下引物：GFP-AC3I-F：5'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3'（clampNheIKozakmet）; GFP-AC3I-R：5'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3'（clampBspEIstop）。 使用NheI和BspEI位點將所得PCR產物插入p1005 +和p1005 +-ΔFosB載體中。 通過測序驗證構建體。 立體定位坐標為：10°角，AP = + 1.6 mm，Lat = + 1.5 mm，DV = -4.4 mm（Barrot等，2002）。 按照進行灌注和腦切片 實驗4.

如所述進行脊柱分析（Christoffel等人，2011）。 簡而言之，從表達GFP的HSV感染的細胞中隨機選擇遠離體細胞的樹突片段50-150μm。 使用帶有rayburst算法的NeuronStudio在共焦LSM 710（Carl Zeiss）上獲得圖像用於形態學分析。 NeuronStudio根據以下值將脊柱分類為薄，蘑菇或粗短:( 1）縱橫比，（2）頭頸比和（3）頭部直徑。 帶頸部的刺可分為薄或蘑菇，沒有明顯頸部的刺被歸類為粗短。 帶有頸部的脊柱根據頭部直徑標記為薄或蘑菇。

圖6

圖6

阻斷CaMKII活性可防止ΔFosB在NAc中的形態和行為影響

實驗16：HSV介導的ΔFosB過表達和CaMKII抑制對可卡因反應的影響（圖6F)

按照成年雄性小鼠注射病毒 實驗15和按照每個5 mg / kg注射可卡因的運動反應進行測量 實驗9。 運動數據表示為可卡因注射後30 min的總束斷裂。

其他信息：

動物房屋

將雄性Sprague Dawley大鼠（250-275 g; Charles River Laboratories）成對飼養。 將8週齡的C57BL / 6J雄性小鼠（傑克遜實驗室）分組飼養，每籠最多5只動物。 在實驗操作之前，所有動物在動物設施中習慣於≥1，並且在23 hr光/暗循環（在25上點亮：12 AM）的氣候控制室（7-00°C）中食用，並且可以獲得食物和水 隨意。 根據西奈山神經科學學會和機構動物護理和使用委員會（IACUC）的指導進行實驗。

毒品

將藥物IP施用並溶解於無菌鹽水中，包括可卡因（5-20 mg / kg，每隻10μl用於小鼠，每1 ml用於大鼠，NIDA）和SCH 23390或鹽酸依地洛普（0.5 mg / kg / 1 ml，Tocris） 。 對於立體定位手術，用無菌鹽水中的氯胺酮（100 mg / kg）和甲苯噻嗪（10 mg / kg）（Henry Schein）的“混合物”麻醉小鼠。

抗體

CaMKIIα（總數）：Upstate 05-532，1：5,000

CaMKII phospho-Thr286：Promega V111A，1：1,000

ΔFosB（總）：Cell Signaling 5G4，1：250

ΔFosBpospho-Ser27：Phosphosolutions，1：500

GluA1（總計）：Abcam，Ab31232，1：1,000

GluA1 phospho-Ser831：Millipore N453，1：1,000

GluA1 phospho-Ser845：Chemicon Ab5849，1：2,000

GluA2：Millipore 07-598，1：2,000

NR2A：Sigma HPA004692，1：2,500

NR2B：Millipore Ab1557P，1：1,000

統計分析

使用Prism 6軟件包（GraphPad）進行所有統計學分析。 學生t檢驗用於所有成對比較（在給出t值的結果中指示），並且單向ANOVA用於所有多重比較（在給出F值的結果部分中指示）。

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成績

慢性可卡因誘導NAc殼中的CaMKII

許多研究表明，NAc殼和核心中的MSN對長期接觸濫用藥物有不同的生化和生理反應（Kourrich和Thomas，2009; Loweth等，2010並且這兩個分區域在不同程度上調節了尋求毒品的行為 (Ito等，2004）。 確定可卡因對NAc殼蛋白成分的不同影響 與 核心，我們使用多重等壓標記（iTRAQ）和串聯質譜（MS / MS）。 每天給成年雄性大鼠注射可卡因（20 mg / kg）或鹽水，持續7天; 最後一次注射後的24小時，NAc殼和核被顯微切割（圖1A）并快速冷凍。 然後使用iTRAQ定量這些樣品中的蛋白質。 與核心相比，所有四種CaMKII同種型在可卡因處理後表現出大大的表達增加，其特異於NAc殼。 幾種蛋白磷酸酶，包括PP1催化和調節亞基和PP2A，它們之前已與其他系統中的各種CaMKII底物相關聯（Colbran，2004），遵循類似的模式。 這些發現提供了新的，無偏見的證據，證明CaMKII信號通路在NAc中以殼特異性方式受可卡因顯著調節。

為了更加定量地驗證這一發現，我們用可卡因（不同劑量）或鹽水處理上述大鼠並測量對可卡因（5 mg / kg）或鹽水攻擊劑量的運動反應。 反復接觸10 mg / kg可卡因導致典型的運動致敏模式（圖1B）。 使用這種給藥方案的進一步研究通過使用Western印跡揭示，在最終注射可卡因後，重複的可卡因在NAc殼24 hr中選擇性地誘導CaMKIIα（圖1C和D.; P = 0.0019; F = 7.943; DF = 29）。 此外，AMPA受體的GluA831亞基的經典CaMKII底物Ser1的磷酸化在NAc殼中顯著增加而不是核心（p = 0.0261; F = 4.208; df = 28），而CaMKIIαThr286自身磷酸化具有強烈但不是僅在殼體中誘導的顯著趨勢（圖1D）。 其他幾種穀氨酸受體未受影響。 與CaMKII的這些測量相反，相同的組織樣品顯示在NAc的兩個殼（p = 0.0260; F = 4.189; df = 29）和核心（p = 0.0350; F = 3.807; df = 29）中誘導ΔFosB。 （圖1C和D.），與先前的調查結果一致（Perrotti等，2008).

由於幾項先前可卡因調節AMPA受體的研究分析了從慢性可卡因中撤出~14天后的動物（見討論），我們在這個時間點重複了這些生化分析。 我們發現，在最終注射可卡因後的14天，ΔFosB在NAc中仍然升高（p = 0.0288; F = 4.258; df = 22），而CaMKII和GluA1 Ser831的磷酸化都沒有增加（圖1E）。 然而，單次1 mg / kg攻擊劑量的可卡因，總CaMKII水平（p = 10; F = 0.0330; df = 3.947）和GluA26 Ser1（p = 831; F = 0.0213; df = 4.509）後的27小時磷酸化水平升高到與初始慢性可卡因暴露後相似的程度（圖1E）。 這些數據表明NAc殼神經元在延長的禁慾期間可能通過CaMKII基因啟動子的直接引發而引發CaMKII誘導（參見討論）。 此外，ΔFosB誘導比CaMKII誘導更持久的事實表明存在額外的機制，無論是基於染色質還是其他，對CaMKII調節施加“制動”，如討論中所述。

為了進一步加強這些觀察，我們探索了可卡因自我管理的模型，其涉及意志藥物攝入。 給成年雄性大鼠短期或長期接觸可卡因; 正如所料（Ahmed和Koob，1998），只有長期獲取條件導致藥物自我管理不斷升級（圖2A）。 ΔFosB被更長時間地誘導 與 NAc shell（p = 0.0011; F = 11.12; df = 17）和核心（p = 0.0004; F = 13.86; df = 17）對可卡因的短暫訪問。 相比之下，只有長期獲取可卡因才能在NAc殼中誘導CaMKIIα（圖2B和C.; P = 0.0236; F = 4.957; DF = 16）。 有趣的是比較短途動物（~12 mg / kg IV），長途動物（~70 mg / kg IV）和實驗動物（10 mg / kg）的每日可卡因攝入量，以及問為什麼後者引發ΔFosB和CaMKII的強烈誘導，而短途訪問則沒有。 這種差異可能是由於可卡因峰值水平的差異（實驗者給予的可卡因是單次推注IP，而自我給予的可卡因是通過多次靜脈注射給藥），或者是藥物暴露時間長度的差異（實驗者的7天數）管理，自我管理的19天數）。

儘管有關可卡因作用的ΔFosB和CaMKII的大量文獻，但在人類可卡因使用者中尚未對這些蛋白質進行研究。 在這裡，我們提出了第一個證據，證明ΔFosB（p = 0.0316; t = 1.921; df = 34）和CaMKII（p = 0.0444; t = 1.755; df = 32）的水平在可卡因依賴性人類的NAc中增加（圖2D, 表1）。 這些數據表明我們對囓齒動物NAc中可卡因誘導的ΔFosB和CaMKII的檢測與人可卡因成癮臨床相關。

表1

表1

來自人可卡因成癮者和匹配對照組的樣品的表徵

ΔFosB在NAc Shell的D1型MSN中選擇性調節CaMKII轉錄

發現CaMKII和ΔFosB都被囓齒動物NAc中的可卡因上調導致我們確定ΔFosB是否可能調節CaMKII基因的轉錄。 我們之前曾報導過CaMKIIα作為NAF無偏微陣列分析中ΔFosB的可能靶標（McClung和Nestler，2003），但該研究未在該研究中進一步驗證。 我們首先使用定量ChIP（qChIP-ChIP，然後定量PCR）來確定ΔFosB是否與成年雄性大鼠的NAc中的CaMKIIα基因啟動子結合，並且發現通過慢性可卡因施用在殼中這種結合顯著增加（ p = 0.0133; t = 2.901; df = 12），但不是核心，次區域（圖3A）。 為了進一步了解與ΔFosB與CaMKIIα啟動子結合的該亞區域特異性差異相關的機制，我們使用qChIP來表徵該基因組區域的組蛋白修飾狀態。 之前的研究表明可卡因誘導H3乙酰化在CaMKIIα啟動子的總小鼠NAc（Wang等人，2010）。 相反，我們發現可卡因在NAc核心中選擇性地降低CaMKIIα啟動子的H3乙酰化（圖3B; P = 0.0213; T = 2.726; df = 10），在殼中沒有明顯變化，與超過ΔFosB結合的亞區域特異性染色質改變一致。 qChIP用於抑制標記，二甲基化H3賴氨酸9（H3K9me2），顯示殼和核心亞區的降低趨勢（圖3C).

確定ΔFosB是否調節CaMKIIα轉錄 体内，我們利用了兩個轉基因小鼠系，特異性地在D1中誘導過表達ΔFosB 與 D2型MSN以飲用水中強力黴素管理的方式控制（陳等人，1998; Kelz等，1999; Werme等人，2002）。 僅在D1型MSN中過表達ΔFosB的成年雄性小鼠在NAc中具有顯著增加的CaMKIIαmRNA水平（p = 0.0337; t = 1.996; df = 13），這是在主要在D2型MSN中過度表達ΔFosB的小鼠中未見的效果（圖3D）。 由D1型MSNs中ΔFosB表達誘導的CaMKIIαmRNA的增加伴隨著NAc殼（p = 0.0030; t = 3.578; df = 14）和核心（p = 0.0392; t）中CaMKIIα蛋白的伴隨增加。 = 2.275; df = 14; 圖3E和F.）。 這些數據表明ΔFosB能夠驅動兩個亞區的D1型MSN中的CaMKIIα基因表達，儘​​管 圖3B 表明可卡因介導的染色質在CaMKIIα啟動子處的變化（例如，乙酰化降低）阻止ΔFosB在可卡因後上調核心亞區域中的CaMKII。

因為我們的轉基因小鼠數據表明CaMKII基因表達的ΔFosB誘導對NAc中的D1型MSN具有特異性，所以我們接下來試圖確定CaMKII的可卡因依賴性上調是否需要激活D1多巴胺受體。 成年雄性大鼠像以前一樣服用慢性可卡因或生理鹽水，但是在每次注射前30分鐘，可卡因組的大鼠接受IP生理鹽水，D1拮抗劑SCH 23390（0.5 mg / kg）或D2受體拮抗劑依替普利德（0.5 mg / kg）。 最後一次注射可卡因後24小時分析動物。 Western印跡顯示，D1而不是D2拮抗劑完全阻斷了可卡因介導的ΔFosB的增加（p <0.0001； F = 18.96； df = 18），Nye等，1995），以及CaMKII（p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; 圖3G和H.）。 這些數據支持這樣的假設：可卡因特異性地在NAc殼的D1型MSN中參與ΔFosB介導的CaMKII基因表達的增加。 在未來的研究中，直接證明可卡因對該腦區域內CaMKII表達的細胞類型特異性作用將是重要的。

ΔFosB對於NAc殼中CaMKII的可卡因誘導是必需的和充分的

為了補充轉基因小鼠的使用，我們接下來研究了ΔFosB在通過在大鼠中使用病毒介導的基因轉移介導可卡因誘導CaMKIIα的作用。 我們將腺相關病毒（AAV）顆粒雙側注射到成年雄性大鼠的NAc殼中（其中殼可以被選擇性靶向）以過量表達ΔFosB加GFP或GFP單獨。 然後給動物單次IP注射10 mg / kg可卡因。 與過表達單獨GFP的動物相比，過表達ΔFosB/ GFP的動物表現出增加的運動反應（圖4A）。 單次可卡因注射後的24小時，通過在熒光光源下解剖從這些動物切除GFP陽性NAc組織。 蛋白質組織的印跡（圖4B和C.）與GFP動物相比，顯示出強的ΔFosB過表達以及總CaMKIIα蛋白的顯著增加（p = 0.0070; t = 2.894; df = 30），類似於用慢性可卡因施用所見的誘導。 此外，Thr286處的CaMKIIα自磷酸化（指示酶活化）通過ΔFosB過表達（p = 0.0330; t = 2.243; df = 28）增加，CaMKII底物的磷酸化，GluA831的Ser1（p = 0.0540; t = 2.012; df = 28），再次模仿慢性可卡因的作用（圖1C和D.）。 Ť總之，這些數據提供了進一步的證據，即NAc殼中的ΔFosB表達足以對該可卡因的可卡因敏感和CaMKII在該亞區中的誘導和激活。

我們使用類似的方法來確定ΔFosB是否也是可卡因介導的NAc殼中CaMKIIα誘導所必需的。 AAV用於過表達截短的JunD蛋白，稱為ΔJunD，它是ΔFosB轉錄激活的負調節因子（Winstanley等人，2007）僅加GFP或GFP。 兩週後，當轉基因表達最大時，動物每天給予可卡因（10 mg / kg）或鹽水7天，並在最後一次慢性注射後測試對可卡因激發（5 mg / kg）24 hr的運動反應（圖4D）。 ΔJunD過表達阻止了對可卡因的運動致敏，並且還阻止了NAc殼中CaMKIIα的誘導和活化（圖4E和F.; P = 0.0437; F = 2.997; 總df = 38），表明ΔFosB轉錄活性對於該子區域中可卡因介導的CaMKIIα誘導是必需的。 有趣的是，我們發現ΔJunD在鹽水和可卡因處理條件下均降低了ΔFosB的水平（p = 0.0004; F = 8.110; df = 35），提高了ΔFosB依賴於其自身表達水平的AP-1活性的新概率。

CaMKII在Ser27處磷酸化ΔFosB

運用 體外 蛋白激酶測定，我們確定純化的ΔFosB是CaMKIIα的穩健底物。 他的孵化6-ΔFosB與CaMKIIα和ATP引起ΔFosB的電泳遷移率向上移動（圖5A）; 幾個產生的條帶錶明多個磷酸化位點。 類似 體外 激酶檢測使用[γ-32P] ATP顯示放射性標記的磷酸鹽摻入移位的ΔFosB帶中（圖5B），證明蛋白質的直接磷酸化。 我們為先前表徵的ΔFosB的Ser27產生了磷酸特異性抗體（Ulery等，2006）。 雖然這種抗體不會產生針對含有Ser27磷酸化ΔFosB的腦提取物的信號（數據未顯示），但我們能夠檢測到Ser27磷酸化。 體外 使用CaMKII的激酶測定（圖5B）。 ΔFosB的CaMKII磷酸化的動力學分析表明它是激酶的有效底物（圖5C），具有明顯的K.M 5.7±2.0μM和K.貓 2.3±0.3min - 1。 這些結果與許多已被充分錶徵的結果相當 体内 CaMKII的底物（Colbran和Brown，2004）。 此外，我們確定CaMKII以化學計量2.27±0.07 mol / mol磷酸化ΔFosB（圖5D），表明在His內至少存在三個CaMKII磷酸化位點6-ΔFosB蛋白，符合 圖5A.

為了研究磷酸化的個別位點，我們對我們的樣品進行了MS分析 體外 激酶分析。 圖5E 表明在先前表徵的Ser27和幾個另外的位點處的ΔFosB磷酸化（數據未顯示）。 鑑於Ser27的先前功能特徵，我們通過產生模擬Ser27的磷酸和非磷酸化狀態的標記合成肽來關注該位點，然後使用已知量的這些肽作為ΔFosB的MRM分析之前和之後的標準。 體外 CaMKII的磷酸化。 隨後的定量（圖5F）證實Ser27是CaMKII的有效底物。 這些結果表明，在ΔFosB內的多個磷酸化殘基中，Ser27是CaMKII的特別有效的底物。

CaMKII介導NAc殼中ΔFosB的可卡因積累

由於CaMKII可以使ΔFosB磷酸化 體外 在一個顯著增強其穩定性的網站上 體外 和 体内 (Ulery等，2006; Ulery-Reynolds等，2009），我們確定CaMKII活性是否控制NAc中的ΔFosB水平 体内。 為了解決這個問題，我們首先使用過表達CaMKIIα（T286D）的鈣依賴性突變體的小鼠系在包括NAc在內的多個大腦區域（Mayford等，1996; Kourrich等，2012）。 我們在20天每天一次注射年齡匹配的成年雄性突變體和野生型同窩仔畜用14 mg / kg可卡因或鹽水，然後在最後一次注射後一天分析動物。 我們發現在NAc殼中突變動物的ΔFosB基礎水平增加（p = 0.0001; F = 9.207; df = 37），但不是核心（圖5G和H.）。 令人驚訝的是，在殼和核心的突變動物中，ΔFosB的可卡因依賴性誘導被阻斷，表明儘管CaMKII可以直接調節NAc殼中的ΔFosB穩定性，但它也可能位於NAc亞區中可卡因激活途徑中ΔFosB的上游。 。

ΔFosB介導的結構和行為可塑性需要CaMKII活性

可卡因在NAc MSNs上誘導樹突棘是這一大腦區域中最好的藥物誘導適應之一，並且這種脊柱誘導與藥物敏感的行為反應相關（Robinson和Kolb，2004; Russo等，2010並且據報導對D1型MSN具有選擇性（Lee等人，2006）。 我們最近證明，NAc中樹突棘的可卡因誘導依賴於ΔFosB及其下游轉錄程序（Maze等，2010）。 雖然有大量關於CaMKII參與樹突棘形態學和其他大腦區域和實驗系統誘導的文獻（Jourdain等，2003; Penzes等，2008; Okamoto等人，2009），其在NAc MSN脊柱形成中的作用尚未研究過。 因此，我們通過利用HSV介導的與GFP融合的CaMKII抑制肽AC3I過表達來確定ΔFosB介導的MSN樹突棘誘導是否需要CaMKII活性，GFP是一種先前顯示抑制CaMKII活性的構建體。 体内 (張等人，2005; Klug等，2012）。 成年小鼠NAc外殼中ΔFosB的病毒過表達導致MSN樹突棘密度顯著增加（p <0.0001; F = 8.558; df = 59; 圖6A和B.）如先前報導（Maze等，2010），這種增加主要是由瘦（p = 0.0027; F = 5.319; df = 59）和粗短（p = 0.0378; F = 2.988; df = 59）脊柱類型（均被認為是未成熟的刺）驅動的（圖6C-E）。 在更成熟的蘑菇狀刺上沒有看到效果。 然而，當GFP-AC3I共表達時，ΔFosB誘導的脊柱被完全消除（圖6A-E），表明在NAc殼中ΔFosB誘導樹突棘需要CaMKII活性。

我們接下來使用相同的病毒工具來確定ΔFosB對可卡因的行為敏感性是否需要CaMKII活性。 在病毒注射到NAc殼中後72小時，給動物單次注射5 mg / kg可卡因並記錄它們的運動活性。 如前所示，ΔFosB的AAV過度表達延長（圖4A），HSV介導的ΔFosB過表達增加了對可卡因的運動敏感性（p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; 圖6F）。 與樹突棘的誘導一樣，通過共表達GFP-AC3I對CaMKII活性的抑製完全阻斷了ΔFosB介導的可卡因敏感性增加，表明ΔCosB誘導的可卡因行為效應改變需要CaMKII活性。

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討論區

本研究描述了一種新的前饋機制，其中可卡因誘導NAc中的ΔFosB，其在NAc殼中選擇性地上調CaMKIIα基因的轉錄。. 隨後CaMKIIα磷酸化並穩定ΔFosB，導致更大的ΔFosB積累並進一步誘導CaMKIIα（圖6G）。 在長期暴露於可卡因期間，這兩種蛋白質的同步水平有助於對藥物敏感的行為反應的基本方式。 這是一個特別吸引人的假設，因為ΔFosB和CaMKII以前都被證明是增加對可卡因的行為反應所必需的。 (Pierce等人，1998; Peakman等人，2003），我們特別使用病毒方法在NAc殼中復制ΔFosB的這一發現（無花果4 和 and66).

儘管D1型MSN中的轉基因ΔFosB過表達可以驅動NAc殼和可卡因初生動物核心中的CaMKII誘導，但在可卡因的情況下，在兩個亞區域中發生的內源ΔFosB的積累促使CaMKII特異性地在NAc殼中誘導。 。 這種差異可能與我們的轉基因模型中誘導的ΔFosB水平較高有關，但也可能反映了可卡因差異改變殼中CaMKIIα啟動子的能力。 與 核心MSN在前者中促進ΔFosB結合或在後者子區域中排除它。 事實上，我們的ChIP數據顯示可卡因介導的僅在NAc核心中CaMKIIα基因啟動子的組蛋白去乙酰化，支持染色質機制的可能參與。 與此假設一致，D1型MSN中的ΔFosB過表達能夠在不存在可卡因的情況下驅動NAc核心中的CaMKIIα誘導（圖3F），表明在慢性可卡因暴露期間存在阻止這種誘導的CaMKIIα啟動子的活性修飾。 調節CaMKII啟動子的染色質景觀也可以解釋為什麼CaMKII是由可卡因在慢性可卡因戒斷大鼠的NAc殼中的攻擊劑量誘導的（圖1E）但不是未經藥物治療的動物（圖1D）。 這可能代表ΔFosB的表觀遺傳“基因啟動”效應（Robison和Nestler，2011），因此可能是孵化可卡因渴望的一種分子機制（皮肯斯等人，2011）。 然而，由於這種染色質變化與渴望的孵化有因果關係，它必須隨著時間的推移而增加。 確定是否是這種情況將是有趣的，並且研究其他基因是否顯示可卡因對ΔFosB依賴性，亞區域特異性調節。 值得注意的是，我們描述的前饋迴路不會導致CaMKII或ΔFosB的無限累積（圖1E）; 揭示對此負責的分子“制動”是未來研究的重要目標。

在幾個實驗系統和腦區域中ΔFosB和CaMKII的已知功能在許多水平上匯合 (圖6F）。 兩種分子都與樹突棘生長密切相關：CaMKII與肌動蛋白細胞骨架相互作用（Okamoto等人，2009），調節脊柱頭部大小（Matsuzaki等，2004，並且對於可塑性誘導的海馬器官切片培養中絲狀偽足和突觸數量的增加是必要和充分的（Jourdain等，2003），w在NAc MSNs中，ΔFosB對於可卡因誘導的樹突棘形成是必要和充分的（Maze等，2010）。 另外，兩種分子都與AMPA谷氨酸受體的調節有關。 CaMKII不調節AMPA受體亞基的總水平，但通過在培養的海馬錐體神經元中的Ser1磷酸化GluA831，驅動AMPA受體插入突觸並增加AMPA通道電導。 体内 （評論於（Malinow和Malenka，2002; Colbran和Brown，2004））。 這種增加的GluA1向突觸的運輸也與慢性可卡因作用有關（Boudreau和Wolf，2005）。 此外，通過以D1多巴胺受體依賴性方式的CaMKIIα過表達，增強了對NAc中AMPA受體活化的行為反應（Singer等，2010）。 長期D1特異性過表達ΔFosB已被證明可誘導NAc中的GluA2轉錄（Kelz等，1999），這抑制了通過GluA1介導的AMPA反應，而我們在這裡顯示短期ΔFosB過表達 - 以及短期可卡因暴露 - 對該亞基沒有影響（圖1）。 儘管如此，我們最近發現短期ΔFosB過表達降低了NAc中D1型MSN中的AMPA反應（Grueter等，2013）。 這些數據表明，時間上不同的機制可能構成對可卡因的神經適應性的時間依賴性系列，這些機制構成了成癮進展的不同方面的基礎，但尚不清楚。 在行為水平上，CaMKII和ΔFosB都是可卡因的運動致敏所必需的（見上文），並且兩者都是囓齒動物持續可卡因自我給藥所必需的（Colby等人，2003; Wang等人，2010），表明這兩種蛋白質對藥物暴露的短期和長期行為適應都很重要，儘管通過部分不同的潛在機制。 據推測，ΔFosB和CaMKII通過NAc突觸功能的變化來調節這種複雜的行為適應，儘管需要進一步的工作來直接將突觸現象與行為改變聯繫起來。

CaMKII全酶同時與多種突觸相關蛋白相互作用（Robison等，2005）它被認為可以調節其對突觸後密度（PSD）的定位，這種現像被認為對突觸可塑性很重要。 特別是，最近顯示CaMKII與NMDA型谷氨酸受體的GluN2B亞基的相互作用調節突觸可塑性和學習（Halt等，2012）。 雖然AC3I肽模擬CaMKII的自身抑制結構域，從而抑制酶催化活性，但它也阻斷了多種蛋白質 - 蛋白質相互作用（Strack等，2000; Robison等，2005）。 因此，這里報道的HSV-GFP-AC3I的行為和形態學效應可能通過減少CaMKII靶蛋白的磷酸化，CaMKII靶向的變化或CaMKII在突觸中提出的結構作用的變化而發生（Lisman等人，2002).

所提出的ΔFosB-CaMKII環對NAc殼的限制是特別值得注意的，因為最近的工作已經證明NAc殼和核心之間在可卡因給藥方面存在幾種生理差異，這一概念由我們的無偏iTRAQ（表S1）數據證實。 NAc殼中的MSN顯示持續數週的慢性可卡因後的放電容量降低，而來自相同動物的核心MSN顯示出短暫的（1-3天）放電容量增加，在2週內恢復到基礎水平（Kourrich和Thomas，2009）。 此外，許多突觸蛋白在NAc殼中受到差異調節 與 接觸慢性可卡因的動物核心，包括GluA2（Knackstedt等，2010）。 由於慢性安非他明在NAc殼中特異性誘導CaMKIIα（Loweth等，2010），我們發現與可卡因有類似的效果也就不足為奇了。 然而，由於慢性可卡因在NAc殼和核心誘導ΔFosB（Perrotti等，2008由於我們證明殼中的CaMKIIα誘導是ΔFosB依賴性的，我們的發現為這兩個亞區之間的CaMKIIα啟動子的不同轉錄機制提供了新的證據，其負責選擇性誘導殼中的CaMKIIα。

最近的大量工作都集中在描繪D1-和D2型NAc MSN之間的差異。 儘管D1和D2受體都參與了可卡因的獎賞效應 (自我，2010), 最近的研究表明，D1型MSN的光遺傳激活會增加對可卡因的行為反應，而D2型MSN激活會產生相反的效果（Lobo等，2010）。 根據這些發現，D1受體敲除小鼠缺乏可卡因自我管理的獲得（Caine等人，2007），雖然D2淘汰賽沒有 (Caine等人，2002）。 直接進入NAc的D1激動劑可以在恢復範例中觸發可卡因尋求行為（自我，2010）。 有趣的是，這種效應需要D1受體依賴性增加NAc殼中的CaMKII活性，但不是核心（Anderson等，2008），結果與這裡提出的D1和殼特定的ΔFosB-CaMKII環很好地吻合。

我們以前報導過ΔFosB中的Ser27可被酪蛋白激酶-2磷酸化（Ulery等，2006然而，我們在這裡建立的CaMKII在這個和其他位點磷酸化ΔFosB具有更大的動力學和化學計量，並且可以復制更高的表觀Mr 觀察ΔFosB（圖5A）與可卡因接觸 体内 (Nestler，2008）。 我們已經知道Ser27磷酸化增加ΔFosB的穩定性和轉錄活性（Ulery等，2006; Ulery和Nestler，2007; Ulery-Reynolds等，2009）。 今後的工作將集中於本研究所指出的ΔFosB磷酸化新位點的鑑定和功能後果。

這裡描述的前饋迴路提供了似乎合理的新機制，通過該機制，重複施用可卡因驅動NAc中的進行性異常。 因此，該生化途徑可以為將來成癮性疾病的治療干預提供重要目標。 因為CaMKII普遍存在並且需要許多基礎神經元和行為功能，所以已經避免直接使用CaMKII抑製劑作為成癮治療。 我們的數據表明，對於單個細胞類型和大腦獎賞迴路的子區域特異性的CaMKII誘導機制的更微妙的靶向可以提供避免全身性CaMKII抑制的並發症的治療靶標。

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致謝

這項工作得到了國家藥物濫用研究所（EJN），NIDA-Yale蛋白質組學中心DA018343（AJR和EJN）和哈特韋爾基金會（AJR）的資助。 作者要感謝Gabby Rundenko為純化的ΔFosB和Roger Colbran慷慨贈送純化的CaMKIIα。

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