伏隔核中DeltaFosB的過度表達模仿了保護性成癮表型，但沒有模仿環境富集的保護性抑鬱表型（2014）

PMCID：PMC4148937

抽象

環境富集在大鼠中產生保護性成癮和抑鬱表型。 ΔFosB是一種調節大腦獎賞的轉錄因子，由心理壓力和濫用藥物誘導。 然而，ΔFosB在環境富集的保護性表型中所起的作用尚未得到很好的研究。 在這裡，我們證明ΔFosB在分離條件（IC）飼養的大鼠中與富集條件（EC）中響應束縛應激或可卡因的大鼠相比受到差異調節。

慢性應激或慢性可卡因治療均提高了IC大鼠伏隔核（NAc）中的ΔFosB蛋白水平，但由於在EC條件下已經觀察到ΔFosB的基礎積累已經升高，因此不會提高EC大鼠的ΔFosB蛋白水平.

病毒介導的ΔFosB在配對大鼠的NAc殼中的過表達（即，獨立於環境富集/分離）增加了在飢餓驅動下對蔗糖的操作響應，但在飽食動物中降低了響應。 此外，ΔFosB過表達減少可卡因自我給藥，增加可卡因尋求的消退，並減少可卡因誘導的靜脈注射可卡因自我給藥的恢復; 所有行為發現均與富集表型一致.

然而，相反，在幾種焦慮和抑鬱相關行為的測試中，ΔFosB過表達並未改變配對大鼠的反應。

因此，ΔFosB在 NAc shell模仿 保護性成癮表型，而不是環境富集的保護性抑鬱表型。

關鍵詞： [增量]FosB，環境富集，抑鬱症，可卡因自我管理，腺相關病毒（AAV），過度表達

引言

生活經歷，特別是在生命的早期階段，對整個生命中的動物行為產生深遠的影響。 環境在人類的脆弱性和對精神障礙的抵抗中起著至關重要的作用（Elisei等， 2013; Akdeniz等人， 2014; 加藤和岩本， 2014; van Winkel等人， 2014). 在囓齒動物模型中，據報導，從斷奶到成年期的年輕人生活在一個豐富的環境中會產生保護性成癮和抑鬱表型 （格林等人， 2002, 2003, 2010; 拉維奧拉等人， 2008; Solinas等人， 2008, 2009; El Rawas等人， 2009; Thiel等人， 2009, 2010）。 在這種範例中，動物被分配到富集條件（EC），其中動物被分組飼養並且每天可以獲得新物體，或者分離動物被單獨飼養而沒有新奇或社交接觸的孤立條件（IC）。 在富含條件下飼養的動物，包括社會接觸，運動和新奇，在靜脈注射藥物自我管理範例中表現出較少的強化和尋求可卡因或安非他明 （格林等人， 2002, 2010). 除了成癮表型之外，這種暴露於富集在抑鬱症的動物模型中產生抗抑鬱樣作用 （格林等人， 2010; Jha等人， 2011）。 具體而言，富集動物在蔗糖偏好測試中表現出減少的快感缺乏樣行為，在社交相互作用測試中減少社交退縮，並且在強迫游泳測試（FST）中表現出較少的不動性。 儘管富集具有抗成癮和抗抑鬱作用，但這些保護環境富集表型的機制仍未得到充分了解，儘管我們之前的研究已經暗示轉錄因子CREB在伏核中的活性降低（NAc）。 ）調解環境富集的一些影響 （格林等人， 2010; Larson等人， 2011）。 因此，這些差別飼養研究的目標是使用基礎科學方法來確定彈性的分子機制，以後可以將其轉化為臨床。 這種方法在環境上等同於完善的遺傳策略，如選擇性育種（McBride等， 2014).

在這裡，我們關注另一種轉錄因子ΔFosB，它通過某些形式的應激或幾乎所有濫用藥物（包括可卡因，嗎啡，酒精，尼古丁和安非他明）在NAc中顯著誘導（Hope等， 1992; Kelz和Nestler， 2000; Perrotti等人， 2004, 2008）。 作為轉錄因子，ΔFosB與Jun家族蛋白（優選JunD）二聚化，形成活性AP-1複合物，其與AP-1反應元件結合以增強或抑制其靶基因的轉錄（Nestler， 2001雖然新的研究表明ΔFosB也可以作為同型二聚體（Wang等， 2012）。 ΔFosB蛋白是截短的剪接方差 FOSB 基因，導致ΔFosB蛋白缺乏兩個C末端degron結構域，阻止ΔFosB蛋白快速降解FosB和所有其他Fos家族蛋白。 因為ΔFosB在NAc中非常穩定，所以與其他Fos蛋白相比，ΔFosB對急性與慢性刺激的反應的作用非常不同。 隨著反复暴露於濫用或應激的藥物，ΔFosB蛋白逐漸積累並持續數天至數週，而FosB和其他Fos蛋白僅在短時間內（小時）被誘導並在隨後暴露時產生減毒誘導（Nestler等， 2001; 內斯特勒， 2008).

ΔFosB的重要性不僅在於它被濫用和壓力的藥物高度誘導，而且已經證明對大腦中ΔFosB的操縱會影響動物的行為。 在成年小鼠的強啡肽中型刺狀神經元中選擇性誘導ΔFosB可增加對急性和重複可卡因的反應的運動敏感性，以及在條件性位置偏好範例中對可卡因的有益響應以及自我管理範例中的強化 （Kelz等人， 1999; Kelz和Nestler， 2000; Colby等人， 2003).

儘管已經對環境富集的大鼠詳細描述了保護性成癮和抑鬱表型，但ΔFosB在介導這些保護性表型中的可能作用尚未得到充分評估。 先前對環境富集的研究表明，與標準環境（SE）相比，富集環境增加小鼠紋狀體區D1和D2中型多刺神經元的基礎ΔFosB水平。 （Solinas等， 2009; Lobo等人， 2013). 此外，與SE大鼠相比，富集的Wistar大鼠在NAc和前額葉皮質中顯示ΔFosB陽性細胞升高，提示ΔFosB可能在尼古丁的保護性成癮表型中起作用。 （Venebra-Muñoz等人， 2014). 此外，在整個小鼠紋狀體中過度表達ΔFosB會增加每日輪的運行，這可能類似於富集環境中大鼠活動的增加。 （Werme等， 2002).

在目前的研究中，我們假設：（1）環境富集會增加NAc中基礎ΔFosB水平的積累; 和（2）ΔFosB的這種積累將有助於環境富集的保護作用。

材料和方法

動物

為了環境富集，將雄性Sprague-Dawley大鼠（Harlan，Houston，TX，USA）從出生後第21天至51隨機分配至EC或IC殼。 將EC大鼠分組飼養（每籠20）在大型金屬籠（70×70×70 cm）中，其具有幾個硬塑料物體（兒童玩具，塑料容器，PVC管等）。 這些對像被新對象替換，並且每天重新排列成新的配置。 將IC大鼠單獨圈養在標準聚碳酸酯籠中。 在整個實驗期間大鼠保持在這些條件下，並且在51天齡之後（即，至少30天的富集/分離）開始所有行為測試和生化測試。 對於ΔFosB的過表達，獲得雄性Sprague-Dawley大鼠（Harlan，Houston，TX，USA），大小為225-250 g，並且在用立體定向注射腺相關病毒載體（AAV2）之前配對飼養在標準聚碳酸酯籠中。用綠色熒光蛋白（GFP）過表達ΔFosB或僅用GFP作為對照（見下文）。 除行為測試和食物調節外，所有大鼠均可自由獲得標準大鼠食物和水。 在實驗動物護理評估和認可協會（AAALAC）批准的菌落中，將所有大鼠維持在受控環境（溫度，22°C;相對濕度，50％;和12 h光/暗循環，在600 h上點亮）中。 。 所有實驗均符合NIH實驗動物護理和使用指南以及德克薩斯大學醫學分會機構動物護理和使用委員會。

環境豐富是一種複合操縱，包括新奇，社會接觸和鍛煉。 配對住房提供社交聯繫，因此代表EC（參見NIH指南）。 因此，對於具有新穎性，社交接觸和鍛煉的病症的適當對照組將是沒有新穎性，社交接觸或鍛煉的組，IC條件。 IC大鼠顯示出比EC大鼠更少的慢性應激跡象。 具體而言，EC大鼠腎上腺增大（Mlynarik等， 2004），CORT反應遲鈍（Stairs et al。， 2011），減弱立即早期基因誘導（Zhang等，準備中的手稿）和ΔFosB積累（Solinas等， 2009; Lobo等人， 2013），所有慢性壓力的跡象（Crofton等，綜述）。

心理壓力

將富集和分離的大鼠置於60分鐘的1分鐘的一次性軟塑料囓齒動物抑製劑（DecapiCone，Braintree Scientific Inc.，MA，USA）中9天（急性）或30天（重複）。 對於短期暴露mRNA測試，在最後一段約束應激開始後，將5大鼠（每組30大鼠）斷頭12 min，提取大鼠腦並解剖NAc用於mRNA分析。 對於免疫組織化學，用鹽水和4％多聚甲醛灌注4大鼠，提取腦，在20％多聚甲醛中後固定，並在1xPBS中以4℃儲存在40％甘油中。 用冷凍切片機以24μm切割大鼠腦。 在最終應激後收穫腦XNUMX h以使全長FosB蛋白降解（Perrotti等， 2008).

靜脈注射可卡因自我管理與環境富集

靜脈導管植入

使用氯胺酮（100 mg / kg IP）和甲苯噻嗪（10 mg / kg IP）麻醉大鼠，並插入Silastic導管並固定在頸靜脈中，離開動物背部的皮膚。 每天導管注入0.1 ml含有肝素（30.0 U / ml），青黴素G鉀（250,000 U / ml）和鏈激酶（8000 IU / ml）的無菌鹽水溶液，以防止感染並在整個持續時間內保持導管通暢。實驗。

可卡因自我管理與環境豐富

將20只富集的和20分離的大鼠置於操作室30×24×21 cm（Med-Associates，St。Albans，VT）中，並允許按壓槓桿輸注可卡因（0.5 mg / kg /輸注，NIDA藥物供應，美國北卡羅來納州研究三角研究所（National Triangle Institute，NC，USA）或生理鹽水，固定比率為1（FR1），每天2 h，總共14天。 為了維持EC和IC組之間相似的可卡因攝入量，每次會話最多輸注30。 組織處理能力僅限於30樣本，因此來自每組的最低響應大鼠未進行處理，留下8的Ns用於可卡因，7用於鹽水組。 因此，EC和IC大鼠之間的總可卡因攝入量或輸注時間沒有EC / IC差異。 在最後一次自我給藥期開始後，將大鼠腦提取3 h，並解剖NAc用於mRNA和蛋白質分析。 NAc的一側用於Western印跡，另一側用於qPCR。

非特遣隊可卡因管理與環境濃縮

與以前發表的文獻直接比較（Hope et al。， 1994; 陳等人， 1995），EC（N = 12）和IC大鼠（N 對於12天（急性）或20天（重複），腹膜內（IP）注射生理鹽水或1 mg / kg可卡因= 9）。 在處理過程中丟失了一個EC樣本。 急性組在8天接受鹽水注射和在9天注射一次可卡因，以便所有大鼠接受相同數量的注射。 在最後一次注射後腦中提取30 min並解剖NAc用於mRNA分析。

使用qPCR定量mRNA

通過在RNA STAT-60（Teltest，Friendswood，TX）中勻漿提取RNA，使用氯仿從DNA和蛋白質中分離RNA，並用異丙醇沉澱總RNA。 除去污染的DNA（TURBO DNA-Free，Life Technologies，CA，USA），將純化的RNA的5 ug逆轉錄成cDNA（SuperScript III First Strand Synthesis：Invitrogen目錄號#18080051）。 使用定量實時PCR（SYBR Green：Applied Biosystems，Foster City，CA）在Applied Biosystems 7500快速熱循環儀上定量ΔFosBmRNA，其中引物設計為僅檢測ΔFosB（正向：AGGCAGAGCTGGAGTCGGAGAT;反向：GCCGAGGACTTGAACTTCACTCG）並歸一化至設計的引物。檢測大鼠GAPDH（正向：AACGACCCCTTCATTGAC;反向：TCCACGACATACTCAGCAC）。 在實驗之前驗證所有引物並分析其特異性和線性（Alibhai等， 2007).

蛋白質印跡

將來自可卡因或鹽水自我給藥的EC和IC大鼠的NAc的右側在含有蔗糖，Hepes緩衝液，氟化鈉，10％SDS和蛋白酶和磷酸酶抑製劑的緩衝液中均質化（Sigma-Aldrich：P-8340，P） -2850，P-5726）。 使用Pierce BCA Protein Assay Kit（Thermo Scientific，IL，USA）評估蛋白質濃度。 因為從一隻大鼠提取的蛋白質不足以進行分析，所以將來自相同組的2樣品合併在一起，產生每組的4樣品。 將蛋白質樣品在95°下變性5 min並在10-20％聚丙烯酰胺梯度凝膠（Criterion TGX，Bio-Rad Laboratories，CA，USA）上運行，然後轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，MA，USA）。 ）。 用印跡級阻斷劑（脫脂奶粉）封閉膜，與ΔFosB一抗（兔，1：1000，＃2251，Cell Signaling Technology，MA，USA）和β-肌動蛋白一抗（小鼠，1：1000）一起孵育。 ，Cell Signaling Technology，MA，USA），用TBST洗滌，然後與熒光二抗（驢抗兔（780 nm），驢抗小鼠（680 nm），1：15000，Li-Cor Biosciences，NE一起孵育，美國）。 然後對Western印跡進行成像（Odyssey，Li-Cor Biosciences，NE，USA），並用Odyssey軟件定量蛋白質水平。

免疫組化

對於圖 Figure11 (N = 3），觀察含有ΔFosB的細胞，並通過用DAB（DAB過氧化物酶底物試劑盒，Vector Laboratories，CA，USA）染色的NAc切片中的ΔFosB的免疫組織化學標記計數。 提取大腦，固定後，冷凍保護並在滑動冷凍切片機（Leica Biosystems，IL，USA）上切片成含有NAc的40μm切片。 在用1％正常山羊血清（Jackson ImmunoResearch，PA，USA）用3％triton和抗生物素蛋白D（Vector Laboratories，CA，USA）封閉之前，切片保持漂浮並用內源過氧化物酶猝滅之前用0.3xPBS漂洗。 將NAc切片與FosB一抗孵育過夜（1：1000，Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX，USA），其具有3％山羊血清，0.3％triton，1xPBS和生物素溶液（Vector Laboratories，CA，USA）。 儘管該抗體同時識別FosB和ΔFosB，但先前的Western印跡研究表明，在刺激後的24 h，絕大多數免疫組化信號由ΔFosB組成，因為FosB在24 h之前很好地降解（Perrotti等， 2008）。 洗滌後，將切片與生物素化的山羊抗兔二抗IgG（Vector Laboratories，CA，USA），山羊血清和1xPBS一起溫育。 然後，將切片與抗生物素蛋白 - 生物素複合物（ABC）過氧化物酶染色劑一起孵育15 min（Thermo Scientific，IL，USA）。 最後，安裝切片，使用乙醇和CitriSolv（Fischer Scientific，MA，USA）脫水，並用DPX（Fisher Scientific）蓋上蓋玻片。 對於細胞計數，從每隻動物的Bregma + 1.80至+ 1.44取樣切片。 從每隻大鼠的核心和殼的四個NAc切片計數ΔFosB免疫陽性細胞的總數。

圖1  

壓力和 [增量]EC和IC大鼠的FosB。 （廣告） 代表性免疫組織化學DAB染色的ΔFosB在NAc殼和IC的核心（A 以及 B）和EC（C 以及 D）老鼠（B 以及 D）和沒有（A 以及 C）重複壓力（N 3）。 （E） 定量 ...

腺病毒相關病毒過度表達 [增量]FOSB

基於AAV2的載體，表達ΔFosB和人源化海腎GFP（hrGFP; Winstanley等， 2007, 2009a,b）或hrGFP控制載體（N 每隻10 =雙側注射到大鼠NAc中。 由於沒有IC人類，因此通過證明ΔFosB的作用，使用配對飼養的大鼠代替IC大鼠進行本研究以增加與科學界的相關性 獨立 EC / IC範例。 表達hrGFP但不過表達ΔFosB的AAV用作對照。 ΔFosB的表達 体内 通過用FosB一抗（1：200，Rabbit，Cell Signaling Technology，MA，USA）進行免疫熒光染色來驗證。 使用坐標將AAV載體雙側注射到NAc殼中（1μl/側超過10 min）（AP = 1.7， L = 2.0， D = -6.5）。 在立體定向手術後數週，行為測試開始了3。 在行為測試結束後，通過免疫組織化學確定準確放置。

蔗糖新恐怖症

ΔFosB過表達大鼠（N = 10）和對照大鼠（N = 8）在行為測試開始前一周處理1。 為了測試焦慮樣行為，評估大鼠的新恐怖症至新味（蔗糖）。 將大鼠分成單獨的籠子，並在1600 h下除去水。 在大鼠的正常“自來水”水中用標準大鼠水瓶裝填1％w / v蔗糖溶液並稱重，然後在1800 h下放置在每個籠子上。 在30分鐘後，取出瓶子並重新稱重，併計算試驗前後蔗糖瓶重量的差異。 然後，在籠子上更換蔗糖另外的2天，以使大鼠在蔗糖偏好測試之前熟悉蔗糖的風味。

高架加迷宮

在蔗糖新恐怖症後2天測試了焦慮樣行為的另一個測試，即高架十字迷宮（EPM）。 EPM在一個新穎和焦慮的環境中測量載體修飾的探索行為（Green等， 2008）。 測量12×50 cm的兩個閉合臂和兩個開放臂（Med Associates Inc.，VT，USA）在地板上方75 cm並且在每個臂的入口處具有光束。 使用Med-PC軟件通過光束破裂監測在開放臂上花費的時間為5 min。

冷應激引起的排便

在EPM後的第二天，使用了第三次焦慮測試：對輕度壓力環境（冷）的排便。 將聚碳酸酯小鼠籠（33×17×13 cm）在冰上預冷卻10 min。 將大鼠置於冰上的籠中30 min，並且每5 min記錄糞便boli的數量。

社交聯繫

在第二天，使用社交互動測試測量抑鬱樣行為。 在測試之前將大鼠分離24 h。 在測試當天，將大鼠置於具有其籠子配偶的新環境（塑料容器，45×40×45 cm）中，並且行為被記錄為30 min的視頻。 由對大鼠狀況無視的研究者測量這對大鼠彼此相互梳理的時間量。

蔗糖偏好

在社交接觸後，蔗糖偏好測試被用作快感缺乏的模型。 配對飼養的大鼠在1600小時與食物分離但不允許在2 h下接觸水。 在1800 h，將兩個預先稱重的水瓶放在每個籠子上，一個裝有水，另一個裝有1％蔗糖水溶液。 將水瓶置於正常位置，同時將蔗糖放置在大約10 cm處。 取出瓶子並在15分鐘後重新稱重。

運動活動

在蔗糖偏好後三天，通過將大鼠置於透明的有機玻璃室（40×40×40 cm）中，用一層薄層床墊，在兩個4×4光束基質周圍放置一個4 cm，在正常光照條件下評估自發活動。地面和地面上方一個16厘米記錄水平行走和垂直（飼養）活動。 通過改進的開放場活動系統（San Diego Instruments，CA，USA）監測光束斷裂的2 h。

強迫游泳測試

最後一次自發行為測試是FST，一種對抗抑鬱藥敏感的模型。 將大鼠置於填充有約14 L室溫（24±0.5°）水的Plexiglas圓筒中，在會話15上1 min，並在第二天在5會話上2 min。 將大鼠乾燥並放回其家籠中。 記錄游泳活動並且由不知道條件的研究者確定會話1的第一個不動期（2 s）和總時間不動的潛伏期。

蔗糖操作反應

對照AAV大鼠和ΔFosB過表達大鼠在85天內調節至自由進食體重的7％。 所有大鼠在1連續幾天的FRNNUMX強化訓練計劃中訓練以壓制蔗糖顆粒（Bio-Serv，NJ，USA）。 然後在15天給大鼠自由獲取食物，並再次以FR5方案對3分鐘進行棒壓製備蔗糖顆粒，這次是1％游離飼料重量。

可卡因自我管理

獲得

導管手術後一周（如上所述），將所有大鼠（7對照大鼠和10ΔFosB過表達大鼠，一隻對照大鼠從導管手術中丟失）置於操作室30×24×21 cm（Med-Associates，St。 Albans，VT）並允許在0.2天內每次2 h自行施用4 mg / kg /輸注單位劑量的可卡因; 然後按照FR0.5計劃，3 mg / kg /輸注1天。 每次輸注通過0.01以5.8 ml的體積靜脈內遞送。 通過照射20的兩個提示燈發出輸液信號，這標誌著超時時間，在此期間不能再進行輸注。

消

因為慢性可卡因暴露可能會誘導對照大鼠ΔFosB的積累，這會導致兩種載體條件下的大鼠在腦中都具有高水平的ΔFosB，大鼠被限制在其家籠中4天而沒有自我給藥以允許ΔFosB蛋白水平在對照載體大鼠中降低。 在4天禁慾後，將大鼠置於操作室中並允許在FR1方案下自行給予鹽水而不是可卡因，連續1天3時間。

固定比例劑量反應

允許每隻大鼠（對照和ΔFosB過表達）每天以FR0.00325方案以遞增的順序自我施用0.0075，0.015，0.03，0.06，0.125，0.25，0.5，1mg / kg /輸注可卡因，連續5天。 大鼠自我給予每劑可卡因30分鐘。

可卡因誘導的複原

大鼠經歷了會話內恢復程序。 大鼠在FR0.5方案中接受1 mg / kg /輸注60 min，然後消除3 h（具有可能的可卡因提示）。 接下來他們接受了IP注射（Green等， 2010）對於每隻大鼠的0恢復期，隨機順序的五種劑量之一（2.5，5，10，20或5 mg / kg）的可卡因。 會議的最後一個3 h階段是恢復響應，再次使用可卡因提示，但仍然沒有可卡因輸注。 在每次可卡因誘導的恢復期後，大鼠在FR2時間表上接受0.5干預天數的高劑量（1 mg / kg /輸注）可卡因，用於2 h，以維持跨療程的高響應率。 在可卡因自我管理過程中，一些大鼠的導管逐漸失去通暢; 因此，在該分析中使用6對照大鼠和7ΔFosB過表達大鼠的數據。

統計分析

進行雙向方差分析（ANOVA）和雙向重複測量方差分析以比較四個治療組，並使用計劃的比較來比較條件之間的差異。 使用學生分析僅兩個條件之間的顯著性 t-測試。 所有 t測試數據通過了Shapiro-Wilk的常態測試。 所有數據均表示為平均值±SEM。 統計顯著性設定為 p <0.05。 所有用於單個實驗的富集大鼠都被關在一個籠子裡，但被當作單獨的對像對待，這暗示了潛在的假複製問題。

成績

EC大鼠顯示出更高的基礎水平 [增量]NAc中的FosB比IC大鼠

與IC大鼠相比，EC大鼠在NAc核心中具有顯著更高數量的ΔFosB陽性細胞（t(4) = -3.31， p <0.05）和外殼 (t(4) = -6.84， p <0.05）（數字 1A，C，E，F), 表明與IC大鼠相比，EC大鼠的ΔFosB基礎音高。 此外，Western印跡結果顯示，與IC鹽水大鼠相比，NAc中具有更高基礎水平的ΔFosB蛋白的EC鹽水大鼠具有強烈趨勢（t(6) = -2.03， p = 0.089; 數字 Figure2A）2A）使用雙尾測試。 然而，鑑於圖中表達的增加 1A-F 和其他論文中的增加（Solinas等， 2009），我們對此有信心。 Western印跡結果也證實，通過免疫組織化學檢測的幾乎所有FosB樣免疫反應性都是ΔFosB而不是FosB，這在24 h時是不可檢測的。

圖2  

可卡因和 [增量]EC和IC大鼠的FosB。 （A-B） 平均ΔFosB蛋白 （A） 和mRNA （B） IC和EC大鼠在生理鹽水或可卡因自我給藥14天后的NAc水平（±SEM）（N = 7-8）。 面板a中的紅色條帶錶示 ...

[增量]通過應激在EC和IC大鼠中差異誘導FosB

兩種殼體中重複的束縛應力具有顯著的主要影響（F（1，8） = 16.6， P <0.005）和核心（F（1，8） = 7.9， P <0.05）的NAc和殼中環境富集的主要作用（F（1，8） = 22.3， P <0.005; 數字 1A-F）。 更重要的是，應力和環境富集之間的相互作用在兩個殼中也是顯著的（F（1，8） = 25.6， P <0.01）和核心（F（1，8） = 6.7， P <0.05）。 這種相互作用使得在反复施加約束壓力後，IC大鼠的ΔFosB陽性細胞數量顯著增加，而在反复應力後的EC大鼠中，該數量沒有變化。

為了進一步研究ΔFosB如何通過急性與重複應激動態調節，並與之前的研究進行比較（Alibhai等， 2007），誘導ΔFosB 基因 研究了急性和反复的束縛應激（圖 （Figure1G）.1G）。 壓力有顯著的主要影響（F（2，24） = 31.9， P <0.001）和環境富集（F（1，24） = 5.1， P <0.05）。 在IC大鼠中，急性束縛應激後強烈誘導了ΔFosBmRNA。 然而，在反复的壓力下，與急性誘導相比，ΔFosBmRNA的誘導顯著減弱。 也有重大的互動（F（2，24） = 4.6， P <0.05），表明與IC大鼠相比，EC大鼠的ΔFosBmRNA急性誘導程度更低。 因此，EC大鼠具有較高的ΔFosB基礎水平 蛋白質 在NAc中，但ΔFosB較少 基因 誘導響應急性應激源。

[增量]在EC和IC大鼠的NAc中，可卡因差異誘導FosB

為了確定EC和IC大鼠對可卡因的反應是否不同，我們研究了可卡因自我給藥後大鼠NAc中ΔFosB蛋白和mRNA的調節（圖 2A，B 分別）。 Western blot顯示可卡因具有顯著的主要作用（F（1，12） = 24.9， P <0.001）和顯著的相互作用（F(1,12) = 5.5， P <0.05）。 相互作用使得IC大鼠的ΔFosB增加幅度大於EC大鼠（圖 （Figure2A）.2A). 事實上，可卡因自我給藥後ΔFosB蛋白水平顯著升高 僅由 在IC大鼠中。 關於mRNA水平，qPCR結果也顯示可卡因的顯著主要作用（F（1，26） = 47.1， P <0.001）和環境富集的主要作用（F（1，26） = 13.8， P <0.005）。 儘管EC大鼠的總體水平較低，但兩組均增加了ΔFosBmRNA（圖 （Figure2B2B).

儘管蛋白質數據支持最初的假設，但它是從圖中假設的 Figure1G1G EC老鼠表現得更少 基因 誘導比上述可卡因實驗中的分離大鼠，這沒有發生，可能是因為圖 Figure1G1G 利用30最小時間點，可卡因實驗使用3 h時間點。 為了進一步詢問mRNA假說，30最小時間點用於探索急性和重複可卡因治療，作為與圖的更好比較 Figure1G.1G。 因為急性可卡因自我給藥本質上是有問題的（即，獲得性學習），EC和IC大鼠被給予重複的非偶然可卡因IP注射的急性或9天（20 mg / kg）。 正如假設的那樣，環境富集具有顯著的主要影響（F（1，17） = 14.3， P <0.005），但可卡因治療的主要作用（F（2，17） = 3.4， P = 0.057）和互動（F（2，17） = 3.4， P = 0.055）僅通過雙尾測試顯示出強勁的趨勢。 但是，鑑於我們有圖中的方向假設 Figure1G，1G我們認為EC大鼠比IC大鼠表現出更少的誘導，我們感到非常舒服（圖 （Figure2C2C).

過度表達 [增量]NAc殼中的FosB模擬保護性富集誘導的成癮表型

為了研究ΔFosB對大鼠行為的影響而不依賴於環境富集/分離（即，使這些結果與非EC / IC研究更相關），使用腺相關病毒（AAV）在NAc中雙側過表達ΔFosB。非富集的雙圈大鼠。 根據我們之前的研究，NAc殼對控制抑鬱症和藥物攝取/尋找行為最敏感，因此在本研究中將AAV載體注射到NAc殼中（Green等， 2006, 2008, 2010）。 數據 3A，B 圖1顯示了ΔFosB的代表性免疫組織熒光，其中對照載體（圖A;即內源ΔFosB表達）和NAc殼中的ΔFosB過表達載體（圖B）。

圖3  

過度表達 [增量]NAc殼中的FosB模擬環境富集的保護性成癮表型。 （A-B） 用於hrGFP對照的ΔFosB的代表性免疫組織化學 （A） 和ΔFosB-過表達 （B） AAV矢量。 ...

驗證滴度後， 体内 表達和病毒載體的一般放置，我們首先研究了ΔFosB在焦慮模型中的過表達的影響。 NAc殼中ΔFosB的過度表達不足以再現蔗糖新恐怖症和冷應激誘導的排便範例中環境富集的致焦慮作用。 （數據未顯示）。 另外，對EPM沒有影響（數據未顯示）。 因為環境富集在大鼠中產生抗抑鬱樣作用，我們接下來對ΔFosB過表達的大鼠進行抑鬱相關測試。 與焦慮模型類似，結果顯示在蔗糖偏好測試，社會交互測試或​​FST中過量表達NAc殼中的ΔFosB不足以減少抑鬱樣行為。 （數據未顯示）。

在環境富集範例中，EC大鼠表現出比IC大鼠更低的基礎運動活性（Bowling等， 1993; 保齡球和巴爾多， 1994; 史密斯等人， 1997; 格林等人， 2003, 2010）。 為了研究過表達ΔFosB在NAc殼中的作用，測試了120 min的自發運動活性。 使用雙尾檢驗結果顯示NAc殼中過量表達ΔFosB導致大鼠基礎運動活性降低的強烈趨勢（圖 （Figure3C; 3C; t(16) = 1.84， p = 0.084）。 儘管雙尾檢驗不具有統計學意義，但這些數據仍然很有趣，因為它們符合我們基於Green等人的明確定向假設。 （2010），這與環境濃縮的效果是一致的。

I與抑鬱和焦慮模型相反，NAc殼中ΔFosB的過表達能夠在多種成癮/強化範例中產生類似EC的表型。 一世在蔗糖顆粒操作自我試驗中，ΔFosB過表達與大鼠飢餓動機之間存在顯著的相互作用（F（1，16） = 7.4， P <0.01）。 在NAc殼中過表達ΔFosB的大鼠明顯攝取 更多 蔗糖顆粒在飢餓動機條件下（即85％游離飼料體重），但在低動力條件下顆粒較少（即100％游離飼料重量;圖 Figure3D），3D），完全模仿EC表型（Green等， 2010).

在環境富集範例中，EC大鼠在消退和可卡因誘導的恢復中表現出減少的可卡因尋求行為 （格林等人， 2010). 因此，使用靜脈內可卡因自我給藥範例在表達ΔFosB的大鼠中測量可卡因攝取和尋求行為。 作為一種渴望的模型，可卡因滅絕範例揭示了NAc殼中ΔFosB的過度表達減少了尋求藥物的行為r（F（1，15） = 6.7， P <0.05； 數字 Figure3E）.3E）。 會話也有重要的主要影響（F（2，30） = 74.0， P <0.001）。 對於根據FR1時間表進行的維護響應，劑量有很大的主要影響（F（7，105） = 222.6， P <0.001）和顯著的相互作用（F（7，105） = 2.3， P <0.05）的可卡因累積攝入量。 相互作用的性質是，僅在較高劑量的可卡因下差異才明顯（圖 （Figure3F）.3F）。 最後，在可卡因誘導的恢復中，劑量有顯著的主要影響（F（4，44） = 15.5， P <0.001）和使用雙尾檢驗（ΔFosB過表達的主要效應的趨勢）（F（1，11） = 4.1， P = 0.067）。 然而，考慮到Green等人的定向假設。 （2010）和圖中統計上顯著和一致的結果 3D，E，F，ΔFosB可能會減少恢復（圖 （Figure3G）.3G）。 對於表達ΔFosB的大鼠，10 mg / kg劑量的響應顯著較低。 結果總體上表明，大鼠NAc殼中過量表達ΔFosB會降低可卡因攝取和尋找行為，這與環境富集的行為影響一致。

討論區

個人對成癮和抑鬱的脆弱性受到環境因素的嚴重影響。 環境富集是一種操縱動物生存環境的範例，對許多精神疾病產生保護作用。 ΔFosB在調節多個腦區的獎賞功能中起關鍵作用，包括NAc和背側紋狀體（Koob等， 1998; 明智的， 1998; 華萊士等人， 2008; Grueter等人， 2013; Pitchers等人， 2013). 在這個項目中，我們研究了富集和分離大鼠中約束應激和可卡因對ΔFosB的動態調節。 該項目的主要發現是:

(與IC大鼠相比，1）EC大鼠在基線時NAc中具有升高的ΔFosB水平;

（2）只有IC大鼠在重複應激下積累額外的ΔFosB蛋白;

（3）EC大鼠在應激或可卡因後顯示ΔFosBmRNA的減弱誘導; 和

（4）在對大鼠的NAc中過表達ΔFosB模擬保護性成癮表型，但不模仿保護性抑鬱表型。

人們可能對已發表的文獻有所期待，這些文獻表明轉基因ΔFosB過表達小鼠對低劑量藥物的可卡因獎勵和自我給藥的敏感性增加（Kelz等人， 1999; Colby等人， 2003; Vialou等人， 2010; Robison等人， 2013), 在當前實驗中ΔFosB過表達的大鼠將顯示出增加的可卡因自我施用和尋求的傾向。 I然而，在目前的實驗中，在NAc殼中過量表達ΔFosB減少了在消退和恢復期間可卡因的攝入和可卡因尋求，表明可卡因的動機減少。 差異可能是由於轉基因小鼠在整個紋狀體中表達ΔFosB，但僅在強啡肽+細胞中表達。 （Colby等， 2003). 在目前的實驗中，ΔFosB通過AAV載體過表達，該載體感染強啡肽+和腦啡肽+神經元。 其次，目前的研究主要集中在NAc殼而不是整個紋狀體區域。

除了成癮表型外，環境富集還在大鼠中產生抗抑鬱和致焦慮樣的特徵 （格林等人， 2010; Vialou等人， 2010). 在目前的研究中，NAc中ΔFosB的過度表達未能在三次抑鬱或三次焦慮測試中產生任何效果。 雖然有許多可能的因素可能導致ΔFosB模仿富集成癮但不影響抑鬱表型，但NAc殼可能更適合成癮相關行為，而抑鬱相關行為可能由其他地區更強有力地介導。 目前的研究結果與研究結果不一致 小鼠 其中ΔFosB在NAc中的過表達（無法可靠地區分殼與核心）在幾種行為測定中產生強烈的抗抑鬱樣作用（Vialou等， 2010). 一個可能的原因是，可能更容易看到ΔFosB對嚴重壓力行為模型（如社交失敗壓力）的影響。 目前的過度表達研究調查了在沒有嚴重壓力源的情況下的抑鬱樣行為。

在整個研究中始終如一地，ΔFosB的高基礎水平（例如，來自富集，重複應激或可卡因）與隨後誘導的ΔFosB相關。 這可能代表天花板效應，在蛋白質的基礎水平升高的基礎上不可能進一步誘導。 在應激或可卡因作為負反饋環之後，ΔFosB的累積水平可能反饋以抑制ΔFosBmRNA的進一步誘導。 例如， EC大鼠具有高水平的ΔFosB並且在應激或可卡因後顯示出ΔFosB的誘導減弱。 這強調了ΔFosB蛋白水平與其mRNA誘導之間的負相關性。 累積ΔFosB的負反饋也是IC大鼠反复應激時ΔFosB的減弱誘導的原因。

需要明確的是，我們並未聲稱環境豐富範式具有直接的轉化相關性，因為在真正的貧困中養育的兒童很少（應該指出的是，社會經濟剝奪並不等同於環境剝奪）。 這種範例的實用性在於它是一種非藥物，非手術，非遺傳操作，可產生成癮和抑鬱的保護性行為表型，可在實驗室控制的環境中利用，作為識別分子機制的基本科學工具。對精神疾病的潛在抵禦能力。 之前的研究已經詳細描述了行為表型（Bowling et al。， 1993; 保齡球和巴爾多， 1994; Bardo等人， 1995; 格林等人， 2002, 2003; El Rawas等人， 2009）和最近的研究（Solinas等， 2009; 格林等人， 2010; Lobo等人， 2013），與目前的研究一起，提供了關於這些行為表型的轉錄機制的線索。 目前正在研究產生保護性表型的下游轉錄靶基因/蛋白質（Fan等， 2013a,b; Lichti等人， 2014).

我們對環境富集的概念化認為，濃縮是低端隔離和高端充分富集的連續體。 “在這種情況下，充分“豐富”被定義為一個環境，​​在這種環境中，受試者接觸到具有新鮮感，無威脅的社會接觸，並且允許空間和物體進行鍛煉。 T這三個因素都代表了“濃縮”的複合條件，因為它們都是有益的，並且每個都在NAc釋放多巴胺，因此激活了一個共同的神經生物學電路 （Louilot等， 1986; Calcagnetti和Schechter， 1992; 克勞德和胡托， 1992; Rebec等人， 1997; Bevins等人， 2002）。 在這種概念化中，隔離被認為是對照組，因為它代表缺乏操作（即富集; Crofton等，在評論中）。 但是，其他概念化也是可能的。 在一個替代概念中，連續體是相同的，但隔離組是實驗組，而富集組是對照。 一世在這個模型中，剝奪了受試者正常的充實 is 實際的操縱。 I在這種情況下，人們會說隔離賦予易感性，而不是說濃縮是保護性的。 還有第三種概念化假定沒有連續統一體，而富集和孤立是兩種根本不同的操縱。 在這種觀點中，應該分離富集和隔離，並將其與成對的對照進行比較。 缺乏關於濃縮性質的普遍共識代表了範式的局限性，但為未來的研究提供了方向。 無論如何，無論後續解釋如何，這些實驗的結果都是堅定的。

環境和生活經歷對許多精神疾病的發展和表達有很大影響。 了解環境富集的保護性成癮和抑鬱表型的機制解決了精神障礙研究中的一個基本問題 - 即環境對易感性或對精神病症的恢復能力的貢獻。 該研究強調了ΔFosB在調節成癮相關行為中的重要性。 在未來的研究中，需要在環境富集模型中進一步探索ΔFosB的作用及其對特定靶基因的激活和抑製作用。

資金和披露

張亞芳，沒有; 伊麗莎白J.克羅夫頓，沒有; 李丁歌，沒有; Mary Kay Lobo，沒有; 修秀範，沒有; Eric J. Nestler， R37DA007359; Thomas A. Green， DA029091.

利益衝突聲明

作者聲明，研究是在沒有任何可被解釋為潛在利益衝突的商業或金融關係的情況下進行的。

致謝

這些實驗由國家藥物濫用研究所，DA029091和R37DA007359資助。 可卡因由國家藥物濫用研究所提供。

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