來源
Nathan Kline研究所，紐約Orangeburg，10962，美國。 [email protected]
抽象
兒童和青少年越來越多地接觸精神興奮劑，非法或用於治療常見的神經精神疾病，例如有和沒有活動過度的注意力缺陷症。 儘管在較年輕的年齡組中廣泛使用精神運動興奮劑，但對未成熟腦中對這些藥物的慢性分子神經適應性反應知之甚少。 在這裡，我們證明，在長期服用精神興奮劑後 可卡因 以及 安非他明，轉錄因子 DeltaFosB 在伏隔核中被上調 periadolescent 小鼠 但不是在斷奶後或成年後 小鼠。 感應 DeltaFosB 也只發生在尾狀殼核中 periadolescent 小鼠 後 安非他明 管理。 這些結果證明了青春期大腦中一種調節精神興奮作用的關鍵分子的獨特可塑性，並表明這些神經適應性變化可能參與調節 增強 青少年相對於成年人的成癮傾向。
引言
精神興奮劑用於治療常見的兒童期疾病，例如注意力缺陷多動障礙。 此外，濫用興奮劑，包括安非他明和可卡因，在青少年中很常見，有證據表明成年人的成癮傾向增強（Estroff等，1989; 邁爾斯和安德森，1991）。 儘管數據表明發育受調節的行為效應，但對於在施用這些藥劑期間發生的未成熟腦中的分子神經適應性反應知之甚少。 可卡因和安非他明可能通過刺激多巴胺D部分地影響持久的行為改變1受體和背側紋狀體（即尾殼核）和腹側紋狀體（即伏隔核）中轉錄因子（包括ΔFosB）水平的增加（陳等人，1997）。 在長期接觸可卡因或苯丙胺後，ΔFosB水平的增加（可能通過穩定蛋白質產物）持續數週，並且至少部分受多巴胺信號轉導途徑調節（陳等人，1997; Nestler等，2001).
由於正常發育過程中關鍵分子水平的變化，包括多巴胺D在內，幼小動物的中樞多巴胺能係統非常不穩定。1受體DARPP-32（多巴胺和cAMP調節的磷蛋白; Mr 32 kDa）和cAMP（Ehrlich等，1990;Teicher等人，1993; Perrone-Capano等，1996; Tarazi等人，1999;安徒生，2002）。 在此期間暴露於增強多巴胺能神經傳遞的精神興奮劑可因此導致定量和/或定性不同的分子反應，包括ΔFosB表達的改變。 為了檢驗慢性暴露於精神興奮劑期間存在年齡依賴性神經適應性反應的假設，在連續實驗中分析了三組小鼠：成人（注射開始時60 d歲），青春期前（注射開始時33 d歲），和斷奶後（24在註射開始時老）。 這是這三個年齡組中分子神經適應性反應與慢性精神興奮劑暴露的第一次直接比較。 我們發現，在相同的治療範例之後，圍產期小鼠對可卡因和苯丙胺的反應顯示出增強的ΔFosB上調。
材料和方法
動物和藥物管理。 將雄性CD-1小鼠（Charles River Laboratories，Kingston，NY）置於12 hr光/暗循環（6：00 AM至6：00 PM）中， 隨意獲得食物和水。 在開始注射之前允許動物適應動物室至少10 d。 動物由兩名研究人員處理，他們在飼養動物的同一房間內進行所有註射。 所有動物在21年齡斷奶。 注射開始於24（斷奶後），33（periadolescent）或60（成人）d歲。 對於20，動物每天在5：4和00：5 PM之間腹膜內接受00 mg / kg可卡因（Sigma，St.Louis，MO），7 mg / kg苯丙胺（Sigma）或等體積的鹽水。 短暫暴露於CO後，通過斷頭處死動物2 在10：00 AM，在最後一次注射後的第二天。 立即從顱骨中取出腦，並在冰上快速解剖尾狀殼核和伏隔核。 所有解剖均由單個研究者從冠狀腦切片進行，並且從新鮮組織製備蛋白質提取物而不冷凍。 所有動物程序均由機構動物護理和使用委員會批准，並符合美國國立衛生研究院的規定 實驗動物護理和使用指南.
蛋白質印跡分析。 對於蛋白質印跡分析，在用BCA測定法測量蛋白質濃度後，將來自每個樣品的等量蛋白質（來自尾狀殼核的40μg和用於伏隔核的20μg）加載到10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠的每個泳道中（Pierce，羅克福德，伊利諾伊州）。 在轉移至硝酸纖維素和/或用抗肌動蛋白抗體（1：500; Sigma）印跡後，通過Ponceau Red對總蛋白的可視化也證實了相等的蛋白質負載。 識別ΔFosB同種型的Fos相關抗原（FRA）抗血清由M.Iadarola博士（美國國立衛生研究院，Bethesda，MD）慷慨提供，並以1：4000的濃度使用。 之前的學習 （陳等人，1997; Hiroi等，1997），包括用M-肽免疫原預吸附FRA抗血清，證明了該抗血清的特異性。 用於32：5的DARPP-1 10,000a單克隆抗體由Drs慷慨提供。 Hugh Hemmings和Paul Greengard（洛克菲勒大學，紐約，紐約）。 多巴胺轉運蛋白（DAT）抗體來自 Chemicon公司 （特曼庫拉，加利福尼亞州）。 將印跡與NEN-DuPont（Boston，MA）化學發光系統反應並暴露於膜。 使用ScanAnalysis for Apple（Biosoft，Ferguson，MO）獲得ΔFosB免疫反應性的光密度值。 使用單向ANOVA確定統計學顯著性，然後是 事後 Tukey的多重比較測試或未配對的兩尾學生的 t 測試如圖例中所示。 對於藥物治療實驗，每個年齡組的分析在單獨的印跡上進行，因此，每個鹽水組被任意地指定100％值用於年齡組之間的比較。 對於個體發育研究，來自所有年齡組的樣品在單個印跡上一起分析。
結果
可卡因和苯丙胺誘導ΔFosB僅發生在周圍小鼠的伏隔核中
在安非他明或可卡因給藥的7 d後，在斷奶後，青春期和成年小鼠的伏隔核和尾殼核中測量ΔFosB的表達。 伏隔核是被認為對於調節精神興奮劑的獎賞效果最關鍵的大腦區域。 在長期給予苯丙胺後，在周圍動物的伏隔核中選擇性地誘導ΔFosB免疫反應性（35 kDa）（圖2）。 1 A）或可卡因（圖。 1 B）。 相反，斷奶後或成年動物的伏隔核中ΔFosB（35 kDa）的水平沒有顯著改變（圖。1 A,B）。 在尾殼核中，ΔFosB水平（35 kDa）在僅在青春期動物中施用慢性安非他明後也顯著上調（圖。2 A）。 所有三個年齡組在長期服用可卡因後顯示尾殼核中ΔFosB（35 kDa）表達顯著增加（圖2）。2 B）。 然而，在圍產期動物中誘導的程度最大，特別是與斷奶後相比（圖2）。 2 B）。 其他FRA和Fos同種型在所有年齡組中都未改變（數據未顯示）。
慢性精神興奮劑給藥後伏隔核中的ΔFosB免疫反應性。 從第1天開始，每天一次用生理鹽水，安非他明或可卡因注射CD-7小鼠用於24 d（P24; 斷奶後），日33（P33; periadolescent），或天60（成人）。 慢性安非他明後顯示伏隔核中ΔFosB（35 kDa）免疫反應性的水平（A）或可卡因（B管理。 來自鹽水的代表性免疫印跡 - （S），安非他明 - （A）和可卡因 - （C）斷奶後注射（P24），periadolescent（P33），成年小鼠顯示在 頂部面板. 底板 顯示基礎ΔFosB表達的平均值±SEM百分比。 n 每組的值顯示在 酒吧。 僅在周圍小鼠的伏隔核中發現ΔFosB的顯著增加。 *p <0.05； **p <0.01（學生的 t 測試; 生理鹽水與藥物）。
慢性精神興奮劑給藥後尾殼核的ΔFosB免疫反應性。 從第1天開始，每天一次用生理鹽水，安非他明或可卡因注射CD-7小鼠用於24 d（P24; 斷奶後），日33（P33; periadolescent），或天60（成人）。 慢性安非他明後顯示尾狀殼核中ΔFosB（35 kDa）免疫反應性的水平（A）或可卡因（B管理。 來自鹽水的代表性免疫印跡 - （S），安非他明 - （A）和可卡因 - （C）注射周圍小鼠（P33）顯示在頂部面板. 底板 顯示基礎ΔFosB表達的平均值±SEM百分比。 n 每組的值顯示在 酒吧。 僅在周圍小鼠的尾狀殼中發現顯著的苯丙胺誘導的ΔFosB免疫反應性增加（A）。 慢性可卡因給藥導致所有三個年齡組的ΔFosB增加（B）。 *p <0.05； **p <0.01（學生的 t 測試; 生理鹽水與藥物）。
慢性可卡因或苯丙胺後，DAT和DARPP-32水平不會改變
由多巴胺能和/或多巴胺能神經元表達的幾種關鍵分子，包括DARPP-32，D1 多巴胺受體和DAT有助於對精神興奮劑的急性和慢性反應（Moratalla等，1996; Fienberg等，1998; Sora等人，1998; Gainetdinov等，2001）。 來自DARPP-32，D的數據1 受體和DAT null和DAT敲低小鼠表明它們的水平之間的複雜關係，多巴胺能活性的調節和對精神興奮劑的反應。 事實上，在接受慢性可卡因的DARPP-32 null小鼠中不會發生ΔFosB誘導（Fienberg等，1998）。 然而，在成年小鼠中，7 d暴露於20 mg / kg可卡因不會改變DARPP-32的總水平（Fienberg等，1998）。 DAT蛋白質調節先前在長期暴露於精神興奮劑的小鼠中尚未見報導，儘管有些物種已報導放射性配體在暴露於精神興奮劑後與多巴胺轉運蛋白結合的改變（Letchworth等，2001）。 在這裡，我們測量了DARPP-32和DAT蛋白的水平，以確定這些蛋白的表達是否在三種小鼠的任何一年中的慢性精神興奮劑給藥後都被改變。 我們的研究結果表明，在三個年齡組中的任何一個中長期服用可卡因或安非他明後，整個尾狀殼核或伏隔核中總DARPP-32或DAT水平沒有顯著變化（表 1).
ΔFosB的基線水平受發育調節
我們檢查了ΔFosB的個體發育，因為在紋狀體中具有基因工程增加的ΔFosB表達的成年小鼠對精神興奮劑具有更高的行為反應（Kelz等，1999）。 我們發現，在尾狀殼核和伏隔核中，年輕動物的ΔFosB基線水平顯著低於成年人（圖2）。3 A）。 多巴胺系統功能標誌物的水平，包括DARPP-32（Ehrlich等，1990），DAT（Perrone-Capano等，1996）和多巴胺受體（Teicher等人，1993; Tarazi等人，1999）也受到發展監管。 CD-1小鼠先前的報導表明出生後第32天線（P28）紋狀體DARPP-28達到峰值（Ehrlich等，1990）。 在大鼠尾殼核和伏隔核中，D1受體水平峰值從P28到P40（Teicher等人，1993; Tarazi等人，1999但是，在小鼠中尚未進行類似的研究。 相反，在這裡我們發現尾殼核和伏隔核中的DAT蛋白水平在出生後第24天和成年期之間是恆定的（圖2）。 3 B）。 因此，D之間的相對比例1 受體，DAT，DARPP-32和ΔFosB在不同年齡組之間不同，可能導致D的差異1 受體活性可能影響ΔFosB誘導的程度。
ΔFosB和DAT的發育表達。 A，ΔFosB（35-37 kDa）在幼稚CD-1小鼠的尾狀殼核和伏隔核中的免疫反應性隨年齡而變化。 代表性的免疫印跡顯示在 頂部面板.底板 顯示每組三隻小鼠的平均值±SEM。 *p <0.05，成人vs P24； ＃p <0.05，成人vs P36（ANOVA後的Tukey多重比較測試）。 B，作為年齡函數的幼稚CD-1小鼠尾殼核和伏隔核中DAT免疫反應性的密度值。 DAT水平在三個年齡組之間沒有差異。
討論
精神運動興奮劑的行為影響與年齡有關。 當非法物質的使用升級時，青春期的成癮傾向最高（Estroff等，1989; 邁爾斯和安德森，1991）。 事實上，年幼的孩子在接觸精神興奮劑時經常會變得煩躁不安，而青少年和成年人則會感到欣快（Rapoport等，1980）。 在囓齒動物模型中，一些研究表明，青春期前動物的基線活動水平較高（Spear and Brake，1983並且相對於年輕和年長的動物，改變了對精神興奮劑的反應。 因此，相對於斷奶和成年動物，它們顯示較少的運動刺激和新奇尋求響應於精神興奮劑的急性低劑量施用，但是在高劑量治療後增加的過度活躍。 與成人相比，慢性給藥對於可卡因誘導的運動的敏感性在早期大鼠中更大，而對立體定型的敏感性更低。 此外，微透析數據顯示，在對安非他明誘導的多巴胺釋放敏感方面，青春期和成年大鼠之間存在差異（Laviola等，1995; Adriani等，1998; Adriani和Laviola，2000;Laviola等，2001）。 然而，在青春期大鼠服用哌醋甲酯後對可卡因的長期反應性存在相互矛盾的研究（Brandon等人，2001; Andersen等，2002）。 後兩篇報告強調了在使用不同實驗範例時比較研究的困難。 通過使用不同的物種和菌株，進一步混淆了比較年輕動物的行為研究的嘗試。
在精神興奮劑的使用和濫用研究中，小鼠正成為越來越重要的動物模型，這是對小鼠或任何其他單一物種的三個不同發育年齡的分子神經適應性反應的首次系統分析。 我們得出治療範例的先前研究表明，慢性可卡因和安非他明給藥後，野生型成年大鼠離體背側和腹側紋狀體的ΔFosB增加（Hope等人，1994; Nye等，1995; Turgeon等人，1997）但僅限於慢性可卡因後野生型成年小鼠的背側和腹側紋狀體或孤立的背側紋狀體（Fienberg等，1998; Zachariou等人，2001).
我們現在證明在斷奶後，衰老期和成年小鼠中精神興奮劑誘導的ΔFosB的空間和數量差異。 與可卡因和安非他明治療的小鼠相比，對成人和斷奶後的動物的反應增強的觀察結果得到了加強。 精神興奮劑可卡因和安非他明都可以通過不同的機制增加突觸多巴胺以及血清素和去甲腎上腺素。 可卡因與質膜轉運蛋白結合，用於檢測多巴胺，血清素和去甲腎上腺素，並抑制它們重新攝入突觸前末梢。 相比之下，安非他明促進了這些發射器的釋放。 興奮劑施用7 d後，僅在周圍年齡組的伏隔核中選擇性誘導ΔFosB，並且尾狀殼核中ΔFosB的相對強烈誘導可能是神經生物學表現或之前註意到濫用精神興奮劑的趨勢增加的原因。年齡階層 （Estroff等，1989; 邁爾斯和安德森，1991）和基因表達的其他長期變化，不同年齡組（Andersen等，2002）。 此外，這些差異可能通過關鍵分子水平的發育變化而內在地調節，包括ΔFosB本身。 年齡組間ΔFosB基線水平差異的潛在影響類似於大鼠品系之間差異的建議（Haile等，2001）。 事實上，我們預計在近交系小鼠中會發現類似的菌株差異。 不同年齡的小鼠也可能在除伏核之外的腦區域中顯示出不同的分子適應性。 使用關鍵分子水平和同時行為觀察的遺傳工程改變的periadolescent小鼠的額外分析將進一步測試這些假設。
腳註
- 收到 四月8，2002。
- 收到修訂 August 6，2002。
- 接受 August 8，2002。
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這項工作得到美國國立衛生研究院/國家神經疾病研究所和中風格蘭特NS41871（MEE和EMU）和國家藥物濫用研究所P30-DA13429（EMU）的支持。
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通訊應發給Michelle E. Ehrlich博士，Thomas Jefferson大學，Curtis 310，1025核桃街，費城，賓夕法尼亞州19107。 電子郵件： [email protected].
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