評論：雖然壓力，濫用藥物和某些自然獎勵都會引發DeltaFosB的積累，但壓力會激活不同的下游細胞和後來不同的受體和基因。 換句話說，成癮和對壓力的抵抗依賴於根本上不同的機制
J Neurosci。 2010 Oct 27; 30（43）：14585-92。
Vialou V，Maze I，Renthal W，LaPlant QC，Watts EL，Mouzon E，Ghose S，Tamminga CA，Nestler EJ。
資源
Fishberg神經科學系，西奈山醫學院，紐約，紐約10029，美國。
抽象
應激和藥物誘導的神經元適應的分子機制尚不完全清楚。 涉及此類適應的一個分子是ΔFosB，其是響應於慢性應激或反复暴露於濫用藥物的響應性核心（NAc）中累積的轉錄因子，其是關鍵的腦獎勵區域。 Ť通過這些環境刺激控制ΔFosB誘導的上游轉錄機制仍然是難以捉摸的。 在這裡，我們確定活動依賴性轉錄因子，血清反應因子（SRF），作為壓力的新型上游介質， 但不是可卡因 - ，誘導ΔFosB。 SRF在抑鬱的人類患者和長期暴露於社交失敗壓力的小鼠的NAc中被下調。 在彈性動物中不存在SRF的下調。 通過使用誘導型誘變，我們表明，應力介導的ΔFosB誘導，主要發生在彈性小鼠，依賴於這個大腦區域的SRF表達。 此外，SRF的NAc特異性遺傳缺失促進了各種類似促腎上腺素和類似焦慮的表型，並使動物對慢性應激的有害作用更敏感。 相反，我們證明SRF在NAc中的ΔFosB積累中不起作用以響應慢性可卡因暴露。 此外，NAC特異性敲除SRF對可卡因誘導的行為沒有影響，表明慢性社交失敗壓力和反复可卡因暴露通過獨立機制調節ΔFosB積累和行為敏感性。
簡介
伏隔核（NAc）是一個關鍵的大腦獎勵區域，對於整合感知和認知輸入非常重要，這些輸入驅動與環境刺激相關的動機相關行為（Nestler和Carlezon，2006; Sesack和Grace，2010）。 NAc還涉及與藥物成癮和抑鬱有關的行為異常。 因此，已經證明以深部腦刺激靶向NAc可減輕人和囓齒動物中的抑鬱和成癮樣行為（Schlaepfer等，2008; Vassoler等，2008; Heinze等，2009; Kuhn等。 al。，2009）。
反复暴露於濫用或壓力的藥物誘導NAc中基因表達的改變模式，潛在地成癮和抑鬱的慢性化（Berton等，2006; Krishnan等，2007; Maze等，2010; Vialou等。，2010）。 有趣的是，轉錄因子ΔFosB（fosB基因的剪接產物）響應於重複的藥物或應激暴露而在NAc中積累（Nestler，2008; Perrotti等，2008; Vialou等，2010）。 ΔFosB已被提議作為潛在的分子開關，指導從娛樂性藥物使用向慢性成癮狀態的轉變（Nestler等人，1999; McClung等人，2004; Renthal等人，2009），因為其在NAc中的積累增強獎勵對幾種濫用藥物的回應。 最近，ΔFosB誘導在NAc慢性社交失敗壓力後的作用（Nikulina等，2008; Vialou等，2010）已被闡明：ΔFosB促進對壓力刺激的積極應對反應並增加彈性。 儘管ΔFosB誘導以刺激依賴性方式發生，但是在NAc中引起藥物和應激誘導的ΔFosB積累的機制仍然未知。
血清反應因子（SRF）是幾個即時早期基因（包括c-fos，fosb，Egr1和Arc）的活動依賴性轉錄激活所需的轉錄因子（Knöll和Nordheim，2009）。 最近的研究表明，SRF對神經元的形態和細胞結構特性具有影響，包括調節成年大腦中的突觸活性和電路形成（Knöll和Nordheim，2009）。 這些發現促使我們調查長期暴露於濫用或壓力藥物下是否會調節SRF的功能，以及在這些情況下此類調節對ΔFosB誘導的潛在影響。
在這裡，我們描述了一種新的機制，通過該機制，NAc中SRF的下調促進了促抑鬱和焦慮症的表型，最終增加了動物對慢性應激的有害影響的脆弱性。 這些作用部分地由應激動物的NAc中ΔFosB誘導的喪失介導。 觀察到的從抑鬱症患者獲得的死後NAc組織中SRF和ΔFosB表達的降低支持了我們的發現與人類抑鬱症的相關性。 有趣的是，這種控制ΔFosB積累的機制似乎是應激特異性的：長期暴露於可卡因對SRF表達沒有影響，從NAc缺失SRF對暴露於慢性可卡因後對ΔFosB積累沒有影響，並且這種SRF缺失對可卡因-誘發的行為。 在壓力的情況下，SRF和ΔFosB之間的這種新穎的相互作用可能代表了調節個人對慢性壓力敏感性的重要穩態機制。
材料和方法
動物
在所有行為和生物化學實驗中使用8週齡的C57BL / 6J雄性小鼠（Jackson Laboratory）。 在實驗操作之前，所有動物在動物設施中習慣至少1，並且在23 h光/暗循環（從25：12 AM到7：00 PM點亮）上保持在7-00℃，並隨意進行獲得食物和水。 實驗按照西奈山醫學院神經科學學會和機構動物護理和使用委員會的指導方針進行。
對於可卡因實驗[Western印跡和定量染色質免疫沉澱（ChIP）]，使用8-至10-週齡雄性C57BL / 6J小鼠。 動物每天接受七次腹膜內註射鹽水或可卡因（20 mg / kg可卡因-HCl; Sigma）。 在最終處理後使用24 h小鼠。 對於行為實驗，小鼠在術後單獨飼養，並如下所述用10 mg / kg（運動致敏）或7.5 mg / kg（條件性位置偏愛）可卡因-HCl腹膜內處理。
如前所述產生Srff1 / fl小鼠（Ramanan等，2005）。 通過立體定位注射和隨後使用腺相關病毒（AAV）載體與綠色熒光蛋白（GFP）融合的Cre重組酶（Cre）的病毒過表達實現了Src的NAc特異性敲除。 使用了非自我刪除Cre。 在Srffl / fl小鼠中註射AAV-GFP代替AAV-Cre-GFP作為對照。 簡而言之，使用氯胺酮（10 mg / kg）和甲苯噻嗪（10 mg / kg）的混合物麻醉小鼠，其中以下立體定位坐標用於病毒遞送：+ 1.6（前/後），+ 1.5（側）， - 4.4（背/腹）與中線成10°（相對於前囟）。 在0.5最小時間段（5μl/ min）雙側遞送總共0.1μl的純化病毒，然後休息5 min。 在手術後數週，當病毒表達最大時，對小鼠進行2測試，並使用標準組織學方法確認所有動物的病毒注射位點。 病毒介導的Cre表達的效率通過免疫組織化學和通過對來自給予AAV-Cre-GFP和AAV-GFP進入NAc的動物的顯微切割NAc沖頭進行的Srf的逆轉錄酶PCR來驗證。 如前所述產生AAV-GFP和AAV-Cre-GFP病毒（Maze等，2010）。
行為程序
社會失敗壓力。
如前所述（Berton等，57; Krishnan等，6; Vialou等，10），C2006BL / 2007J小鼠連續2010天經歷慢性社交失敗應激。 簡言之，將每隻小鼠暴露於不熟悉且具有攻擊性的雄性CD1退役種雞，每天5 min。 在與CD1攻擊者直接相互作用後，然後將動物置於相同籠子的相鄰隔室中，用於下一個具有感覺但非物理接觸的24 h。 對照動物飼養在等同的籠子中，但是具有相同菌株的成員。 在失敗的最後一天之後，24進行了社交互動測試。
根據公開的方案評估了對陌生CD1雄性小鼠的社交迴避（Berton等，2006; Krishnan等，2007; Vialou等，2010）。 首先將實驗小鼠引入包含空金屬絲網籠的開放場地2.5分鐘。 在第二階段中，將陌生的CD1雄性小鼠引入有線籠中。 測量在交互區域（籠子周圍8厘米寬的走廊）中花費的時間。 如先前所述（Krishnan等，2007； Vialou等，2010）將失敗的小鼠分為敏感的和有彈性的亞群。 由於大多數對照組小鼠與社交目標互動所花費的時間要多於與空目標包圍圈互動所花費的時間，因此將互動比率100（存在或不存在社交目標的互動區域所花費的時間相等）設置為臨界值。 得分<100的小鼠被標記為易感，得分≥100的小鼠被標記為有彈性。 廣泛的行為，生化和電生理分析支持了這些不同的易感和彈性亞群的有效性（Krishnan等，2007； Wilkinson等，2009； Vialou等，2010）。
為了檢查Srffl / fl小鼠對社交失敗壓力的脆弱性，用AAV-GFP或AAV-Cre-GFP雙側注射的小鼠在同一天連續三次失敗，然後測試社交相互作用24 h。 先前已經驗證了這種次最大失敗程序，以揭示遺傳操作後的易感性表型（Krishnan等，2007; Vialou等，2010）。
學會了無奈。
如前所述（Berton等，2007），過表達AAV-GFP或AAV-Cre-GFP的Srff1 / fl小鼠進行學習的無助程序。 簡言之，在1連續天（2 mA，0.45持續時間）內，小鼠暴露於5 h的間歇性，不可避免的足部休克。 在測試當天，將小鼠重新引入15連續逃避試驗的盒子中。 在每次試驗期間，進行持續的休克，並且通過進入相鄰的非電氣隔室使小鼠有機會逃脫。 成功逃生後，門自動關閉並記錄逃生延遲。 當小鼠在25內沒有逃脫時，試驗終止並記錄為失敗。 先前的研究表明，在沒有應激的情況下，NAc和其他區域中的病毒表達對基線逃避行為沒有影響（Newton等，2002; Berton等，2007）。
運動致敏。
在NAc內註射AAV-GFP或AAV-Cre-GFP後兩週，對Srffl / f30小鼠進行運動致敏。 使小鼠習慣於運動場所每天4分鐘，持續10天。 適應後，給動物腹膜內註射30mg / kg可卡因-HCl，並放入運動箱中。 使用光光束系統（San Diego Instruments）記錄動物的運動活動，每天動態不停地換束6分鐘。 在XNUMX天的時間內記錄了運動敏化。
條件的地方偏好。
如先前所述（Maze et al。，2010）進行位置調節程序，並進行以下修改。 簡而言之，在Srffl / fl小鼠的NAc內AAV-GFP或AAV-Cre-GFP的NAc內輸注後18 d，將動物置於條件調節室中，該條件室由三個背景不同的環境組成。 對這兩個調節室中的任一個表現出明顯偏好的小鼠被排除在研究之外（所有動物的<10％）。 調節組進一步平衡以調節仍然可能存在的任何腔室偏差。 在隨後的幾天中，給動物注射生理鹽水並在下午限制在一個房間中30分鐘，然後在第二天將可卡因（7.5 mg / kg，ip）注射到另一個房間中，總計30分鐘每次治療進行兩輪關聯訓練（兩個生理鹽水和兩個可卡因配對）。 在測試當天，將小鼠未經處理放回設備中20分鐘，並進行測試以評估副作用。 通過可卡因配對室中的光束中斷評估對可卡因的運動反應，以確保藥物治療的有效性。 對於所有組，評估對鹽水的基線運動，以確保運動不受病毒治療的影響。
其他行為測試。
基於公開的方案（Vialou等，2010）在開放場，光/暗和強迫游泳測試中測試Srff1 / fl小鼠。 在紅光條件下使用視頻跟踪系統（Ethovision）記錄5 min中開放場中小鼠的活動。 對於明/暗測試，允許小鼠自由探索由一個連接到較小的封閉場地的一個大型照明場所組成的兩室箱。 測試小鼠5 min的時間以評估在任一外殼中花費的時間量。 在開場和亮/暗測試中，分別在中心和光場中花費的時間被評估為焦慮相關反應的反向指數。 1 d強制游泳試驗進行5 min的一段時間。 在強迫游泳測試期間增加的不動時間被解釋為類似於抑鬱症的行為。 1 d強迫游泳測試已經在小鼠中廣泛使用，並且已經被驗證為預測有效性的量度，因為抗抑鬱療法減少了不動時間。
免疫組化
將Srffl / fl小鼠麻醉並用4％多聚甲醛/ PBS心臟內灌注。 取出腦並在30％蔗糖/ PBS中冷凍保護。 在冷凍切片機上切割冠狀切片（30μm）並進行免疫組織化學分析。 使用針對SRF的多克隆抗體（1 / 2000; Santa Cruz Biotechnology）進行Srff1 / fl敲除的驗證。 通過GFP（雞多克隆，1 / 8000，Aves Labs）在解剖的腦中表達證實Cre表達，因為Cre與GFP融合。 為了定量Srff1 / fl敲除小鼠中社交失敗應激後的ΔFosB誘導，使用針對蛋白質的N-末端區域產生的兔多克隆抗體（1 / 1000; Santa Cruz Biotechnology）檢測ΔFosB。 用共聚焦顯微鏡（20×放大倍數; Zeiss）拍攝圖像。 在每個動物的多個圖像中定量計數為ΔFosB免疫反應性為陰性和陽性的GFP免疫陽性細胞的數量，隨後計算每隻動物的平均值。 每隻動物被認為是用於統計分析的個體觀察。
人死後NAc組織
人類死後腦組織是從達拉斯大腦收藏中心獲得的，該組織的組織是在得到近親同意後，從達拉斯醫學檢驗官辦公室和德克薩斯大學（UT）西南組織的器官移植計劃中採集的。 分析了年齡，驗屍間隔，RNA完整性數（RIN）和pH值匹配的雄性和雌性組織。 特定的痛苦因素包括昏迷，缺氧，發熱，癲癇發作，脫水，低血糖，多器官功能衰竭以及死亡時攝入神經毒性物質會影響死後腦組織中的RNA完整性（Tomita等，2004）。 我們使用神經因素量表（AFS）來表徵這八種情況下的組織樣本。 不存在嚴重因素的患者的評分為0，其存在評分為1，以提供0至8的總AFS評分。 表0給出了病例統計數據。高RIN值證實了出色的組織質量。 將病例進行標準解剖，然後在-1°C的異戊烷中速凍並在-1°C的溫度下保存； 在冷凍組織上進行NAc的進一步解剖。 UT西南機構審查委員會審查並批准了該組織的收集品，以供研究使用。 隨後，對每個抑鬱症病例進行了直接的線人訪談，並記錄了有關該病的信息； 兩名研究精神科醫生使用DSM-IV標準對重度抑鬱症進行了共識診斷。 這項研究中沒有一個病例的血液毒理學篩查結果顯示抗濫用藥物，酒精或除抗抑鬱藥以外的處方藥呈陽性。 儘管進行了抗抑鬱治療，但所有患者在死亡時均處於臨床抑鬱狀態。 以盲法分配組織樣品用於分析。
表1。
人類死後研究的人口統計數據
蛋白質印跡
如前所述處理人和小鼠NAc樣品（Maze等，2010）。 將冷凍組織在含有5％SDS的1 mM HEPES裂解緩衝液中用蛋白酶（Roche）和磷酸酶抑製劑（Sigma）超聲處理。 通過Dc蛋白質測定（Bio-Rad）測定蛋白質濃度。 將等量的蛋白質樣品進行SDS-PAGE和Western印跡。 使用針對SRF的抗體（1 / 2000; Santa Cruz Biotechnology）或GAPDH（1 / 1500; Abcam）探測Western印跡，然後使用Odyssey成像系統（Licor）掃描和定量。
RNA分離和定量PCR
如前所述進行RNA分離，定量PCR（qPCR）和數據分析（Maze等，2010; Vialou等，2010）。 簡而言之，用TriZol試劑（Invitrogen）分離RNA，並用來自Qiagen的RNAeasy微量試劑盒進一步純化。 確定所有RNA樣品具有260 / 280和260 / 230值≥1.8。 使用iScript（Bio-Rad）進行逆轉錄。 使用具有以下循環參數的Applied Biosystems 7900HT RT PCR系統進行使用SYBR green（Quanta）的qPCR：2 min的95 min; 40的95°C，15的59°C，30的72°C的33週期; 並分級加熱至95°C以產生解離曲線以確認單個PCR產物。 通過用ΔΔC（t）方法（Tsankova等，2006）比較治療條件（對照與易感或彈性小鼠，或人對照與抑鬱患者）的C（t）值來分析數據。 ΔFosBqPCR引物：foward，AGGCAGAGCTGGAGTCGGAGAT和反向，GCCGAGGACTTGAACTTCACTCG。
芯片
如前所述（Maze等，2010）對來自對照，易感和有彈性的小鼠（四隻14-量規拳擊/小鼠）的混合雙側NAc拳擊進行ChIP，在最後一次失敗經歷之後1 h以及來自鹽水和可卡因 - 最終治療後治療的動物24 h。 組織在1％甲醛中交聯。 隨後通過施用甘氨酸中斷固定，洗滌組織並保持在-80℃直至使用。 將剪切的染色質與預先與磁珠結合的抗SRF抗體（Santa Cruz Biotechnology）（Dynabeads M-280; Invitrogen）孵育過夜。 在反向交聯和DNA純化後，通過qPCR使用跨越含有兩個血清反應元件結合位點的fosb啟動子區域的引物測定SRF與fosb啟動子的結合。 與無抗體對照相比，SRF下拉顯著富集。 小鼠fosb基因啟動子引物：正向，CCCTCTGACGTAATTGCTAGG和反向，ACCTCCCAAACTCTCCCTTC。
統計分析
在生化和行為分析中，單向方差分析用於比較對照，易感和有彈性的小鼠之間的均值。 雙向方差分析用於比較Srf局部基因敲除小鼠中的社交失敗引起的ΔFosB誘導，以及比較Srf基因敲除在學習到的無助感和運動敏化方案中的作用。 使用學生t檢驗比較Srf基因敲除對ΔFosB誘導的影響，以及人死後組織各組之間的均值和小鼠ChIP分析。 當p≤0.05時，實驗條件之間的差異被認為具有統計學意義。
成績
SRF和ΔFosB在人類抑鬱症和社交失敗的小鼠中的表達
為了探索SRF在抑鬱樣行為發展中的潛在作用，我們首先評估了死後抑鬱人類患者NAc中SRF蛋白的表達。 與年齡相匹配的對照組相比，抑鬱的受試者的NAc的SRF水平顯著降低（t（19）= 1.9； p <0.05）（圖1A）。 鑑於SRF在調節活動相關的立即早期基因表達中的作用（Ramanan等，2005），我們假設SRF可能參與控制該大腦區域的ΔFosB表達。 為了支持這一假設，我們觀察到抑鬱的人的NAc中的ΔfosbmRNA水平也顯著降低（t（16）= 1.8； p <0.05）（圖1B）。 這與最近發現的在這些條件下ΔFosB蛋白水平降低的發現是一致的（Vialou等，2010）。
圖1。
慢性應激誘導的SRF抑制與NAc中ΔFosB轉錄降低有關。 A，B，死後人類抑鬱患者的NAc中SRF蛋白水平降低（n = 10 /組； A），NAc中ΔfosbmRNA表達降低（n = 8 / group; B）。 C，遭受慢性（10 d）社交挫敗壓力的小鼠被分為易感和有彈性的亞群。 D，慢性社交衰竭應激與C中所示的社交互動測試後24小時的對照組相比，易感小鼠的NAc中的SRF蛋白水平降低，但不降低彈性小鼠的ERF。E，易感小鼠中NAc中的ΔfosBmRNA水平未改變，但顯著韌性動物中的表達上調（n = 7–15 /組）。 F，SRF蛋白僅在有彈性而不是易感的小鼠（n = 5 /組）中顯示出在慢性社交衰竭應激後與fosb基因啟動子的結合增加。 顯示的數據以平均值±SEM表示（以誤差線表示）。 缺點，控制； 鬱悶Sus。，易感； Res。，富有彈性。 * p <0.05與對照相比； ***與對照相比，p ＜0.001； #p <0.05與易感性； ## p <0.01相對易感； ### p <0.001相對易感。
為了擴展這些發現，我們在小鼠中使用了慢性社交失敗應激協議。 根據社交迴避的度量，有兩組可區分的失敗小鼠是易感的和有韌性的（Krishnan等，2007），與對照組和有韌性的動物相比，易感動物的社交互動明顯減少（F（2,23， 157.2）= 0.001; p <0.001;進行Bonferroni校正的t檢驗，易感性vs對照，p <0.05;彈性性vs對照，p <0.01;彈性性vs易感性，p <1）（圖2,32C）。 最後一次失敗發作後兩天，分析了易感，有彈性和不敗的對照小鼠在NAc中的SRF表達。 與人類抑鬱症的發現相似，與對照組相比，易感小鼠的NAc中SRF蛋白水平顯著降低，而彈性小鼠的NAc中SRF蛋白水平不受影響（F（4.7）= 0.05; p <0.05; Bonferroni矯正，易感vs.對照，p <0.05；彈性vs.易感，p <1）（圖XNUMXD）。
接下來，我們檢查了這三組動物的NAc中的ΔfosbmRNA表達，並僅在有恢復力的動物中觀察到了Δfosb表達的顯著增加，而在易感小鼠中卻沒有觀察到這種趨勢，但沒有顯著增加（t（14）= 2.1； p <0.05 ）（圖1E）。 為了進一步研究SRF水平與Δfosb轉錄之間可能存在的相互作用，我們使用ChIP來檢查在易感和有抵抗力的小鼠的單獨小組中慢性社交衰竭應激後，SRF與fosb基因啟動子的結合是否發生了改變。 與對照（t（8）= 2.1; p <0.05）和易感小鼠（t（8）= 2.0; p <0.05）相比，有彈性的動物在NAc中顯示出顯著增強的SRF與fosb啟動子的結合。 在對照組和易感小鼠之間未觀察到差異，這可能反映了易感小鼠中SRF誘導的缺乏（圖1F）。
為了證實SRF在慢性社交衰竭應激後在ΔFosB調控中的作用，使用Srffl / fl小鼠檢查從NAc選擇性缺失SRF對ΔFosB應激誘導的作用。 Srffl / f2小鼠被立體定向注射到NAc內，並表達GFP或Cre-GFP的AAV載體。 免疫組織化學證實了由AAV-Cre-GFP誘導的SRF的NAc特異性敲除（圖50A）。 實際上，SRF染色和Cre表達之間沒有重疊，證明了敲除的有效性。 在顯微解剖的NAc沖頭中，我們檢測到SRF蛋白水平顯著降低了11％（t（4.3）= 0.001； p <XNUMX）。 數量級可能反映了這樣的事實：這種顯微解剖中的一部分組織沒有被病毒感染。
圖2。
SRF通過慢性社交失敗壓力介導ΔFosB誘導。 A，將AAV-Cre-GFP注入Srffl / fl小鼠的NAc中會導致表達Cre的神經元中的SRF蛋白敲除。 注射AAV-GFP沒有明顯的作用。 B，這種從NAc中選擇性去除SRF完全阻斷了慢性社交失敗壓力（n = 4 /組）後NAc中ΔFosB的誘導。 顯示的數據以平均值±SEM表示（以誤差線表示）。 與AAV-GFP對照相比* p <0.05； ** p <0.01，相對於AAV-GFP失敗。
接下來，我們對注射AAV-Cre-GFP或AAV-GFP的NAc內失敗的Srffl / fl小鼠的NAc中的ΔFosB進行了定量免疫組織化學分析。 在長期的社會挫敗壓力之後，在註射AAV-GFP的動物的NAc中明顯誘導了ΔFosB表達（病毒×治療相互作用，F（1,12）= 6.4；採用Bonferroni校正的t檢驗，對照與失敗的比較，p <0.05； AAV-Cre與AAV-GFP，p <0.01）。 但是，在接受AAV-Cre-GFP的Srffl / f2小鼠中未觀察到這種誘導作用（圖XNUMXB），表明慢性應激在NAc中的ΔFosB誘導作用需要SRF。
NAc中的SRF敲除促進了表達抑制和表達類似的表型
由於先前已證明由慢性社交挫敗壓力誘導的ΔFosB介導了復原力（Vialou等人，2010），因此我們假設易感動物中SRF的下調以及由此導致的ΔFosB誘導的喪失可能代表了一種負適應，最終導致動物更容易受到壓力的有害影響。 為了驗證這一假設，我們如上所述誘導了成年Srffl / fl小鼠中Srf基因的局部NAc特異性缺失，並在一系列行為範式中對所得小鼠及其對照組進行了測試，以評估基線抑鬱症和焦慮症。喜歡的行為。 SRF的局部NAc缺失通過強迫游泳試驗（t（30）= 2.5; p <0.05）促進了類似抑鬱的作用，以及在曠野中測量的促焦慮作用（t（38）） = 1.9; p <0.05）和明/暗測試（t（8）= 1.9; p <0.05）。 因此，接受AAV-Cre-GFP進入NAc的Srffl / f3小鼠在強迫游泳試驗中顯示出固定不動的潛伏期縮短，在空曠區域中央的時間更少，在明/暗盒的光室中的時間更少與註射AAV-GFP的動物相比（圖3A–C）。 但是，NAC內SRF的缺失並沒有改變運動的基線水平，這表明在SRF敲除動物中觀察到的行為影響不是由於總體運動活動異常引起的（圖2010D）。 鑑於先前的報導表明，儘管NAc中的ΔFosB調節抑鬱樣行為，但這些數據似乎並不有趣（Vialou等人，XNUMX），這似乎並不參與焦慮相關的反應。 我們目前的發現，SRF的丟失會引起焦慮反應，這表明它是通過ΔFosB以外的靶標引起的。
圖3。
從NAc的SRF基因敲除促進前抑鬱和焦慮樣表型。 A–C，通過將AAV-Cre-GFP注射到Srffl / fl小鼠的NAc中，從NAc中選擇性剔除SRF，可減少強制游泳試驗中固定的潛伏期（n = 14-18 /組； A）並分別減少了在野外測試（B）和明/暗（C）測試中在中心花費的時間和在明室中花費的時間（n = 5-15 /組）。 D，在接受AAV-GFP或AAV-Cre-GFP的NAc內註射的小鼠的開放視野中，未觀察到基礎運動能力的差異。 E，F，分別以逃避潛伏期和社交互動時間來衡量，對學習的無助感的敏感性增加（n = 7-8 /組； E）和社交失敗壓力（n = 5-6 / group; F） 。 顯示的數據以平均值±SEM表示（以誤差線表示）。 * p <0.05，相對於GFP或相對於目標缺失； **與GFP相比p <0.01； ***相對於GFP，p ＜0.001。
接下來，我們研究了NAc中SRF的缺失是否還會增加動物對反复脅迫的不利影響的脆弱性。 在兩個抑鬱症模型中檢查了注射有AAV-Cre-GFP或AAV-GFP的Srffl / f14,180小鼠的NAC抑鬱模型，即學習性無助和慢性社交挫敗壓力。 在習得性無助中，接受AAV-Cre-GFP的Srffl / fl動物在事先暴露於不可避免的足部震動壓力後表現出逃避足部震動的潛伏期延長（治療×試驗交互作用，F（10.2）= 0.001；採用Bonferroni校正的t檢驗， p <0.01； AAV-Cre與AAV-GFP，p <3），表明對壓力誘發的行為缺陷的易感性增加（圖10E）。 類似地，在慢性社交衰竭壓力後，與註射AAV-GFP的對照動物相比，NAc的局部SRF缺失也增加了社交厭惡感（t（1.8）= 0.05; p <3）（圖XNUMXF），類似於抑鬱症。
SRF缺乏參與ΔFosB誘導和對可卡因的行為反應
鑑於在NAc中也對可卡因等濫用藥物產生了ΔFosB，因此研究SRF在可卡因作用中的潛在作用非常重要。 與長期的社會失敗壓力不同，重複的可卡因暴露不會改變NAc中的SRF蛋白表達（t（14）= 0.8; p> 0.05）（圖4A），並且對SRF與該腦區域中fosB基因啟動子的結合沒有影響。 （t（4）= 0.7; p> 0.05）（圖4B）。 這表明，與壓力相反，慢性可卡因誘導的ΔFosB不是通過SRF介導的。 我們通過檢查在接受AAV-Cre-GFP與AAV-GFP進入NAc的Srffl / fl動物中慢性可卡因後ΔFosB積累是否發生改變，直接測試了這一點。 我們發現SRF缺失對可卡因誘導的ΔFosB在此大腦區域的蓄積沒有影響（圖4C）。
圖4。
SRF的喪失對可卡因誘導ΔFosB或可卡因調節行為沒有影響。 A，B，重複可卡因暴露（7 d，20 mg / kg可卡因-HCl）對NAc（A）中的SRF蛋白表達或SRF與該腦區域中的fosB基因啟動子結合沒有影響（B）24 h後藥物暴露（n = 5 /組）。 在慢性可卡因暴露後免疫細胞化學測量的C，ΔFosB積累不受SRF的NAc特異性敲除的影響。 D，E，來自NAc的SRF的局部缺失也對鹽水注射（d 1）後對可卡因誘導的運動活性和致敏（n = 8 /組）（d 1-7; D）的運動活性沒有影響或關於可卡因條件性地點偏好（n = 8 / group; E）。 顯示的數據表示為平均值±SEM（表示為誤差棒）。
為了跟踪這一令人驚訝的發現，我們調查了從NAc中選擇性剔除SRF是否會改變對可卡因的行為反應。 與SRF缺乏可卡因對ΔFosB誘導的調控相一致，NAc特異的SRF敲除對急性可卡因誘導的運動活動或重複可卡因暴露後的運動致敏作用沒有影響（治療×時間相互作用，F（4,80） ＝ 0.3； p＞ 0.05）（圖4D）。 同樣，NAc特異的SRF剔除對可卡因條件的位置偏好沒有影響（t（14）= 0.1； p> 0.05）（圖4E），這是可卡因獎勵的間接衡量。
討論區
該研究將SRF鑑定為慢性社交失敗應激後NAc中ΔFosB的新型上游介質，並暗示SRF在抑鬱和焦慮樣行為的發展中。 我們提供直接證據表明慢性社交失敗壓力會降低敏感但不具彈性的動物的NAc中的SRF水平，並且這種下調可以阻止在這個大腦區域誘導ΔFosB，我們已經證明這對於有效應對慢性壓力是必要的，即彈性（Vialou等，2010）。 在抑鬱的人的NAc中發現了SRF表達的類似降低，其中ΔFosBmRNA和蛋白質表達也降低。 相反，儘管SRF下調，但是在易感小鼠的NAc中ΔFosB水平沒有降低，這表明在控制ΔFosB表達方面尚未知的其他轉錄機制。 通過使用來自該腦區域的SRF的誘導型遺傳缺失，建立SRF在介導慢性應激後NAc中ΔFosB誘導中的因果作用。 具有這種NAc特異性SRF敲除的小鼠的行為分析進一步暗示SRF在基線和應激誘導的抑鬱和焦慮樣行為的發展中起關鍵作用。 與此形成鮮明對比的是，SRF缺失對響應慢性可卡因給藥的ΔFosB誘導或可卡因的行為影響沒有影響。 這些發現支持SRF在調節ΔFosB誘導和對不同環境擾動的行為反應中的新的刺激特異性作用。
先前已經顯示SRF介導的轉錄響應於突觸活動，主要由鈣流入增加以及增強的神經營養活性引發，特別是在腦源性神經營養因子（BDNF）的情況下（Bading等，1993; Xia等人，1996; Johnson等人，1997; Chang等人，2004; Kalita等人，2006;Knöll和Nordheim，2009）。 這提出了一個有趣的問題，即為什麼SRF在慢性社交失敗壓力後的易感但不具彈性的老鼠的NAc中被下調。 這種差異調節可能不是由多巴胺或BDNF信號傳導介導的，因為易感小鼠在NAc中顯示出增加的BDNF蛋白水平和增加的下游BDNF信號傳導以及增強的腹側被蓋區（VTA）多巴胺神經元的突發發射，其支配NAc，而彈性動物顯示正常水平的BDNF信號傳導和VTA激發率（Krishnan等，2007）。 另一種可能性是響應於該腦區域的谷氨酸能神經支配的改變，在NAc中SRF表達受到抑制，我們已經顯示在易感性和有彈性的小鼠中差異調節（Vialou等，2010）。 需要進一步的工作來直接研究這個和其他可能的機制。
最近使用全基因組和其他方法的研究表明，神經元中~5-10％的SRF靶基因是直接的早期基因（Philippar等，2004; Ramanan等，2005; Etkin等，2006;Knöll和Nordheim，2009）。 這與我們的數據一致，證明了SRF通過慢性應激誘導ΔFosB（fosb立即早期基因的截短產物）的關鍵作用。 有趣的是，在這些不同研究中鑑定的許多SRF靶基因也代表NAc中ΔFosB的已知靶標（Kumar等，2005; Renthal等，2008，2009; Maze等，2010）。 在這些通常調節的基因中，已知有幾種調節神經元細胞骨架的基因（例如，Cdk5，Arc和Actb）。 反過來，這與SRF影響幾種神經元細胞類型中的肌動蛋白動力學和神經元運動的報導一致（Alberti等，2005; Ramanan等，2005;Knöll等，2006），而ΔFosB是已知的影響NAc神經元的樹突棘向外生長（Maze等，2010）。 這些共同的功能終點可以反映SRF的協同作用，結合其誘導ΔFosB，作用於一系列共同的靶基因以影響神經元形態，並最終影響複雜行為。
SRF還被證明在調節突觸可塑性和神經元活性依賴性基因表達和行為中發揮關鍵作用。 例如，響應於對新環境的自願探索或通過電驚厥性癲癇發作的神經元激活而立即早期基因的SRF依賴性誘導的喪失與Srf突變體的海馬中的長期突觸增強受損相關（Ramanan等人。 ，2005; Etkin等，2006）。 此外，已顯示海馬中的SRF耗竭導致長期突觸抑制的缺陷，由新環境誘導的立即早期基因表達，以及在新環境的探索期間受限的習慣性（Etkin等，2006）。 這些數據確立了SRF在動物適當適應環境擾動的能力中的重要性，例如在上述學習適應新環境的情況下，或者在適應負面壓力刺激的情況下，防止壓力的釋放。導致的行為缺陷，如我們目前的研究。 因此，我們觀察到動物表現出SRF表達的缺陷，無論是對易感個體的社交失敗壓力的反應還是通過SRF的直接敲低，都表現出抑鬱和焦慮樣行為增加。 鑑於抑鬱的人類受試者在NAc中的SRF水平也降低，可以想像SRF在調節個體積極適應負面環境刺激的能力方面起著基本作用，部分是通過調節NAc中的ΔFosB表達。
不同的機制：成癮與抗壓力
本研究的一個令人驚訝的發現是，儘管響應於慢性應激，在NAc中ΔFosB積累需要SRF，但是響應於慢性可卡因，在同一腦區內ΔFosB誘導不需要SRF。 同樣，SRF對於藥物的正常行為反應不是必需的。 這些數據表明，儘管ΔFosB在NAc中響應許多類型的刺激而被誘導（Nestler等，1999; Nestler，2008），但似乎存在導致ΔFosB誘導的不同分子途徑。 對這些發現的一種可能的解釋是部分不同的細胞類型，其顯示響應於應激與可卡因的ΔFosB積累。 慢性應激在NAc中型多刺神經元的兩個主要亞群中大致相等地誘導ΔFosB，那些主要表達D1與D2多巴胺受體，而慢性可卡因主要在D1 +神經元內誘導ΔFosB（Kelz等，1999; Perrotti等，2004） 。 因此，SRF依賴性途徑可能對D2 +神經元中的ΔFosB誘導很重要。 然而，這不能解釋慢性應激後SRF敲除小鼠中ΔFosB誘導的完全喪失，因為誘導發生在兩種神經元亞型中。 另一種解釋是慢性應激和慢性可卡因通過其對NAc神經元的不同作用模式影響不同的細胞內信號級聯，如前所述，慢性應激可能通過改變的谷氨酸能傳遞起作用，而慢性可卡因主要通過D1起作用。受體信號傳導（Nestler，2008）。 另一種可能性是慢性應激對慢性可卡因的ΔFosB誘導依賴於不同的轉錄機制，所述轉錄機制由支配來自各種穀氨酸能投射區域的NAc的不同神經輸入差異控制，例如，前額皮質，海馬和杏仁核的幾個區域。 需要做更多的工作來探索這些和替代的可能性。
總之，我們的發現確定了一種新的轉錄機制，通過該機制在NAc中誘導ΔFosB以介導對應激刺激的抗衰老反應。 這項研究還提供了重要的新見解，SRF在NAc水平調節抑鬱和焦慮行為方面發揮的作用。 更好地了解SRF在此類行為的調控中的轉錄作用將有助於鑑定與應激相關疾病的適應力有關的新基因靶標，並可能促進未來更有效的抗抑鬱療法的發展。
這項工作得到了國家精神衛生研究所和國家藥物濫用研究所的資助以及與阿斯利康的研究聯盟的支持。 我們感謝David D. Ginty提供的Srffl / fl小鼠。
通訊應發送給西奈山醫學院Fishberg神經科學系的Eric J.Nasler，One Gustave L. Levy Place，Box 1065，紐約，紐約10029-6574。 [電子郵件保護]
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