Physiol Behav . 作者手稿；可在 PMC 2015 年 3 月 10 日取得。
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生理行為。 2008 Jun 9; 94（3）：309-315。
線上發表於2008年1月16日。 doi: 10.1016/j.physbeh.2008.01.008
PMCID：PMC4354893
NIHMSID：NIHMS669562
抽象
過度攝取糖分可能以類似於濫用藥物的方式激活神經通路，從而導致相關的依賴症狀。本實驗旨在檢驗過度攝取蔗糖後禁食的大鼠是否會出現類似鴉片類藥物的戒斷症狀。實驗中，大鼠先禁食12小時，接著自由攝取10%蔗糖溶液和標準飼料，持續28天，之後禁食36小時。與同樣禁食且自由攝取標準飼料的對照組相比，這些大鼠在高架十字迷宮暴露臂上停留的時間更短，提示存在焦慮。微透析結果顯示，伏隔核殼部細胞外乙醯膽鹼濃度升高，而多巴胺釋放減少。這些結果似乎並非由低血糖引起。研究結果表明，過度攝取蔗糖和標準飼料後禁食會造成一種涉及焦慮以及伏隔核多巴胺和乙醯膽鹼平衡改變的狀態。這與納洛酮的作用類似，提示可能出現類似鴉片類藥物戒斷症狀。這可能是某些飲食障礙的誘因之一。
戒斷反應是藥物成癮病因學中的因素[ 1 ]。 Le Magnen[ 2 ]發現，在餵食高適口性自助餐式飲食的大鼠中，鴉片拮抗劑納洛酮會產生類似鴉片類藥物的戒斷症狀。同樣，餵食誘導每日暴食糖的飲食的大鼠在接受納洛酮治療後也表現出類似阿片類藥物的戒斷症狀[ 3 ]。這些大鼠表現出軀體戒斷症狀、高架十字迷宮焦慮以及伏隔核（NAc）中細胞外多巴胺（DA）減少和乙醯膽鹼（ACh）增加。雖然使用鴉片拮抗劑對於理解某種行為的潛在神經機制很重要，但這與自然情況不同。戒斷或自發性出現的戒斷反應更符合實際情況，也更能反映野生動物或人類在飢荒或嚴重節食期間的狀態。
光是停止濫用藥物就足以引發行為和生化上的戒斷症狀。例如，停止使用嗎啡的大鼠會出現震顫和濕狗樣抖動等戒斷症狀[ 4 , 5 ]。這些行為與多巴胺（DA）系統的變化密切相關，包括紋狀體D1和D2受體mRNA的減少[ 6 ]、伏隔核（NAc）細胞外DA的減少[ 7 , 8 ]以及伏隔核乙醯膽鹼（ACh）的增加[ 9 ]。
同樣，缺乏美味食物會導致類似阿片類藥物戒斷的行為表現。先前以間歇性糖分攝取飲食餵養的大鼠，在食物和/或糖分停止供應24或36小時後，會表現出戒斷症狀[ 3 , 10 ]。此外，食物剝奪已被證明會增強藥物強化行為，這表明食物戒斷與成癮行為之間存在關聯[ 11 , 12 ]。
目前尚不清楚攝取糖分過量後禁食是否會改變伏隔核（NAc）中多巴胺（DA）和乙醯膽鹼（ACh）的細胞外水平。在本實驗中，我們監測了受試者在禁食糖和飼料期間的這些神經傳導物質水平，其理論依據是缺乏天然鴉片類刺激會導致類似於納洛酮誘導戒斷的紊亂，具體表現為伏隔核殼部多巴胺釋放減少和乙醯膽鹼釋放增加。為了進一步補充我們先前報告[ 3 ]中關於阿片類藥物戒斷樣軀體症狀的發現，我們在受試者暴飲糖分後禁食期間測量了其在高架十字迷宮中的焦慮水平和血糖水平。
1。 材料和方法
1.1。 一般方法
雄性Sprague-Dawley大鼠獲自Taconic Farms（Germantown，NY）或在普林斯頓大學動物園飼養來自Taconic Farms的原種。 將大鼠單獨圈養在反向12-h光：12-h暗循環中。 所有程序均經普林斯頓大學機構動物護理和使用委員會批准。
1.2。 實驗1：糖暴食大鼠禁食時焦慮是否明顯？
主要實驗組（間歇性糖+標準飼料；n = 9）的大鼠（300–450 g）每日黑暗期開始4小時後，連續28天，每天禁食12小時，隨後自由攝取10% (w/v)蔗糖溶液和標準囓齒動物飼料（LabDiet #5001，PMI，St. Louis，MO，3.02 kcalg）[ 12 13 ]。對照組（自由攝取標準飼料；n = 7）可自由攝取標準囓齒動物飼料。所有動物均可自由飲水。實驗2和3中使用的其他組別（間歇性飼料組和自由攝取糖組）未進行焦慮測試，因為在先前的報告中，這些組別在納洛酮或禁食後未表現出戒斷行為症狀[ 3 ]。
在第28天，經過通常的12小時禁食後，實驗組大鼠被進一步剝奪糖和飼料24小時。對照組也剝奪飼料36小時。在此期間，所有動物均可自由飲水。然後，採用File、Lippa、Beer和Lippa[ 14 ]的方法，將動物單獨放入高架十字迷宮5分鐘。該裝置有四個臂，每個臂寬10厘米，長50厘米，離地60厘米。其中兩個相對的臂由高高的不透明壁封閉，另外兩個臂沒有防護壁。實驗在紅光下進行。將大鼠放置在迷宮中心，並交替面向開放臂或封閉臂。每次十字迷宮試驗均被錄影，並由一位對處理條件不知情的觀察者記錄大鼠頭部和前爪在開放臂、封閉臂或迷宮中間區域停留的時間。
1.3。 實驗2：糖禁食大鼠在禁食期間是否會改變伏隔核中DA和ACh的釋放？
將一組單獨的大鼠（350-450 g）進行手術以植入用於微透析的導管。 根據需要用20 mg / kg甲苯噻嗪和補充有氯胺酮的100 mg / kg氯胺酮（ip）麻醉大鼠（100 mg / kg，ip）。 雙側21規格不銹鋼導管針對後內側伏隔殼（前部：+ 1.2 mm，側面：0.8 mm和腹側：4.0 mm，分別參考前囟，中頜竇和水平顱骨表面）使用立體定位儀器。
大鼠術後至少恢復1週。與實驗1類似，實驗組（n =6）每天進行12小時禁食，隨後在黑暗期開始4小時後給予12小時10%蔗糖溶液和標準囓齒動物飼料，持續28天以誘導暴食行為（即間歇性糖+飼料）。對照組採用相同的餵食方案，但不提供蔗糖（間歇性飼料，n =7），另一組則每天自由攝取飼料（n =6）。第28天，將每隻大鼠轉移至微透析室，並在實驗前14-16小時插入探針，用丙烯酸樹脂固定，以使神經傳導物質恢復穩定。微透析探針由內徑 37 µm 的石英玻璃管（Polymicro Technologies Inc.，Phoenix，AZ）構成，外層包裹 26 號不銹鋼管，末端為纖維素管微透析尖端，並用環氧樹脂（Spectrum Medical Co.，Los Angeles，CA，6000 MW，外徑 0.2 mm × 長度 2.05 ]。探針從引導套管伸出 5 mm，到達伏隔核殼部的目標部位。穩定期，將探針以 0.5 µL / min 的流速灌注緩衝林格氏液（142 mM NaCl、3.9 mM KCl、1.2 mM CaCl₂ 、1.0 mM MgCl₂ 、1.35 mM Na₂HPO₄ 、 0.3 mM NaH₂ 、 1.35 mM Na₂HPO₄ 、 0.3 mM NaH₂ 、1.35 mM Na₂HPO₄ 、 0.3 mM NaH₂小時及整個實驗過程中，灌注流速提高至 1.3 µL/min。在林格氏液中添加新斯的明（0.3 µM）以抑制乙醯膽鹼的酵素降解，從而提高乙醯膽鹼的基礎恢復水準。
在第28天最後一次12小時蔗糖攝取期結束後，所有大鼠均停止攝取飼料、蔗糖和水。在36小時透析實驗期間停止供水，是因為飲用水會改變DA和ACh的基線水平[ 16 ]，幹擾實驗結果。在禁食12、24和36小時後（不提供食物、糖或水），分別採集1小時的微透析樣本（3個20分鐘的樣本）。每個樣本分成兩份，一份用於DA分析，另一份用於ACh分析。
1.4。 多巴胺和乙酰膽鹼測定
通過反相高效液相色譜和電化學檢測（HPLC-EC）分析DA及其代謝物3,4-二羥基 - 苯乙酸（DOPAC）和高香草酸（HVA）。 將樣品注入20-μL樣品環中，得到具有10 mm孔和3.2μm，C3填料（Brownlee Co. Model 18，San Jose，CA）的6213-cm柱。 流動相含有60 mM磷酸鈉，100μMEDTA，1.24 mM庚磺酸和5％vol / vol甲醇。 用庫侖檢測器（ESA Co. Model 5100A，Chelmsford，MA）測量DA，DOPAC和HVA，調節電位設定為+ 500 mV，工作電池電位為-400 mV。
使用20 µL樣品定量環和10 cm C18分析柱（Chrompack Inc.，Palo Alto，CA），通過反相HPLC-EC測量ACh。 通過固定的酶反應器（來自密蘇里州聖路易斯的Sigma的乙酰膽鹼酯酶和膽鹼氧化酶，以及來自加利福尼亞州帕洛阿爾託的Chrompack Inc.的色譜柱）將ACh轉化為甜菜鹼和過氧化氫。 流動相是pH 200的8.0 mM磷酸鉀。 使用了安培檢測器（EG＆G普林斯頓應用研究，新澤西州勞倫斯維爾）。 過氧化氫在相對於Ag-AgCl參比電極（EG＆G Princeton Applied Research）設定為500 mV的鉑電極（BAS，West Lafayette，IN）上被氧化。
在禁食的20，12和24 h收集三個36-min樣品。 對於每小時，將三個樣品的數據取平均值。 當間歇餵養的大鼠通常期望食物時，DA和ACh的數據被轉換為每組的12-h剝奪時間點的百分比。
1.5。 組織學
實驗結束時，進行組織學檢查以驗證微透析探針的位置。大鼠接受過量戊巴比妥鈉麻醉，深度麻醉後，經心臟灌注0.9%生理食鹽水，隨後灌注10%甲醛溶液。取出腦組織，冷凍保存，實驗人員在切片過程中（切片厚度為40 µm，從伏隔核前方開始）檢查切片，直到找到探針尖端的位置。探針軌跡可視化後，使用Paxinos和Watson的圖譜[ 17 ]進行繪製。
1.6。 實驗3：由於蔗糖的慢性暴食，血糖水平是否有變化？
體重300-350公克的實驗鼠分為三組，分別飼養28天。飼養條件分別為：(a) 間歇性糖+飼料組（黑暗期開始4小時後，禁食12小時，隨後自由攝取10%蔗糖溶液和飼料； n =10）；(b) 間歇性飼料組（黑暗期開始4小時後，禁食12小時，隨後自由攝取標準囓齒動物飼料（不含蔗糖）；黑暗期開始4小時後，禁食12小時，隨後自由攝取標準囓齒動物飼料（不含蔗糖）；黑暗期開始4小時）；分別在禁食12、24和36小時後停止餵食飼料和糖，並採集尾部血液樣本。採血時，一名實驗人員輕輕托住動物，另一名實驗人員則用無菌手術刀在距尾尖約5毫米處做一個小切口。血液採集於毛細管中，離心後，使用Analox GM7快速酵素代謝儀（Analox公司，麻薩諸塞州倫嫩堡）分析血清葡萄糖濃度。在28天的自由攝食期內，每日測量糖和飼料攝取量，每週測量體重。在禁食期間，也在每個時間點測量體重。
2。 結果
2.1。 體重，糖攝入量和食物攝入量
實驗3中28天的攝取期內收集的數據顯示，在28天的暴露期內，自由攝取蔗糖的大鼠蔗糖攝取量顯著增加（F (27, 279) = 4.9，p < 0.001；圖1A），這一結果與我們先前關於蔗糖或葡萄糖的研究結果相似[ 3 , 20 ]。飼料攝取量數據顯示各組間有顯著差異。間歇性攝糖組的飼料攝取量低於自由攝糖組和間歇性攝糖組（F (2, 26) = 60.8，p < 0.001；圖1B）。然而，各組每日總熱量攝取量並無顯著差異（圖1C）。
在為期 28 天的攝取期內，各組體重無差異；然而，時間效應顯著，所有三組在 28 天內體重均有所增加（F (4,104) = 298.9，p < 0.001）。在 36 小時的禁食期間，所有組別的體重均隨時間推移而下降（F (2,52) = 1957.8，p < 0.001），且在任何時間點（12、24 或 36 小時）各組之間均無差異。
2.2。 實驗1：糖暴食大鼠禁食後焦慮的行為指數
在食物剝奪 36 小時後，將先前間歇性餵食糖和飼料的大鼠放入高架十字迷宮 5 分鐘，與同樣剝奪食物但沒有蔗糖經驗的自由攝食飼料組相比，先前間歇性餵食糖和飼料的大鼠在十字迷宮開放臂上停留的時間較短（18 ± 4 秒，佔總時間的6 % ； 0.05，d = 1.03，其中 0.8 或更高被認為是較大的效應量 [ 18 ]，p rep = 0.87；圖 2）。
2.3。 實驗2：糖禁食大鼠在禁食時減少細胞外DA並增加NAc殼中的ACh
組別與時間（禁食12、24和36小時）之間有顯著的交互作用（F (4,28) = 2.86，p < 0.05；圖3A）。禁食24小時後，先前間歇性餵食糖+飼料組的DA釋放量下降至68 ± 6%，自由採食飼料組的DA釋放量下降至72 ± 5%，而間歇性餵食飼料組的DA釋放量保持不變（95 ± 7%）。禁食36小時後，間歇性餵食糖+飼料組的細胞外DA水準仍較低（61 ± 14%），此時顯著低於自由採食飼料組（113 ± 14%，p < 0.05）和間歇性餵食飼料組（104 ± 15%，p < 0.05）。
在DA或ACh剝奪12 h後，組之間沒有差異（間歇性糖+食物= 1.6±0.3 pg和0.4±0.1 pmol /樣品;間歇性食物= 1.5±0.4 pg和0.7±0.3 pmol /樣品; ad libitum chow = 1.4±0.3 pg和0.7±0.3 pmol /樣品;分別為DA和ACh）。
禁食24小時後，所有組別的DOPAC水平均下降（F (2,34) = 33.8，p < 0.001）。禁食36小時後也觀察到類似的趨勢，但未達統計意義。 HVA的釋放也存在時間效應（F (2,34) = 6.97，p < 0.001）。與DOPAC和DA類似，所有組別的HVA在禁食24小時後均有所下降（表1）。然而，禁食36小時後，間歇性糖+飼料組的HVA水平較高（119 ± 20%），而自由採食飼料組和間歇性飼料組的HVA水平仍略有下降。
細胞外乙醯膽鹼（ACh）的變化方向與多巴胺（DA）相反。組別與時間之間有顯著的交互作用（F (4, 30) = 4.81，p < 0.005；圖3B）。間歇性蔗糖+飼料組在禁食24小時後ACh水平升高（115 ± 10%；p < 0.05），而自由採食飼料組（77 ± 13%）和間歇性飼料組（90 ± 15%）則未見升高。禁食36小時後，這種差異進一步增強，間歇性蔗糖+飼料組的ACh水平（164 ± 14%）顯著高於自由採食飼料組（97 ± 17%；p < 0.05）和間歇性飼料組（104 ± 15%；p < 0.05）。
注意，基線測量是在禁食的第一次12 h後進行的，此時間歇性蔗糖+食物和間歇性食物大鼠通常會獲得食物。 因此，36-h禁食時間點恰好是24-h測量後的12 h。 在晝夜週期的這一點，食物餵養的對照組沒有顯示DA或ACh的變化，而糖暴食組具有顯著低的DA和高ACh。
組織學證實探針放置主要在伏隔核的殼部（圖 4）。
2.4。 實驗3：糖暴食大鼠禁食後的戒斷症狀與低血糖無直接關係
各組間血糖值無顯著差異（12 小時範圍 = 5.1–7.8 mmol，24 小時範圍 = 4.6–6.9 mmol，36 小時範圍 = 4.2–6.4 mmol）。然而，時間對血糖值有影響，所有組別的血糖水平均在 36 小時禁食期間下降（F (2,52) = 52.8，p < 0.001）。
3。 討論
3.1。 糖暴食大鼠禁食期間焦慮的行為指徵
高架十字迷宮是最常用的動物焦慮測試方法之一[ 14 , 21 ]，已被廣泛驗證可用於檢測一般焦慮[ 22 ]和藥物戒斷引起的焦慮[ 23 ]。實驗1的結果表明，間歇性攝取糖分後禁食會導致高架十字迷宮測試中觀察到的焦慮。先前攝取過大量糖分的實驗鼠在迷宮開放臂停留的時間僅佔6%，而自由攝食組的比例為11%。這些數據與其他研究結果相符，且與使用此方法通常得到的結果相似[ 24 , 25 ]。這項發現與嗎啡自發性戒斷後觀察到的開放臂探索減少現象類似[ 26 ]。在先前的研究中，長期自由攝取糖和飼料的動物在接受納洛酮治療後未表現出焦慮症狀，而間歇性攝取糖和飼料的動物在接受相同劑量的納洛酮治療後則表現出焦慮症狀[ 3 ]。自由攝取糖也未能產生其他依賴性行為表現，包括對苯丙胺的交叉致敏作用[ 27 ]和飲酒傾向[ 28 ]。間歇性攝取糖則會產生這些行為。另一項研究發現，停止自由攝取糖精並未導致憂鬱樣行為[ 29 ]，而憂鬱樣行為是戒斷期間可能觀察到的另一種行為，這進一步表明間歇性攝取在誘發上述效應方面的重要性。鑑於這些先前的研究，本實驗未測試自由攝取糖的情況。
研究也表明，並非給予蔗糖飲食本身，而是長時間停止攝取蔗糖才會誘發蔗糖暴食大鼠出現焦慮症狀。我們先前曾報道過，每日12小時自由攝食蔗糖，隨後進行12小時禁食的暴食大鼠，在經過通常的12小時每日禁食期後，並未表現出焦慮的軀體症狀、超音波求救信號或在高架十字迷宮中表現出焦慮[ 3 ]。目前的研究結果證實，36小時的禁食確實會導致焦慮現象。
實驗1中禁食期間出現的焦慮症狀與鴉片類藥物戒斷症狀相似，後者可由鴉片拮抗劑納洛酮誘發[ 3 ]。糖攝取過量大鼠對納洛酮的敏感性提示，飲食可能導致內源性鴉片受體改變。已有研究證實，攝取適口性食物會改變伏隔核（NAc）中腦啡肽mRNA的表達和μ-阿片受體的結合[ 30-32 ] 。本研究觀察到的禁食後戒斷症狀很可能是由於糖分攝取過量動物體內缺乏內源性鴉片刺激所致。
這些結果與其他關於禁食後或先前大量攝取糖分的大鼠中自發性出現類似鴉片類藥物戒斷症狀的報告相符。除了軀體痛苦症狀[ 3 ]外，也觀察到攻擊行為和體溫下降[ 10 ]。這些行為和生理變化與阿片類藥物戒斷期間觀察到的變化相似[ 33 , 34 ]，並支持間歇性攝入糖溶液的飲食會導致類似阿片類藥物戒斷症狀的理論。
3.2。 糖暴食大鼠禁食期間伏隔核中的細胞外DA和ACh
在禁食的36 h，與兩個對照組相比，間歇性糖+食物組的DA水平顯著降低。 這表明食物和水的剝奪會導致大鼠的DA音失去，並且有糖暴食史。 同時，細胞外ACh升高，提示阿片樣戒斷樣狀態。
對照組未出現此效應。在36小時時間點（與12小時時間點處於同一光暗週期階段），自由採食組的DA水準已恢復至基線水準（圖3A）。這表明，自由採食組伏隔核DA釋放遵循晝夜節律，正如Paulson和Robinson所提出的[ 35 ]。其他研究也顯示紋狀體有類似的改變[ 36 , 37 ]。間歇採食組未觀察到此晝夜節律效應，可能是因為週期性餵食改變了DA釋放的正常晝夜節律。
間歇性攝取糖+飼料組中細胞外多巴胺的持續下降與嗎啡自發性戒斷期間的報導相似[ 7 ]，並且可能在戒斷後促進糖攝取量的恢復中發揮作用[ 38 ]。間歇性攝取飼料組在任何時間點的多巴胺釋放量變化都相對較小，這表明，糖和飼料的共同攝取（而不僅僅是飼料）是產生觀察到的效應的重要因素。
儘管DOPAC和HVA通常遵循與DA相似的模式，但並非總是如此。在本實驗中，DOPAC和HVA並未表現出與DA類似的晝夜節律變化，而是持續受到抑制。雖然其他研究報告了伏隔核（NAc）中這些代謝物的晝夜節律波動[ 35 ]，但我們尚未發現任何文獻測量過禁食36小時期間這些代謝物的水平。因此，在本實驗中，禁食可能影響了正常飼料對照組的DA代謝。
禁食36小時後，各組間乙醯膽鹼（ACh）水準有顯著差異。伏隔核（NAc）中的ACh與攝食行為[39]和飽腹感密切相關[40-44 ]，並且，當多巴胺（DA）水平較低時，ACh可能促進厭惡反應[ 40 , 45-48 ]。在本實驗中，間歇性糖+普通飼料組大鼠在禁食期間ACh水平顯著升高，這可能與獎賞剝奪的負面影響有關。既往研究支持以下理論：本文所報導的結果是由蔗糖飲食剝奪所致。大量攝取蔗糖的大鼠會釋放DA，且伏隔核中ACh的釋放會減弱[ 20 , 49 ]，這與本研究中長期剝奪蔗糖後的結果相反。間歇性糖+飼料組中伏隔核DA和ACh之間的不平衡，但在對照組中沒有出現，可能導致實驗1中觀察到的焦慮。
3.3。 糖暴食大鼠禁食期間的血糖水平
低血糖可導致動物產生厭惡狀態，並可能透過進食來逃避。這種厭惡狀態相關的行為與納洛酮給藥或蔗糖暴食大鼠禁食期間觀察到的行為相似[ 50 ]。多種因素會影響大腦獎賞系統。然而，由於低血糖期間觀察到的行為與焦慮期間觀察到的行為相似，本研究測量了血糖水平，以確保觀察到的效果並非僅由血糖異常引起。各組的血糖值相似，因此似乎無法解釋行為差異或多巴胺（DA）和乙醯膽鹼（ACh）釋放的變化。由於未觀察到血糖值的變化，且體重未因餵食方案而出現差異，因此可以推斷各組的平均胰島素水平保持一致。因此，本研究結果以及我們先前的報告[ 30 ]表明，行為和神經化學變化並非由血糖水平差異引起。相反，它們可能是內源性鴉片類物質和多巴胺系統改變共同作用的結果。
4. 結論
長期糖癮發作後的戒斷會導致行為和神經化學方面的適應性改變，類似於阿片類藥物依賴動物戒斷濫用物質（例如嗎啡）時觀察到的改變。這些類似阿片類藥物戒斷的指標是依賴性的標誌。這項發現，結合先前研究表明糖癮發作還會導致其他依賴性跡象，包括多巴胺能和阿片類物質的變化[ 30 , 32 ]、納洛酮誘發和自發性戒斷[ 3 ]、與濫用藥物的交叉致敏作用[ 27 , 51 ]、戒斷後糖攝入量增加[ 38 ]、對先前飲酒的反應與時間相關的反應（52 28 ]、對先前飲酒的影響]，顯示依賴性在多個向度上都有所體現[ 53 , 54 ]。目前的研究結果可能對理解可能導致暴食的厭惡因素具有重要意義。
參考