胰島素激活下丘腦中的胰島素受體（InsRs）以在飯後發出飽腹感。 然而，肥胖的發病率上升導致胰島素水平長期升高，這意味著胰島素也可能在調節動機和獎勵的大腦中心起作用。 我們在這里報告，胰島素可以通過間接機制放大伏隔核（NAc）和尾狀殼核中的動作電位依賴性多巴胺（DA）釋放，所述間接機制涉及表達InsR的紋狀體膽鹼能中間神經元。 此外，在大鼠中的兩種不同的慢性飲食操作，食物限制（FR）和致肥胖（OB）飲食，相反地改變了紋狀體DA釋放到胰島素的敏感性，具有增強的FR反應性，但是OB中的反應性喪失。 行為研究表明，NAc殼中的完整胰島素水平對於獲得對配對葡萄糖溶液的風味的偏好是必需的。 總之，這些數據意味著紋狀體胰島素信號傳導增強DA釋放以影響食物選擇。

已有充分證據表明，餐中及餐後血漿胰島素水平持續升高會激活下丘腦中的胰島素受體（InsRs），從而對食慾迴路產生負反饋，減少進一步的進食^{^1,2,3。腦胰島素主要來自胰臟β細胞，並}透過血腦障壁從血漿主動轉運至腦組織^{^4,5,6,7,8 ，儘管越來越多的證據顯示神經元也能}合成和釋放胰島素^{^1,9 。}值得注意的是，胰島素受體的表達並不局限於下丘腦，但下丘腦外胰島素受體的功能仍有待闡明^{^1,2,3 。鑑於肥胖和II型糖尿病的}發生率不斷上升，導致循環胰島素水平持續升高，而腦胰島素轉運和受體敏感性降低^{^3,8,10,11 ，因此}，了解胰島素在調節動機和獎賞的大腦區域中的功能至關重要。特別值得關注的腦區包括伏隔核（NAc），它介導食物和藥物的獎賞效應^12,13；以及尾狀核-殼核（CPu），它在習慣性行為和渴求^{中發揮作用}^{¹³ 。}胰島素受體（InsR）在這些區域均有表達，其中在伏隔核（NAc）中的密度最高^{^3,14}；中腦的多巴胺（DA）神經元也表達胰島素受體，包括腹側被蓋區（VTA）和黑質緻密部（SNc）中的神經元^¹⁵ 。腦胰島素濃度與血漿胰島素濃度和身體脂肪含量成正比^{6 , 7 , 8}，由此產生了胰島素可能作用於這些腦區胰島素受體 (InsR) 以影響食物獎勵的假設^{3 , 16 , 17}。

以前的研究紋狀體突觸體，異種細胞，腦切片和 体内 已經表明胰島素激活InsRs導致DA轉運蛋白（DAT）DA攝取增加^{18, 19, 20, 21, 22, 23}。 該過程涉及PI3激酶信號傳導途徑^{19, 20}，並導致DAT插入質膜中¹⁹。 循環胰島素水平動態調節紋狀體DAT活性，降低DA攝取和DAT表面表達，見於糖尿病動物模型和食物限制（FR）後^{20, 21}。 已顯示胰島素依賴性DAT活性增加可降低誘發的細胞外DA濃度（[DA]）_o）在VTA中²³，反映了DA釋放與吸收之間平衡的轉變。 與胰島素在飽腹感中確定的作用一致，VTA中胰島素的急性顯微注射可降低食物獎勵^{23, 24}而在VTA和SNc DA神經元中缺乏InsRs的小鼠顯示食物攝入增加並變得肥胖²⁵。 雖然胰島素可以誘導長期抑制VTA DA神經元的興奮性輸入²⁴再次與飽腹感的作用一致，胰島素暴露也可以通過降低DA釋放和自身受體介導的抑制來增加DA神經元的放電率²⁵。 因此很難預測胰島素對紋狀體DA釋放的淨效應。 實際上，胰島素對紋狀體DA釋放影響的研究結果 離體 片¹⁹ NAc局部顯微注射胰島素對食物獎賞的影響²⁶ 似乎是矛盾的。 為了解決這個問題，我們評估了NAc和CPu的完整微環境中的軸突DA釋放和攝取 離體 紋狀體切片採用快速掃描循環伏安法（FCV），確定NAc中胰島素信號傳導對獎賞行為的影響 体内.

我們的研究表明，儘管多巴胺（DA）攝取同時增加，但胰島素在伏隔核（NAc）和尾狀核（CPu）中的主要作用是增強DA釋放。這種DA釋放的動態調節涉及紋狀體膽鹼能中間神經元（ChIs）興奮性的胰島素依賴性增加，進而透過活化尼古丁乙醯膽鹼（ACh）受體（nAChR）增強DA釋放。胰島素對ChIs和DA釋放的影響是由胰島素受體（InsRs）介導的。值得注意的是，胰島素對DA釋放的影響在FR大鼠的腦片中被放大，但在肥胖（OB）飲食大鼠中則被減弱。這些數據表明，胰島素在離體腦片中增強了DA釋放，由此推測胰島素可能在體內發揮獎賞訊號的作用。事實上，平行的行為研究表明，胰島素在伏隔核殼部參與了味覺偏好條件反射。綜上所述，這些發現揭示了胰島素作為一種獎賞訊號的新功能，它可以影響食物選擇。

在InsRs起作用的胰島素增加誘發的紋狀體DA釋放

本地誘發的初步檢查[DA]_o 用FCV監控 離體 來自大鼠的紋狀體切片 隨意 （AL）對食物和水的獲取揭示了意外的發現，即在一系列生理相關濃度下急性應用胰島素^{1, 4} 增加單脈衝誘發[DA]_o (圖1a-c），用胰島素EC₅₀ 2-12 nM的值（效應最大值的一半）（圖1b）。 誘發增加[DA]_o 特別令人驚訝的是，這伴隨著最大速率的顯著增加（V_最大）用於每個次區域的DAT介導的攝取（表1），這會導致誘發的競爭性減少[DA]_o，如前所述^{22, 23}。 相反，我們發現誘發[DA]_o 通過20 nM胰島素最大限度地擴增55-30％; 比例效應最大的區域是NAc殼，它是具有最高InsR表達的紋狀體亞區^{1, 14}。 在相同條件下暴露於30 nM胰島素的切片顯示紋狀體DA含量沒有變化（補充圖1a），暗示胰島素改變動態釋放調節，而不是簡單地上調DA合成。 值得注意的是，胰島素對誘發[DA]的影響_o 在超生理濃度≥100nM時丟失（圖1b）。 這不是DAT活性增加超過釋放的結果，因為胰島素的作用 V_最大 在這些濃度下也會丟失（表1）。 總體而言，這些數據表明，在完整的紋狀體微環境中，胰島素對誘發的主要作用[DA]_o 儘管DA攝取量同時增加，但仍會增加釋放量。

  

  

(a）平均單脈衝誘發[DA]_o 在NAc殼中，NAc核心和胰島素前後CPu（Ins）為30 nM所示; 錯誤欄已省略，但請參閱（b）; 箭頭表示刺激的時間。 胰島素增加誘發[DA]_o 在shell中（通過55±10％），核心（通過37±5％）和CPu（通過20±4％）（***P<0.001）。 （b）胰島素的作用在殼中的生理範圍（1-30 nM）濃度依賴性（n= 22-24， F_5,133= 14.471， P<0.001），核心（n= 36-76， F_5,308= 16.318， P<0.001）和CPu（n= 30-62， F_5,253= 13.763， P<0.001），但在≥100nM時丟失。 （c）峰值誘發的代表性記錄[DA]_o 在施用胰島素（30 nM）期間或在InsR抑製劑HNMPA（5μM）存在下施用胰島素期間，在沒有施用藥物（Con）的NAc核心中的單個位點處的時間與時間的關係。 （d）平均峰值誘發[DA]_o 數據顯示HNMPA，InsR拮抗劑S30（961μM）和PI1K抑製劑LY3（294002μM）對胰島素（1 nM）的影響，但不是IGF-1R抑製劑PPP（1μM）（n= 29-76; P與單獨使用胰島素相比，> 0.9）。 對於 圖1a-d, n=每種藥物或胰島素濃度的3-6大鼠每個亞區域的位點數; 單因素方差分析，Tukey誠實顯著性檢驗（HSD）。 看到 補充圖1b，c 對於NAc shell和CPu數據。

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由於胰島素也能作用於類胰島素生長因子1受體（IGF-1R），儘管其濃度需超過100 nM（參考文獻1），我們試圖證實胰島素對誘發[DA] _o的增強作用是否依賴於胰島素受體（InsR）。結果證實了這一點，因為細胞內InsR抑制劑羥基-2-萘甲基膦酸（HNMPA）和InsR拮抗劑S961均能阻斷這種增強作用，而IGF-1R選擇性抑制劑苦參鹼²⁴（PPP）則不能（圖1c、d和補充圖1b、c）。隨後，我們研究了PI3激酶的參與，PI3激酶啟動了負責胰島素依賴性DAT調節的訊號路徑^¹⁹。濃度為 1 μM 時，P13K 抑製劑 LY249002 單獨使用對峰值誘發的 [DA] _o或V _max沒有影響（每種藥物n = 29–76 個位點（NAc 核心）， P > 0.05，單因素方差分析 (ANOVA)；數據未顯示），但阻止了胰島素對所有紋狀體亞區誘發的 [DA] _{o的影響（}圖 1d和補充圖1b,c）。

InsRs對DA軸突和ChIs的定位

觀察到生理水平胰島素下多巴胺（DA）攝取最大攝取速率（Vmax）的增加，^提示_DA軸突^上存在胰島素受體（InsR），這與先前在多種紋狀體標本中的研究結果一致^{^{18,19,20,21,22} 。儘管已證實中腦DA神經元上存在功能性InsR表達^15,23,24,25，但尚未}有^{關於紋狀體DA軸突上}InsR表達的報導。我們採用免疫組織化學方法對此進行了研究。紋狀體中密集的InsR免疫反應性限制了對DA軸突上InsR定位的定量評估，而DA軸突是透過DA合成酶酪胺酸羥化酶（TH）的免疫反應性來鑑定的。因此，我們採用了先前報告的方案^²⁷，該方案包括計數正常圖像視圖中與TH⁺輪廓重疊的InsR斑點，並在僅將InsR圖像旋轉90°後再次計數。如果InsR和TH⁺輪廓的明顯重疊是非特異性的，則無論正常或旋轉90°，則該方法都應給出統計學上相似的計數結果。然而，分析顯示InsR斑點與TH⁺輪廓的重疊減少了14±9%（n = 42個視野，P < 0.01，配對雙尾t檢定；數據未顯示），證實了InsR存在於DA軸突上。更令人感興趣的是，紋狀體的InsR免疫標記顯示，在大的細胞體上存在明顯的InsR表達，這些細胞體通過膽鹼乙醯轉移酶（ChAT，乙醯膽鹼合成所需的主要酶）的共免疫標記被鑑定為紋狀體膽鹼中間神經元（ChI）。在初步的全細胞記錄研究中，我們採用電生理學標準^²⁸鑑定膽鹼能中間神經元（ChIs）。隨後，我們用生物素標記了幾個神經元，並進行免疫組織化學染色；所有這些神經元（4/4）均對肌醇受體（InsR）和膽鹼乙醯轉移酶（ChAT）呈現免疫陽性（圖 2a）。對伏隔核（NAc）中InsR和ChAT共定位的後續評估證實，幾乎所有ChAT陽性神經元都表達InsR（96%；n = 27/28，來自兩隻大鼠的四個切片）。

  

  

(a）ChI填充生物胞素，然後免疫標記用於ChAT，和InsR（代表4 / 4生物胞素填充的ChIs）; 合併圖像顯示共定位; 比例尺，10μm。 （b - e）紋狀體ChI對胰島素（3 nM）之前和之後的一系列去極化電流脈衝（200-s持續時間; 300，400和120 pA; 30-s間隔）的響應。 （b）在電流注入期間動作電位（AP）放電損失中觀察到ChI（上部）中的尖峰頻率適應，而胰島素（下部）中的電流脈衝持續存在尖峰; 完整的數據集顯示在 d。 （c）胰島素誘導的AP數量增加的代表性時間過程，每個當前步驟為ChI b。 （d）在胰島素暴露之前和之後傳遞的電流脈衝期間AP數量的總結（n= 21配對刺激，7神經元，5大鼠）（e）顯示在對照條件下胰島素（+ Ins）的影響的平均反應（Con; n= 21配對刺激，7神經元，***P<0.001，配對兩尾 t-test），存在HNMPA（5μM）（n= 12配對刺激，4神經元，4大鼠， P>0.05，配對雙尾 t- 測試），以及PPP（1μM）（n= 18配對刺激，6神經元，6大鼠，**P<0.01，Wilcoxon匹配對符號秩檢驗）。 （f）平均單脈衝誘發[DA]_o 胰島素（30 nM）在美卡拉明（Mec;5μM）或DHβE（1μM）之前和之後的NAc核心標準化為100％峰值對照（n=來自20-40大鼠的每個亞區域的3-4個位點， P與對照相比> 0.05，未配對 t-測試）。 （g）平均單脈衝誘發[DA]_o 在來自雜合對照（Het）和。的前腦切片中 ChAT的 胰島素前後的KO小鼠（30 nM）標準化為100％峰值對照。 胰島素增加誘發[DA]_o 在雜合小鼠中，NAc殼中的190±23％，NAc核中的140±8％和CPu中的137±12％（n=每個基因型的15-25小鼠每個亞區的3-4個位點，**P<0.01，***P<0.001與未配對對照 t- 測試），但對誘發沒有影響[DA]_o 在任何紋狀體亞區域 ChAT的 KO小鼠（P> 0.1）。

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胰島素增加ChI興奮性

為了檢測胰島素受體（InsRs）對紋狀體膽鹼能中間神經元（ChIs）的功能，我們利用全細胞電流鉗記錄技術研究了胰島素對ChI興奮性的影響。我們使用一系列持續3秒的去極化電流脈衝來評估ChI的興奮性，以誘發一系列動作電位，這些動作電位表現出可靠的峰值頻率適應性（圖2b），通常在電流脈衝結束時出現動作電位消失。值得注意的是，胰島素（30 nM）減弱了峰值頻率適應性，導致動作電位數量隨時間逐漸增加（圖2c），最大增幅（圖2d、e）通常出現在胰島素暴露20至50分鐘之間。在沒有胰島素的情況下，對照組ChIs誘發的動作電位數量沒有改變（P > 0.05，配對雙尾t檢定；數據未顯示）。與在相同時間間隔內監測的對照神經元相比，暴露於胰島素的神經元誘發的動作電位數量變化顯著更大（對照組n = 12 對刺激，來自 4 個神經元；胰島素組n = 21 對刺激，來自 7 個神經元；F _{_1,25} = 5.63，因子P < 0.055；胰島素增加動作電位數量的作用可被 HNMPA 阻斷，但不能被 IGF-1R 選擇性抑制劑 PPP 阻斷（圖 2e），顯示胰島素引起的膽鹼能神經元興奮性增加是由胰島素受體 (InsR) 介導的。

誘發胰島素增強[DA]_o 需要nAChRs和ACh

以前的研究表明，ChIs和ACh通過DA軸突上的nAChRs有效調節紋狀體DA的釋放。^{29, 30, 31, 32, 33, 34}。 在急性胰島素暴露中，ChIs上的豐富的InsR表達和ChI興奮性的增強表明這些神經元可能是胰島素的新靶標，可導致DA釋放增強。 為了測試這一點，我們檢測了胰島素在mecamylamine（一種非選擇性nAChR拮抗劑）或二氫-β-紅黴素（DHβE）存在下的作用，二甲基-β-紅黴素（DHβE）是一種富含β2亞基的β2亞基（βXNUMX*）nAChRs的選擇性拮抗劑。 DA軸突³⁵。 誘發[DA]_o 在這些拮抗劑存在下很容易檢測到，即使兩種藥物都降低了單脈衝誘發的振幅[DA]_o （例如，通過NAc核心中的13-26％），如前所述^{29, 30, 31, 32}。 為了支持ACh和nAChRs的作用，胰島素對誘發的作用[DA]_o 美卡拉明或DHβE預防了圖2f）。 為了證實紋狀體ACh信號傳導參與胰島素增強的DA釋放，我們檢測了胰島素的作用 離體 來自小鼠的紋狀體切片，其中ChAT表達在前腦結構中被遺傳消融（前腦 ChAT的 KO小鼠），包括紋狀體³²。 儘管在這些小鼠中ChIs是完整的，但是ACh合成被廢除，這導致減少但仍然容易檢測到的單脈衝誘發[DA]_o，如前所述³²。 在對照雜合子同窩中，胰島素（30 nM）增加誘發[DA]_o 在NAc shell和core以及CPu中的37-90％（圖.2g），超過大鼠紋狀體中的擴增（例如， 圖 1）。 然而，胰島素對誘發的影響[DA]_o 整個前腦紋狀體複合體缺失 ChAT的 KO小鼠，證明胰島素介導的DA釋放增強需要紋狀體ACh，但不是來自ChIs的共同釋放的發射體，例如穀氨酸³⁶.

胰島素對誘發的影響[DA]_o 是飲食依賴

血漿和腦胰島素濃度與身體肥胖成正比^{6, 7, 8}，並可能導致大腦對胰島素敏感性的代償性變化。 因此，我們測試了飲食影響胰島素促進DA釋放的能力的假設，使用來自維持慢性FR或OB飲食的大鼠的紋狀體切片與AL對照。 正如預期的那樣，血漿胰島素水平與體重相關，FR中胰島素水平低於AL或OB大鼠（圖3a 以及 表2）。 儘管循環胰島素存在這些差異，但峰值誘發[DA]_o 在NAc shell和core中，CPu明顯較低 離體 來自兩個飲食組的紋狀體切片與AL相比（圖3b 以及 補充圖2 a，b），暗示除胰島素之外的因素控制絕對誘發[DA]_o。 紋狀體DA含量在飲食組之間沒有差異，表明釋放調節的變化而不是DA合成（補充圖2c）。 與動態調節的變化一致，紋狀體DA釋放到胰島素的敏感性顯著地依賴於飲食。 在FR大鼠中，胰島素濃度≤1nM，對AL沒有影響（圖1b），誘發增加[DA]_o (圖.3c），反映了EC的胰島素敏感性增加₅₀ FR紋狀體中的值（0.4-0.6 nM）比AL中的值低約一個數量級（比較 無花果1b 以及 3c）。 與之形成鮮明對比的是，OB紋狀體中胰島素的作用喪失了; 甚至是30 nM胰島素，對AL紋狀體有最大作用（圖1b），對OB沒有影響（圖.3c).

  

  

(a）血漿胰島素濃度與餵養組的體重呈正相關（R= 0.76）。 （b）平均單脈衝誘發[DA]_o 在NAc核心（見 補充圖2a，b 對於NAc殼和CPu）在FR（38±4％）和OB（25±4％）與AL（n=每個飲食組50-60大鼠的5-6位點， F_2,156= 23.337，單向ANOVA，Tukey HSD; ***P<0.001）; OB與FR（P<0.08）。 （c）誘發的敏感性[DA]_o FR中胰島素增強，但OB丟失（n=每個飲食組21-49大鼠每個亞區的2-4位點，單向ANOVA，Tukey HSD），所有亞區的FR對AL大鼠的敏感性更高（P每個區域<0.001； 兩向方差分析； 中央處理器： F_{（濃縮飲食; 3,286）}= 10.253; 核心： F_{（濃縮飲食; 3,353）}= 6.166; 貝殼： F_{（濃縮飲食; 3,195）}= 10.735）。

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這些數據顯示紋狀體InsR敏感性與體脂含量呈負相關。然而，這些飲食依賴性差異也可能反映了nAChR敏感性的改變。因此，我們測定了各飲食組伏隔核核心區域對尼古丁的濃度反應。尼古丁會導致nAChR脫敏，可透過比較100 Hz五脈衝串刺激誘發的[DA] _o與單脈衝刺激誘發的[DA] _o的比值（5脈衝：1脈衝比值）來量化，以此作為nAChR激活/脫敏的指標^{^30,31}。採用此方法，我們發現各飲食組伏隔核核心區nAChR敏感性無差異（補充圖3a-c）。此外，在伏隔核核心區（補充圖3d ）或尾狀核（未顯示）中，各飲食組的對照組5p:1p比值無差異，顯示飲食不改變nAChR依賴的多巴胺釋放調節。因此，與AL組相比，FR組大鼠紋狀體胰島素受體敏感度似乎增強，而OB組大鼠則無此現象，且在生理濃度胰島素下紋狀體多巴胺釋放的調節喪失。

NAc殼胰島素調節條件性風味偏好

食物偏好由攝入前和攝入後因素產生; 每種機制都沒有完全解決，但目前的證據都暗示NAc DA信號傳導^{37, 38}。 鑑於血漿和腦脊液（CSF）胰島素水平在外周血糖升高後迅速上升⁶並且可以在血漿胰島素升高的5 min內檢測到紋狀體中胰島素的增加⁷，合理地假設在餐中釋放外周胰島素可以增強NAc DA的釋放並有助於攝入後的獎賞機制。 我們採用了先前描述的風味偏好協議³⁷ 在大鼠中使用糖精加糖的葡萄糖溶液來檢驗通過在NAc中局部施用胰島素抗體（InsAb）來阻斷內源性胰島素作用的假設將降低對配對風味的偏好。 Insab在阻斷胰島素作用方面的功效進行了測試 體外 測定DA攝入紋狀體突觸體。 胰島素（30 nM）引起顯著增加 V_最大 來自NAc或CPu的突觸體（補充圖4），符合我們的要求 V_最大 紋狀體切片的數據（表1和以前的研究^{18, 19, 20, 21, 22, 23}。 在沒有胰島素的情況下，InsAb和對照抗體免疫球蛋白G（IgG）均未改變 V_最大 用於DA攝取與對照。 在IgG存在下，胰島素仍然導致顯著增加 V_最大; 然而，胰島素的作用 V_最大 在InsAb面前丟失了（補充圖4).

為了最大限度地減少組織損傷並保持目標組織的敏感性，我們測試了兩組受試者，交替進行伏隔核（NAc）內微注射和模擬微注射，而不是使用單組受試者並將一種口味溶液與免疫球蛋白（InsAb）配對，另一種口味溶液與載體配對。因此，在單瓶條件反射訓練期間，實驗組接受與兩種口味之一配對的免疫球蛋白微注射，並在交替的訓練中接受與另一種口味配對的模擬微注射（圖4a，左）。對照組接受模擬微注射，並交替進行磷酸鹽緩衝液（PBS）或免疫球蛋白G（IgG）的微注射。在條件反射訓練期間，兩種口味溶液均含有葡萄糖。我們預期對照組的微注射組對不同口味不會有偏好，而免疫球蛋白微注射組的偏好會傾向與模擬微注射配對的口味。

  

  

(a）圖解說明一瓶調節（左）和兩瓶測試（右）。 （b）在一瓶調理期間消耗的體積（ml）。 輸注調節期和顯微注射治療之間存在顯著的相互作用（n=每組19-20大鼠， F_(3,111)= 3.088， P<0.05，採用2×4混合ANOVA並在輸注調節階段重複進行測量）。 與對照組相比，InsAb顯微注射顯著降低了消耗量（t（40）= 3.026，**P<0.01）和第四（t（40）= 3.052，**P<0.01，帶保護性的單尾 t - 測試）輸液。 模擬注射對兩組的消耗均無影響（F_3,111= 1.110，2×4混合ANOVA，重複測量模擬調節會話）。 （c）在兩瓶香味偏好測試期間消耗的體積。 調理期間風味和顯微注射處理之間存在顯著的相互作用（F_1,37= 5.36， P<0.05，雙向混合方差分析（ANOVA），並重複測量風味）。 與模擬配對的風味相比，InsAb組消耗的InsAb配對風味明顯更少（t（18）= 2.82， ** P<0.01，帶保護性的單尾 t-測試）; 對照組未顯示風味偏好（t（19）= 0.803， P> 0.05，受保護 t-測試）。 比較組，InsAb大鼠飲用的輸液配對風味顯著降低（t（40）= 1.96，*P<0.05）和更多的模擬配對風味（t（40）= 1.77，*P<0.05，帶保護性的單尾 t- 測試）比控制。

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在單瓶調理期間，與第三次和第四次輸注期間的載體相比，InsAb顯微注射顯著降低了消耗量（圖4b）。 相比之下，在所有四次模擬注射過程中，兩組都消耗了相同體積的溶液（F_3,111= 0.127， P>0.05，混合雙向ANOVA）（圖4b）。 在總共八次調理期後，在兩瓶測試中評估風味偏好，其中大鼠同時獲得兩種調味溶液（圖4a）。 統計分析顯示風味與調理期間接受的顯微注射治療之間存在顯著的相互作用（圖.4c）。 與模擬配對風味相比，InsAb組消耗的InsAb配對風味顯著減少（圖.4c），而車輛組沒有顯示出風味偏好（圖.4c），暗示完整的胰島素信號傳導有助於選擇甜的熱量溶液。 與載體相比，InsAb顯微注射的大鼠顯著減少了輸注配對的風味，並顯著增加了模擬注射配對的風味（圖.4c）。 顯微注射IgG（t（9）= 0.792。 P>0.05，受保護 t- 測試）或PBS（t（9）= 0.442。 P>0.05，受保護 t - 試驗）對風味偏好沒有影響（數據未顯示），反對InsAb顯微注射的非特異性作用降低消費或風味偏好的可能性。 還應該注意的是，InsAb組在測試中的偏好並不是對不那麼新穎的味道的偏好，因為InsAb組的會話和會話類型（實際輸注與模擬輸注）之間沒有相互作用（F_3,54= 1.584， P> 0.05，雙向ANOVA）。 也就是說，相對於InsAb輸注配對風味，InsAb組沒有消耗更多的模擬輸注配對風味； 相反，治療組之間的差異僅在輸注條件治療期間出現。 總體而言，這些數據表明，NAc中的胰島素在增強對發出血糖負荷信號的風味的偏愛中起作用。

我們在此報導胰島素通過InsRs調節Ch1興奮性以nAChR依賴性方式擴增紋狀體DA釋放。 我們的研究結果表明，胰島素可以作為一種獎勵信號，除了它在信號飽足感中的既定作用。 值得注意的是，胰島素對DA釋放的影響受飲食調節，FR後對胰島素的敏感性顯著增加，但對OB飲食的胰島素增強調節完全喪失。 這些變化似乎反映了與循環胰島素水平呈負相關的InsR敏感性變化，因為發現血漿胰島素水平與飲食有關，但nAChR敏感性則不然。 最後，我們對行為動物的風味偏好研究暗示NAc殼中的胰島素信號傳導影響食物偏好，這不僅暗示胰島素在食物相關學習中，而且還證實其作為獎勵信號的作用。

^淨[ DA] _{o反映了DA釋放和DA}^透過DAT攝取之間的平衡。先前的證據顯示胰島素可以調節DAT活性^{^{18,19,20,21,22,23} ，因此預測}胰島素增加會透過增加DA攝取導致誘發的[DA]o淨下降。然而，我們發現，在紋狀體中，胰島素的作用更為複雜。儘管胰島素暴露確實增加了DAT的最大攝取速率（V_max），但胰島素的主要作用是促進DA釋放^，_而非^促進DA攝取。^在伏_隔核殼部和核心部以及紋狀體中，在生理範圍內的胰島素濃度下，誘發的[DA] _{o均持續增加。雖然在100 nM的超生理濃度下，誘發的[DA] o}恢復至對照水平，但V _{_max}也與對照水平無變化，這排除了胰島素主要作用於DAT的可能性。相反，對攝取和釋放的影響喪失表明，在高胰島素濃度下，胰島素受體（InsR）脫敏或下游訊號通路下調。事實上，胰島素受體在與外周組織中的胰島素結合後會迅速發生內吞作用和降解^¹ ，並且越來越多的證據表明，短期暴露於高水平胰島素或高熱量飲食後，神經元胰島素受體的敏感性會喪失^{^{10 , 11 , 39}} 。

本文所通報的胰島素增強紋狀體多巴胺釋放的主要作用與另外兩個近期離體腦片研究的結果相反。在第一項研究中，胰島素導致電刺激誘發的[ ^³H ]DA從紋狀體腦片溢出減少，但當DAT被抑制時，[³H]DA溢出^增加²²。鑑於釋放的[ ^³H ]DA必須逃脫DAT介導的組織攝取才能在灌流液中被偵測到，因此此實驗方案對DAT的調控尤為敏感。我們的結果表明，胰島素除了增強DAT介導的攝取外，還通過激活膽鹼受體（ChI）和尼古丁乙醯膽鹼受體（nAChR）來增強多巴胺釋放，這可以解釋當阻斷對DAT的競爭性作用時觀察到的胰島素增強[³H]DA溢出的看似矛盾的增加²²。第二項研究採用FCV直接檢測VTA中胞體樹突多巴胺的釋放，但也發現胰島素對多巴胺攝取有顯著影響，表現為誘發多巴胺濃度[DA] _{_o}降低（參考文獻23 ）。從局部微迴路到胞體樹突與軸突多巴胺釋放機制^⁴⁰等諸多因子的差異可能導致這種區域性差異。然而，如下文將進一步討論，胰島素在不同區域的作用很可能是互補的，而非矛盾的。

先前，人們一直認為胰島素依賴性多巴胺（DA）訊號調節是透過直接活化DA神經元上的胰島素受體（InsRs）來實現的。本文研究表明，紋狀體膽鹼中間神經元（ChIs）上也表達InsRs，並且胰島素能夠調節ChIs的興奮性，從而增強紋狀體DA的釋放，這可能在胰島素對飲食的影響中發揮關鍵作用。紋狀體ChIs接受來自丘腦板內核神經元的投射，這些神經元在顯著感覺刺激下表現出爆發式放電，並有助於驅動ChIs中爆發-暫停放電模式，這種模式在引導注意力、強化和聯想學習中至關重要^⁴¹。因此，胰島素作用於紋狀體ChIs上的InsRs可能增強感覺食物線索對紋狀體丘腦放電反應的影響，進而提高對攝取食物獎勵價值的認知。膽鹼受體活化直接促進紋狀體多巴胺釋放，這表明刺激膽鹼受體的因素在多巴胺釋放的觸發中起著特殊作用^³³。我們的數據首次為此提供了支持性證據，胰島素增強的膽鹼受體興奮性和乙醯膽鹼訊號驅動多巴胺釋放的動態增加。

胰島素存在下DA釋放增加也顯示ACh訊號傳導並未增強到足以導致nAChR脫敏或毒蕈鹼型ACh受體（mAChR）活化的程度，而這兩者都能抑制單脈衝誘發的[DA] _o（參考文獻29、30、31、42 ）。因此，本文所報告的機制與ACh活化mAChR不同，後者與厭惡感和飽足感相關⁴³ ^。

與AL組大鼠相比，FR組和OB組大鼠的單脈衝誘發[DA] _o均較低；儘管這些結果與先前的報導^{^44,45,46一致，但}我們的研究首次在恆定的時間範圍內系統地比較了兩種飲食組三個紋狀體亞區的[DA]o。飲食依賴性DA釋放變化的潛在機制尚未闡明，也超出了本研究的範圍。然而，鑑於FR和OB飲食對血漿胰島素水平的影響相反，兩組誘發[DA]o的降低不太可能^是飲食依賴性胰島素水平所致_。

另一方面，飲食引起的胰島素受體（InsR）敏感性變化以及由此導致的飲食依賴性血漿胰島素水平變化，最有可能解釋FR組大鼠胰島素敏感性增加和OB組大鼠胰島素反應性喪失。沒有證據顯示FR組或OB組大鼠與AL組相比，nAChR敏感性改變。儘管我們的研究結果是首批顯示FR組紋狀體InsR敏感性增加的研究之一^¹⁸ ，但體重減輕可能伴隨腦脊髓液（CSF）中胰島素水平降低^{⁷，這可能導致FR組大鼠多巴胺（ DA ）}釋放對胰島素的敏感性增強。相反，OB組大鼠胰島素反應性喪失與先前關於體重增加或肥胖飲食可導致腦InsR敏感性降低的證據相符^{^3,10,11}。

我們的離體腦片數據支持胰島素可能傳遞獎賞和飽腹訊號這一假設。我們透過在味覺偏好條件反射訓練期間，於伏隔核（NAc）殼部雙側注射胰島素抗體（InsAb）來阻斷內源性胰島素的作用，從而驗證了這個假設。與獎賞作用一致，阻斷胰島素的作用降低了小鼠對配對的含葡萄糖溶液的偏好，使其偏好程度低於胰島素訊號完整時小鼠對相應溶液的偏好程度。阻斷NAc殼部的胰島素作用也降低了小鼠在單瓶條件反射訓練期間對配對溶液的攝取量，而模擬注射或對照注射對攝取量沒有影響。這些數據表明，NAc殼部的胰島素在食物偏好中發揮作用。先前的研究表明，NAc中完整的DA訊號傳導對於味覺條件反射的習得是必需的^{^37,38}，這證實了NAc DA在介導營養溶液的強化作用中的作用。由此可見，在胰島素供應充足的情況下，對葡萄糖溶液的偏好表明胰島素並非主要作用於伏隔核殼部DAT介導的多巴胺攝取，因為DAT介導的多巴胺攝取預計會降低[DA] _{_o}，從而減少對照配對口味的攝入量。我們的結果也與先前研究的結果一致，該研究表明，在伏隔核殼部微量注射胰島素可延長動物口服蔗糖的自我給藥時間，同時蔗糖攝入量略有增加^{²⁶ ，這與預期的多巴胺攝取增加的結果相反。總體而言，這些行為數據與胰島素對紋狀體膽鹼能中間神經元（ChI）的影響以及多巴胺釋放增強的預測相符。然而，考慮到紋狀體中廣泛存在胰島素受體（InsR） ^1,14}，這些結果並不排除紋狀體微迴路的其他成分參與所監測的行為。

本文所報導的研究首次證實，胰島素在傳遞食物熱量值以及由此產生的餐後愉悅感方面發揮作用，這對於胰島素在體重過輕和肥胖人群中的影響具有重要意義。多項研究表明，食物攝取後的效應，無論味覺轉導路徑是否完整^⁴⁷，都會增加伏隔核（NAc）多巴胺（DA）的釋放，並強化進食行為^{^37,47}。因此，吸收後的胰島素反應可能編碼餐點的血糖生成率，並有助於強化食物偏好和促進進食的行為。然而，循環胰島素水平和中樞胰島素受體（InsR）敏感性的極端變化可能在異常行為以及適應性行為中發揮作用。例如，低胰島素血症和代償性InsR敏感性上調可能是食物反應性低下（FR）患者易暴食的一個因素^⁴⁸。相反，II 型糖尿病或肥胖症的中樞胰島素不敏感性（如 OB 大鼠所示）可能導致攝入後獎賞感降低，從而促使攝入高血糖指數的食物以進行補償^{49 , 50。}因此，紋狀體胰島素敏感性的增加或降低都可能導致病理性進食，從而導致暴食和/或肥胖。

總體而言，我們的研究結果揭示了胰島素作為獎賞訊號的新功能。這項功能與其已知的飽足訊號功能形成對比，包括最近的研究發現，將胰島素微量注射到腹側被蓋區（VTA）可以降低享樂性進食和對與食物獎賞相關的線索的偏好^{^23,24}。這就引出了一個問題：如何調和胰島素在這些多巴胺依賴性功能中看似相反的作用？答案可能是，這些作用是互補的，而非矛盾的。目前的研究結果表明，紋狀體中的胰島素傳遞了所攝取食物的獎賞價值。胰島素在傳遞飽足訊號方面的雙重作用可能僅僅使其能夠發揮結束進食的重要功能，同時建立對食物營養價值和獎勵特性的記憶，從而強化進食行為的重複。

動物處理

動物實驗程序均符合美國國立衛生研究院（NIH）指南，並經紐約大學醫學院動物照護和使用委員會批准。所有動物均置於12小時光照/12小時黑暗循環環境中，光照時間為06:00至18:00；離體腦片製備時間為08:00至12:00。在AL組大鼠和小鼠進行機制研究時，使用成對飼養動物的離體腦片；而所有飲食組比較和行為學研究中的大鼠均單獨飼養。

大鼠飲食療法

成年雄性Sprague-Dawley大鼠（Taconic公司）在8-10週齡時開始進行為期21-30天的飲食方案試驗。大鼠以半隨機分組：先依初始體重排序，然後將每組三隻大鼠隨機分配到各飲食組。 AL組大鼠與FR組或OB組的配對大鼠在相同時間內可自由攝取鼠糧。所有大鼠均可自由飲水。食物限制的實施方式與先前的研究^⁵¹相同；簡而言之，大鼠每日攝取標準鼠糧的40-50%，直到體重下降20%，之後調整食物攝取量以維持體重。 OB組大鼠可自由攝取鼠糧和巧克力口味的Ensure營養液^⁵² ，Ensure是一種適口性極佳、脂肪和糖含量適中的液體營養液。

前腦 ChAT的 敲除老鼠

將攜帶條件性ChAT條件性floxed等位基因（ChAT ^{^flox}）的小鼠與Nkx2.1 ^Cre轉基因小鼠雜交，以獲得乙醯膽鹼（ACh）合成缺失僅限於前腦的小鼠^³²。非突變轉基因同窩小鼠作為對照；它們的基因型為Cre^⁺ ; ChAT ^{^flox/+}和Cre^⁻ ; ChAT ^{^flox/flox}，統稱為「雜合子」。用於腦片研究的成年雄性小鼠可自由攝取食物和水。

離體 切片製備和生理解決方案

用50 mg kg對大鼠或小鼠進行深度麻醉 ^{- 1} 戊巴比妥（腹膜內（ip））並斷頭。 對於伏安法，在含有（以mM計）：NaCl的冰冷HEPES緩衝人工CSF（aCSF）中的Leica VT300S振動刀片切片機（Leica Microsystems; Bannockburn，IL）上切割冠狀前腦切片（400-1200-μm厚度）。 （120）; 碳酸氫鈉₃ （20）; 葡萄糖（10）; HEPES酸（6.7）; KCl（5）; HEPES鈉鹽（3.3）; 氯化鈣₂ （2）; 和MgSO₄ （2），用95％O平衡₂/ 5％CO₂。 然後在實驗前將切片在室溫下保持在該溶液中1 h^{30, 32, 53}。 對於電生理學，在麻醉後，用含有（以mM計）的冰冷溶液經心臟灌注大鼠：蔗糖（225）; KCl（2.5）; 氯化鈣₂ （0.5）; 氯化鎂₂ （7）; 碳酸氫鈉₃ （28）; 氫化鈉₂PO₄ （1.25）; 葡萄糖（7）; 抗壞血酸（1）; 和丙酮酸（3），並用95％O平衡₂/ 5％CO₂。 在該溶液中切割切片，然後轉移到含有（以mM計）：NaCl（125）的改良的aCSF中的回收室中; KCl（2.5）; 氫化鈉₂PO₄ （1.25）; 碳酸氫鈉₃ （25）; 氯化鎂₂（1）; 氯化鈣₂ （2）; 葡萄糖（25）; 抗壞血酸（1）; 丙酮酸（3）; 和 肌- 肌醇（4），用95％O平衡₂/ 5％CO₂; 該溶液最初在34℃，然後逐漸冷卻至室溫⁵⁴。 所有伏安法和生理學實驗均在32°C的浸沒式記錄室中進行，其以1.5 ml min灌注。 ^{- 1} 含有aCSF（以mM計）：NaCl（124）; KCl（3.7）; 碳酸氫鈉₃ （26）; 氯化鈣₂ （2.4）; 硫酸鎂₄ （1.3）; KH₂PO₄ （1.3）; 和葡萄糖（10），以及牛血清白蛋白（BSA，0.05-0.1 mg ml） ^{- 1}）用95％O平衡₂/ 5％CO₂; 在實驗之前，使切片在該環境中平衡30 min。

快速掃描循環伏安法

以快速電流伏安法（FCV）對雄性大鼠或膽鹼乙醯轉移酶（ChAT）前腦敲除小鼠及其雜合子對照組（5-8週齡）的腦片進行誘發多巴胺（DA）釋放研究^{^{32 , 53}}。 ChAT敲除小鼠的研究採用盲法，但大鼠飲食組的表型明顯，無法採用盲法。伏安法測量使用Millar伏安儀（可特別申請倫敦大學聖巴塞洛繆皇家醫學與牙科學院的Julian Miller博士）。 FCV採用常規三角波形，掃描範圍為-0.7至+1.3 V（相對於Ag/AgCl電極），掃描速率為800 V s ^{^-1} ，採樣間隔為100 ms ^{^{30 , 32 , 53}}。資料擷取使用DigiData 1200B A/D轉換板，並由Clampex 7.0軟體（Molecular Devices公司）控制。以同心刺激電極誘發多巴胺（DA）釋放；刺激脈衝幅度為0.4–0.6 mA，持續時間為100 μs^{^{30 , 32 , 53}}。在伏隔核（NAc）核心區和尾狀核（CPu）採用局部單脈衝刺激；然而，在伏隔核殼區則使用短暫的高頻脈衝串（100 Hz，5個脈衝）來增強誘發的多巴胺濃度_。兩種刺激模式皆能誘發依賴動作電位和Ca ^²⁺的多巴胺釋放，不受同時釋放的麩胺酸和GABA的影響^{^{42 , 55}}，但可同時釋放的乙醯膽鹼（ACh）促進<sup> ^{29 , 30 , 31 , 32, 31 , 32 , 31 , 32, 31 , 32 , 31 , 32 , 31 , 32, 31 , 32 , 31}。為了量化誘發的 [DA] _o，在每次實驗後，在 aCSF 中，以及在給定實驗中使用的每種藥物存在的情況下，於 32 °C 下用已知濃度的 DA 對電極進行校準⁵³。

採用兩種方案之一進行伏安法實驗，以評估胰島素對誘發多巴胺濃度[DA] _o的影響。首先，透過監測單一位點每5分鐘的誘發[DA] _{o ，確定胰島素（Sigma，I5523）作用的時間進程。在獲得穩定的誘發[DA] o}（通常需要4-5次測量）後施加胰島素；胰島素的作用在50-60分鐘後達到最大值，之後誘發[DA] _o在整個實驗期間保持在該水平（通常胰島素總暴露時間為90分鐘；圖 1c）。隨後，在對照條件下（人工腦脊髓液或人工腦脊髓液加藥物），_以及在胰島素作用達到高峰時（採樣時間為60-80分鐘），分別在三個紋狀體亞區切片（距前囟1.5毫米處）的4-5個離散位點記錄誘發的多巴胺濃度[DA]o，以評估胰島素的作用。然後，將每個亞區的樣本取平均值。切片製備後，胰島素的作用隨時間推移而減弱；為了最大限度地減少離體實驗時間並優化動物使用，通常同時在記錄室中測試來自同一動物的兩個切片。用於挑戰胰島素作用的藥物在註射胰島素前15分鐘以灌注人工腦脊髓液（aCSF）給藥，包括HNMPA三乙醯氧基甲酯（HNMPA-AM _3； Enzo Life Sciences）、S961（Novo Nordisk）、LY294002（Sigma）、鬼臼毒素（PPP；Tocris）、HocrisDH（Mocris）、美卡拉明）。如結果部分所述，透過比較在0-500 nM尼古丁（Sigma）存在下，伏隔核（NAc）核心中5 p（100 Hz）誘發的峰值[DA] _{_o}與1 p誘發的峰值[DA]_o的比值（5 p:1 p比值）<sup> <sup>30,314類化合物的比值（5 p:1 p比值） ^尼古丁之間改變了不同飲食組（31,31 31, 31] 尼古丁之間的非飲食）。

的測定 V _最大 來自誘發[DA]_o 紋狀體切片中的瞬變

為了評估胰島素誘導的 DAT 介導的 DA 攝取的變化，將誘發 [DA] _o曲線下降相的初始部分擬合到 Michaelis-Menten 方程，以提取_{V max（最大攝取速率常數）56。 K m} （_與DAT^對DA的親和力成反比）固定為 0.2 μM，已知在紋狀體亞區相似⁵⁷，且不受胰島素的影響（見補充圖 4說明）。

全細胞記錄

腦片取自29至35日齡雄性大鼠；記錄條件與多巴胺釋放研究相同。採用常規方法進行全細胞電流鉗記錄^⁵⁴。紋狀體膽鹼中間神經元（ChI）使用配備紅外線差分乾涉對比光學系統和40倍水浸物鏡的奧林巴斯BX51WI顯微鏡（美國奧林巴斯公司，賓夕法尼亞州森特瓦利）進行觀察。移液管溶液成分（單位：mM）：葡萄糖酸鉀（129）；氯化鉀（11）；HEPES（10）；氯化鎂（ ₂）；EGTA（1）；ATP鈉（ ₂）；GTP鈉_（ 0.3）；並以氫氧化鉀調節pH至7.2-7.3。為評估ChAT免疫反應性，在移液管溶液中加入0.3%生物素，並短暫記錄（約5分鐘）以最大程度地減少細胞內物質的稀釋。移液管電阻約為3–5 MΩ。記錄使用Axopatch 200B放大器（Molecular Devices，Sunnyvale CA）進行，並進行2 kHz低通濾波。膽鹼能中間神經元（ChI）的鑑定依據已建立的電生理學標準^²⁸；大多數ChI最初處於持續活化狀態，但在膜片鉗記錄後，其活性會不同程度地降低。然而，對電流注入的反應通常穩定且隨時間推移保持一致，因此用於研究胰島素對ChI興奮性的影響（見結果）。在研究胰島素受體（InsR）和胰島素樣生長因子-1受體（IGF-1R）在此反應中的作用的實驗中，在對ChI進行膜片鉗記錄前，至少20分鐘施加HNMPA或PPP。單獨使用胰島素的最大效應通常在暴露約16分鐘後出現，儘管在某些細胞中，這種增加直到50分鐘或更長時間才達到最大值。此外，在PPP記錄的六個神經元中的四個中，胰島素導致動作電位數量最初減少，然後恢復到並超過初始動作電位數量。因此，在所有實驗中，胰島素的作用均透過比較其對動作電位數量的最大影響與胰島素應用前立即誘發的動作電位數量來量化。達到峰值效應所需時間的明顯差異可能反映多種因素，包括記錄細胞在腦片中的深度。在相似的時間點，我們也記錄了未施加胰島素時膽鹼能中間神經元（ChI）的誘發動作電位。

高效液相色譜

以高效液相層析-電化學檢測法測定大鼠紋狀體切片（厚度400 μm）中的多巴胺（DA）含量^⁵⁸。將切片對在32℃的人工腦脊髓液（aCSF）中平衡30分鐘，然後將每對切片中的一片在32℃的aCSF中繼續孵育60分鐘，另一片則在含有10或30 nM胰島素的aCSF中孵育。為進行飲食組比較，在恢復後30-60分鐘之間收集紋狀體組織。孵育後，小心移除切片中多餘的aCSF，秤取7-10 mg紋狀體組織樣本，用乾冰冷凍，然後儲存於-80℃。分析當天，將樣品在冰冷的洗脫液中進行超音波處理，用氬氣脫氧⁵⁸，在微型離心機中旋轉 2 分鐘，並將上清液直接注入 HPLC 色譜柱（BAS，印第安納州西拉法葉）；檢測器是玻碳電極，相對於 Ag/AgCl 設置為 0.7 V。

免疫組化

^{進行免疫組織化學標記時，大鼠先以戊巴比妥鈉（50 mg kg⁻¹} ，腹腔注射）麻醉，然後經心臟灌注PBS（154 mM NaCl，10 mM磷酸鹽緩衝液，pH 7.2），隨後灌注4 ^%多聚甲醛PBS溶液；腦組織，切取冠狀切片（20 μmsup> 20 μmsup> 20 μm 2074 30 ^{μm ）}。免疫螢光影像使用配備數位相機（由Spot軟體（Diagnostic Instruments Inc.）控制）的Nikon PM 800共聚焦顯微鏡（100倍物鏡，數值孔徑=1.4）或Zeiss LSM 510共聚焦顯微鏡（63倍物鏡，數值孔徑=1.2）取得。雷射分別為氬離子雷射（488 nm）、氦氖雷射（543 nm）及氦氖雷射（633 nm）。共聚焦顯微鏡軟體為每台雷射選擇合適的濾光片。針孔大小隨所用物鏡和z軸掃描層厚而變化；我們選擇軟體指示的最佳針孔值（通常為30 μm）。使用反捲積軟體（AutoQuant Imaging）分析數位文件，並使用Adobe Photoshop 7.0處理最終影像。所有影像均調整了亮度和對比度；此類調整對影像的所有部分進行了統一處理。使用兩種酪胺酸羥化酶（TH）抗體鑑定紋狀體多巴胺能（DA）軸突：多克隆兔抗TH抗體AB152（1:800）和單株鼠抗TH抗體MAB318（1:500）（皆購自Chemicon公司）。使用三種胰島素受體（InsR）抗體：sc-57342和sc-09（1:100；購自Santa Cruz公司），以及PP5（由輝瑞公司惠贈）。每種抗體的特異性已在先前的研究中得到證實^{^{60 , 61}}，本研究也透過在相應阻斷勝肽存在的情況下，未觀察到抗體sc-57342或PP5的免疫標記而進一步證實了這一點。 ChAT抗體為AB144（1:200；Millipore），生物素為Vector公司產品（1:200）。所用二抗為驢抗兔Alexa 488（Invitrogen）、驢抗兔Cy2（Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME）、驢抗山羊Cy3（Jackson）和驢抗小鼠Cy5（Jackson）。

為了評估InsR在TH+軸突中的共定位情況，我們採用了先前描述的方法來鑑定DA軸突中ATP敏感性K ^{+通道的孔道形成亞基Kir6.2的存在²⁷}。代表InsR的斑點分佈在調整後的影像中，顯示其與TH免疫反應性的重疊可能在某種程度上是偶然發生的。為了驗證這個假設，我們對兩隻大鼠的三個NAc免疫標記切片中的42個獨立視野中的InsR/TH重疊區域進行了計數。然後將InsR數位檔案順時針旋轉90°並重複計數；旋轉後，大多數視野中與TH共定位的InsR斑點數量減少（見結果）。旋轉後重疊數量的減少^²⁷顯示了每個紋狀體視野中與DA軸突相關的InsR斑點的比例。

血糖和胰島素ELISA

在斷頭時採集軀幹血液進行切片研究。立即使用標準血糖儀測定血糖。胰島素檢測，另取血液置於含EDTA的試管中，以1,500 g離心15分鐘；收集上清液（血漿），並儲存於-80℃直至使用ALPCO大鼠胰島素ELISA試劑盒進行檢測。

套管放置和組織學驗證

41隻成年雄性Sprague-Dawley大鼠（Taconic和Charles River公司），初始體重350-425 g，用氯胺酮（100 mg kg⁻¹，腹腔注射）和賽拉嗪（10 mg kg⁻¹，腹腔注射）麻醉^，並^立體定位植入兩根慢性留置的導引套管（26號），套管雙側置於伏隔核（NAc）內側殼^62的輸注位點背側2.0 mm處（距前囟前1.6 mm；距矢狀縫外側2.1 mm，套管尖端向中距顱線8°術後麻醉甦醒後及隔天早晨，大鼠均皮下注射氟尼辛（2.0 mg kg⁻¹ ^）作為術後止痛藥。術後一周，將大鼠置於自由進食（FR）條件下（如上所述），並在研究剩餘時間內維持其術後恢復體重的80%。行為學測試結束後，透過組織學方法確定插管位置。每隻大鼠均以二氧化碳處死_，斷頭後取出腦組織，並固定於10%中性緩衝福馬林溶液中48小時以上。使用Reichert-Jung冷凍切片機切取40 μm厚的冠狀切片，解凍後貼於明膠包覆的玻片上，並以甲酚紫染色。只有當兩個插管都位於伏隔核內側殼⁶²（包括殼/核或殼/嗅結節交界處）時，才使用來自該大鼠的數據（補充圖5）；基於這些標準，兩隻大鼠被排除在最終分析之外。

風味偏好調理預曝光

大鼠在水中以30-h間隔接受一次過夜（在家籠中）和每天六次0.2-min-每天預暴露（在測試室中）至48％糖精鈉（Sigma）的水。 然後大鼠在5％不加糖的葡萄或櫻桃Kool-Aid（卡夫食品）中在水中接受兩次0.2-min-每天暴露於0.05％糖精鈉的過程。 對於第一次Kool-Aid預曝光療程，一半的大鼠接受櫻桃味的溶液，另一半接受葡萄味的溶液。 在第二次Kool-Aid預曝光期間，味道被逆轉，以確保所有大鼠對每種味道進行取樣。 測量所有暴露前會話的攝入量。 測試室是帶有新鮮床上用品的透明塑料籠。 對於所有暴露前期，大鼠可以在腔室兩側獲得相同的溶液。 除了隔夜暴露前會議，所有會議都在行為程序室進行，在任何培訓或測試之前都有30-min適應期。

單瓶調理

先前研究表明，將胰島素抗體（InsAb）微量注射到腹內側下丘腦可以阻斷胰島素對攝食行為和胰高血糖素分泌的影響^{^{63 , 64}}。本研究採用此方法評估胰島素在食物選擇強化的潛在作用。根據暴露前平均攝取量，將大鼠半隨機分為兩組：對照組和實驗組（InsAb組）。對照組大鼠在攝取兩種口味溶液中的一種之前，分別在伏隔核（NAc）殼部注射賦形劑（微量注射PBS；10 mM磷酸鹽緩衝液中含有137 mM NaCl和2.7 mM KCl）或IgG（Abcam ab81032；0.5 μg/ ^μl PBS溶液，直接使用），並在另一種口味注射溶液之前進行模擬。實驗組中，大鼠在接觸一種調味溶液前，先接受伏隔核殼部（NAc shell）的InsAb微量注射（Abcam ab46707；0.5 μl，濃度為1 μg/μl，^溶於PBS，直接注射），然後在接觸另一種調味溶液前接受模擬微量注射。實驗採用兩組受試者，交替進行液體微量注射和模擬微量注射，從而將微量注射的總次數限制在四次以內，最大限度地減少可能的組織損傷和注射部位的敏感性喪失^⁶⁵。液體微量注射，將對照溶液或InsAb分別裝入兩段30 cm長的PE-50管中，一端連接裝有蒸餾水的5 μl Hamilton注射器，另一端連接31號注射器套管，套管超出植入導管2.0 mm。在 90 秒內以 0.005 μl s ⁻¹的速率輸送 0.5 μl 的輸注量；注射器留在原位約 60 秒，以便藥物擴散，然後用針芯替換注射器。

在完成顯微注射或模擬顯微注射的2 min內將大鼠直接轉移至行為室。 調理溶液含有0.2％糖精鈉，0.05％不加糖的葡萄或櫻桃Kool-Aid和0.8％葡萄糖。 解決方案訪問限制為每會話30分鐘。 在每組中，半隨機分配和平衡具有飲用通道的室的成對風味和側面。 顯微注射之間的間隔至少為72 h，在輸注和模擬會話之間交替進行總共八次調節。

兩瓶偏好測試

在最後一次調理後48小時，將大鼠放入測試室中，同時獲得兩種調理風味; 溶液是0.2％葡萄或櫻桃Kool-Aid中的0.05％糖精鈉，不含葡萄糖。 測試發生在2天（每天60分鐘）。 包含模擬配對或輸注配對溶液的飲用管的位置交替進行，以確保測試每隻大鼠在籠子兩側的每種溶液的消耗。 每個調味溶液的攝入量在兩個測試日內取平均值以確定偏好。

[³H]在紋狀體突觸體中的DA攝取以評估InsAb功效

紋狀體突觸體^{21, 66} 從AL大鼠（雄性，350-400 g）製備NAc（殼和核）並分別解剖和製備CPu。 將來自每個區域的組織在15體積的冰冷的0.32 M蔗糖溶液中在玻璃均化器中用馬達驅動的Teflon研杵均化; 在漂洗和離心後，將最終的沉澱重新懸浮在冰冷的0.32 M蔗糖中^{21, 66}。 在開始之前[³H] DA攝取試驗⁶⁶將總體積為180μl攝取緩衝液的突觸體等分試樣在15℃下在30℃下在30 nM胰島素存在或不存在下，在載體（PBS）或InsAb（最終稀釋度1：500）中孵育1 min。 ，在IgG（最終稀釋500：122）或載體中。 攝取緩衝液含有（以mM計）：NaCl（XNUMX）; 娜₂HPO₄ （3）; 氫化鈉₂PO₄ （15）; KCl（5）; 硫酸鎂₄ （1.2）; 葡萄糖（10），CaCl₂ （1）; 尼亞胺（0.01）; 托酚酮（0.1）; 和抗壞血酸（0.001），pH 7.4。 吸收[³通過將20μl的每種突觸體懸浮液快速分配到具有不同濃度的DA（96-0.003μM）和[1.0-XNUMXμM]的XNUMX-孔板中來啟動H] DA。³H] DA（5 nM）; 在5℃的平板振盪器中25 min後，通過冷，快速真空過濾終止吸收⁶⁶。 將每孔計數轉換為皮摩爾，然後校正為每分鐘總蛋白質mg。 所有測定一式三份進行並重複至少4次; V_最大 以及 K_m 使用Biosoft Kell Radlig軟件（Cambridge，UK）計算。

統計分析

數據以平均值±標準誤（SEM）表示；除非另有說明，否則顯著性檢定採用配對或非配對t檢定或變異數分析（ANOVA）。對於伏安法數據，n為記錄位點數，因為紋狀體亞區內位點間的變異性大於動物間或切片間的變異性^{^{30 , 32 , 55 , 56}}；每個數據集均註明動物編號。胰島素和尼古丁對峰值誘發[DA]_{_o}效應的EC _₅₀值使用Prism 6.0（GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA）計算。對於電生理數據，統計學顯著性檢定採用Prism 6.0中的配對t檢定或Wilcoxon檢驗，或SAS 9.3（SAS Institute Inc.，Cary，NC）中的混合雙因子變異數分析。為了評估胰島素在味覺偏好條件反射中的作用，我們完成了兩個完整的實驗，兩個實驗的實驗方案完全相同，唯一的差異在於所使用的載體處理方式。在第一項實驗中，10隻大鼠接受了PBS載體輸注，9隻大鼠接受了InsAb輸注。在第二項實驗中，10隻大鼠接受了IgG載體輸注，10隻大鼠接受了InsAb輸注。在輸注條件反射階段（F _{₁₉ = 0.619，混合雙因子變異數分析，重複測量因子為輸注條件反射階段）和測試階段（F₁₉} = 0.012，混合雙因子變異數分析，重複測量因子為味覺偏好），兩組載體（PBS或IgG）之間均無顯著差異。因此，我們將兩個實驗的結果合併進行分析。在本分析中，採用 2 × 4 混合變異數分析（重複測量因子為輸注-條件反射日）來確定條件反射期間微注射治療的效果，隨後進行保護性t檢定（單尾檢定），以確定微注射治療在哪些條件反射訓練中降低了攝取量。對模擬條件反射訓練也進行了相同的分析。為了確定條件反射治療在雙瓶口味偏好測試中的效果，使用混合雙因素變異數分析（重複測量因子為口味）分析數據，隨後進行保護性t檢定（單尾檢定），以檢驗 InsAb 是否會降低偏好。

如何引用本文： Stouffer, MA等。胰島素透過活化膽鹼能中間神經元增強紋狀體多巴胺釋放，發出獎賞訊號。 Nat . Commun . 6:8543 doi: 10.1038/ncomms9543 (2015)。

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下載參考資料

這些研究由美國國立衛生研究院 (NIH) 資助，項目編號分別為 DA033811（MER、KDC 和 MEAR）、NS036362（MER）、DA03956（KDC）以及 NARSAD 獨立研究者獎（KDC）。 S961 由諾和諾德公司的 Lauge Schaffer 博士慷慨贈送。 PP5 抗體由輝瑞公司慷慨贈送。我們感謝紐約大學醫學院的 Charles Nicholson 博士提供用於從 FCV 數據中提取Vmax_值的軟體。