蔗糖攝入誘導快速AMPA受體販運（2013）

J Neurosci。 作者手稿; 可在PMC Oct 3，2013中找到。
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抽象

天然獎勵（例如糖）影響突觸傳遞和行為的機制尚不清楚。本文研究了蔗糖攝取對伏隔核突觸的調控作用。先前研究表明，AMPA受體轉運是調節突觸強度的主要機制，在體外，含有GluA1亞基的AMPA受體的轉運是一個兩步驟機制，首先是突觸外轉運，然後是突觸內轉運。我們發現，在大鼠中，每日重複攝取25%的蔗糖溶液可短暫提高自發性運動能力，並透過Ca²⁺通透性AMPA受體（CPARs，一種含有GluA1亞基但缺乏GluA2亞基的AMPA受體）的整合增強伏隔核核心突觸的強度。電生理、生化和定量電鏡研究表明，蔗糖訓練（7天）可誘導穩定的（>24小時）脊髓內GluA1表達，並且在這些大鼠中，單次蔗糖刺激可快速（5分鐘）但短暫（<24小時）地提高突觸外位點的GluA1表達。體內實驗表明，蔗糖攝取後運動能力的提高需要CPARs和多巴胺D1受體的參與。值得注意的是，每日攝取3%的糖精溶液（一種非熱量甜味劑）7天，其誘導突觸GluA1表現的效果與攝取25%的蔗糖溶液相似。這些發現揭示了先前在體外描述的多步驟GluA1轉運機制，並將其作為天然口感覺獎賞在體內急性調節突觸傳遞的機制。運輸是由一種不依賴蔗糖熱量值的化學感覺路徑所刺激的。

引言

蔗糖過度消費是一個重大的公共衛生問題（胡和馬利克，2010但是，不知道自然，感官獎勵如蔗糖調節突觸傳遞以影響行為的機制。 伏隔核中的突觸可塑性，是腦回饋電路的組成部分（Sesack和Grace，2010），促進許多形式的動機行為，包括獎勵學習（Day和Carelli，2007），對社會壓力的反應（LaPlant等，2010）和成癮病症（Luscher和Malenka，2011）。 重複的可卡因暴露導致伏隔核和腹側被蓋區（VTA）神經元的突觸可塑性（Brebner等，2005; Grueter等，2010; Mameli等人，2009; Pascoli等，2012; Thomas等人，2001; Ungless等人，2001）。 一旦長期接觸可卡因自我給藥，然後長時間停藥，通過摻入Ca來增強突觸2+- 可滲透的，缺乏GluA2的AMPA型谷氨酸受體（CPARs），其信號傳導介導可卡因渴望的孵化（Conrad等人，2008; McCutcheon等人，2011a）。 與可卡因類似，蔗糖等感官獎勵強有力地提升伏隔核多巴胺（史密斯，2004），但是對於伏隔可塑性的感覺獎勵誘導尚未進行過調查。

AMPA受體（AMPARs）是中樞神經系統興奮性傳播的主要介質，它們的運輸有助於多種神經過程，包括學習和記憶 (Nedelescu等，2010; Rumpel等，2005; Whitlock等，2006）。 AMPAR由四個不同的亞基GluA1-4組成。 含有GluA2的AMPAR是Ca.2+-inmpermeable和交通組成性突觸，而GluA2缺乏受體（CPARs，主要是GluA1同源物，導電Ca）2+ 並表現出內向糾正。 GluA1通過兩步途徑經歷活動依賴性突觸運輸，其中cAMP依賴性蛋白激酶（PKA）和cGMP依賴性蛋白激酶II（cGKII）的Ser 845磷酸化促進質膜中突觸外位點的受體積聚（Esteban等，2003; Serulle等，2007; Sun等人，2008; Sun等人，2005）。 在橫向擴散到突觸後，PKC磷酸化Ser 818可穩定突觸內的AMPAR（Boehm等，2006），錨定到突觸後密度（Ehlers等，2007; 哦等人，2006; Serulle等，2007）。 如2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II（CaMKII）磷酸化Ser 567和Ser 831也有助於突觸結合和突觸外靶向（Lu等人，2010; 羅氏等人，1996）， 分別。 但是，目前尚不清楚是否 体内 CPAR的結合採用了所描述的這些快速，多步驟的機制 體外.

為了研究口部感覺獎勵（例如蔗糖）調節伏隔核興奮性突觸的機制，我們採用了短暫攝取蔗糖的實驗範式，並測量了伏隔核神經元突觸傳遞的變化。我們觀察到，重複攝取蔗糖可透過CPARs的整合來增強伏隔核突觸；並且在經過蔗糖訓練的動物中，單次蔗糖刺激足以誘導GluA1快速轉運至突觸外位點。由於非熱量甜味劑糖精也能以類似蔗糖的方式誘導突觸轉運，因此這種轉運是對口部感覺路徑而非熱量路徑的反應。此外，CPAR阻斷劑可阻止蔗糖誘導的體內自發性運動活性升高，進一步證實伏隔核CPARs是調節自然獎勵反應的重要因子。

材料和方法

受試者和外科手術

實驗對象為雄性Sprague-Dawley大鼠（Taconic公司；行為實驗），體重150-300公克；以及懷孕18天的雌性Sprague-Dawley大鼠（Taconic公司；細胞培養實驗）。行為實驗中，大鼠每籠飼養兩隻，光照週期為12小時光照/12小時黑暗（18:00熄燈），並可自由攝取食物和水。所有實驗程序均經紐約大學醫學院機構動物照護和使用委員會批准，並嚴格遵守《實驗動物照護原則》（NIH出版物編號85-23）執行。

蔗糖訓練和運動測量

實驗鼠連續3天被運送到測試室，每天2小時，並被放回籠中。第四天，將裝有水或25%蔗糖溶液的瓶子經由籠蓋放入實驗鼠籠中，持續5分鐘。之後稱量瓶子的重量。所有實驗鼠均需在訓練開始後的3天內，在5分鐘的蔗糖溶液飲用時間內至少攝入1克蔗糖溶液方可納入研究；事實上，所有實驗鼠均符合此標準。取下瓶子後，實驗鼠在測試室停留30分鐘，然後被送回動物房。處死當天，以二氧化碳麻醉實驗鼠，用斷頭台斷頭，並在冰上採集組織樣本。在運動實驗中，將實驗鼠放入運動測量箱（Accuscan，Columbus，OH）中，共35分鐘。在測量箱中待15分鐘後，將帶有珠塞的瓶子從測量箱頂部放入並固定。 5分鐘後，將瓶子從實驗箱頂部移除，大鼠在移除瓶子後繼續在實驗箱內停留15分鐘。此過程連續重複7天。使用VersaMax系統（Accuscan，哥倫布，俄亥俄州）測量大鼠的活動距離。該系統透過一個16×16的紅外線光束網格監測動物的活動，這些光束在動物籠（42×42×30公分）內前後左右移動。光束狀態資訊以每秒100次的頻率掃描並儲存到磁碟。活動量以公分為單位，在35分鐘的實驗過程中，選取12個不同的3分鐘時間段（最後一個時間段為2分鐘）來測量大鼠的活動距離。

糖精培訓

為了比較蔗糖誘導的GluA1運輸與糖精攝取的影響，將12成年雄性大鼠（250 g）以12小時光/暗循環圈養在動物設施中。 然後通過運送到測試室，使所有大鼠習慣於測試室，放置2小時，並運回動物設施。 在第4天（在3天適應之後），給大鼠接近含有水，蔗糖或糖精的瓶子。 使4大鼠接近在籠子頂部放置水的瓶子，其中壺嘴通過蓋子突出到籠子中。 訪問時間為5分鐘，然後移除瓶子，並且在15分鐘後，將另外幾分鐘的大鼠運送回動物設施。 使4大鼠獲得25％蔗糖溶液，並使4大鼠獲得3％糖精溶液（Sweet'n Low）。 測量消耗的流體體積。 在7天重複該過程。 在飲用的第7天，立即取出瓶子後，處死大鼠並收穫伏隔核並通過蛋白質印跡探測GluA1水平。

電

如上所述在透明塑料籠中對大鼠進行蔗糖培養，並在第7天取出瓶後，用氯胺酮（100 mg / kg ip）和甲苯噻嗪（10 mg / kg ip）麻醉，並用冷鹽水經心臟灌注（mEPSC實驗）或立即斷頭（整頓實驗）。 將腦迅速移入人造腦脊液（ACSF）中，由以下組成（以mM計）：對於mEPSC實驗：NaCl（118），KCl（2.5），CaCl2 （3），MgCl2 （1），NaHCO3 （26），NaH2PO4 （1），D-葡萄糖（10），滲透壓調整至325 mOsm並通過95％O充氣2/ 5％CO2 （pH 7.4）; 整流實驗：75蔗糖，87 NaCl，2.5 KCl，1.25 NaH2PO4，0.5 CaCl2，7 MgCl2 6 H.2O，25 NaHCO3，10葡萄糖，用95％O鼓泡2 / 5％CO2 （pH 7.4）。 使用振動切片機（Leica，VT300S）在冰冷的ACSF中切割含有伏隔核的冠狀切片（1200μm厚）並保持浸沒在ACSF中（ACSF，在mM中：124 NaCl，2.5 KCl，1.25 NaH）2PO4，2.5 CaCl2，1.5 MgSO4 7H2O，26 NaHCO3，以及10葡萄糖）持續30分鐘； 然後在室溫下於切片預培養箱中放置至少1小時，以便恢復。 對於mEPSC實驗：然後將單個切片轉移到記錄室中，並在其中用TC32B在線溶液加熱器和控制器（Warner Instruments，CT）將其浸入324°C的尼龍網中。 通過ACSF以2 ml / min的恆定速率連續灌注腔室。 在紅外引導下，使用裝有5405倍長工作距離水浸物鏡的Olympus BX50WI立式顯微鏡的紅外微分乾涉對比視頻顯微鏡（Hamamatsu C40）在視覺引導下鑑定出伏隔核核心區域的中棘神經元。 膜片電極（4–6MΩ）充滿細胞內移液，其組成為（mM）：CsCl（145），HEPES（10），EGTA（0.5）和MgATP（5）。 用蔗糖將滲透壓調節至290mOsm，並且用CsOH將pH調節至7.4。 使用Axopatch 10B放大器（Molecular Devices，CA）在雙小分子（1μM）和河豚毒素（200μM）存在下記錄微型興奮性突觸後電流（mEPSC），並由Digidata 1322A（Molecular Devices，CA）數字化。 為了進行校正實驗：將切片轉移到記錄室中並進行灌注（2.0–2.5 ml min - 1）含有33-35°C的含氧ACSF，含有50μm印防己毒素以分離EPSCs。 使用IR-DIC視頻顯微鏡，使用Multiclamp 700B放大器（Molecular Devices），在電壓鉗中從核心區域中型多刺神經元製備體細胞全細胞記錄。 用細胞內溶液填充膜片移液管（4-6MΩ）（以mM：125 Cs-葡萄糖酸鹽，2 CsCl，5 TEA-Cl，4 Mg-ATP，0.3 GTP，10磷酸肌酸，10 HEPES，0.5 EGTA和3.5 QX） -314）。 數據在2 kHz下過濾，在10 kHz下數字化，並用Clampfit 10（Molecular Devices）分析。 用來自記錄電極的小玻璃雙極電極0.01-1 mm施加細胞外刺激（5-150 ms，0.2-0.05μA，0.5 Hz）。 在基線記錄~10分鐘後，將含有Naspm（200μM）的溶液灌注到浴中以進行10分鐘。 在施用藥物之前和之後，在-70，-50，-30，0，+ 20，+ 40和+ 60 mV的保持電位下測量EPSC振幅的變化。 整改指數（ir）通過校正反轉勢的任何潛在變化來計算，並根據以下等式計算： ir =（I - 70 / 70）/（I+ 40 / 40），在哪裡 I - 70 以及 I+ 40 是以-70 mV和+ 40 mV記錄的EPSC幅度。

亞細胞分離和蛋白質印跡

如上所述，在冰上收集伏隔核。當分別解剖出核殼時，透過檢測突觸體組成中的多巴胺β-羥化酶來確認分離情況。多巴胺β-羥化酶是一種存在於軸突末端（而非核殼）的酵素（Sesack和Grace，2010）。全細胞、突觸體和突觸後緻密區（PSD）組分的製備方法如前所述（Jordan等，2004）。將突觸體沉澱重懸於200 μl含1% Triton X-100的25 mM Tris緩衝液中，4°C搖晃30分鐘，然後在微型離心機中以13,800 × g離心15分鐘沉澱PSD。將含有粗PSD的沉澱物重懸於含2% SDS的25 mM Tris緩衝液中。依照先前描述的方法（ Jordan 等，2004 ） ，以 SDS-PAGE 凝膠上的 Western blot 分析各組分。使用的抗體如下：多巴胺 β-羥化酶（1:1,000，Abcam）、GluA1（1:1,000，Millipore）、磷酸化 Ser 845 GluA1（1:1,000，Millipore）、GluA2（1:1,000，Millipore）和微管蛋白（1:10,001:10）。

電子顯微鏡

在組織採集當天（蔗糖訓練第7天），將3個實驗組（水組、蔗糖/水組、蔗糖組；每組3隻大鼠）的大鼠放入運動測量箱中15分鐘；15分鐘後，從箱頂插入一個瓶子。水組大鼠飲用純水，蔗糖組大鼠飲用25%蔗糖溶液，蔗糖/水組大鼠（已連續6天飲用25%蔗糖溶液）飲用純水。所有大鼠均以戊巴比妥鈉（50 mg/kg，腹腔注射）深度麻醉，然後經心臟灌注含4%多聚甲醛和0.1%戊二醛的0.1 M磷酸鹽緩衝液（pH 7.4），前3分鐘灌注流速為50 ml/min，後7分鐘灌注流速為20 ml/min。組織樣本依照先前描述的方法（ Nedelescu等，2010 ）進行包埋後免疫金（PEG）標記和影像擷取。免疫標記依其相對於非對稱突觸連接處突觸後緻密區（PSD）的位置進行分類，分為「裂隙」、「PSD附近」（距離PSD不超過1個PSD寬度）、「PSD處」、「棘內」或「突觸外膜」。每隻動物的伏隔核核心區域均採集了93個突觸樣本。為了確保隨機取樣，我們在系統地掃描網格時，首先分析隨機遇到的前93個突觸，然後將接受相同生前處理的三隻動物的相同數量的突觸樣本合併。進行了兩種類型的定量分析。一種是透過統計棘突不同功能區域出現的PEG顆粒數量來評估GluR1免疫反應水準。另一項研究旨在評估突觸後緻密區（PSD）上被任意數量的PEG顆粒標記的突觸比例。即使僅被1個PEG顆粒標記的突觸也被視為已標記，這是基於先前研究證實的GluR1-PEG標記方法的特異性（Nedelescu等人，2010）。採用單因子變異數分析（ANOVA）和預先規劃的事後比較（Fisher's LSD）分析了處理對GluR1免疫標記比例和水平的影響。為消除實驗偏差，數據採用三盲法：一名實驗人員進行蔗糖訓練並記錄三個實驗組中動物的情況；第二名實驗人員製作電子顯微照片，並為每張照片分配一個新的字母數字代碼，且代碼保密；另外三名實驗人員掃描顯微照片並定量PEG顆粒。 PEG定量完成後，實驗人員聚集在一起，揭示每張照片的來源。

套管植入和顱內註射

採用顱內注射法將Naspm和APV遞送至伏隔核核心。如前所述（Carr等，2010），對於插管植入，大鼠先用氯胺酮（100 mg/kg，腹腔注射）和賽拉嗪（10 mg/kg，腹腔注射）深度麻醉，術後皮下注射鎮痛藥苯那敏（1 mg/kg）。將兩根26號引導套管（PlasticsOne，Roanoke，VA）立體定位植入大鼠雙側伏隔核核心，座標為：前囟前1.6 mm；矢狀縫外側2.9 mm；套管尖端向中線傾斜8°；顱骨表面下方5.6 mm。套管用牙科丙烯酸樹脂固定，並用咬合針保持通暢。顱內注射，將Naspm和APV溶液分別裝入兩段30 cm長的PE-50導管中，導管一端連接裝有蒸餾水的25 μl Hamilton注射器，另一端連接31號注射套管，套管超出植入導管2.0 mm。注射器安裝在Harvard 2272微升注射幫浦的雙支架上，可在100秒內輸送0.5 μl的注射液。注射完成後一分鐘，將注射套管從導管上取下，重新裝回針芯，並將動物放入運動測試箱中進行蔗糖訓練。動物處死後，分析冷凍腦組織切片以確定套管位置；15隻動物中有2隻因套管位置不當而被排除在研究之外。

統計分析

單因素方差分析隨後進行Fisher事後檢驗，用於電子顯微鏡，免疫細胞化學和生物素化實驗。 雙尾學生t檢驗用於電生理學。 對於蔗糖過度活躍實驗，使用雙向ANOVA，然後進行Fisher事後檢驗。

結果

蔗糖攝取範例的表徵

我們採用蔗糖攝取範式來研究天然口感覺獎勵對突觸傳遞的影響（圖1A）。成年雄性大鼠連續三天被運送到測試室。第四天（訓練的第一天），將大鼠放入運動測量箱中。在測量箱內進行15分鐘的運動活性測量後，透過測量箱蓋上的小孔將裝有水（水組）或25%蔗糖溶液（蔗糖組）的瓶子放入測量箱內。 5分鐘後取出瓶子，繼續測量15分鐘的運動活性，然後將動物放回籠中。我們連續7天重複此過程。在一些實驗中，蔗糖訓練延長至第8天。這種短暫且無條件的、高適口性溶液攝取方式使我們能夠研究蔗糖攝取的急性效應和累積效應，因為動物在訓練開始後的三天內，在攝入窗口期內均能穩定地大量攝入蔗糖（圖1B）。這些實驗條件使得我們能夠在停止攝取後立即對各測試組進行比較。本研究的納入標準為：大鼠在訓練開始後的三天內，在攝取窗口期內至少攝取1克蔗糖；沒有動物因不符合此標準而被排除在研究之外。

圖1  

重複攝取蔗糖會引起自發運動的短暫升高。

我們觀察到，經過三天的訓練後，蔗糖組動物攝取的蔗糖溶液量顯著高於水組動物（圖1B）。此外，雖然在訓練的第1-6天未觀察到自發性運動量的顯著差異（數據未顯示），但在第7天移除瓶子後的三分鐘內，蔗糖組動物的總運動距離顯著高於水組動物（圖1D），且這種差異在第8天仍然存在（圖1E）。在所有測試日，移除瓶子前三分鐘內，水組和蔗糖組動物的總運動距離均無差異（圖1C），這表明運動量的增加是蔗糖訓練大鼠對攝取蔗糖的急性反應，而不是對運動箱的條件反射。與此推測相符的是，蔗糖攝取量與總運動距離之間存在顯著的正相關性（圖1F）。在訓練 7 天前後，蔗糖組和水組的動物體重沒有差異（數據未顯示）。

蔗糖攝入誘導CPAR摻入

蔗糖訓練導緻小鼠在最後一天的運動量短暫增加。為了確定攝取蔗糖是否伴隨伏隔核（一個調節獎賞行為的區域）的電生理變化，我們在第7天移除蔗糖瓶後立即製備伏隔核切片，並記錄伏隔核核心神經元的電活動（圖2A）。伏隔核核心亞區與獎賞刺激的運動反應有關（Sesack和Grace，2010）。我們發現，與水組相比，蔗糖組小鼠伏隔核核心的自發性微型興奮性突觸後電流（mEPSC）的振幅和頻率均顯著增加（圖2B）。這顯示重複攝取蔗糖可以正向調節伏隔核核心的突觸傳遞。為了確定CPAR的整合是否在蔗糖後的增強作用中發揮作用，我們透過測量不同膜電位下的EPSC（圖2C、2D和2E）來確定伏隔核核心神經元的整流指數。由於內源性多胺的阻斷作用，CPAR在去極化電位下表現出內向整流特性。與水組動物相比，蔗糖組動物神經元的記錄中觀察到顯著的整流現象，表現為I/V關係曲線的非線性（圖2E），以及整流指數的顯著增加（圖2F）。

圖2  

在反复攝取蔗糖後，伏隔核心突觸被加強。

為了透過另一種方法驗證CPAR水平的升高，我們在浴液中加入特異性CPAR阻斷劑1-萘乙醯亞精胺（Naspm）後，記錄了伏隔核核心神經元的電活動。我們發現，Naspm顯著降低了蔗糖組而非水組動物神經元的EPSC振幅（圖3A-C）。此外，Naspm處理後，蔗糖組動物神經元的I/V關係曲線呈線性，顯示蔗糖組動物突觸中CPAR的表達受到抑制；而水組動物神經元的I/V關係曲線在Naspm處理後未觀察到顯著變化（圖3D）。這些結果表明，反覆攝取蔗糖會誘導伏隔核核心突觸中CPAR的表達。

圖3  

蔗糖攝入引起Ca2 + - 可滲透的AMPA受體的摻入。

蔗糖攝入誘導GluA1運輸

CPAR 是缺乏 GluA2 AMPA 受體亞基的 AMPA 受體。因此，CPAR 的突觸整合通常涉及 GluA1 亞基的突觸活動依賴性轉運（He et al., 2009 ; Isaac et al., 2007 ; Liu and Zukin, 2007 ; Plant et al., 2006）。為了驗證蔗糖訓練後 CPAR 的突觸整合，我們研究了蔗糖攝取是否會增加 GluA1 的突觸表現。如上所述，大鼠連續 7 天可自由攝取蔗糖。在第 1、3、5 和 7 天，我們從三個腦區分離出全細胞、突觸體和突觸後緻密區 (PSD) 組成：伏隔核核心區（core）、伏隔核殼區（shell）和體感皮質（cortex）。我們以蛋白質印跡法分析了全細胞和PSD組分中GluA1和GluA2的表達。

在檢測的測試日，我們未發現伏隔核裂解液全細胞組分中 GluA1 或 GluA2 發生任何變化，表明重複攝取蔗糖並不會調節這些蛋白的整體水平（圖 4A–C）。然而，在伏隔核 PSD 組分中，GluA1 在第 7 天於核心區顯著增加，但在殼區未見顯著增加，而 GluA2 在兩個組分中均未發生顯著變化（圖 4D–4F和未顯示數據）。在先前的測試日，我們未觀察到伏隔核核心區 PSD 組分中 GluA1 的顯著增加（圖 4D–F），且在任何測試日，皮質 PSD 組分中的 GluA1 或 GluA2 均未發生變化（未顯示數據）。重複攝取蔗糖後伏隔核核心區 PSD 中 GluA1 的增加，尤其是相對於 GluA2 的增加，與上述伏隔核核心神經元中觀察到的整流作用增強相一致。

圖4  

蔗糖攝取後伏隔核中的突觸後密度GluA1，但不是GluA2，增加。

研究表明，活動依賴性GluA1轉運在體外和體內均能促進突觸可塑性（Lu和Roche，2011 ）。體外實驗也證實了GluA1轉運存在快速的多步驟機制（Serulle等，2007；Sun等，2008；Sun等，2005）。然而，迄今為止，這種多步驟機制對體內GluA1突觸累積的貢獻尚未得到驗證。為了確定蔗糖訓練是否透過這種多步驟機制急性誘導GluA1轉運，我們利用定量電子顯微鏡技術對蔗糖訓練組和水訓練組大鼠伏隔核突觸中的GluA1進行了定位。在蔗糖訓練的第七天，我們從3組實驗大鼠中收集了伏隔核核心組織。這些大鼠分為三組：1）連續7天飲水（水組）；2）連續7天飲蔗糖（蔗糖組）；3）連續6天飲蔗糖，第7天飲水（蔗糖/水組）。大鼠在第7天，即飲蔗糖或飲水後5分鐘處死。因此，透過比較蔗糖/水組和蔗糖組以及水組大鼠，可以揭示蔗糖訓練大鼠攝取蔗糖後突觸後變化的時間尺度。我們測量了5個不同的突觸後區室中包埋後免疫金（PEG）標記的GluA1：樹突棘胞質（棘內）、突觸外質膜（膜）、突觸後緻密區（PSD）、PSD附近和突觸間隙，其中後三個區室被歸類為「PSD」（圖5A）。為了消除實驗者偏見，電子顯微鏡測試組的身份採用了三重盲法。

圖5  

電子顯微鏡顯示通過蔗糖攝取誘導多步GluA1運輸。

與水組動物相比，蔗糖組和蔗糖/水組動物的棘內GluA1水準顯著增加（圖5B和5C）。這表明，長期攝取蔗糖會增加突觸附近含有GluA1的AMPA受體的細胞內數量，這些受體可能易於進行突觸轉運，而且重要的是，這種細胞內GluA1受體庫在最後一次攝入蔗糖後可持續存在24小時。接下來，我們探討了一個重要問題：急性蔗糖刺激是否能誘發GluA1的快速轉運。我們觀察到，與蔗糖/水組和水組動物相比，蔗糖組動物的突觸外質膜GluA1水準顯著升高（圖5B和5D）。這項觀察結果表明，單一蔗糖刺激提供的自然口感覺獎勵可以迅速（<5 分鐘）但短暫（衰減時間 < 24 小時）地提高突觸外含有 GluA1 的 AMPA 受體的數量，從而形成一個不穩定的受體池，受體可以從該受體池運輸到突觸。

值得注意的是，體外研究表明，AMPA受體的突觸整合分兩步驟進行。第一步，麩胺酸或多巴胺依賴的Ser 845磷酸化會提高質膜上突觸外位點的受體水平（Esteban等，2003；Serulle等，2007；Sun等，2008；Sun等，2005）；第二步，Ser 818磷酸化促進突觸整合（Boehm等，2006 ）。我們利用電鏡比較了蔗糖組、蔗糖/水組和水組動物的實驗結果，發現體外觀察到的GluA1轉運的第一步（Makino和Malinow，2009），即快速轉運至突觸外膜，在給予口感覺獎勵後，體內也會發生。

與上述電生理和生化結果一致，PEG EM 實驗表明，蔗糖攝取也誘導了 GluA1 轉運的第二步，即 GluA1 受體進入突觸。這是因為與水組大鼠相比，蔗糖組大鼠的 PSD 處 GluA1 免疫反應性顯著較高，且蔗糖/水組大鼠的 GluA1 水準也呈現上升趨勢（圖 5B 和 5E）。蔗糖/水組大鼠 GluA1 水準的升高可能與以下兩種情況相符：一是 GluA1 快速摻入，其在突觸中的半衰期約為 24 小時；二是 GluA1 快速摻入，並在相似的時間段內被突觸 GluA1/2 取代。與水組大鼠相比，蔗糖組大鼠 PSD 中表達 GluA1 的突觸百分比也顯著較高（圖 5F），顯示 GluA1 轉運至先前缺乏 GluA1 的突觸。這也表明，蔗糖組大鼠中觀察到的mEPSC振幅增加是由於突觸GluA1的增加所致，而mEPSC頻率的增加可能是由於GluA1被募集到先前靜息的伏隔核突觸所致，儘管也不能排除谷氨酸釋放增強的可能性。我們也測量了三個實驗組中每個實驗組的突觸數量，以確定蔗糖攝取是否誘導了突觸生成；三個實驗組之間沒有差異（數據未顯示）。我們得出結論，重複攝取蔗糖會提高脊髓內GluA1的穩定水平（>24小時），而對經過蔗糖訓練（6天）的大鼠進行單次蔗糖刺激足以迅速（5分鐘）提高突觸外質膜上的GluA1水平，這可能將受體從脊髓內池中募集出來。我們認為，一部分突觸外受體穩定地整合到突觸後緻密區（PSD）中，導致觀察到的整流指數和PSD GluA1變化，之後突觸外受體池在刺激後24小時恢復至基線水平。這些結果表明，自然獎勵可以急性誘導訓練動物體內GluA1的快速轉運。

蔗糖攝取後升高的運動需要CPAR活性

中型棘狀神經元同時接受多巴胺能和麩胺酸能輸入（Calabresi 等，1992）。為了評估谷氨酸訊號路徑在蔗糖訓練大鼠攝取蔗糖後自發性運動增加中的作用，我們將導管植入大鼠伏隔核核心，並按照上述方法在運動測量箱中訓練動物。在蔗糖訓練的第 8 天，我們在將動物放入運動測試箱之前，向其伏隔核核心微量注射了 Naspm。注射後，蔗糖組動物的總運動距離減少，並且消除了拔瓶後立即觀察到的蔗糖組和水組動物之間的差異（圖 6A）。為了驗證動物操作引起的壓力是否影響了蔗糖反應，我們在第二天（蔗糖訓練的第 9 天）向其伏隔核核心注射了生理食鹽水；拔瓶後，蔗糖組動物再次表現出顯著的活動過度（圖 6B）。這顯示Naspm特異性地抑制了蔗糖誘導的運動能力提升。隨後幾天，向伏隔核核心注射NMDAR拮抗劑APV也消除了蔗糖組和水組動物之間的差異（圖6C），顯示NMDAR也是蔗糖攝取後自發性運動能力提升所必需的。為了確定測試箱的條件反射是否在過動症的誘導中發揮作用，將動物放入測試箱中35分鐘，期間不給予水瓶；蔗糖組和水組動物的運動距離沒有差異（圖6D）。 Naspm和APV皆不影響蔗糖的消耗量（圖6E），顯示核心CPAR和NMDAR並非劇烈攝取蔗糖所必需的。在處死後評估中，未將插管置於伏隔核核心的動物（15隻動物中的2隻）（圖6F）未納入本研究。總之，這些數據共同表明，經過蔗糖訓練的大鼠攝取蔗糖後，5 分鐘內即可誘導 GluA1 的突觸運輸，而阻斷控制這種運輸的信號機制可防止蔗糖後自發性運動活性的增加。

圖6  

蔗糖攝取後升高的自發運動需要CPAR和NMDAR。

蔗糖訊號傳導可能存在兩條途徑。一條是嚴格的化學感覺或口感覺途徑，由蔗糖與甜味受體結合啟動，該受體對應於異源G蛋白偶聯受體複合物T1R2/T2R3（Kitagawa等，2001；Max等，2001；Nelson等，2001；Sainz等，2001）。高熱量營養物質還可以透過獨立於味覺的代謝途徑調節大腦功能，儘管其機制尚不完全清楚（de Araujo等，2008）。為了區分蔗糖誘導的GluA1轉運途徑的兩種不同途徑，我們重複了訓練方案，將大鼠分為三組（每組4隻），每組大鼠可自由飲用5分鐘，分別裝有水、25%蔗糖溶液或3%糖精（甜味組和低糖組）。隨後移除瓶子，大鼠在訓練籠中繼續停留15分鐘。訓練持續7天。蔗糖組和糖精組的液體攝取量無顯著差異，且均高於水組，這與兩種甜味物質的獎勵作用相符（圖7A）。在飲水的第7天，移除瓶子後立即處死大鼠，收集伏隔核核心組織，並將各組的組織混合，分離出突觸後緻密區（PSD）組分，並透過Western blot檢測GluA1的表達量（圖7B）。與先前的結果一致，攝取蔗糖的動物在突觸後緻密區（PSD）組成中GluA1的水平高於飲水組（圖7C）。值得注意的是，攝取糖精的動物的PSD組分中GluA1水平也升高。飲水組、蔗糖組和糖精組動物伏隔核核心區全細胞組分中的GluA1水平無顯著差異，顯示GluA1的升高特異性地發生在突觸組分中（圖7D）。由於糖精與蔗糖一樣，都能刺激相同的異源G蛋白偶聯味覺受體複合物（Masuda等，2012；Nelson等，2001），但糖精本身不具有熱量，因此我們得出結論：甜味受體的激活足以啟動信號通路，從而提高伏隔核核心區突觸的GluA1水平。

圖7  

糖精訓練誘導突觸GluA1的增加類似於蔗糖訓練。

討論區

我們已證實，口部感覺獎勵（例如重複攝取蔗糖）可透過先前在體外描述的多步驟轉運機制，急性誘導GluA1突觸整合。連續6-7天重複攝取蔗糖，可透過CPARs的插入，在電生理學上增強伏隔核核心突觸的功能。這種效應伴隨著伏隔核核心突觸後緻密區（PSD）中GluA1而非GluA2的積累，並且具有區域和時間特異性，因為在訓練第7天之前，伏隔核核心未觀察到任何變化，伏隔核殼部或體感皮質也未觀察到任何變化。電子顯微鏡分析顯示，重複攝取蔗糖可提高棘內相對穩定（半衰期> 24小時）的含GluA1受體的數量。蔗糖也能迅速（5分鐘）且短暫（半衰期<24小時）地提高經蔗糖訓練動物突觸外位點GluA1受體的水平，從而增加能夠橫向擴散進入突觸的AMPA受體數量。與水組動物相比，蔗糖組動物的突觸GluA1（以PSD組分和PEG-EM檢測）均顯著增加。基於這些結果，我們提出，先前在體外描述的AMPA受體突觸插入的兩步機制（突觸外胞吐作用後進行突觸轉運） （Boehm等人，2006；Makino和Malinow，2009；Oh等人，2006；Serulle等人，2007 ； Sun等人，2005年通過自然的口內通過自然）可以感覺獎勵 Sun 等人，2005 口內通過自然的口體內作用）可以感覺在自然流中通過自然的 157 ；

突觸GluA1水平的變化僅在7次訓練後才觀察到，這表明增強作用需要一個持續數天的過程。在體內生化實驗中，我們未觀察到蔗糖訓練第1、3和5天伏隔核核心PSD中GluA1水平的顯著升高；僅在蔗糖訓練7天后，PSD中的GluA1才顯著升高。在電鏡實驗中，我們觀察到，經過6天蔗糖訓練但24小時內未接受蔗糖刺激的蔗糖/水組動物，其PSD中GluA1水平呈現升高的趨勢。與水組動物相比，這些動物的棘內GluA1水平也升高，但未觀察到突觸外膜GluA1水平的變化。基於這些結果，我們得到三個結論。首先，含有GluA1的AMPA受體在連續的蔗糖刺激下會在棘內累積。鑑於先前研究表明，攝取蔗糖可誘導伏隔核多巴胺釋放（Cacciapaglia et al., 2012 ; McCutcheon et al., 2012 ; Rada et al., 2005），且D1受體可驅動樹突中局部GluA1的翻譯（Smith et al., 2005），因此可驅動樹突中局部GluA1的翻譯（ Smith et al., 2005 ），因此，GluA1A1的翻譯後可能會觸發另一種解釋是，棘內GluA1的增加可能反映了GluA1從遠端部位的轉運。這種升高的棘內GluA1池的胞吐轉運很可能有助於質膜上突觸外GluA1池的形成。其次，在蔗糖組（而非蔗糖/水組或水組）動物中觀察到突觸外膜GluA1增加，這表明突觸外受體可能在攝入蔗糖後24小時內通過第二步進入突觸間隙，或被內吞，從而使突觸外受體池呈現瞬時性。第三，與水組動物相比，蔗糖組動物的PSD GluA1水平升高，而蔗糖/水組動物則無此現象，這也顯示每次蔗糖刺激後，受體從快速轉運至突觸外質膜的受體池橫向進入突觸間隙。我們不能排除GluA1直接從棘內受體池轉運至突觸間隙的可能性。然而，鑑於已有研究顯示 GluA1 插入突觸外（Boehm 等，2006；Makino 和 Malinow，2009；Oh 等，2006；Serulle 等，2007；Sun 等，2005 ），這種途徑似乎不太可能。這些發現首次證實，體外觀察到的 GluA1 轉運時間進程（<5 分鐘）和路徑在體內也同樣存在。此外，我們的結果表明，重複的獎賞刺激會透過增加可轉運的棘內受體池來改變突觸增強的能力。

由於糖精誘導GluA1轉運的方式與蔗糖類似，因此蔗糖的熱量並非必要。糖精與蔗糖一樣，都能刺激相同的甜味受體T1R2/T2R3（Masuda等，2012；Nelson等，2001），提示此受體的活化可能啟動了GluA1整合到MSN突觸中的過程。蔗糖能夠促進伏隔核VTA神經元釋放多巴胺（ Cacciapaglia等，2012；McCutcheon等，2012；Rada等，2005），進而導致GluA1轉運至細胞表面。因此，連接甜味受體和VTA的路徑很可能是本文研究的可塑性的核心。

蔗糖攝取後GluA1的快速轉運可能在調節自發性運動中發揮作用。事實上，在經過蔗糖訓練的動物中，抑制CPARs可阻止蔗糖攝取後立即出現的自發性運動活性升高。連續幾天測量大鼠攝取蔗糖後的總運動距離，僅在訓練第七天攝取蔗糖後立即的3分鐘內顯著增加。從訓練第三天開始觀察到攝入蔗糖後立即出現的活動增加，但直到第七天才出現顯著差異。這種活動的時間進程與伏隔核核心樹突中GluA1的累積時間進程一致。由於向伏隔核核心注射Naspm抑制了活動增加，因此運動增加是CPAR轉運至伏隔核核心MSN突觸的功能性結果。使用NMDA受體抑制劑抑制運動活性增強的實驗表明，谷氨酸通過NMDA受體和CPARs的信號傳導對於提高運動活性是必需的。然而，谷氨酸信號傳導阻斷並不影響蔗糖的攝入，這與先前的研究結果一致，即伏隔核核心參與協調與口部感覺獎賞相關的運動反應，但並不參與攝入本身（Smith，2004）。在特定環境下餵食的動物中，條件性過動症的發展也呈現出類似的運動活性增強時間進程（Matthews等，1996）。然而，如果目前的反應是由環境與蔗糖配對引起的條件性過動症，那麼它應該先於蔗糖的攝入，而我們並未觀察到蔗糖的攝入。因此，受試者可能表現出探索性興奮。還需要進行更多實驗來區分攝取蔗糖後運動能力增強是探索慾望的激發，還是某種形式的運動敏化或其他行為。無論如何，自發性運動能力的增強需要谷氨酸訊號傳導，並且至少部分是由於伏隔核核心中CPARs的整合所致。

攝入蔗糖後運動活性的增加可能直接源於伏隔核核心突觸的增強，因為基底神經節直接路徑輸出的增加可透過解除運動丘腦的抑制來促進運動（Sesack和Grace，2010）。增強的突觸很可能位於表達D1受體的伏隔核直接路徑核心神經元上。如果大量多巴胺釋放後，D1受體活性誘導含有GluA1亞基的AMPA受體轉運至這些神經元的突觸，則會導致直接路徑神經元突觸的增強。由此產生的增強會增強直接通路神經元到基底節輸出核的抑制性投射的活性，從而解除運動丘腦的抑制並促進運動皮層的活動（Gerfen和Surmeier，2011；Kravitz等人，2010；Sesack和Grace，2010）。重複攝取蔗糖後觀察到的突觸增強很可能專門發生在直接通路神經元中，因為多巴胺透過 D1 受體發揮作用，可以誘導 GluA1 S845 磷酸化，從而導致表面轉運。

多項研究探討了重複使用古柯鹼刺激後戒斷的影響。這種處理方式會對獎賞系統功能產生深遠影響，並最終導致可卡因致敏，其特徵是對可卡因的運動反應增強、藥物渴求和復吸（Kalivas等，1998）。連續5-10天腹腔注射古柯鹼後戒斷，導致表面含GluA2亞基的AMPA受體在14天內逐漸增加（Boudreau等，2007；Kourrich等，2007）。然而，在10天自我給藥後戒斷45天，大鼠中型多棘神經元（MSN）的整流指數顯著增加（McCutcheon等，2011b），顯示CPARs增加。因此，本研究觀察到，無論是攝取蔗糖後或可卡因自我給藥後，均觀察到了CPAR的轉運，儘管兩者的處理條件截然不同。由於可卡因自我給藥或註射後的即時效應（例如，給藥後5分鐘）尚不清楚，因此無法將可卡因的作用與本研究中的蔗糖作用直接比較。同樣，目前尚不清楚在停止蔗糖訓練後，CPAR是否仍存在於經蔗糖訓練的動物的MSN突觸中，或者這些動物在長期戒斷後是否表現出蔗糖敏感性。

了解獎賞刺激如何調節伏隔核可塑性和行為對於解決成癮、過度進食、病理性賭博和其他行為障礙至關重要（Basar et al., 2010 ; Berridge, 2009 ; Luscher and Malenka, 2011）。糖的過度攝取是導致肥胖流行的重要因素之一（Hu and Malik, 2010），儘管其機制可能與藥物濫用類似（Avena et al., 2008），但尚未得到充分研究。目前的研究結果確立了獎賞誘導可塑性的基本要素，未來的研究可以以此為基礎，探討複雜行為的調控機制，並可能為解決與獎賞相關的病理問題提供新的途徑。

致謝

我們感謝Ziff實驗室過去和現在的成員提供的技術幫助和有益的討論，包括H. Girma，L。Lee和Drs。 B. Fernholz，B。Jordan，W。Lu，G。Rameau，S。Restituito和Y. Serulle。 這項工作得到了美國國家心理健康研究所博士後獎學金F31MH76617-01和美國國立神經疾病與中風研究所（EBZ）的紐約大學神經科學訓練計劃（DST）的NIH培訓補助金5T32DC000063，R01NS061920的支持，1R21MH091445-美國國家心理健康研究所和婦女健康研究辦公室的01，飲食疾病研究的克拉曼家庭基金會補助金計劃，紐約大學的研究挑戰基金和P30EY13079（CA），美國藥物濫用研究所補助金DA003956和NARSAD的獨立研究者獎（KDC），美國國家耳聾與其他溝通障礙研究所向RCF授予DC009635，並由紐約大學Langone醫學中心在成癮卓越中心提供種子基金。

腳註

利益衝突：作者聲明沒有競爭性的經濟利益。

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