Proc Natl Acad Sci US A. 2005 únor 1; 102(5): 1737-1742.
Abstraktní
Kokain, zneužívající droga, zvyšuje hladiny synaptického dopaminu v striatu blokováním zpětného vychytávání dopaminu na axonových terminálech. Cyclin-dependentní kináza 5 (Cdk5) a jeho aktivátor p35, bílkoviny podílející se na fosforylaci substrátů v postmitotických neuronech, byly zjištěny, že jsou po chronické expozici kokainu upraveny. Pro další zkoumání účinků indukce Cdk5 a p35 na signalizaci striatálního dopaminu jsme vytvořili dvě nezávislé transgenní myší linie, ve kterých byly Cdk5 nebo p35 nadměrně exprimovány specificky v neuronech. Uvádíme zde, že zvýšená aktivita Cdk5 v důsledku p35, ale ne nadměrné exprese Cdk5, vede k oslabení signalizace dopaminu zprostředkované kokainem. Zvýšená fosforylace fosforylace dopaminu a cAMP-regulovaného fosfoproteinu, molekulová hmotnost 5 kDa (DARPP-32) u Thr-32 byla doprovázena sníženou fosforylací DARPP-75 u Thr-32. Zvýšení Cdk34 zprostředkované fosforylace extracelulární signálně regulované kinázy kinázy 5 u Thr-1 bylo doprovázeno sníženou aktivací extracelulární signální kinázy 286 / 1. Tyto účinky přispívaly k zeslabení fosforylace indukované kokainem proteinem vázajícím element cAMP, stejně jako k menší indukci c-fos v striatu. Tyto výsledky podporují myšlenku, že aktivita Cdk2 se podílí na změně genové exprese po chronickém vystavení kokainu, a proto má vliv na dlouhodobé změny v neuronální funkci, která je základem závislosti na kokainu.
Kokain zvyšuje hladiny synaptických dopaminů v striatu a mění expresi genů v dopaminoceptivních neuronech aktivací intracelulárních cest, které propagují počáteční signál z receptoru dopaminu D1 do jádra1). Chronické vystavení kokainu zvyšuje regulaci několika transkripčních faktorů, což vede k dlouhodobým změnám v genové expresi, o nichž se předpokládá, že jsou základem adaptace neuronů na závislost na kokainu (2). ΔFosB, identifikovaný jako takový transkripční faktor (3) ukázala, že zvyšuje reakci zvířat na kokain na chování (4, 5). Proto se očekává, že identifikace cílových genů, které jsou regulovány indukcí ΔFosB, přispěje k lepšímu porozumění molekulárního mechanismu, který je příčinou závislosti na kokainu. Nedávno bylo prokázáno, že chronická léčba zvířat kokainem zvyšuje expresi cyklin-dependentní kinázy 5 (Cdk5) a jeho aktivátoru p35 v striatu indukcí ΔFosB (6, 7).
Cdk5 je členem rodiny Cdk serin / threonin kináz. Na rozdíl od jiných Cdks, které jsou hlavními regulátory progrese buněčného cyklu, se Cdk5 primárně podílí na fosforylaci substrátů v postmitotických neuronech (8). Neuronová specifičnost aktivity Cdk5 je dosažena spojením se svými aktivátory, buď p35 nebo p39, které jsou převážně exprimovány v postmitotických neuronech (8). Kromě základní role Cdk5u v rozvoji mozku (9, 10), it se také podílí na dopaminergním přenosu v postnatálním mozku (11, 12). Inhibice aktivity Cdk5 vede ke zvýšení uvolňování dopaminu v striatu, což naznačuje presynaptickou funkci Cdk5 jako negativního regulátoru uvolňování dopaminu (11). Dále Cdk5 moduluje účinnost signalizace postsynaptického dopaminu fosforylací fosfoproteinu regulovaného dopaminem a cAMP, molekulové hmotnosti 32 kDa (DARPP-32) v Thr-75, který konvertuje DARPP-32 na inhibitor cAMP dependentní kinázy (PKA) (12).
Tato pozorování naznačují, že Cdk5 a p35 jsou downstreamovými regulátory prodloužené aktivace signalizace dopaminu po chronickém vystavení kokainu a tudíž závislosti na závislosti na kokainu. Abychom dále řešili úlohu Cdk5 na signalizaci striatálního dopaminu, vytvořili jsme dvě transgenní myší linie, ve kterých buď Cdk5 nebo p35 byl specificky exprimován v neuronech pod kontrolou promotoru p35. Naše nálezy naznačily, že aktivita Cdk5 byla up-regulována se zvýšenou hladinou proteinu p35, ale ne s proteinem Cdk5, což naznačuje, že hladina proteinu p35 je omezena rychlostí aktivity Cdk5. Poskytujeme zde in vivo což svědčí o tom, že zvýšená aktivita Cdk5 v důsledku nadměrné exprese p35 vede k oslabení signalizace dopaminu zprostředkované kokainem v jádře prostřednictvím inhibice kaskády PKA a extracelulární signální kinázy (ERK).
Materiály a metody
Protilátky. Polyklonální protilátky proti Cdk5 (C-8) a p35 (C-19) byly získány od firmy Santa Cruz Biotechnology. Na buněčné signalizační technologii (Beverly, MA) byly získány fosforylačně závislé a nezávislé protilátky proti ERK kináze (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 a cAMP-odezvající element-vázací protein (CREB). Protilátky proti fosfo-Thr-34 DARPP 32 (13), fosfo-Thr-75 DARPP-32 (12), celkem DARPP-32 (12) a c-fos (14). Protilátka proti aktinu byla zakoupena od firmy Sigma.
Experimentální zvířata. Dříve jsme klonovali myší p35 gen Cdk5r1, který kóduje protein p35 a charakterizuje jeho genomovou strukturu (15). Pro generování transgenní myši s neuronální nadměrnou expresí p35 (Tgp35) se 6-kb EcoRI-EcoRI fragment obsahující oblast promotoru 1.2-kb byl subklonován do plazmidu pGEM9Z (-) a značka 45-bp odvozená z SV40 byla vložena do KpnI místo pod poly (A+) signál (Obr. 1A). Značka obsahovala a SpeI místa pro genotypizaci zvířat. Fragment 6-kb byl vyříznut z plazmidu a purifikován, následovaný pronukleární injekcí transgenu za vzniku transgenních myší. Ke zkoumání profilu exprese transgenu pod regulační kontrolou promotoru 1.2-kb p35 in vivo, dvojitá transgenní myš (Tgp35, p35 - / -) byla dále generována použitím dvoustupňové strategie chovu, při které byla myš Tgp35 regenerována v endogenním p35-nulovém pozadí. Jiné modely myší používané v této studii zahrnovaly p35 +/-, p35 - / -, Cdk5 +/- a transgenní myš s nadměrnou expresí neuronů Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Genotypy těchto myší byly stanoveny buď analýzou Southern blot nebo PCR na genomové DNA izolované z biopsie ocasu. Myši byly umístěny v tmavém cyklu 12-h světle / 12-h. Veškerá péče byla poskytnuta v souladu s pokyny Národní instituty zdraví o péči a používání laboratorních a pokusných zvířat.
Analýza Southern Blot. Genomová DNA extrahovaná z biopsií ocasu byla štěpena EcoRI a SpeI, elektroforéza na agarózovém gelu 0.9% a převedení na nylonovou membránu. Membrána byla hybridizována s náhodně připraveným základem 32P-značené sondy při teplotě 42 ° C přes noc. Sonda 485-bp pro genotypizaci p35 knockout (p35 - / -) a Tgp35 myši byla generována PCR pomocí následujících primerů: 5'-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 'a 5'-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3'. Hybridizovaná membrána byla promyta dvakrát v 2XSSC / 0.1% SDS při 42 ° C pro 10min a dvakrát v 0.1XSSC / 0.1% SDS při 65 ° C pro 20 min a vystavena rentgenovému filmu.
Léčba léků. Kokain (Sigma) byl rozpuštěn v sterilním fyziologickém roztoku. Zvířata byla injekčně injikována kokainem (15 mg / kg) nebo stejným objemem fyziologického roztoku ve věku 3 měsíců a usmrcena dekapitací v různých časových bodech (15, 30, 60 a 120 min) po injekci. Mozky byly rychle odstraněny a chlazeny v ledově chladném PBS. Pryata byly pak rozříznuty a podrobeny analýze Northern nebo Western blot. Pro imunohistochemickou analýzu byly získané striatální části z myší 2 h po injekci.
Northern Blot Analysis. Celková RNA byla extrahována z striat s činidlem TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) a podrobena Northern blot analýze, jak je popsáno (18). Pro detekci c-fos mRNA byl použit 189-bp fragment myší c-fos cDNA jako sonda, jak je popsáno (19). Úrovně c-fos mRNA byly kvantifikovány měřením optické hustoty specifického pásma pomocí systému pro analýzu obrazu pomocí softwaru nih image verze 1.62.
Analýza Western Blot. Striatální tkáně byly sonikovány v 1% SDS a uvařeny pro 10 min. Koncentrace proteinu v každém vzorku byla stanovena pomocí BCA proteinového testu (Pierce). Stejné množství proteinu bylo separováno pomocí SDS / PAGE předtím, než byly přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Membrány byly blokovány v 1 × PBS obsahujícím 5% odstředěného mléka a 0.05% Tween 20 a inkubovány s primárními protilátkami přes noc při 4 ° C. Inkubace s peroxidázou konjugovaným anti-myším nebo králičím IgG (Sigma) byla prováděna při pokojové teplotě pro 60 min. Signál byl detekován zvýšením chemiluminiscence (Pierce) a optické hustoty pásů byly kvantifikovány tak, jak bylo popsáno výše.
Cdk5 kinázový test. Striatální lyzáty byly připraveny s lyzačním pufrem sestávajícím z 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM fenylmethylsulfonylfluoridu / 1 μg / ml aprotininu / 1 μg / ml inhibitorů leupeptinu / fosfatázy (směsi inhibitorů fosfatázy I a II, Sigma). Lyzáty byly imunoprecipitovány buď protilátkami anti-Cdk5 (C-8) nebo anti-p35 (C-19). Imunoprecipitáty Cdk5 byly připraveny inkubací 300 μl lyzátu (odpovídající 300 μg proteinu) s protilátkou proti Cdk5 (3 μg) přes noc při 4 ° C a následnou inkubací s 25 μl bílkovin A-agarózových perliček (50 % suspenze v lyzačním pufru, Santa Cruz Biotechnology) pro 3 h při 4 ° C. Pro přípravu imunoprecipitátů p35 se 500 μl lyzátu (odpovídající 1 mg bílkoviny) inkubuje s protilátkou protilátky proti p35 (3 ug), jak je popsáno výše. Imunoprecipitáty byly dvakrát promyty lýzovým pufrem a dvakrát kinázovým pufrem sestávajícím z 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 / 5 mM MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, resuspendovány v 60 μl kinázového pufru. Aktivita kinázy byla měřena za použití histonu H1 jako substrátu (18).
Imunohistochemie. Myši byly anestetizovány intraperitoneální injekcí (250 mg / kg, Fluka) a infikovány transkardiálně pufrem fosforečnanu sodného 0.1M, pH 7.4 a následně Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), fixační prostředek bez zesíťování. Rozptýlené mozky byly dále fixovány ve stejném fixačním přípravku přes noc při 37 ° C. Pak byly mozky vloženy do parafinu, nakrájeny na koronální části s tloušťkou 5-μm a vystaveny imunohistochemii pomocí techniky komplexu avidin-biotin-peroxidáza (Vector Laboratories) s diaminobenzidinem jako substrátem. Sekce byly inkubovány s afinitně purifikovanou polyklonální protilátkou proti c-fos přes noc při 4 ° C. Specificita barvení byla stanovena vynecháním primární protilátky.
výsledky
Generování transgenních myší s neuronální nadměrnou expresí p35. Transgen použitý k dosažení zvýšené neuronální exprese p35 zahrnoval fragment 6-kb klonovaného myšího p35 genu obsahující promotor 1.2-kb a celou kódující sekvenci p35Obr. 1 A). Genotypy myší byly stanoveny analýzou Southern blot za použití sondy, která byla navržena tak, aby rozlišovala myši p35 - / - a Tgp35 od myší divokého typu (Obr. 1 A a B). Pro zkontrolování exprese transgenu pod kontrolou promotoru 1.2-kb p35 jsme vytvořili dvojité transgenní myši (Tgp35; p35 - / -), ve kterých byla exprese p35 řízena pouze z transgenu. Exprese p35 u Tgp35; p35 - / - myši byla pozorována pouze v mozku (Obr. 1C), kde byl vzorec prostorové exprese podobný vzoru myší divokého typu (Obr. 1D). Bylo prokázáno, že nedostatek p35 vede k abnormální vrstvové struktuře v mozkové kůře a hipokampu myší (10). Myši Tgp35; p35 - / - však ukázaly úplnou záchranu fenotypu p35 - / - mozku (Obr. 1E). Tyto údaje naznačily, že promotor 1.2-kb p35 řídil expresi transgenu s podobným profilem exprese jako profil p35 z endogenního genu p35.
Úroveň proteinu p35 je omezením rychlosti pro up-regulaci aktivity Cdk5. Zkoumali jsme gen-dávkové účinky genů kódujících p35 a Cdk5 na expresi proteinu v striatálních extraktech z myší p35 - / -, p35 +/-, divokého typu, Tgp35, Cdk5 +/- a TgCdk5 ve věku 3 měsíců. Úroveň proteinů p35 a Cdk5 dobře korelovala s dávkami genu (Obr. 2 A a B). Myši Tgp35 vykazovaly ≥ 1.6-násobné zvýšení hladiny proteinu p35 ve srovnání s myší divokého typu, zatímco hladiny proteinů Cdk5 nebyly ovlivněny různými hladinami proteinu p35. Myši TgCdk5 vykazovaly ≥ 1.9-násobné zvýšení hladiny proteinu Cdk5 ve srovnání s myší divokého typu, zatímco hladiny proteinu p35 nebyly ovlivněny různými hladinami proteinu Cdk5. Ke zkoumání účinků různých množství p35 proteinu na aktivitu Cdk5 byl Cdk5 imunoprecipitován z striatálních extraktů protilátkou proti Cdk5 a měřena aktivita kinázy. Podobně, aby se zkoumaly účinky různých množství proteinu Cdk5 na aktivitu kinázy, p35 byl imunoprecipitován z striatálních extraktů protilátkou proti p35 a byla měřena aktivita kinázy. Aktivita Cdk5 korelovala dobře s hladinou proteinu p35, ale ne s hladinou proteinu Cdk5 (Obr. 2 C a D). Tyto výsledky ukázaly, že množství p35 proteinu je faktor omezující rychlost aktivity Cdk5. Proto jsme použili Tgp35 myši k vyšetření účinků zvýšené aktivity Cdk5 na signalizaci striatálního dopaminu.
Kokain-indukovaná fosforylace DARPP-32 v Thr-34 je oslabena u myší Tgp35. Funkce DARPP-32 závisí na jeho fosforylačním stavu na více místech (20). PKA fosforyluje DARPP-32 v Thr-34, zatímco Cdk5 fosforyluje DARPP-32 v Thr-75. Tak jsme zkoumali fosforylační stav DARPP-32 ve striatálních extraktech z myší divokého typu a Tgp35. Úroveň fosfo-Thr-75 DARPP-32 byla vyšší u myší Tgp35 (Obr. 3A; 1.6 ± 0.2 - nad hodnotu myší divokého typu). Dále jsme zhodnotili účinky zvýšené aktivity Cdk5 na signalizaci striatálního dopaminu. Zkoumali jsme aktivaci PKA indukovanou kokainem u Tgp35 myší analýzou fosforylačního stavu DARPP-32 u Thr-34. Úroveň fosfo-Thr-34 DARPP-32 byla zvýšena u divokého typu myší 15 min po injekci kokainu (Obr. 3B; 1.8 ± 0.2 - převyšuje základní úroveň). Účinek kokainu na Thr-34 fosforylaci DARPP-32 byl však oslaben u Tgp35 myší (1.2 ± 0.3-krát nad bazální hladinou). Tyto výsledky ukázaly, že zvýšení aktivity Cdk5 zeslabilo aktivaci PKA indukovanou kokainem pravděpodobně prostřednictvím fosforylace DARPP-32 v Thr-75 (6, 12). Je také možné, že zvýšení presynaptické aktivity Cdk5 vede ke snížení uvolňování dopaminu a že to přispívá ke snížení účinku kokainu. Zejména jedna injekce kokainu neovlivnila hladiny proteinu p35 a Cdk5, stejně jako aktivitu kinázy (Obr. 3 C a D). To je v rozporu s předchozí studií, u kterých bylo prokázáno, že chronická expozice kokainu zvyšuje expresi p35 a Cdk5 (6).
Up-Regulace aktivity Cdk5 zeslabuje aktivaci ERK1 / 2 indukovanou kokainem. Nedávné důkazy naznačují, že aktivace dopaminového receptoru v striatu také aktivuje jiné signalizační kaskády, včetně dráhy ERK (21, 22), která hraje důležitou roli při reakci na chování kokainu (23). Zkoumali jsme proto, zda by aktivita Cdk5 mohla ovlivnit kokainem vyvolanou aktivaci dráhy ERK. Aktivace dráhy ERK byla pozorována po injekci kokainu ve striatálních extraktech z divokých typů myší, což je patrné z důvodu zvýšené fosforylace MEK1 / 2 u Ser-217 a Ser-221 (1.5 ± 0.2-krát nad bazální hladinou) a ERK1 / 2 u Thr-202 a Tyr-204 (fosforylace ERK2: 1.5 ± 0.2-fold nad bazální hladinou) (Obr. 4 A a B). Nicméně aktivace kokainu indukovaná MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-fold nad bazální hladinou) a ERK1 / 2 (fosforylace ERK2: 1.2 ± 0.2-krát nad bazální hladinou) byla atenuována u myší Tgp35Obr. 4 A a B). Navíc bazální hladiny fosfo-ERK1 / 2 byly nižší u myší Tgp35 (0.8 ± 0.2-fold pod hodnotou myší divokého typu), zatímco tento trend nebyl statisticky významný. Tento druhý výsledek může být přičítán fosforylaci MEK5 závislé na Cdk1 u Thr-286, což vede ke snížení katalytické aktivity (24). Abychom tuto možnost posoudili, jsme zkoumali fosforylační stav MEK1u u Thr-286 a zjistili jsme, že vyšší výskyt fosfo-Thr-286 MEK1 byl přítomen v striatálních extraktech myší Tgp35Obr. 4C; 1.3 ± 0.1 - nad hodnotu myší divokého typu). Navíc fosforylační stav MEK1 v Thr-286 nebyl změněn jedinou injekcí kokainu, což bylo v souladu se zjištěním, že Cdk5 aktivita nebyla ovlivněna léčbou (Obr. 3D).
Propagace signalizace dopaminu na jádro je zeslabena zvýšenou aktivitou Cdk5. Kokainem indukovaná aktivace kaskád s vícenásobnou signalizací zahrnující PKA a ERK vede k následné aktivaci transkripčního faktoru CREB v jádře jeho fosforylací na Ser-13322, 25). Abychom zjistili, zda Cdk5-zprostředkované inhibiční účinky na aktivační kaskády PKA a ERK mohou konvergovat na fosforylaci CREB v jádře, jsme zkoumali fosforylační stav CREB v Ser-133 ve striatálních extraktech myší divokého typu a Tgp35. Základní koncentrace fosfo-CREB byla nižší u myší Tgp35 (0.7 ± 0.1-fold hodnoty divokého typu myší) (Obr. 5). V odezvě na injekci kokainu byla hladina fosfo-CREB zvýšena u striatum myší divokého typu (1.5 ± 0.1-fold nad bazální hladinou), ale tato odpověď na kokain byla atenuována u myší Tgp35 (1.2 ± 0.1- překročení bazální úrovně) (Obr. 5).
Fosforylace CREB v Ser-133 zvyšuje jeho transkripční aktivitu prostřednictvím elementu cAMP odpovědi v promotorové oblasti určitých genů, včetně genu c-fos (26). Proto jsme zkoumali indukci c-fos v striatum myší divokého typu a Tgp35 po injekci kokainu. U divokých typů myší se hladina c-fos mRNA po injekci kokainu zvýšila na vrcholovou hodnotu (1.8 ± 0.2-krát nad základní hladinou) 30 min a následně se vrátila zpět na bazální hladinu 120 min po injekci (Obr. 6 A a B). Avšak hladiny c-fos mRNA byly o ≥ 30% nižší u myší Tgp35 než u myší divokého typu, dokud se 30 min po injekci (Obr. 6 A a B). Menší indukce c-fos u myší Tgp35 byla dále potvrzena imunohistochemií (Obr. 6 C-F). Podávání kokainu zvýšilo imunoreaktivitu c-fos, silně v dorsomediálně-dorsokentrálních částech striatu a slabě v laterálních částech u myší divokého typu i Tgp35. Avšak nárůst počtu c-fos-imunopozitivních buněk indukovaný kokainem byl výrazně oslabován striatum myší Tgp35 (Obr. 6G). Společně tyto výsledky ukázaly, že kokainem zprostředkované zvýšení signalizace signálu striatálního dopaminu do jádra bylo inhibováno u myší Tgp35, což je pravděpodobný výsledek zvýšené aktivity Cdk5.
Diskuse
Cdk5 a jeho aktivátor p35 byly identifikovány jako cílové geny, které jsou up-regulovány chronickým vystavením kokainu (6). Zde uváděme důkazy o tom, že zvýšená aktivita Cdk5 v důsledku up-regulace p35 spíše než up-regulace Cdk5 vede k oslabení signalizace dopaminu zprostředkované kokainem v striatálních neuronech. Ke zkoumání důsledků zvýšené exprese buď Cdk5 nebo p35 na signalizaci striatálního dopaminu byly analyzovány dvě transgenní myší linie, myši TgCdk5 a Tgp35. Zjistili jsme, že aktivita Cdk5 byla up-regulována úměrně ke zvýšené hladině p35 proteinu, ale nebyla ovlivněna zvýšenou hladinou proteinu Cdk5. Naše předchozí zpráva rovněž ukázala, že aktivita Cdk5 v mozku myši TgCdk5 byla nižší než u myší divokého typu, když byla aktivita měřena za použití imunoprecipitátů Cdk5 (17), což naznačuje, že nadměrná exprese Cdk5 vede ke zvýšení hladiny monomerní Cdk5, pokud není zvýšena hladina p35. Tyto výsledky ukázaly, že hladina proteinu p35 je faktor omezující rychlost pro aktivitu Cdk5.
Myši Tgp35 projevily nižší indukci jak CREB fosforylace, tak c-fos v striatu po akutní injekci kokainu, což naznačuje, že striatální odpověď na kokain byla inhibována zvýšenou aktivitou Cdk5. Zeslabení signalizace dopaminu zprostředkované kokainem u myší Tgp35 bylo pravděpodobně dosaženo Cdk5-zprostředkovanou inhibicí kaskád vícenásobné signalizace zahrnující DARPP-32, PKA a ERK. Podávání kokainu zvýšilo PKA fosforylaci DARPP-32 u Thr-34 u myší divokého typu, zatímco tato odpověď byla u myší Tgp35 oslabena. Bylo prokázáno, že PKA fosforylace DARPP-32 u Thr-34 inhibuje aktivitu proteinu fosfatázy 1 (PP1), enzymu odpovědného za defosforylaci Ser-133 CREB27). Aktivita PP1 by tedy nebyla antagonizována cestou DARPP-32 / PP1 u myší Tgp35.
Aktivace ERK1 / 2 indukovaná kokainem byla také atenuována u myší Tgp35. Existuje několik odlišných mechanismů, kterými Cdk5 může inhibovat aktivaci ERK1 / 2 indukovanou kokainem. Za prvé, fosforylace DARPP-5 závislá na Cdk32 v Thr-75 může inhibovat PKA, což vede k následné inhibici jakékoliv aktivace MEK1 / 2 zprostředkované PKA, která je zapotřebí pro aktivaci ERK1 / 2. Nedávná studie rovněž zjistila, že fosforylace DARPP-32 u Thr-34 je zapotřebí pro kokainem zprostředkovanou aktivaci ERK1 / 2 několika cestami, které zahrnují nepřímou regulaci aktivace MEK, stejně jako zahrnující regulaci fosfatázy obohacené striatem, tyrosinu fosfatázy, která působí přímo na ERK1 / 2 (28). Podpora této možnosti je naznačena zjištěním, že fosforylace MEK1 / 2 vyvolaná kokainem u Ser-217 a Ser-221 byla zrušena u myší Tgp35. Další pravděpodobnou cestou je fosforylace MEK5 na Thr-1 závislá na Cdk286, která by vedla ke snížení její katalytické aktivity a vést k inhibici aktivity ERK1 / 2 (24).
Bylo prokázáno, že inhibice aktivity Cdk5 v striatu zvyšuje chování chronické léčby kokainem u zvířat (6). V souladu s hypotézou, že zvýšená regulace aktivity Cdk5 může přispět k adaptaci neuronů pro potlačení účinků opakovaného podávání kokainu (6), zjistili jsme, že fosforylace DARPP-5 a MEK32 zprostředkovaná Cdk1 přispěla k útlumu aktivace ERK1 / 2 indukované kokainem, což vedlo k menší indukci fosforylace CREB a c-fos v striatu. Naše nálezy podporují myšlenku, že zvýšená aktivita Cdk5, která je výsledkem up-regulace p35, může po chronickém vystavení kokainu změnit geny v striatu. To se může objevit změnami v činnostech transkripčních faktorů, jako je CREB a c-fos. Aktivátor Cdk5 p35, díky svým účinkům omezujícím rychlost na aktivitu Cdk5, může přispět k dlouhodobým změnám v neuronální funkci, která je závislá na závislosti na kokainu.
Poděkování
Děkujeme doktorům. Mary Jo Danton, Philip Grant a Sashi Kesavapany za kritické čtení rukopisu. Tato práce byla podpořena grantem Z01DE00664-05 (do společnosti ABK), americkým grantem DA10044 ve veřejném zdravotnictví a granty Nadace Simons, Nadace Peter J. Sharp a Nadace Picower (do PG).
Poznámky
Zkratky: Cdk5, cyklin-dependentní kináza 5; ERK, extracelulární signálně regulovaná kináza; DARPP-32, dopamin a cAMP-regulovaný fosfoprotein, molekulová hmotnost 32 kDa; PKA, kinázu závislou na cAMP; MEK, ERK kináza; CREB, protein vázající element cAMP.
Reference
;
