J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.
Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.
Zdroj
Katedra psychiatrie, Centrum pro základní neurovědu, Texaská univerzita Jihozápadní lékařské centrum, Dallas, Texas 75390-9070, USA.
Abstraktní
Transkripční faktor DeltaFosB (označovaný také jako FosB2 nebo FosB [krátká forma]) je důležitým mediátorem dlouhodobé plasticity vyvolané v mozku chronickou expozicí několika typům psychoaktivních podnětů, včetně drog zneužívání, stresu a elektrokonvulzivních záchvatů . Charakteristickým rysem DeltaFosB je to, že jakmile je indukováno, přetrvává v mozku po relativně dlouhou dobu bez další stimulace. Mechanismy, které jsou základem této zjevné stability, však zůstaly neznámé. Zde demonstrujeme, že DeltaFosB je relativně stabilní transkripční faktor, s poločasem přibližně 10 hv buněčné kultuře. Dále ukazujeme, že DeltaFosB je fosfoprotein v mozku a že fosforylace vysoce konzervovaného zbytku serinu (Ser27) v DeltaFosB ho chrání před proteazomální degradací. Poskytujeme několik řádků důkazů naznačujících, že tato fosforylace je zprostředkována kaseinovou kinázou 2. Tato zjištění představují první důkaz, že DeltaFosB je fosforylována, a prokazují, že fosforylace přispívá k její stabilitě, která je jádrem její schopnosti zprostředkovat dlouhodobé adaptace v mozku.
Úvod
Transkripční faktor AFosB, také označovaný jako FosB2 nebo FosB [krátká forma], je sestřihovou variantou okamžitého časného genu zkrácenou C terminus. fosb (Dobrazanski a kol., 1991; Nakabeppu a Nathans, 1991; Yen a kol., 1991). Jako FosB s plnou délkou má ΔFosB DNA základní vazebnou doménu a leucinový zip, kterým dimerizuje s Jun proteiny za vzniku komplexů aktivátorového proteinu-1 (AP-1), které regulují expresi mnoha genů (Morgan a Curran, 1995; Rylski a Kaczmarek, 2004). Ačkoli postrádá část transaktivační domény nacházející se na C-konci FosB, AOSF funguje jako silný transkripční aktivátor a represor v kultivovaných buňkách a v mozku (Dobrazanski a kol., 1991; Nakabeppu a Nathans, 1991; Chen a kol., 1997; McClung a Nestler, 2003; Kumar a kol., 2005).
ΔFosB je v mozku indukován na vysoké úrovně v regionu specifickým způsobem po chronickém, ale ne akutním vystavení celé řadě psychoaktivních podnětů, včetně stresu, určitých lézí, antipsychotických a antidepresivních léků, zneužívání drog a přírodních výhod (Hope et al., 1994b; Hiroi a Graybiel, 1996; Moratalla a kol., 1996; Bing a kol., 1997; Mandelzys a kol., 1997; Kelz a kol., 1999; Werme a kol., 2002; Andersson a kol., 2003; Colby a kol., 2003; Peakman a spol., 2003; Perrotti a kol., 2004; Zachariou a kol., 2006). Indukce AFosB přímo souvisí s funkčními účinky několika z těchto podnětů na mozek. Perzistence ΔFosB i při absenci další stimulace ji odlišuje od všech ostatních transkripčních faktorů rodiny Fos, které jsou indukovány rychle v reakci na akutní podněty, během několika hodin se rozkládají zpět na bazální hladiny a obecně vykazují desenzibilizaci po chronické stimulaci (Hope a kol., 1992; Daunais et al., 1993; Persico a kol., 1993; Hiroi a Graybiel, 1996; Perrotti a kol., 2004). Díky tomu je AFB atraktivním kandidátem pro zprostředkování některých dlouhodobých změn v genové expresi, které jsou základem stabilních neuronálních adaptací způsobených určitými chronickými stimuly.
Protože k dlouhodobé přítomnosti ΔFosB dochází v nepřítomnosti další indukce její mRNA (Chen a kol., 1995), spekulovali jsme, že na rozdíl od úplných FosB a všech ostatních proteinů rodiny Fos, které jsou ve své podstatě nestabilní, může být AFos neobvykle stabilní transkripční faktor (Hope et al., 1994b; Chen a kol., 1997; Nestler a kol., 2001; McClung a kol., 2004). Navíc imunoblottingová analýza mozkové tkáně s akutní versus chronickou stimulací naznačila, že ΔFosB se posunuje ve zjevné Mr (molekulová hmotnost) od ∼33 kDa v akutním stavu do ∼35 – 37 kDa během chronické léčby (Hope a kol., 1994a; Chen a kol., 1995). Protože neexistuje žádný důkaz o existenci dalších mRNA, které by mohly kódovat tyto různé izoformy, dále jsme spekulovali, že AFosB je posttranslačně modifikován a že to možná přispívá k jeho neobvyklé stabilitě. Dosud však nebyly hlášeny žádné biochemické analýzy obratu nebo posttranslačních modifikací AFosB. Cílem této studie bylo zjistit, zda AFosB je fosfoprotein a zda fosforylace hraje roli ve své stabilitě.
Materiály a metody
Savčí buněčné linie a DNA konstrukty.
Buňky PC12 (Clontech, Mountainview, CA) byly kultivovány v DMEM s vysokým obsahem glukózy, obsahujícím l-glutamin (L-Gln) a doplněny o 5% fetální hovězí sérum (FBS), 10% koňské sérum (oba od Invitrogen, Carlsbad, CA). , 100 U / ml penicilinu a 100 μg / ml streptomycinu (oba od Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Buňky HeLa (American Type Culture Collection, Manassas, VA) byly kultivovány v DMEM s vysokým obsahem glukózy obsahujícím L-Gln a doplněny 10% FBS, penicilinem a streptomycinem. Obě buněčné linie byly udržovány při 37 ° C ve vlhkém 5% CO2 atmosféra.
Pro přechodné transfekce DNA byly buňky PC12 nebo HeLa naočkovány na šestijamkové destičky (potažené kolagenem I pro buňky PC12) tak, aby se dosáhlo konfluence 90 – 100%, a poté byly transfekovány pomocí lipofektaminu 2000 (Invitrogen). V některých experimentech (viz Obr. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), AFOS byl přechodně exprimován v buňkách PC12 infekcí rekombinantním virem herpes simplex (HSV).
ΔFosB a FosB cDNA byly získány z našich vlastních konstruktů pTetop (Chen a kol., 1997) a subklonován do vektoru pcDNA3.1 (Invitrogen). Tyto konstrukty pcDNA3.1-AFOSB / FosB byly použity pro expresi v savčích buňkách a jako templát pro místně cílenou mutagenezi. Rekombinantní HSV-AFOS byl připraven výše popsaným způsobem (Neve a kol., 1997) a přípravek měl titr ∼1 × 108 pfu / ml.
Experimenty s pulzní chasou.
Přibližně 24 h po infekci / transfekci byly buňky (PC12 nebo HeLa) v šesti-jamkových destičkách dvakrát až třikrát promyty 2 ml PBS a inkubovány při 37 ° C po dobu 1 h v 2 ml Cys / Met-free DMEM (Invitrogen) doplněný 5% dialyzovaným FBS (Hyclone, Logan, UT), aby se vyčerpaly intracelulární soubory Met a Cys. Na konci tohoto „hladovění“ byly přidány léky (pokud měly být buňky ošetřeny) a buňky byly označeny (pulzně) 12 – 25 μCi 35S Protein Labelling Mix (PerkinElmer, Wellesley, MA) pro ∼1 h při 37 ° C k označení všech nově syntetizovaných proteinů. Radioaktivní značka byla poté odstraněna promytím buněk dvakrát až třikrát 2 ml PBS a 35Proteiny značené S byly sledovány (pronásledování) nahrazením média „studeným“ (neradioaktivním) médiem doplněným 5% FBS a sklizením buněk v různých časových bodech. Ošetření buněk byla udržována po celé honičce. Všechny obrázky těchto experimentů ukazují podobná počáteční množství různých proteinů, aby se optimalizovalo srovnání jejich obratů.
Zvířata a chronické elektrokonvulzivní záchvaty.
Dospělé samce krys Sprague Dawley (200 – 300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) byly ošetřeny jednou denně elektrokonvulzivními záchvaty (ECS) pro 7 – 9 d. ECS bylo provedeno tak, jak bylo popsáno dříve (Hope a kol., 1994a) pomocí Ugo Basile (Comerio VA, Itálie) ECS jednotka s následujícím nastavením: frekvence, 100 pulsy / s; pulsovat s 0.5 ms; trvání šoku, 1.0 s; a proud, 75 mA. Falešná kontrolní zvířata byla léčena paralelně použitím elektrod pro ušní svorky bez elektrického proudu.
32 Metabolické značení P.
Pro značení mozkových řezů se krysy dekapitovaly, mozky se rychle pitvaly a frontální kortikální řezy 300 μm se připravily pomocí DSK mikrolikeru (Ted Pella, Redding, CA). Plátky byly inkubovány uvnitř plastových zkumavek v 2 ml umělého CSF s nedostatkem fosfátů (ACSF) a udržovány při 30 ° C za stálého jemného probublávání O2/ CO2 směs (Hemmings a kol., 1989). Plátky (dva plátky na zkumavku) byly označeny 1.3 mCi pro 8 – 10 h v přítomnosti nebo nepřítomnosti kyseliny okadaové (100 ng / ml). Na konci této inkubace byly plátky opláchnuty alespoň třikrát studeným ACSF a poté homogenizovány sonikací v 250 μl studeného pufru radioimunoprecipitace (RIPA) [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (obj./obj.) ) Igepal, 0.5% (hm./obj.) Deoxycholát sodný, 0.1% (hm./obj.) SDS, 1 mm EDTA] doplněný před použitím s SDS až do 0.6%, inhibitor proteázového inhibitoru pro savčí buňky (použitý v 5 μl / ml; Sigma-Aldrich), koktejly inhibitorů fosfatázy I a II (používané v 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF a 2% glycerol. Homogenáty byly poté vařeny po dobu 15 min a vyčištěny centrifugací při 15,000x g pro 15 min. Koncentrace proteinu ve výsledných supernatantech byla hodnocena pomocí testu BCA proteinu (Pierce, Holmdel, NJ).
Pro 32P značení kultivovaných buněk, 24 h po infekci / transfekci, byly buňky dvakrát až třikrát promyty médiem bez fosfátů a inkubovány v tomto médiu po dobu 1 h. Po tomto období hladovění 0.2 – 0.3 mCi z 32PH3PO4 (PerkinElmer) byly přidány do každé jamky a buňky byly označeny pro 4 – 12 h v závislosti na druhu experimentu (specifikace viz obrázky 1 – 7). Buňky byly poté třikrát promyty PBS a lyžovány na ledu po dobu 15 min s 50 ul doplňeného RIPA pufru. Lyzáty byly shromážděny seškrábáním a byly prošly 10 krát 25 ga jehlou ke stříhání DNA, vařeny po dobu 10 min, a centrifugovány při 15,000 rpm pro 15 – 30 min při 4 ° C. Vyčištěné lyzáty (supernatanty) byly přeneseny do nové zkumavky a byl proveden test BCA proteinu (Pierce). Všechny obrázky těchto experimentů ukazují podobné množství celkových divokého typu (WT) a S27A AFOS proteiny pro optimalizaci srovnání jejich relativních hladin fosforylace.
Chemikálie a ošetření buněčných kultur.
Kyselina okadaová (OA; Sigma-Aldrich) byla rozpuštěna v ethanolu a použita v konečné koncentraci 100 ng / ml. 5,6-Dichlor-1-p-d-ribofuranosylbenzimidazol (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) byl rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (DMSO; Sigma-Aldrich) a použit v buněčné kultuře v konečné koncentraci 50 um. Spermine (Sigma-Aldrich) byl rozpuštěn ve vodě a použit v konečné koncentraci 200 μm. Calphostin-C (Biomol) byl rozpuštěn v DMSO a použit v 0.2 μm, zatímco forbol 12-myristát 13-acetát (PMA; Promega, Madison, WI) byl rozpuštěn v DMSO a použit v 0.1 μm. Inhibiční peptid myristoylovaný-autocamtid-2 (m-AIP; Biomol) byl rozpuštěn ve vodě a použit v konečné koncentraci 1 a 10 μm. Inhibitory širokospektrého proteinkinázy H-7 a H-8 (Biomol) byly rozpuštěny ve vodě a použity v konečné koncentraci 150 a 200 μm. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) a epoxomicin (Peptides International, Louisville, KY) byly rozpuštěny v DMSO a použity v konečné koncentraci 12.5 a 7.5 μm. Ve všech experimentech byl k buňkám přidán DMSO (vehikulum) podle potřeby, aby se udržovalo konstantní množství DMSO během ošetření. Pro 32Experimenty značení P byly léčiva přidána těsně před značku a ponechána po zbývající dobu značení. Pro experimenty s pulzní chasou byla léčiva přidávána v době „hladovění“ Cys / Met, udržovaného po dobu značení, a poté byla přidána zpět do chasového média. Inhibitory proteazomu byly přidávány každých 3 – 4 h po celé honičce, aby se kompenzoval rychlý obrat těchto peptidů.
FOSB imunoprecipitace, imunoblotting a autoradiografie.
Pro imunoprecipitace byly lyzáty zředěny 1: 5 s čistým RIPA, aby se koncentrace SDS snížila na 0.1% před pokračováním v imunoprecipitaci (IP). Pro omezení nespecifické vazby byly lyzáty nejprve vyčištěny imunoprecipitací s neimunním IgG a proteinem G-Sepharose (Sigma-Aldrich) po dobu alespoň 4 h. ΔFosB byl potom imunoprecipitován z vyčištěných lyzátů pomocí kozí polyklonální protilátky, která rozpoznává vnitřní epitop přítomný v FosB i AFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) v 0.5 – 1 μg IgG na 10 μg lyzátového proteinu (50 – 300 μg celkového proteinu) v celkovém objemu 0.5 ml. IP byly jemně promíchány při 4 ° C na rotoru po dobu alespoň 8 ha potom byl přidán 15 μl proteinu G-Sepharose a IP byly smíchány alespoň další 4 h. IP byly peletovány odstředěním při 3000 × g pro 3 – 5 min při 4 ° C, promytý třikrát 0.5 ml studené holé RIPA a dvakrát studeným PBS obsahujícím 0.1% Tween 20. IP byly poté resuspendovány v 0.5 ml studeného PBS, přeneseny, peletovány do nové zkumavky a imunoprecipitované proteiny byly poté eluovány přidáním 15 – 25 μl 2 × redukujícím vzorkový pufr Laemmli proteinu. Tento protokol IP vedl ke specifickému a efektivnímu srážení prakticky všech AFOS v lyzátu. Imunoprecipitované proteiny byly podrobeny SDS-PAGE nanesením celé IP na gel 12.5% Tris-HCl Criterion (Bio-Rad, Hercules, CA) a poté přeneseny na PVDF nebo nitrocelulózu. Po přenosu byla membrána sušena na vzduchu a 32P- a 35S-radioaktivně značené proteinové pásy byly pozorovány autoradiografií s použitím autoradiografického filmu Kodak (Rochester, NY), jakož i pomocí fosforového zobrazování pomocí Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Celkový (nefosforylovaný a fosforylovaný) AFOS v buněčných lyzátech nebo mozkových homogenátech byl detekován imunoblotováním buď imunoprecipitovaného proteinu (pomocí stejné membrány použité k detekci 32P-značený protein) nebo stejného množství lyzátu / homogenátového proteinu podrobeného SDS-PAGE a přeneseného na PVDF nebo nitrocelulózu. Membrána byla nejprve blokována inkubací s 1% (w / v) beztučné sušené mléko (Bio-Rad) v PBS doplněném 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) po dobu 1 h při 25 ° C. Membrána byla poté imunoblotována přes noc při 4 ° C s naší vlastní králičí anti-FosB polyklonální protilátkou generovanou proti aminokyselinám 1 – 16 z FosB / AFosB (použito v 1: 10,000). Po primární inkubaci byly membrány promývány čtyřikrát po dobu 5 min blokovacím pufrem a poté inkubovány při 25 ° C po dobu 1 h s kozím anti-králičím IgG konjugovaným na křenovou peroxidázu (použito v 1: 5000 v blokovacím pufru, od Vector Laboratories, Burlingame, CA). Membrány pak byly třikrát promyty 10 min blokovacím pufrem a jednou 5 min PBS. Celkový proteinový pás FosB byl vizualizován na filmu Kodak MR zvýšenou chemiluminiscencí (Pierce) a / nebo detekcí fluorescence pomocí činidel ECL-Plus (Amersham Biosciences) a Storm PhosphorImager.
Nadměrná exprese a čištění rekombinantního AFosB z hmyzích buněk.
FosB byl nadměrně exprimován v hmyzích buňkách Sf9 jako N-koncový hexa-His-značený protein (N-His (6) AFosB) s použitím bakulovirového expresního systému Bac-to-Bac (Invitrogen) a podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, ΔFosB cDNA (zbytky 2 – 237), které předcházela afinitní N-koncová značka MGHHHHHAG, byla subklonována do vektoru pFASTBacTM1, který byl použit pro generování rekombinantního bakuloviru. Buňky Sf9 byly infikovány rekombinantním virem a N-His (6) AFosB byl purifikován z buněčných lyzátů několika chromatografickými kroky včetně afinitní chromatografie s použitím niklové kolony (Qiagen, Valencia, CA), výměny aniontů pomocí mono-Q kolony (Amersham) Biosciences) a vylučování podle velikosti pomocí gelové filtrační kolony (Amersham Biosciences).
In vitro studie fosforylace.
In vitro fosforylační reakce pro časový průběh a stechiometrickou analýzu byly provedeny v objemu 30 μl obsahujícím 10 μm substrát (N-His (6) AFosB nebo pozitivní kontrolní substrát), 250 μm ATP a 1 μCi / μl [y-32P] ATP, pufr dodávaný výrobcem kinázy, a jedna z následujících kináz: CK2 (20 ng / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; Upstate), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) nebo p70S6K (2.5 mU / μl; Upstate). Reakce v průběhu času byly prováděny odstraněním alikvotů 5 μl z reakčního roztoku v určených časových bodech a přidáním stejného objemu 4 × redukujícího pufr vzorku vzorku Laemmli. Kinetické parametry Michaelis-Menten pro reakci CK2 byly stanoveny za empiricky definovaných podmínek lineárního ustáleného stavu. Tyto reakce byly prováděny po dobu 15 min v objemu 10 μl obsahujícím 2 ng / μl enzymu, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [y-32P] ATP a koncentrace N-His (6) ΔFosB v rozmezí od 2.5 – 30 μm. Všechny reakce byly prováděny při 30 ° C ve vodní lázni. Po SDS-PAGE a obarvení gelu Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad) byl gel vysušen a 32Začlenění P-fosfátu bylo hodnoceno analýzou fosforu (viz níže, Kvantifikace dat, výpočty a statistika).
Dvourozměrná mapa fosfopeptidů a analýza fosfoaminokyselin.
Obě tyto analýzy byly provedeny podle popisu Ploegh a Dunn (2000). Stručně, suché gelové fragmenty obsahující 32P-značený ΔFosB (buď z in vitro reakce nebo z imunoprecipitátů metabolicky značených buněk), byly vyříznuty, rehydratovány, promyty a podrobeny tryptickému štěpení. Supernatant obsahující produkty tryptického štěpení byl lyofilizován a lyofilizát byl několikrát promyt a resuspendován v 10 μl elektroforetického pufru, pH 1.9. Vzorek (3 μl) byl nanesen na tenkovrstvou chromatografii na tenké vrstvě (TLC) (Analtech, Newark, DE) a rozdělen v jedné dimenzi elektroforézou a ve druhé dimenzi vzestupnou TLC. Výsledné fosfhopeptidové mapy byly vizualizovány autoradiografií a fosforimagingem. Pro analýzu fosfoaminokyselin se 2 μl tryptických štěpů, které byly resuspendovány v elektroforézním pufru, dále štěpily hydrolýzou HC1 při 105 ° C po dobu 25 min v 3 m HCI pod N2 atmosféra. Reakce byla zastavena šestinásobným zředěním ve vodě a směs byla lyofilizována. Lyofilizát byl resuspendován v 5 μl elektroforetického pufru, pH 1.9, a nanesen na celulózovou TLC destičku společně s fosfo-Ser, -Thr a -Tyr standardy. Elektroforéza byla prováděna na polovině délky TLC destičky za použití elektroforetického pufru, pH 1.9, a poté byla destička přenesena do pufru pH 3.5 a elektroforéza byla dokončena. Fosfoaminokyselinové standardy byly vizualizovány postřikem TLC destičky roztokem 1% (obj./obj.) Ninhydrinu v acetonu a 32Vzorky aminokyselin značených P byly vizualizovány jak autoradiografií, tak fosforimagingem.
siRNA-indukované CK2a knock-down.
Použili jsme RNA interferenční metodu k selektivnímu snížení hladin CK2 (Di Maira a kol., 2005). Buňky PC12 byly naočkovány na šestijamkové destičky potažené kolagenem I, aby se následující den dosáhlo were70 – 80% konfluence, když byly přechodně transfekovány 20 nm (konečná koncentrace) buď necílící siRNA nebo siRNA namířené směrem k mRNA katalytické a podjednotka krysy CK2, s použitím 5 μl transfekčního činidla SilentFectin (Bio-Rad) a podle pokynů výrobce. Přibližně o 24 h později byly buňky přechodně transfekovány plazmidem FosB, jak bylo uvedeno výše. Přibližně 24 h později (-48 h po transfekci siRNA) byly buňky podrobeny buď 32Metabolické značení P nebo analýza puls-chase, jak je popsáno výše. Následující čtyři CK2α siRNA byly použity s podobnými výsledky: 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ', 5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3', 5'P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3 ', 5'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3 "(Dharmacon, Lafayette, CO). Jako negativní kontrolu jsme použili Tlumič negativní kontrola #3 siRNA od Ambion (Austin, TX). Rozsah knock-down CK2 byl monitorován imunoblotováním s použitím polyklonální protilátky anti-CK2 (katalogové č. 06-873 od Upstate) přes noc při ředění 1: 1000. P-Tubulin byl použit jako kontrola plnění a detekován pomocí monoklonální protilátky (katalogové č. 05-661 od Upstate) přes noc při ředění 1: 20,000.
Místně cílená mutageneze.
Mutace Ser27 na Ala nebo na Asp byla provedena za použití soupravy mutageneze zaměřené na rychlou změnu místa (Stratagene, La Jolla, CA) a podle pokynů výrobce. K zavedení mutací Ser27 do myšího FOSB proteinu byly použity následující primery mutageneze. Ser27 na Ala: (reverzní primer) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 ′. Ser27 na Asp (přímý primer) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 ′. Mutované báze jsou tučně a Ser27 kodon je kurzívou.
Bioinformatika.
Potenciální fosforylační místa a kinázy pro AFosB byly prohledány odesláním sekvence myšího proteinu do specializovaných databází, včetně ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost a kol., 2004) a NetPhosK (Blom a kol., 2004).
Kvantifikace dat, výpočty a statistiky.
Množství proteinu přítomného v PVDF nebo nitrocelulózové membráně bylo kvantifikováno pomocí Storm PhosphorImager a doprovodného softwaru ImageQuant (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). Ve studiích buněčné kultury a fosforylace mozkových řezů byly hodnoty získané pro 32Protein značený P byl poté dělen hodnotami získanými pro celkový AFOSB a vyjádřen jako poměr. V in vitro fosforylační studie, množství 32P-značené AFOSB na mol AFFB (stechiometrie) bylo vypočteno, jak bylo popsáno dříve (Sahin a kol., 2004). Všechna měření byla provedena v rozsahu linearity použitého přístroje. Kinetické parametry byly vypočteny pomocí modelu Michaelis-Menten, přičemž V = VMax[S] / ([S]+KM) a VMax = k2[ECelková cena]. Poločas (t1/2) ΔFosB a FosB byly odhadnuty z grafů pulzně-chase (pomocí nelineární regrese, která nejlépe odpovídala datovým bodům) a odpovídají času, ve kterém množství zbývajícího proteinu je 50% originálu. Na všech obrázcích jsou uvedené výsledky reprezentativní pro alespoň dva až tři nezávislé experimenty. Ve všech grafech jsou uvedená data průměrem ± SEM (3 ≤ n ≤16). Statistická významnost rozdílů byla hodnocena pomocí nepárových t test opravený pro vícenásobná srovnání a hvězdičky označují p ≤ 0.05.
výsledky
FosB je neobvykle stabilní transkripční faktor
Ačkoli jsme dříve spekulovali, že ΔFosB je relativně stabilní transkripční faktor (Nestler a kol., 2001), nebyla dosud provedena přímá analýza profilu obratu proteinu. Abychom tuto otázku vyřešili, provedli jsme experimenty s pulzní chasou za použití buněk PC12, které se široce využívaly jako neuronové buněčné linie, ve kterých byl AFosB přechodně exprimován infekcí rekombinantním virem herpes simplex (HSV-AFOSB). Nově syntetizované proteiny byly metabolicky značeny 35S-Met / Cys a degradační vzorec 35ΔFosB označený S35S-ΔFosB) byl monitorován imunoprecipitací z buněčných lyzátů získaných v různých časových bodech po odstranění radioaktivně značených aminokyselin. Analýza imunoprecipitátů pomocí SDS-PAGE a autoradiografie odhalila, že poločas ΔFosB v buňkách PC12 je ∼10 h (Obr. 1). Tato zjištění ukazují, že poločas ΔFosB je vyšší než poločas většiny indukovatelných transkripčních faktorů (viz Diskuse), včetně FosB plné délky, jehož poločas v buněčné kultuře je uváděn jako ∼90 min (Dobrazanski a kol., 1991; Carle a kol. 2004). Kromě toho je třeba poznamenat, že degradace AFosB neodpovídá křivce exponenciálního rozpadu prvního stupně, ale je spíše dvojfázová, počínaje pomalejší degradací. To naznačuje existenci více než jednoho druhu FosB a / nebo více než jedné cesty degradace.
Zobrazit větší verzi:
Obrázek 1.
FosB je neobvykle stabilní transkripční faktor. Poločas ΔFosB je ∼10 hv buněčné kultuře. FOSB byl exprimován v buňkách PC12 buď infekcí HSV-AFOSB nebo přechodnou transfekcí plazmidem obsahujícím FOSB a buňky byly podrobeny experimentům s pulzní chasou, jak je popsáno v části Materiály a metody. Ekvivalentní výsledky byly získány bez ohledu na metodu použitou k nadměrné expresi AFos. Obrázek ukazuje časový průběh (a reprezentativní autoradiogram) degradace AFosB. Vynesená data jsou průměrem ± SEM alespoň 15 individuálních datových bodů získaných z alespoň pěti nezávislých experimentů. Pro srovnání je uveden hlášený poločas plné délky FosB.
FOSB je fosfoprotein v mozku
Předpokládali jsme, že posttranslační modifikace AFosB může přispět k její zjevné stabilitě. Protože se ukázalo, že fosforylace moduluje aktivitu transkripčních faktorů mnoha způsoby, včetně jejich stability (přehled viz Desterro a kol., 2000; Whitmarsh a Davis, 2000), zkoumali jsme, zda AFos je fosfoprotein. Za tímto účelem byla exprese AFosB indukována v mozku potkanů pomocí chronické ECS, ošetření, o které je známo, že indukuje vysoké hladiny AFosB, zejména v čelní kůře (Hope a kol., 1994a). Jeden den po poslední léčbě ECS, kdy hladiny AOSOS zůstaly vysoké, byly připraveny tenké přední kortikální plátky a metabolicky označeny 32P-ortofosfát. Paralelní sada plátků nebyla radioaktivně označena a tyto byly použity k detekci celkových hladin AFos. Po imunoprecipitaci specifickou anti-FosB / AFOS protilátkou a separaci imunoprecipitovaných proteinů pomocí SDS-PAGE, fosforylovaná 32P-značený AFosB byl detekován autoradiografií, zatímco celkový AFosB byl detekován imunoblotováním. Tato analýza odhalila, že AFos je fosforylován v mozku, jak o tom svědčí konkrétní 32P-značený pruh ∼35 kDa přítomný v chronicky ošetřených vzorcích mozku, ale je prakticky nedetekovatelný v kontrolně ošetřených kontrolách (Obr. 2A). To je v souladu se skutečností, že při absenci chronické stimulace jsou bazální hladiny AFosB velmi nízké. Specifičnost imunoprecipitační reakce je ilustrována nedostatkem signálu v neimunní sraženině IgG.
Zobrazit větší verzi:
Obrázek 2.
FOSB je fosfoprotein v mozku. A, AFos je fosforylovaný v mozku. Endogenní AFosB byl indukován v mozku potkanů chronickým ošetřením ECS, jak je popsáno v části Materiály a metody. Čelní kortikální řezy byly metabolicky označeny 32PH3PO4 na několik hodin. Po homogenizaci plátků byl ΔFosB imunoprecipitován a fosforylován ΔFosB (32P-ΔFosB) byl detekován autorádiografií (horní panel). Celkový FosB v neradioaktivních imunoprecipitátech byl detekován imunoblotováním (spodní panel). Jako negativní kontroly je ukázána imunoprecipitát falešně ošetřeného zvířete a neimunní IgG. BBioinformatickou analýzou byly získány kandidátní fosforylační místa a kinázy s odpovídajícím skóre predikce pro myší proteinovou FOSB proteinovou sekvenci. Kandidátní místa s vyšším skóre predikce jsou zvýrazněna v proteinové sekvenci a uvedena v tabulce. DNA (vazební) doména a leucinový zip jsou v proteinové sekvenci tučně. C, D, FosB fosforylace je zvýšena inhibitorem Ser / Thr fosfatázy OA. C, 32Hladiny P-ΔFosB v imunoprecipitátech z čelních kortikálních řezů značených v nepřítomnosti (Ctr) nebo v přítomnosti 100 ng / ml OA (graf a horní panel) byly detekovány autoradiografií. Spodní panel ukazuje celkový AFOS detekovaný v imunoprecipitátech z neoznačených řezů imunoblotováním. D, Buňky PC12 byly infikovány HSV-AFOSB nebo HSV-LacZ (vektor) a metabolicky značeny 32PH3PO4 v nepřítomnosti (Ctr) nebo v přítomnosti 100 ng / ml OA. 32Hladiny P-ΔFosB v imunoprecipitátech byly detekovány autoradiografií (graf, horní panel). Spodní panel ukazuje celkový AFOS detekovaný v buněčných lyzátech imunoblotováním.
Jako první krok k objasnění, které kinázy a místo a místa se účastní fosforylace AFB, jsme podrobili její aminokyselinovou sekvenci několika bioinformatickým analýzám. Toto odhalilo, že ačkoli FosB neobsahuje žádná Tyr fosforylační kandidátní místa, obsahuje několik konsenzuálních míst Ser / Thr kinázy, včetně tří míst CaMKII, tří míst CK2 a dvou míst PKC s velmi vysokým skóre predikce fosforylace (Obr. 2B). Pokud je, jak bylo předpovězeno bioinformatikou, AFOSB pouze fosforylovaný na zbytcích Ser nebo Thr, pak by měla být jeho fosforylace významně modulována aktivitou Ser / Thr fosfatáz. Abychom tuto hypotézu otestovali, označili jsme přední kortikální řezy 32P-ortofosfát v přítomnosti nebo nepřítomnosti OA, inhibitoru fosfátázy proteinu Ser / Thr. Jak je uvedeno v Obrázek 2C, OA způsobil velký (∼2.5-násobný) nárůst v 32P-AFosB. Způsobil také malé zvýšení celkových hladin ΔFosB, což je v souladu s předchozími zprávami spojujícími karcinogenní účinky OA s jeho schopností indukovat několik okamžitých časných genů včetně proteinů Fos (Miller a kol., 1998; Choe a kol., 2004). Čistým výsledkem je významné celkové zvýšení (∼60%) fosforylovaných hladin FosB.
Pak jsme zkoumali, zda v buňkách PC12, které jsou přístupnější experimentální manipulaci, AFB vykazoval fosforylační obrazec podobný tomu, který byl pozorován v mozku. Exprimovali jsme ΔFosB v buňkách PC12 pomocí infekce HSV-ΔFosB a buňky jsme metabolicky označili 32P-orthofosfát v přítomnosti nebo nepřítomnosti OA. Úspěšná exprese a imunoprecipitace proteinu z buněk infikovaných HSV-AFOSB je prokázána přítomností obou v imunoblotu (Obr. 2D, dolní panel) a autoradiograf (horní panel) pásma ∼35 kDa, který není přítomen ve vektorově infikovaných buňkách. Jak bylo pozorováno v mozku, OA způsobil malé zvýšení celkových hladin FosB, ale mnohem vyšší (přibližně dvojnásobné) zvýšení 32P-AFosB, což má za následek významné (~ 50%) čisté zvýšení fosforylace AFosB. Kromě toho v souladu s bioinformatickými předpovědi nemělo ošetření buněk PC12 inhibitorem fosfátázy Tyr žádné významné změny v 32Hladiny P-ΔFosB (data nejsou zobrazena). Společně tato zjištění odhalila, že AFosB je fosforylován na Ser a / nebo Thr zbytcích v mozku a v buňkách PC12 a potvrdilo, že tyto buňky jsou dobrým systémem buněčné kultury, ve kterém dále studují profily fosforylace a degradace AFosB.
CK2, ale ne PKC nebo CaMKII, fosforyluje AFosB in vitro
Jak je popsáno výše, analýza aminokyselinové sekvence AFosB odhalila vysoké predikční skóre pro fosforylační místa CK2, PKC a CaMKII. Abychom určili, která z těchto kináz může fosforylovat AFosB, provedli jsme řadu in vitro fosforylační reakce za použití purifikovaných kináz a purifikovaných rekombinantních AFosB. Jak je uvedeno v Obrázek 3A, ze tří kandidátních kináz, pouze CK2 fosforylovalo AFosB významným způsobem. Kromě toho bylo testováno několik dalších kináz (např. GSK3 a p70S6K), ale nepodařilo se jim významně fosforylovat ΔFosB (data neuvedena). Další charakterizace reakce CK2 analýzou časového průběhu odhalila, že tato kináza může katalyzovat inkorporaci ∼0.5 mol fosfátu na mol AFosB (Obr. 3B). Skutečnost, že CK2 může fosforylovat AFos in vitro do značné stechiometrie (∼50%) svědčí o fyziologicky relevantní reakci. Potom jsme studovali kinetiku této reakce inkubací CK2 v přítomnosti zvyšujícího se množství vyčištěného AFosB a zjistili jsme, že CK2 fosforyluje AFosB s Vmax 5.8 pmol · min-1 · Μg-1 enzymu, a KM 18.4 μm a a kkočka 0.2 / s (Obr. 3C). Hodnoty získané pro tyto kinetické parametry dále podporují fyziologický význam této reakce. Například KM CK2 pro DARPP32, jeden z jeho nejznámějších substrátů, je 3.4 μm a kkočka je ∼0.3 / s (Girault a kol., 1989); KM pro rozsahy ATP od ∼10 – 40 μm (Cochet a kol., 1983; Silva-Neto a kol., 2002), a to pro kasein v rozmezí od ∼10 – 50 μm (Meggio a kol., 1977; Pyerin a kol., 1987). Tyto údaje společně ukazují, že AFos je bona fide substrát pro CK2 in vitro.
Zobrazit větší verzi:
Obrázek 3.
CK2, ale ne PKC nebo CaMKII, fosforyluje AFosB in vitro. Autoradiograf (horní panel) ukazuje fosforylovaný produkt a gel zafarbený Coomassie (spodní panel) ukazuje celkový AFOS přítomný v reakci. AByl podroben purifikovaný rekombinantní AFosB in vitro fosforylace různými kandidátními kinázami (z nichž tři jsou uvedeny). BČasový průběh a stechiometrické analýzy ukazují, že CK2 může fosforylovat AFosB in vitro se stechiometrií ∼50%. CKinetická analýza reakce CK2 odhalila, že AFos je bona fide in vitro Podklad. Linearizace reakce je zobrazena na dvojitě recipročním grafu (dole), ale kinetické parametry byly odvozeny z Michaelis-Mentenovy křivky (nahoře).
CK2 moduluje fosforylaci a stabilitu AFosB v intaktních buňkách
Pro posouzení fyziologické relevance CK2-zprostředkované fosforylace ΔFosB jsme provedli srovnávací fosfhopeptidové mapování pomocí in vitro fosforylovaný a PC12 buněčně fosforylovaný AFosB. Po SDS-PAGE a gelové eluce 32P-ΔFosB (z in vitro reakce nebo z imunoprecipitátu 32P-značené buňky), byl protein štěpen trypsinem a výsledné fosfhopeptidy byly podrobeny dvourozměrné separaci. Tato analýza odhalila, že hlavní fosfhopeptid z reakce CK2 komigroval s jedním ze dvou hlavních fosfhopeptidů z AFOS fosforylovaných v buňkách PC12 (Obr. 4A), zatímco fosfopeptidy vzniklé reakcí PKC nebo CaMKII (data neuvedena) ne. Na mapě byl z buněk PC12 přítomen druhý fosfoseptid AFosB, ale kvůli neschopnosti kterékoli z kináz, které jsme testovali, abychom vytvořili podobný fosfhopeptid in vitro, v současné době nevíme, zda tento druhý fosfhopeptid obsahuje fosforylační místo odlišné od jiného fosfhopeptidu nebo zda představuje odlišný tryptický peptid obsahující stejné fosforylační místo.
Zobrazit větší verzi:
Obrázek 4.
CK2 moduluje fosforylaci a stabilitu AFosB v intaktních buňkách. AZdá se, že CK2, ale ne PKC, fosforyluje AFosB v buňkách. Dvourozměrné fosfopeptidové mapy AFosB fosforylované CK2 nebo PKC in vitro nebo neporušenými buňkami PC12. Šipky ukazují komigraci CK2-fosforylovaného peptidu, ale nikoli PKC-fosforylovaného peptidu s jedním z FosB fosfhopeptidů získaných z buněk PC12. B, FosB fosforylace v buňkách PC12 je zvýšena ošetřením buněk účinným sperminem aktivátoru CK2 (SP) a snížena ošetřením inhibitorem CK2 DRB. Naopak, FosB fosforylace v buňkách PC12 nebyla ovlivněna ošetřením buď aktivátorem PKC (PMA), ani inhibitorem calphostin-C (Calph) specifickým pro PKC. Je zobrazen reprezentativní autoradiogram (horní panel) a imunoblot (spodní panel). C-FVliv aktivity CK2 na stabilitu AFosB. Obrázky ukazují časový průběh (a reprezentativní autoradiogram) degradace AFosB. Buňky PC12 přechodně exprimující AFosB byly podrobeny experimentům s pulzní chasou prováděným v nepřítomnosti nebo přítomnosti inhibitoru CK2 DRB (C), spermin aktivátoru CK2 (D) nebo širokospektrálního inhibitoru kinázy H-8 (E), který byl použit ke kontrole nespecifických účinků DRB. FVliv srážení katalytické podjednotky CK2 na stabilitu AFosB. Buňky PC12 byly transfekovány buď necílovou siRNA (Ctr) nebo siRNA zacílenou na krysí CK2a a 24 h později transfekovány plazmidem AFosB. Horní panel zobrazuje imunobloty celobuněčných lyzátů, které ukazují účinek CK2 siRNA na hladiny CK2 a AFOSB. Odpovídající imunoblot pro P-tubulin je zobrazen jako kontrola plnění.
Pro další řešení fyziologické relevance CK2 jako AFOS kinázy jsme ošetřili PC12 buňky exprimující AFOSB dvěma léčivy, která modulují aktivitu CK2. Jak je uvedeno v Obrázek 4B, FosB fosforylace byla snížena ošetřením buněk PC12 inhibitorem CK2 propustným pro buňky DRB (Meggio a kol., 1990; Szyszka a kol., 1995) a zvyšuje se ošetření polyaminovým sperminem, o kterém je známo, že je silným aktivátorem CK2 (Cochet a Chambaz, 1983; Meggio a kol., 1983). Naproti tomu ošetření buněk PC12 inhibitorem PKC calphostin-C (Kobayashi a kol., 1989; Tamaoki a kol., 1990) nebo aktivátoru PKC PMA (Schmidt a Hecker, 1975; Beh a kol., 1989) nevedly k významným změnám ve FosB fosforylaci. V případě PMA se mírný (a nikoli významný) nárůst v% 32P-ΔFosB mohl být způsoben zvýšením celkových hladin ΔFosB způsobených tímto lékem; ve skutečnosti se uvádí, že estery forbolu indukují expresi několika proteinů rodiny Fos, včetně FosB (Yoza a kol., 1992; Suh a kol., 2004). Kromě toho ošetření buněk specifickým buněčně propustným inhibitorem CaMKII m-AIP (Ishida a Fujisawa, 1995; Stevens a kol., 1999) rovněž nevedla ke snížení fosforylace AFosB (data nejsou uvedena). Společně jsou tyto výsledky v souladu s našimi in vitro objevy a ukazují, že v intaktních buňkách je FosB pravděpodobně fosforylován CK2, ale ne PKC nebo CaMKII. Skutečnost, že inhibice CK2 zcela nezabrání FosB fosforylaci, naznačuje existenci dalších fosforylačních míst v proteinu.
Dále jsme zkoumali, zda CK2 hraje roli v obratu ΔFosB a tím v jeho stabilitě. Za tímto účelem jsme provedli experimenty s pulzní chasou za použití buněk PC12 exprimujících AFosB ošetřených buď inhibitorem CK2 nebo aktivátorem CK2 použitým ve studii fosforylace. Jak je uvedeno v Obrázek 4C, ošetření buněk inhibitorem CK2 DRB mělo významný vliv na rychlost obratu AFosB, o čemž svědčí změna tvaru jeho degradační křivky, z bifázické na křivku, která je blíže křivce exponenciálního rozkladu. Naopak přítomnost sperminu aktivátoru CK2 způsobila významné snížení rychlosti degradace ΔFosB, což vedlo k akumulaci proteinu během prvních hodin chase (Obr. 4D).
Stejně jako v případě mnoha aktivátorů a inhibitorů kinázy mohou mít spermin a DRB metabolické účinky mimo modulaci aktivity CK2. Ve skutečnosti se ukázalo, že DRB inhibuje kinázu asociovanou s transkripčním faktorem IIH (TFIIH) (Yankulov a kol., 1995), což vede k inhibici transkripce zprostředkované RNA polymerázou II. Protože tento účinek by mohl ovlivnit stabilitu AFosB, analyzovali jsme účinek širokospektrálního inhibitoru kinázy H-8 (Hidaka a Kobayashi, 1992) o obratu AFOSB při koncentraci (200 μm), o které je známo, že inhibuje kinázu spojenou s TFIIH, ale nikoli CK2 (Yankulov a kol., 1995). Jak je znázorněno na obrázku Obrázek 4E, ošetření H-8em neovlivnilo rychlost obratu ΔFosB. Podobné výsledky byly získány s H-7, dalším širokospektrálním inhibitorem kinázy, použitým v koncentraci, která inhibuje kinázu spojenou s TFIIH, ale nikoli CK2 (data nejsou uvedena). Tato data dále podporují interpretaci, že snížení stability AFosB způsobené DRB je pravděpodobně způsobeno inhibicí CK2.
Abychom dále stanovili roli CK2 v obratu AFOS, zkoumali jsme důsledky srazení CK2 prostřednictvím siRNA. Tyto experimenty jsme provedli s použitím buněk PC12, které byly poprvé transfekovány kontrolní (nontargeting) siRNA nebo siRNA, která cílí na mRNA katalytické podjednotky krysí CK2 (CK2a) a 24 h později transfekovaných AFOSB. Jak je uvedeno v Obrázek 4F, transfekce s CK2a siRNA účinně a specificky potlačila hladiny CK2a proteinu, aniž by to ovlivnilo hladiny FosB (horní panel). Analýza pomocí pulzní cházy odhalila, že srážení CK2 vedlo k významnému zvýšení rychlosti obratu AFosB, což dokládá rychlejší degradace proteinu. Skutečnost, že inhibice aktivity CK2 (ať už pomocí ošetření DRB nebo siRNA) zvyšuje obrat ΔFosB a vede k vymizení pomalé složky dvojfázové křivky, zatímco aktivace CK2 zvyšuje pomalou fázi křivky, poskytuje silnou podporu pro myšlenka, že CK2 hraje roli v regulaci ΔFosB stability.
CK2 fosforyluje AFosB na Ser27
Abychom mohli začít identifikovat místo (místa) na ΔFosB fosforylovaném CK2, provedli jsme fosfoaminokyselinovou analýzu rekombinantního ΔFosB fosforylovaného CK2 in vitro a FosB fosforylovaný v buňkách PC12. Tyto experimenty odhalily, že v obou případech byla jedinou detekovanou fosfo-aminokyselinou fosfo-Ser (Obr. 5A). Toto zjištění, spolu se stechiometrií získanou pro CK2 in vitro fosforylační reakce (∼50%) (Obr. 3B) a přítomnost pouze jednoho významného místa na mapě fosfodeptidů CK2 (Obr. 4A), naznačuje, že CK2 fosforylace AFosB je pravděpodobně omezena na jediný serinový zbytek. Tento závěr je v souladu s analýzou místa konsenzuálního fosforylace (Obr. 2B), který předpovídal pouze jeden kandidát serinu, tj. Ser27, pro CK2. Taxonomická analýza odhalila, že Ser27 je vysoce zachován díky evoluci mezi členy rodiny Fos (Obr. 5B), což naznačuje, že může mít důležitou fyziologickou funkci.
Zobrazit větší verzi:
Obrázek 5.
CK2 Fosforyláty AFosB na Ser27. AAnalýza fosfoaminokyseliny CK2-fosforylované (in vitro) a PC12 buněčně fosforylovaný AFosB, což ukazuje, že v obou případech je hlavním zbytkem fosforylovaný serin. BMezidruhová analýza FosB / AFosB aminokyselinové sekvence odhalila vysokou konzervaci Ser27 mezi členy rodiny Fos od člověka po zebrafish (tmavé zvýraznění). Kyselý zbytek v poloze + 3, který je vyžadován pro konsenzuální místo CK2, není konzervován (světelné zvýraznění). C, HeLa buňky byly přechodně transfekovány buď divokým typem AFosB (WT) nebo AFosB obsahující bodovou mutaci, aby se nahradil Ser27 Ala (S27A). Buňky byly metabolicky značeny 32PH3PO4 a ošetřeno vehikulem nebo sperminem (SP) pro aktivaci CK2. Je ukázán reprezentativní autoradiogram (horní panel) a imunoblot (spodní panel) získaných imunoprecipitátů AFosB. Je ukázána imunoprecipitát falešně transfekovaných buněk (vektor).
Abychom určili, zda je Ser27 fosforylován v AFosB, mutovali jsme tento zbytek na Ala a analyzovali důsledky na fosforylační stav proteinu. Za tímto účelem jsme použili HeLa buňky (které mohou být transfekovány s vyšší účinností) k přechodné expresi WT nebo S27A mutantu FosB. Přibližně 24 h po transfekci byly buňky metabolicky značeny 32Byly připraveny P-orthofosfát a celobuněčné lyzáty. Po imunoprecipitaci a SDS-PAGE 32P-ΔFosB byl detekován autoradiografií a celkový ΔFosB imunoblotováním. Jak je uvedeno v Obrázek 5C (spodní panel), AFoB nebyl detekován v buňkách transfekovaných vektorem, zatímco buňky transfekované mutantem WT nebo S27A AFOSB úspěšně exprimovaly protein. Zjistili jsme, že mutace S27A způsobila významné (∼30%) snížení v 32Hladiny P-ΔFosB (Obr. 5C, horní panel a graf), což ukazuje, že v živých buňkách je FosB fosforylován na Ser27. Ve snaze zjistit, zda je v buňkách Ser27 skutečně fosforylován CK2, jsme porovnali schopnost spermatu aktivátoru CK2 modulovat fosforylaci WT a S27A ΔFosB. Jak jsme již dříve pozorovali v buňkách PC12 (Obr. 4B), ošetření HeLa buněk sperminem významně zvýšilo fosforylaci WT proteinu. Skutečnost, že tento účinek byl významně snížen mutací S27A (Obr. 5C) podporuje interpretaci, že Ser27 v AFOSB je fyziologický substrát pro CK2.
Fosforylace Ser27 reguluje stabilitu ΔFosB
Po zjištění, že stabilita ΔFosB je snížena, když je inhibován CK2, a zvýšen, když je aktivován CK2 (Obr. 4) a že CK2 fosforyluje AFosB na Ser27 (Obr. 5), předpovídali jsme, že zabránění fosforylaci tohoto místa by mělo destabilizovat protein. Experimenty s pulzní chasou prováděné s HeLa buňkami přechodně exprimujícími buď WT nebo S27A mutantní ΔFosB odhalily, že, jak bylo předpovězeno, mutace S27A vedla k významnému zvýšení rychlosti degradace ΔFosB a souběžnému snížení poločasu proteinu (Obr. 6A). Poté jsme zkoumali, zda se tento regulační mechanismus vyskytuje také v buněčné linii PC12 podobné neuronům. Tyto experimenty odhalily, že, jak jsme pozorovali v HeLa buňkách, S27A bodová mutace způsobuje dramatické snížení poločasu ΔFosB v PC12 buňkách (z ∼11 na ∼4 h) (Obr. 6B). Skutečnost, že tato destabilizace je podobná destabilizaci způsobené inhibicí nebo knock-down CK2 (Obr. 4) poskytuje další podporu pro myšlenku, že fosforylace Ser2 zprostředkovaná CK27 reguluje stabilitu AFosB. Další důkaz regulační úlohy Ser27 fosforylace na obratu AFOSB proteinu byl získán pomocí fosfomimetické Ser27 na Asp mutaci (S27D). Mutace S27D je považována za fosfomimetickou, protože klade velkou záporně nabitou (karboxylovou) skupinu na aminokyselinu 27, a tím částečně napodobuje fosforylaci Ser27. Jak je uvedeno v Obrázek 6C, mutace S27D způsobila opačný účinek mutace S27A a vyústila v protein podstatně stabilnější než protein WT. Podobně jako účinek získaný po aktivaci CK2 (Obr. 4D), mutace S27D vedla k akumulaci, a tak zvýšila hladinu AFosB během prvních hodin chase.
Zobrazit větší verzi:
Obrázek 6.
Fosforylace Ser27 reguluje stabilitu ΔFosB. A, CAnalýza pulzně-chase ukazující účinek fosforylace Ser27 na rychlost obratu AFOS. Je ukázán profil degradace a odhadované poločasy AFOS B divokého typu (WT), mutant Ser27 na Ala (S27A) a fosfomimetický mutant Ser27 na Asp (S27D). Stejné nálezy byly získány v HeLa buňkách (A) a buňky PC12 (B, C).
Fosforylace Ser27 stabilizuje AFosB tím, že zabraňuje jeho proteazomální degradaci
Abychom začali objasňovat mechanismus, kterým fosforylace Ser27 stabilizuje ΔFosB, zkoumali jsme schopnost inhibitorů proteazomu MG132 (Palombella a kol., 1994; Tsubuki a kol., 1996) a epoxomicin (Hanada a kol., 1992; Kim et al., 1999) modulovat rychlost degradace mutantu WT a S27A ΔFosB. Experimenty s pulzní chasou byly prováděny za použití buněk PC12 infikovaných rekombinantním HSV exprimujícím buď WT nebo S27A AFOS a ošetřeny buď DMSO nebo jedním ze dvou inhibitorů proteazomu. Tyto experimenty odhalily, že ačkoli rychlost degradace proteinu WT je relativně necitlivá na přítomnost jednoho ze dvou inhibitorů proteazomu (Obr. 7A) je mutant S27A citlivý na tyto léky (Obr. 7B). To ukazuje, že na rozdíl od proteinu WT je mutant S27A cílem proteazomální degradace. Ve skutečnosti ošetření buněk buď MG132 nebo epoxomicinem úplně obrátilo účinek mutace S27A na rychlost degradace ΔFosB, o čemž svědčí zvýšení poločasu mutantu S27A z ∼4 na ∼9 h pro MG132 a ∼ 12 h pro epoxomicin (Obr. 7B). Tato zjištění společně ukazují, že fosforylace AFosB na Ser27 chrání protein před proteazomální degradací, a je proto nezbytná pro jeho neobvyklou stabilitu.
Zobrazit větší verzi:
Obrázek 7.
Fosforylace Ser27 stabilizuje AFosB tím, že brání jeho proteazomální degradaci. A, B, Pulse-chase analýza s HSV-infikovanými PC12 buňkami ukazující degradační profil a odhadované poločasy ΔFosB divokého typu (A) nebo S27A ΔFosB (B) v nepřítomnosti nebo přítomnosti jednoho ze dvou inhibitorů proteazomu [MG132 a epoxomicinu (Epoxo)]. Povšimněte si skutečnosti, že ani jedno léčivo nemá významný účinek na obrat divokého typu AFosB, zatímco ošetření buněk inhibitorem proteazomu vedlo ke stabilizaci S27A AFOSB. C, Model role Ser27 fosforylace ve schopnosti AFosB zprostředkovat dlouhodobou plasticitu mozku. Jakmile je indukována, část AFOSB je stabilizována v mozku fosforylací S2 zprostředkovanou CK27. To má za následek jeho akumulaci, což zase vede k dlouhodobým změnám v genové expresi. Tyto stabilní změny v genové expresi přispívají ke stabilním změnám chování. Naopak defosforylace S27 Ser / Thr fosfatázami PP1 a / nebo PP2A vede k destabilizaci proteinu a jeho zpracování proteazomálním aparátem.
Diskuse
V této studii jsme ukázali, že AFosB má v buněčné kultuře poločas ∼10 h, což je stabilní ve srovnání s FosB s plnou délkou a většina dalších indukovatelných transkripčních faktorů, jejichž poločasy v buněčné kultuře mohou být tak krátké za několik minut a zřídka překračují 3 h (Hann a Eisenman, 1984; Dobrazanski a kol., 1991; Roberts a Whitelaw, 1999; Ferrara a kol., 2003; Hirata a kol., 2004). Kromě toho jsme zjistili, že AFos je fosforylovaný v mozku a že jeho fosforylace je citlivá na inhibitor kyseliny okadaové PP1 / PP2A. Naše studie o buněčné kultuře ukazují, že stabilita AFosB je modulována pomocí CK2, s vyšší aktivitou CK2 stabilizující protein. Nakonec naše zjištění naznačují, že CK2 fosforyluje AFosB na vysoce konzervovaném serinu N terminus (S27) a prokazuje, že fosforylace S27 chrání AFos před proteazomální degradací. Navrhujeme proto model, ve kterém je fosforylace ΔFosB na S27 pomocí CK2 kritickým regulačním mechanismem obratu ΔFosB (Obr. 7C). Taková stabilizace AFosB zprostředkovaná fosforylací je funkčně důležitá, protože bylo prokázáno, že zvýšené hladiny AFosB v konkrétních mozkových oblastech přímo regulují četné neuronální geny in vivo a projevovat silné behaviorální účinky na zvířecích modelech několika neuropsychiatrických poruch (viz Úvod).
Přestože je fosforylace rychlým a reverzibilním způsobem regulace transkripční aktivity určitých transkripčních faktorů, jako je CREB (cAMP protein vázající protein) (Bohmann, 1990), modulace degradace transkripčních faktorů poskytuje ještě silnější (méně snadno reverzibilní) formu regulace (Desterro a kol., 2000). Mezi transkripční faktory, jejichž funkční aktivita je regulována na úrovni jejich degradace, patří NFκB (Desterro a kol., 2000), c-Myc (Sears a kol., 1999) a c-Fos (Ferrara a kol., 2003), mezi ostatními. V mnoha případech je fosforylace klíčovým regulátorem stability transkripčního faktoru, jak bylo ukázáno u c-Fos (Okazaki a Sagata, 1995; Tsurumi a kol., 1995), Fos-příbuzný antigen-1 (Fra-1) (Vial a Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe a kol., 2001), c-červen (Fuchs a kol., 1996), JunB (Fuchs a kol., 1997), ATF2 (Fuchs a kol., 2000) a p53 (Buschmann a kol., 2001). Naše studie tak přidávají ΔFosB do tohoto seznamu transkripčních faktorů, jejichž funkční aktivita je regulována díky své fosforylované závislosti.
CK2 je všudypřítomná a konstitutivně aktivní Ser / Thr kináza, která má dosud identifikovaných> 300 údajných substrátů a je zapojena do mnoha biologických procesů, včetně buněčné smrti a přežití (Litchfield, 2003; Unger a kol., 2004), reakce na buněčný stres (Yanagawa a kol., 1997; Kato a kol., 2003) a opravy DNA a remodelace chromatinu (Barz a kol., 2003; Krohn a kol., 2003). Více než třetina domnělých substrátů CK2 jsou proteiny zapojené do regulace genové exprese (Meggio a Pinna, 2003). Ve skutečnosti se ukázalo, že CK2 je prominentní jaderná kináza (Krek a kol., 1992) (pro kontrolu viz Yu a kol., 2001) a interagovat s doménami bZIP několika transkripčních faktorů (Yamaguchi a kol., 1998). Ukázalo se také, že fosforylace zprostředkovaná CK2 moduluje degradaci (buď ji zvyšuje nebo snižuje) mnoha proteinů, včetně IkB (Schwarz a kol., 1996), PTEN (Torres a Pulido, 2001), připojení objektivu (Yin a kol., 2000), s proteinem HMG1 asociovaným s chromatinem (Wisniewski a kol., 1999) a několik transkripčních faktorů, jako je HMGB (Stemmer a kol., 2002), Myf-5 (Winter a kol., 1997) a c-Myc (Channavajhala a Seldin, 2002). CK2 je nejhojnější v mozku (Alcazar a kol., 1988; Girault a kol., 1990) a jeho aktivita se podílí na mnoha aspektech funkce mozku, včetně přežití neuronů (Boehning a kol., 2003), diferenciace (Nuthall a kol., 2004), funkce iontového kanálu (Jones a Yakel, 2003; Bildl a kol., 2004), a dlouhodobá potenciace a neuronální plasticita (Diaz-Nido a kol., 1992; Lieberman a Mody, 1999; Reikhardt a kol., 2003).
Přes tento rostoucí důkaz o úloze CK2 v regulaci neuronální funkce je málo známo, co řídí její aktivitu. CK2 je považován za konstitutivně aktivní, s regulací jeho schopnosti fosforylovat specifické substráty, přičemž se spoléhá hlavně na změny ve své intracelulární lokalizaci (např. Cytosol vs. jádro) (Ahmed a Tawfic, 1994; Yu a kol., 1999). Tato informace vyvolává důležitou otázku týkající se toho, jaké signály jsou potřebné k vyvolání akumulace ΔFosB v mozku po chronické stimulaci (Obr. 7C). Jedním požadavkem je opakovaná aktivace systému fosB gen a indukce ΔFosB mRNA (Chen a kol., 1995). Naše data ukazují, že CK2 fosforylace AFosB je kritická pro její stabilitu, což naznačuje, že pro dlouhodobé účinky AFosB na genovou expresi může být vyžadován druhý signál, jmenovitě signál, který stimuluje fosforylaci proteinu CK2. To by mohlo zahrnovat aktivaci CK2 nějakým neznámým mechanismem nebo jeho translokaci do jádra. Alternativně může být CK2 fosforylace AFosB konstitutivní tak, že jak je protein FosB translatován v reakci na každý stimul, jeho část se fosforyluje a tím stabilizuje, takže se opakovanou stimulací hromadí na vysokých hladinách v postižených neuronech.
Naše zjištění ukazují, že CK2 a S27 pravděpodobně nejsou jedinou kinázou a místem odpovědným za fosforylaci AFB, protože ani inhibice mutace CK2 ani mutace S27A nebyla schopna zcela zabránit fosforylaci AFB. Stejně tak skutečnost, že mutace S27A vede k 30% redukci fosfo-AFOSB, tvrdí, že S27 je hlavní fosforylační místo v proteinu. Prozkoumáváme však další domnělé kinázy a fosforylační místa na FosB. Nakonec bude také důležité analyzovat fosforylaci S27 a dalších fosforylačních míst v FOSB v mozku in vivo po různých typech chronické stimulace, například pomocí hmotnostní spektrometrie nebo fosfospecifických protilátek.
Jak je uvedeno výše, S27 v AFOSB je vysoce konzervovaný během evoluce a mezi jinými proteiny rodiny Fos. Místo konsensu pro CK2 však není: jak je uvedeno v Obrázek 5B, pouze FosB / AFosB (a xenolog Zebrafish), ale ne c-Fos nebo Fra-2, mají kyselý zbytek na + 3, klíčový determinant fosforylace CK2 (Marin a kol., 1986; Meggio a kol., 1994). Nedostatek fosforylace CK2 na S27 může tedy vysvětlit, proč jiné proteiny rodiny Fos nejsou tak stabilní jako AFB. To však nevysvětluje, proč FosB s plnou délkou, který má stejné konsenzuální místo CK2 jako AOS, není podobně stabilizován. Nevíme, zda je FosB plné délky fosforylován CK2 na tomto konzervovaném zbytku. Jediné zprávy FosB (Skinner a kol., 1997) a c-Fos (Okazaki a Sagata, 1995; Chen a kol., 1996) fosforylace popisuje místa v C-terminální oblasti těchto proteinů, která v AFOS chybí. Potenciální fosforylace full-length FosB a dalších proteinů rodiny Fos pomocí CK2 vyžaduje přímé zkoumání. I když jsou však fosforylované, je známo, že ostatní proteiny rodiny Fos obsahují na svých koncích C motivy, které cílí na proteiny pro rychlou degradaci (Papavassiliou a kol., 1992; Jariel-Encontre a kol., 1997; Acquaviva a kol., 2002). Například bylo ukázáno, že úsek ∼21 zbytků přítomných na C-konci všech proteinů rodiny Fos, ale chybějící v AFosB, působí jako destabilizující doména pro c-Fos (Acquaviva a kol., 2001). Zjistili jsme, že ačkoli tato sekvence podobně destabilizuje plnou délku FosB (Carle a kol., 2004), nepřítomnost této domény v AFOS není plně zodpovědná za její stabilizaci. Zdá se, že kombinace nepřítomnosti této C-koncové domény a fosforylace Ser27 plně odpovídá přibližně pětinásobnému rozdílu ve stabilitě mezi AFOS a FosB.
Ačkoli degradace proteinů rodiny Fos je složitá a není zcela pochopena, zdá se, že hlavní proteazální degradace je proteazomální degradace (Salvat a kol., 1999; Acquaviva a kol., 2002; Ferrara a kol., 2003). Zde prezentovaná data, ve kterých proteazomální inhibitory významně nemění rychlost degradace AFosB, tvrdí, že na rozdíl od jiných proteinů rodiny Fos se FosB vyhýbá proteazomu 26S, a to hraje ústřední roli při jeho stabilizaci. Navrhujeme proto schéma, kde zvýšená stabilita AFosB je způsobena kombinací dvou hlavních faktorů: (1) absence destabilizující domény C-terminálu a (2) fosforylace S27 pomocí CK2.
Stručně řečeno, tato studie poskytuje mechanistický pohled na to, proč AFOS, produkt okamžitého raného genu fosB, je na rozdíl od všech ostatních členů rodiny Fos relativně dlouhověkým proteinem. Přestože se předpokládá, že jiné proteiny rodiny Fos zprostředkovávají rychlou, ale přechodnou vazbu stimulace a transkripceMorgan a Curran, 1995), relativní stabilita AFosB jí dává schopnost zprostředkovat dlouhodobé transkripční změny vyvolané chronickou stimulací. To podporuje názor, že AFos funguje jako trvalý molekulární přepínač v mozku a postupně převádí akutní reakce na chronické adaptace. Identifikace fosforylace Ser27 jako centrálního mechanismu pro stabilitu FosB otevírá nové možnosti pro vývoj prostředků pro regulaci funkce FosB, a tím modulovat jeho dlouhodobé účinky na nervovou a behaviorální plasticitu.
Poznámky pod čarou
- Přijato listopad 21, 2005.
- Revize byla přijata únor 21, 2006.
- Přijato v dubnu 2, 2006.
- Tato práce byla podpořena cenou Národní aliance pro výzkum schizofrenie a ceny deprese mladých vyšetřovatelů pro PGU, cenou Národního institutu pro zneužívání drog (NIDA) National Research Service Award pro PGU a granty od Národního institutu duševního zdraví a NIDA EJN We děkuji Dr. Jamesovi Bibbovi za jeho pomoc s in vitro Fosforylační testy, Dr. Ming-Hu Han za pomoc s přípravou řezů mozku používaných pro metabolické značení a Dr. Rachael Neve za pomoc při balení rekombinantních HSV.
- Současná adresa G. Rudenka: Life Sciences Institute and Department of Pharmacology, University of Michigan, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
- Korespondence by měla být adresována Ericu J. Nestlerovi, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallasu, TX 75390-9070. E-mailem: [chráněno e-mailem]
Reference
Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) Identifikace C-terminálního tripeptidového motivu podílejícího se na řízení rychlé proteazomální degradace proto-onkoproteinu c-Fos během fázového přechodu G (0) -to-S. Onkogene 20:7563-7572.
Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Více cest degradace proteinů rodiny Fos. Ann. NY Acad Sci 973:426-434.
Ahmed K, Tawfic S (1994) Mechanismus intracelulární regulace proteinové kinázy CK2: role stimulačně zprostředkované subnukleární asociace. Cell Mol Biol Res 40:539-545.
Alcazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M. (1988) Vylepšený postup čištění a vlastnosti kaseinové kinázy II z mozku. Neurochem Res 13:829-836.
Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Časový průběh striatální imunoreaktivity typu DeltaFosB a hladiny mRNA prodynorphinu po přerušení chronické dopaminomimetické léčby. Eur J Neurosci 17:661-666.
Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) Genomové expresní obrazovky ukazují na globální roli proteinové kinázy CK2 při remodelaci chromatinu. J Cell Sci 116:1563-1577.
Beh I, Schmidt R, Hecker E. (1989) Dva izozymy PKC nalezené v buňkách HL-60 vykazují rozdíl v aktivaci pomocí forbolesteru TPA. FEBS Lett 249:264-266.
Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Protein kináza CK2 je kombinována s malými vodivostmi Ca (2 +) - aktivovanými K + kanály a reguluje hradlování kanálů. Neuron 43:847-858.
Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Dlouhodobá exprese antigenu souvisejícího s Fos a přechodná exprese delta FosB spojená se záchvaty v hippocampu a striatu potkana. J Neurochem 68:272-279.
Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Predikce posttranslační glykosylace a fosforylace proteinů z aminokyselinové sekvence. proteomika 4:1633-1649.
Boehning D, Moon C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Neurotransmise oxidu uhelnatého aktivovaná CK2 fosforylací heme oxygenázy-2. Neuron 40:129-137.
Bohmann D (1990) Fosforylace transkripčního faktoru: souvislost mezi signální transdukcí a regulací genové exprese. Rakovinové buňky 2:337-344.
Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Fried VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) Červen NH2-terminální kinázová fosforylace p53 na Thr-81 je důležitá pro stabilizaci a transkripční aktivity p53 v reakci na stres. Mol Cell Biol 21:2743-2754.
Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Absence konzervované C-koncové domény rodiny Fos přispívá k jedinečné stabilitě deltaFosB. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.
Channavajhala P, Seldin DC (2002) Funkční interakce proteinové kinázy CK2 a c-Myc v lymfomagenezi. Onkogene 21:5280-5288.
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ (1995) Regulace delta FosB a proteinů podobných FosB pomocí elektrokonvulzivního ošetření záchvatů a kokainu. Mol Pharmacol 48:880-889.
Chen J, Kelz MB, Hope BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Chronické Fos-příbuzné antigeny: stabilní varianty ΔFosB indukované v mozku chronickými léčebnými postupy. J Neurosci 17:4933-4941.
Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) Fosforylace c-Fos na C-konci zvyšuje její transformační aktivitu. Onkogene 12:1493-1502.
Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Inhibitor proteinové fosfatázy 1 / 2A, kyselina okadaová, zvyšuje fosforylaci CREB a Elk-1 a expresi c-fos in striatum potkanů in vivo. J Neurochem 89:383-390.
Cochet C, Chambaz EM (1983) Fosforylace proteinů zprostředkovaná polyaminem: možný cíl pro intracelulární působení polyaminu. Mol Cell Endocrinol 30:247-266.
Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Katalytické a molekulární vlastnosti vysoce purifikované kaseinové kinázy typu G z plicní tkáně skotu. Biochim Biophys Acta 743:1-12.
Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) Nadměrná exprese DeltaFosB specifická pro striatální buněčné typy zvyšuje motivaci ke kokainu. J Neurosci 23:2488-2493.
Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Samopodávání kokainu zvyšuje mRNA preprodynorfin, ale ne c-fos, ve striatu potkana. NeuroReport 4:543-546.
Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Regulace transkripčních faktorů degradací proteinů. Cell Mol Life Sci 57:1207-1219.
Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) Zvýšení aktivity typu cytoplazmatické kaseinové kinázy II doprovází růst neuritů po inhibici syntézy DNA v buňkách neuroblastomu NIA-103. J Neurochem 58:1820-1828.
Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Protein kináza CK2 fosforyluje a zvyšuje reguluje Akt / PKB. Cell Death Differ 12:668-677.
Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) Oba produkty genu fosB, FosB a jeho krátké formy, FosB / SF, jsou transkripčními aktivátory ve fibroblastech. Mol Cell Biol 11:5470-5478.
Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) Strukturální determinanty odpovědné za proteazomální degradaci proteinu c-Fos se liší podle podmínek exprese. Onkogene 22:1461-1474.
Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) Fosforylace závislé cílení c-Jun ubikvitinace Jun N-kinázou. Onkogene 13:1531-1535.
Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun NH2-terminální kinázy se zaměřují na ubikvitinaci jejich přidružených transkripčních faktorů. J Biol Chem 272:32163-32168.
Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) Stabilita transkripčního faktoru ATF2 je regulována fosforylací a defosforylací. J Biol Chem 275:12560-12564.
Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) Fosforylace DARPP-32, dopaminem a cAMP-regulovaného fosfoproteinu, kaseinovou kinázou II. J Biol Chem 264:21748-21759.
Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Charakterizace serinové kinázy DARPP-32 v mozku savců identické s kaseinovou kinázou II. J Neurochem 55:1772-1783.
Hanada M, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Epoxomicin, nové protinádorové činidlo mikrobiálního původu. J Antibiot (Tokio) 45:1746-1752.
Hann SR, Eisenman RN (1984) Proteiny kódované lidským c-myc onkogenem: diferenciální exprese v neoplastických buňkách. Mol Cell Biol 4:2486-2497.
Hemmings HC Jr, Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, cyklický AMP-regulovaný fosfoprotein (Mr = 21,000) obohacený v mozkových oblastech inervovaných dopaminem. Aminokyselinová sekvence místa fosforylovaná cyklickým AMP v intaktních buňkách a kinetické studie jeho fosforylace in vitro. J Biol Chem 264:7726-7733.
Hidaka H, Kobayashi R (1992) Farmakologie inhibitorů protein kinázy. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377-397.
Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lewis J, Kageyama R (2004) Nestabilita Hes7 proteinu je rozhodující pro segmentaci somitů. Nat Genet 36:750-754.
Hiroi N, Graybiel AM (1996) Atypická a typická neuroleptická léčba indukují odlišné programy exprese transkripčního faktoru ve striatu. J Comp Neurol 374:70-83.
Naděje B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Regulace okamžité rané genové exprese a vazby AP-1 v jádru krysy podle chronického kokainu. Proc Natl Acad Sci USA 89:5764-5768.
Naděje BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Léčba chronickým elektrokonvulzivním záchvatem (ECS) vede k expresi dlouhodobého komplexu AP-1 v mozku se změněným složením a charakteristikami. J Neurosci 14:4318-4328.
Naděje BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Indukce dlouhodobého komplexu AP-1 složeného ze změněných Fos-like proteinů v mozku chronickým kokainem a jinými chronickými léčbami. Neuron 13:1235-1244.
Ishida A, Fujisawa H (1995) Stabilizace kalmodulin-dependentní proteinové kinázy II prostřednictvím autoinhibiční domény. J Biol Chem 270:2163-2170.
Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Složité mechanismy pro degradaci c-fos a c-jun. Mol Biol Rep 24:51-56.
Jones S, Yakel JL (2003) Kasein kináza ii (protein kináza ck2) reguluje funkci kanálu serotoninového 5-ht (3) v buňkách ng108 – 15. Neurovědy 119:629-634.
Kato T Jr, Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2 je C-terminální IkappaB kináza zodpovědná za aktivaci NF-kappaB během UV reakce. Mol Cell 12:829-839.
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Exprese transkripčního faktoru deltaFosB v mozku řídí citlivost na kokain. Příroda 401:272-276.
Kim KB, Myung J, Sin N, Crews CM (1999) Inhibice proteazomu přírodními produkty epoxomicinem a dihydroeponemycinem: vhledy do specifičnosti a účinnosti. Bioorg Med Chem Lett 9:3335-3340.
Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Calphostin C (UCN-1028C), nová mikrobiální sloučenina, je vysoce účinný a specifický inhibitor proteinové kinázy C. Biochem Biophys Res Commun 159:548-553.
Krek W, Maridor G, Nigg EA (1992) Kasein kináza II je převážně jaderný enzym. J Cell Biol 116:43-55.
Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Protein kináza CK2 fosforyluje protein domény domény vysoké mobility SSRP1, což indukuje rozpoznávání DNA poškozené UV zářením. J Biol Chem 278:12710-12715.
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Self DW, Nestler EJ (2005) Chromatinová remodelace je klíčovým mechanismem, který je základem plasticity vyvolané kokainem ve striatu. Neuron 48:303-314.
Lieberman DN, Mody I (1999) Kasein kináza-II reguluje funkci NMDA kanálu v hippocampálních neuronech. Nat Neurosci 2:125-132.
Litchfield DW (2003) Protein kináza CK2: struktura, regulace a role v buněčných rozhodnutích o životě a smrti. Biochem J 369:1-15.
Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) Degradace proteinu c-Fos exprimovaného N-methyl-dkyselina asparagová v jaderných frakcích myšího hippocampu. Brain Res 905:34-43.
Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Absence trvale zvýšeného 37 kDa fos-příbuzného antigenu a AP-1-podobné DNA vazebné aktivity v mozcích myší ošetřených fosB nulovou myší ošetřených kyselinou kainovou. J Neurosci 17:5407-5415.
Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Site specificita kasein kinázy-2 (TS) z jaterního cytosolu potkana. Studie s modelovými peptidovými substráty. Eur J Biochem 160:239-244.
McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulace genové exprese a kokainové odměny pomocí CREB a DeltaFosB. Nat Neurosci 6:1208-1215.
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: molekulární přepínač pro dlouhodobou adaptaci v mozku. Brain Res Mol Brain Res 132:146-154.
Meggio F, Pinna LA (2003) Tisíc a jeden substrát proteinkinázy CK2? FASEB J 17:349-368.
Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Fosforylace kaseinových frakcí krysími játry „fosvitin kinázou“. FEBS Lett 75:192-196.
Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Autofosforylace kaseinové kinázy TS typu 2 na alfa a beta podjednotkách. Vliv různých efektorů. FEBS Lett 160:203-208.
Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Deriváty ribofuranosylbenzimidazolu jako inhibitory kaseinové kinázy-2 a kaseinové kinázy-1. Eur J Biochem 187:89-94.
Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Substrátová specificita proteinové kinázy CK2. Cell Mol Biol Res 40:401-409.
Miller C, Zhang M, He Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) Transkripční indukce genu cyklooxygenázy-2 inhibicí fosfatázové aktivity kyseliny okadaové v lidských chondrocytech: ko-stimulace jaderných vazebných proteinů AP-1 a CRE. J Cell Biochem 69:392-413.
Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Změny exprese indukovatelných proteinů Fos-Jun na úrovni sítě během chronické léčby kokainem a jeho vysazení. Neuron 17:147-156.
Morgan JI, Curran T (1995) Okamžitě rané geny: o deset let později. Trendy Neurosci 18:66-67.
Nakabeppu Y, Nathans D (1991) Přirozeně se vyskytující zkrácená forma FosB, která inhibuje transkripční aktivitu Fos / Jun. Buňka 64:751-759.
Nestler EJ, Barrot M, Self DW (2001) Delta FosB: trvalá molekulární změna závislosti. Proc Natl Acad Sci USA 98:11042-11046.
Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Zavedení podjednotky glutamátového receptoru 1 do motorických neuronů in vitro a in vivo pomocí rekombinantního viru herpes simplex. Neurovědy 79:435-447.
Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Fosforylace serinu 239 Groucho / TLE1 proteinovou kinázou CK2 je důležitá pro inhibici neuronální diferenciace. Mol Cell Biol 24:8395-8407.
Okazaki K, Sagata N (1995) Dráha Mos / MAP kinázy stabilizuje c-Fos fosforylací a zvyšuje její transformační aktivitu v buňkách NIH 3T3. EMBO J 14:5048-5059.
Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) Pro zpracování prekurzorového proteinu NF-kappa B1 a aktivaci NF-kappa B je vyžadována ubikvitin-proteazomová cesta. Buňka 78:773-785.
Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) Cílená degradace c-Fos, ale nikoli v-Fos, signálem závislým na fosforylaci na c-Jun. Věda 258:1941-1944.
Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. (2003) Indukovatelná exprese dominantního negativního mutanta c-Jun v mozkové oblasti u transgenních myší snižuje citlivost na kokain. Brain Res 970:73-86.
Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) Indukce DeltaFosB v mozkových strukturách souvisejících s odměnami po chronickém stresu. J Neurosci 24:10594-10602.
Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Exprese faktoru transkripce mozku: účinky akutního a chronického amfetaminu a injekčního stresu. Brain Res Mol Brain Res 20:91-100.
Ploegh HL, Dunn BM (2000) Posttranslační modifikace: fosforylace a fosfatázy. In: Aktuální protokoly ve vědě o proteinech (Dunn BM, ed.) Str. 13.01–13.02. New York: Wiley a synové.
Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Katalytické a molekulární vlastnosti vysoce purifikovaného fosvitin / kasein kinázy typu II z lidských epiteliálních buněk v kultuře (HeLa) a vztah k ekto protein kináze. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215-227.
Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) Stav systému proteinové kinázy CK2-HMG14 u amnézie související s věkem u potkanů. Neurosci Behav Physiol 33:799-804.
Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Degradace základního dioxinového receptoru domény helix-loop-helix / Per-ARNT-Sim prostřednictvím ubikvitin / proteazomové dráhy. J Biol Chem 274:36351-36356.
Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) Server PredictProtein. Nucleic Acids Res 32:W321–W326.
Rylski M, Kaczmarek L (2004) Ap-1 cíle v mozku. Přední Biosci 9:8-23.
Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Molekulární charakterizace rekombinantní myší adenosinkinázy a vyhodnocení jako cíl pro fosforylaci proteinu. Eur J Biochem 271:3547-3555.
Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) Existují různé proteolytické dráhy přispívající k degradaci proteinu c-Fos, c-Jun a p53 in vivo? Mol Biol Rep 26:45-51.
Schmidt R, Hecker E. (1975) Autoxidace forbolových esterů za normálních skladovacích podmínek. Cancer Res 35:1375-1377.
Schwarz EM, Van Antwerp D, Verma IM (1996) Konstituční fosforylace IkappaBalfa kaseinovou kinázou II nastává přednostně v serinu 293: požadavek na degradaci volného IkappaBalpha. Mol Cell Biol 16:3554-3559.
Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras zvyšuje stabilitu proteinu Myc. Mol Cell 3:169-179.
Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Cyklická nukleotidově nezávislá fosforylace vitellinu kaseinovou kinázou II vyčištěnou z oocytů Rhodnius prolixus. Insect Biochem Mol Biol 32:847-857.
Skinner M, Qu S, Moore C, Moudrost R (1997) Transkripční aktivace a transformace proteinem FosB vyžadují fosforylaci karboxylové koncové aktivační domény. Mol Cell Biol 17:2372-2380.
Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Protein kináza CK2 odlišně fosforyluje kukuřičné chromosomální proteiny skupiny B s vysokou mobilitou (HMGB), které modulují jejich stabilitu a interakce DNA. J Biol Chem 277:1092-1098.
Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) Identifikace cyk, cyklin B2 kinázy, jako nové proteinové kinázy II závislé na vápníku / kalmodulinu a její role během maturace oocytů Xenopus laevis. Exp Cell Res 252:303-318.
Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Regulace exprese genu c-fos a c-jun lipopolysacharidem a cytokiny v primárních kultivovaných astrocytech: účinek cest PKA a PKC. Arch Pharm Res 27:396-401.
Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Diferenciální fosforylace ribosomálních kyselých proteinů z kvasinkové buňky dvěma endogenními proteinovými kinázami: kaseinovou kinázou-2 a 60S kinázou. Acta Biochim Pol 42:357-362.
Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Kalphostin (UCN1028) a sloučeniny související s kalphostinem, nová třída specifických a silných inhibitorů protein kinázy C. Adv Druhý Messenger Phosphoprotein Res 24:497-501.
Torres J, Pulido R (2001) Nádorový supresor PTEN je fosforylován proteinovou kinázou CK2 na svém C-konci. Důsledky pro stabilitu PTEN na degradaci zprostředkovanou proteazomy. J Biol Chem 276:993-998.
Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Diferenciální inhibice aktivity calpainu a proteazomu peptidyl aldehydy di-leucinu a tri-leucinu. J Biochem (Tokio) 119:572-576.
Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) Degradace c-Fos proteazomem 26S je urychlena c-Jun a více proteinovými kinázami. Mol Cell Biol 15:5682-5687.
Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) Protein kináza CK2 jako regulátor přežití buněk: důsledky pro léčbu rakoviny. Cíle proti rakovině měny 4:77-84.
Vial E, Marshall CJ (2003) Zvýšená aktivita ERK-MAP kinázy chrání člena rodiny FOS FRA-1 před proteazomální degradací v buňkách karcinomu tlustého střeva. J Cell Sci 116:4957-4963.
Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) ΔFosB reguluje běh kola. J Neurosci 22:8133-8138.
Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Regulace funkce transkripčního faktoru fosforylací. Cell Mol Life Sci 57:1172-1183.
Zima B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) Pro předpokládanou aktivitu Myf-2 jsou důležitá dvě předpokládaná proteinová kinázová CK5 fosforylační místa. Biol Chem 378:1445-1456.
Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Konstituční fosforylace kyselých zbytků proteinů 1 skupiny s vysokou pohyblivostí kaseinovou kinázou II mění jejich konformaci, stabilitu a vazebnou specificitu DNA. J Biol Chem 274:20116-20122.
Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) Kasein kináza II interaguje s doménami bZIP několika transkripčních faktorů. Nucleic Acids Res 26:3854-3861.
Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) Fosforylace stresového proteinu A170 kaseinovou kinázou II podobnou aktivitou v makrofázích. Biochem Biophys Res Commun 241:157-163.
Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) Inhibitor transkripčního prodloužení 5,6-dichlor-1-beta-d-ribofuranosylbenzimidazol inhibuje protein kinázu spojenou s transkripčním faktorem IIH. J Biol Chem 270:23922-23925.
Yen J, Moudrost RM, Tratner I, Verma IM (1991) Alternativní sestřihovou formou FosB je negativní regulátor transkripční aktivace a transformace proteiny Fos. Proc Natl Acad Sci USA 88:5077-5081.
Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Kasein kináza II fosforyluje konexin 45.6 čočky a podílí se na její degradaci. J Biol Chem 275:6850-6856.
Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Indukce složek transkripčního faktoru AP-1 během aktivace T lymfocytů interleukinovými 1 a forbolovými estery. Růst buněk se liší 3:677-684.
Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) Důsledky signalizace CK2 na jadernou matici. Mol Cell Biochem 227:67-71.
Yu S, Davis AT, Guo C, Green JE, Ahmed K (1999) Diferenční cílení proteinové kinázy CK2 na jadernou matici po přechodné nadměrné expresi jejích podjednotek. J Cell Biochem 74:127-134.
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: zásadní úloha ΔFosB v jádru accumbens při morfinovém působení. Nat Neurosci 9:205-211.
Články citující tento článek
- Reakce na behaviorální a strukturální reakce na chronický kokain vyžadují dopřednou smyčku, která zahrnuje enzym FosB a proteinovou kinázu závislou na vápníku / kalmodulinu v prostředí Nucleus Accumbens Shell Journal of Neuroscience, 6 březen 2013, 33(10):4295-4307
- Striatální nadměrná exprese {delta} FosB reprodukuje chronické nežádoucí pohyby vyvolané levodopou Journal of Neuroscience, 26 May 2010, 30(21):7335-7343
- Abstraktní
- Plný text
- Plný text (PDF)
- Abstraktní
- Plný text
- Plný text (PDF)
- Abstraktní
- Plný text
- Plný text (PDF)
- Abstraktní
- Plný text
- Plný text (PDF)
- Transkripční mechanismy závislosti: role {Delta} FosB Filozofické transakce královské společnosti B: Biologické vědy, 12 říjen 2008, 363(1507):3245-3255
- Trvalá zranitelnost při obnovení chování hledání methamfetaminu v mutantních myších myších neurotrofních faktorů odvozených z gliální buněčné linie Časopis FASEB, 1 červenec 2007, 21(9):1994-2004
- Transkripční faktor aktivátorového proteinu-1 v karcinogenezi respiračního epitelu Molecular Cancer Research, 1 únor 2007, 5(2):109-120
;