PLoS One. 2010; 5(10): e15401.
Abstraktní
Dokončení vzoru, schopnost načíst kompletní paměti iniciované částečnými narážkami, je kritickou vlastností paměťového procesu. O molekulárních a buněčných mechanismech, na nichž je tento proces založen, je však známo jen málo. Abychom studovali roli dopaminu v paměti, jsme analyzovali dopaminové transportéry heterozygotní knockout myši (DAT)+/−), a zjistili, že zatímco tyto myši mají normální učení, konsolidaci a vyvolání paměti za podmínek úplného podnětu, vykazují specifické nedostatky v dokončení vzoru za podmínek částečného podnětu. Tato forma deficitu vyvolání paměti u dopaminových transportních heterozygotních knockout myší může být zvrácena nízkou dávkou antagonisty dopaminu haloperidolu, což dále potvrzuje, že neschopnost získat paměťové vzorce je výsledkem dopaminové nevyváženosti. Naše výsledky proto ukazují, že jemná kontrola hladiny dopaminu v mozku je rozhodující pro dokončení vzoru během vyvolání asociativní paměti.
Úvod
Vyvolání paměti zahrnuje rekapitulaci dříve získaných informací [1], [2]. V závislosti na podmínkách odvolání může dojít k načtení paměti s většinou nebo se všemi dříve naráženými narážkami spojenými s učením (např. Vidět člověka a slyšet jeho hlas současně nebo revidovat něčí rodné město, které se příliš nezměnilo atd.). Na druhé straně, v mnoha případech, paměťové načítání obvykle nastane, když jsou přítomné pouze podmnožiny počátečních podnětů (např. Rekonstrukce starých uličních map něčího rodného města, když jen několik starých orientačních bodů zůstalo nezměněno). Toto je známo jako dokončení vzoru, ve kterém mozek rekonstruuje a načte celé vzory paměti z částečných externích podnětů nebo samo iniciovaných interních procesů. V současné době je málo známo o skutečných molekulárních a buněčných mechanismech, které jsou základem dokončení paměti pro vyvolání paměti. Nové studie však ukazují, že monoaminová signalizace může hrát roli při získávání paměti [3].
V této studii jsme se pokusili prozkoumat, jak modulační neurotransmiter dopamin hraje roli v regulaci dokončování paměťových vzorů během částečného vyvolání paměti. Dopamin je klíčovým neurotransmiterem, který může ovlivnit poznávání, emoce a pohyb. Abnormální dopaminergní přenos se podílí na řadě psychiatrických a neurologických poruch, včetně deficitu pozornosti a hyperaktivity (ADHD), schizofrenie a Parkinsonovy choroby [4]-[8]. Přestože dopaminergní neurony pocházejí pouze z ventrální tegmentální oblasti a substantia nigra compacta, jejich výstupy se promítají téměř všude v mozku, včetně prefrontální kůry, středního laloku a hippocampu, oblastí, o nichž je známo, že jsou aktivovány během načítání pamětil [3], [9]-[14].
Je třeba také poznamenat, že dopamin byl považován za funkčně zásadní pro pozornost a pracovní paměť zprostředkovanou nad mozkovými oblastmi [15]-[18], které byly zahrnuty do procesu získávání paměti za podmínek částečného startu [19]. Jako primární buněčný mechanismus k ukončení signalizace dopaminu dopaminový transportér (DAT), umístěný na neuronálních presynaptických terminálech, znovu absorbuje dopamin ze synaptické štěrbiny zpět do dopaminergních neuronů. Jako takový je DAT kritická molekula v regulaci synaptických hladin dopaminu a v důsledku toho určování časové doby působení dopaminu na lokálních nervových obvodech. Genetické vyřazení genu pro dopaminový transportér skutečně vede k závažným poruchám. Homozygotní DAT-KO myši trpí zjevnými abnormalitami, jako je zpomalení růstu, robustní lokomotorická hyperaktivita a mnoho dalších poruch, včetně deficitů v návyku a sociální interakci, jakož i zhoršené pohyblivosti střev, respirační kontroly atd. [6], [20], [21]. Celkové defekty u homozygotních DAT-KO myší způsobily, že je méně vhodné zkoumat roli dopaminu v regulaci paměťových procesů.
Je zajímavé, že heterozygotní knockoutované myši (DAT+/− myši), které stále mají alelu funkčního genu DAT, se zdají být docela normální v jejich celkovém hrubém chování [6], [20], [21]. DAT+/− myši mohou poskytnout cenný model pro studium některých delikátních, ale důležitých fenotypů, jako jsou procesy asociativní paměti a související mechanismy regulované dopaminergními obvody. Zde jsme použili sadu vzorců chování k posouzení funkčních důsledků nevyváženosti dopaminu na dokončení vzoru během vyvolání asociativní paměti.
výsledky
Ke zkoumání úlohy dopaminu při získávání paměti jsme použili myši s heterozygotním dopaminovým transportním knockoutem (DAT)+/−). K posouzení jejich lokomotorické aktivity na otevřeném poli jsme použili baterii základních behaviorálních měření (Obrázek 1A), představení rotarodu (Obrázek 1B a 1C) a zjistili, že tyto heterozygotní knockoutované myši jsou zcela normální. Také jsme potvrdili, že DAT+/− myši vykazují nerozeznatelné výkony v úrovni úzkosti měřené zvýšeným plus bludištěm (Obrázek 1D).
Kromě toho jsme vyhodnotili základní funkce učení a paměti v DAT+/− myši. Nejprve jsme použili nový test rozpoznávání objektů a pozorovali jsme, že tyto myši vykazovaly zcela normální behaviorální chování v denních testech retence 1 ve srovnání s jejich divokým typem kontroly vrhu (Obrázek 1E). Navíc tyto myši také vykazují normální 1-denní strach podmíněnou retenci, která je nerozeznatelná jejich kontrolním myším divokého typu (Obrázek 1F). Tyto výsledky proto naznačují, že DAT+/− myši mají normální učení a paměťovou funkci v těchto dvou formách testů primární paměti.
Test prostorové referenční paměti byl dříve použit k posouzení dokončení vzoru vyvolání paměti. Podřídili jsme DAT+/− myši a ovládací prvky divokého typu pro tento úkol. Použití protokolu prostorové referenční paměti, který byl popsán dříve [22], Vycvičili jsme tyto myši ve vodním bludišti se skrytou platformou. Školení se skládalo ze čtyř pokusů denně, s intervalem jedné hodiny mezi jednotlivými zkouškami. Zjistili jsme, že oba DAT+/− myši a myši divokého typu vykazovaly srovnatelné učení a konsolidaci paměti v průběhu denních sezení 10 as podobnou rychlostí plavání (Obrázek 2A a 2B).
Dále jsme prozkoumali jejich vzpomínky na skryté umístění platformy pomocí testu sondy (P1) v den 11, jeden den po dokončení posledního tréninku. Jak měřeno obsazením kvadrantu, oba DAT+/− myši a jejich kontrolní vrhu byli schopni zaměřit své hledání v cílovém kvadrantu za přítomnosti úplných podnětů (Obrázek 3A). Navíc, DAT+/− myši také vykazovaly silnou preferenci v oblasti phantomové platformy a nebyl žádný rozdíl ve srovnání s obsazením kontrolních plošin (Obrázek 3B). Dále, jak se očekávalo, oba DAT+/− myši a vrhy divokého typu vykazovaly významné zvýšení počtu křížení (Obrázek 3C). Všechna tato měření tedy naznačují, že DAT+/− myši se mohou tento úkol naučit normálně a získávat tuto asociativní paměť normálně za podmínek plné cue.
Abychom určili, zda je křehká rovnováha dopaminu nezbytná pro dokončení vzoru za podmínek částečného tága, provedli jsme druhý den test sond (P2) následující den odstraněním tří ze čtyř distálních podnětů (den 12). Aby se předešlo možnému vyhynutí z předchozí relace stažení, byl 4 hodinu po testovací sondě P1 doručen další blok školení (testy 1). Během této zkoušky s částečnou narážkou, zatímco kontrolní myši pokračovaly v soustředění svého času vyhledávání v cílovém kvadrantu spíše než v ostatních kvadrantech, DAT+/− myši vykazovaly pouze výkon na úrovni šance, měřeno podle obsazenosti cílového kvadrantu (Obrázek 3D). Kromě toho měření obsazenosti oblastí fantomové platformy dále potvrdilo, že tyto DAT+/− myši si pamatovaly umístění platformy (Obrázek 3E). Tento deficit vyhledávání byl také prokázán nedostatkem nárůstu počtu přechodů platforem (Obrázek 3F), zatímco vrh divokého typu byli plně schopni provést částečné vyvolání paměti. Proto tato data naznačují, že DAT+/− myši jsou nedostatečné v získávání prostorových referenčních pamětí za podmínek částečného startu.
Nakonec jsme se zeptali, zda bychom v těchto DAT mohli obnovit dokončení vzoru+/− myši pomocí farmakologických metod. Bylo publikováno, že nízká dávka antagonisty dopaminu, haloperidolu, by mohla být užitečná při zmírnění určitých poruch dopaminu [20]. Důvodem je, že nízká dávka haloperidolu může být schopna poněkud tlumit účinek zvýšeného dopaminu u heterozygotních myší, které mají nedostatečné zpětné vychytávání dopaminu v důsledku ztráty jedné alely normálního dopaminového transportního genu. Stejnou sadu myší jsme použili při záchranném experimentu. V den 13 a 14 jsme výše uvedené myši podrobili třetí zkoušce sondou (P3) za podmínek úplného cue a čtvrtému pokusu sondou (P4) za podmínek částečného podnětu. Abychom zabránili jakémukoli zániku, který se mohl vyskytnout během pokusu se sondou, znovu jsme provedli další blok (testy 4) tréninku 1 hodinu po dokončení testu sond P2 nebo P3. Naše měření obsazenosti cílového kvadrantu při testu sondy P3 ukazují, že obě DAT+/− myši a kontrolní vrh vrhu soustředili své hledání v cílovém kvadrantu za přítomnosti úplných podnětů (Obrázek 4A). Navíc, jejich normální paměťová paměť byla znovu prokázána měřením obsazenosti platformy (Obrázek 4B) a také počet přechodů platforem (Obrázek 4C). Tyto mutantní myši byly tedy plně schopny získat prostorovou paměť za podmínek cue.
V den 14 jsme odstranili tři ze čtyř distálních cue a provedli jsme čtvrté experimenty sond (P4) za podmínek částečného cue. Injektovali jsme DAT+/− myši intraperitoneálně nízkou dávkou haloperidolu (0.002 mg / kg tělesné hmotnosti) 30 minut před retenčními testy. Štěňata divokého typu dostali jako kontrolu injekci fyziologického roztoku. Zjistili jsme, že DAT+/− myši soustředily svůj vyhledávací čas v cílovém kvadrantu a vykazovaly statisticky podobné výkony ve srovnání s protějšky divokého typu (Obrázek 4E). Měření obsazenosti oblastí fantomové platformy dále zdůvodnilo, že tyto DAT+/− myši si mohou vzpomenout na umístění platformy (Obrázek 4F). Jejich normální vyvolání paměti bylo znovu potvrzeno zvýšením počtu křížení platforem, které bylo na stejné úrovni jako u myší divokého typu (Obrázek 4G). Tyto experimenty tedy naznačují, že deficity dokončování vzorů byly původně pozorovány v DAT+/− myši mohou být způsobeny dopaminovou nerovnováhou.
Abychom vyloučili možnost, že výsledky pro fenotyp injikovaný haloperidolem v pokusu se sondou P4 byly způsobeny přetrénováním během opakovaných testů se sondou, použili jsme jinou sadu DAT+/− a kontrolujeme vrhy a opakovali celý experiment. Jak se očekávalo, oba DAT+/− myši a jejich myši divokého typu vykazovaly v průběhu denních školení 10 dobré míry učení (Obrázek 5A). V den 11 jsme poté tyto myši podrobili testům úplného vyvolání zpětného volání, mezi výsledky DAT nedošlo k významnému rozdílu ve výsledcích testu uchování paměti.+/− myši a kontrolní vrh vrhu, měřeno podle obsazenosti kvadrantů (Obrázek 5B), obsazenost kvadrantu (Obrázek 5C) a počet přechodů platforem (Obrázek 5D). Jednu hodinu po dokončení testu cue sondy jsme tyto myši přeškolili dalším tréninkovým blokem, abychom zabránili jakémukoli zániku. V den 12 byly tyto myši podrobeny částečným vyvolávacím testům. Nízká dávka haloperidolu (nebo fyziologického roztoku) pro kontrolní skupiny byla injikována myším intraperitoneálně 30 minut před částečným pokusem. Zjistili jsme, že toto ošetření skutečně vedlo k normálním výkonům u mutantních myší. Mutantní a kontrolní myši vykazovaly srovnatelnou výkonnost v kvadrantu.Obrázek 5E), obsazenost kvadrantu (Obrázek 5F) a počet přechodů platforem (Obrázek 5G). Měření rychlosti plavání také neodhalilo žádné rozdíly (Obrázek 5H). Tato data tedy jasně ukázala, že zachránený deficit částečného náběhu v DAT+/− myši haloperidolem nebyly způsobeny opakovaným přetrénováním během několika pokusů na sondě.
Diskuse
Zatímco dopaminový systém je dobře znám jako rozhodující pro regulaci mnoha kognitivních procesů [8], [16]-[18], [23]-[25], naše současná studie poprvé poskytuje důkaz, že dopaminová nerovnováha, která je důsledkem ztráty jedné alely normálního genu pro transport dopaminu, způsobila specifický deficit v dokončení vzoru během vyvolání asociativní prostorové paměti. Tento deficit vyvolávající paměť je patrný pouze za podmínek částečného prostorového cue, ale ne za podmínek úplného cue. Navíc se zdá, že tento deficit paměti vyvolává vysoce specifickou formu deficitu paměti, protože široké aspekty základních chování (lokomoce v otevřeném poli, rotarod a úzkost) a dalších forem paměti, jako je kondiční kondiční kondice a rozpoznávání nových objektů, zůstávají normální.
Existuje několik potenciálních molekul a buněčných scénářů, které mohou kolektivně přispívat k pozorovanému deficitnímu paměťovému deficitu vyvolanému částečnou narážkou, mezi nimiž je dopamin považován za hlavní kandidátní molekulu, která je základem tohoto paměťového procesu, protože je to pozornost a pracovní paměť, primárně řízená Dopaminové signály jsou považovány za kritické pro získávání prostorových vzpomínek [15]-[18], [26]. Je dobře známo, že dopaminergní neurony, které pocházejí pouze z ventrální tegmentální oblasti a substantia nigra compacta, vyčnívají téměř všude v mozku, včetně prefrontální kůry, středního laloku a hippocampu. [5], [19], [27]-[28], regiony, o nichž je známo, že jsou aktivovány během načítání paměti, jakož i procesy pozornosti [3], [9]-[14], [29], [30]. Vzhledem k širokým důkazům, že dopamin je nezbytný pro pozornost a pracovní paměť [15]-[18] a že genetický polymorfismus v DAT genu je považován za zapojený do ADHD [31]-[33], je možné, že jak pozornost, tak pracovní paměť mohou hrát roli při dokončování vzoru získávání paměti za podmínek částečného startu prostřednictvím regulace dopaminem zprostředkované DAT. Deficity dokončování paměťového vzoru pozorované u heterozygotních mutantních myší DAT tedy mohou být způsobeny neschopností myši uspokojit zvýšené nároky na pozornost během částečného vyvolání paměti založeného na paměti v důsledku poruchy synaptického dopaminu.
Naše zjištění, že dopaminová nerovnováha vyústila v deficit získávání paměti, je také zajímavá ve světle klinické demence pozorované u pacientů s Parkinsonovou chorobou. Zdá se, že tito pacienti si obvykle uchovávají schopnost učit se, konsolidovat a ukládat novou paměť, ale jsou hluboce narušeni při získávání pamětí, zejména při částečných externích narážkách nebo samovolně iniciovaném vyvolání. [34], [35]. Tento schodek je obzvláště hluboký, když neexistovaly výslovné narážky [8], [23], [34]-[36], což dále naznačuje, že do procesu vyvolání paměti může být zapojen dopamin. Tyto typy deficitů v paměti paměti u pacientů s Parkinsonovou chorobou jsou v ostrém kontrastu s deficity paměti v jiných neurotransmiterových systémech [37] nebo časná demence u pacientů s Alzheimerovou chorobou, kteří jsou obvykle narušeni v učení a upevňování nových vzpomínek při zachování schopnosti vyvolat staré vzpomínky [34], [35]. To ilustruje potřebu vyvinout různé terapeutické strategie z důvodu různých zranitelností vůči odlišným molekulárním a časovým procesům v paměťových obvodech.
Naše demonstrace, že dokončení vzoru může být zcela zachráněno injekcí haloperiodolu v době stažení, posiluje představu o úloze vyvážených hladin dopaminu při získávání paměti. Tento farmakologický záchranný experiment poskytuje další důkazy o časové specifičnosti, která způsobuje parciální paměťový deficit založený na narážce. Je třeba poznamenat, že dopaminové dysfunkce u DAT+/− myši a pacienti s Parkinsonovou chorobou se od sebe navzájem velmi liší, ale oba vedou k deficitům při získávání vzorů. Tato obecnost poskytuje kolektivní podporu pro představu, že křehká rovnováha dopaminového systému je rozhodující pro získávání paměti, a nerovnováha v obou směrech (nahoru nebo dolů) by způsobovala deficity v dokončování paměti během vyvolávání. Důležité je zdůraznit, že naše současná analýza by neměla být interpretována jako důkaz pro použití mutantních myší DAT jako modelu Parkinsonovy choroby. Na druhou stranu, in vivo měření dopaminu u DAT homozygotních knockout myší ukazuje významné snížení uvolňování dopaminu vyvolané stimulací roztržení [38]-[40]. To ukazuje, že schopnost převádět neurální aktivitu propuštěnou do dopaminových signálů v různých oblastech mozku knockoutovaných myší může být nedostatečná. Je možné, že snížené změny poměru dopaminu mohou vést ke změnám fyziologických změn ve vzorcích palby v nervových obvodech zapojených do zpracování paměti. V současné době není známo, zda k podobné změně dochází také u DAT heterozygotních knockout myší nebo u pacientů s Parkinsonovou chorobou.
Ačkoli je známo jen málo, co se týče nervových obvodů aktivovaných během vyvolávání prostorové paměti, je pravděpodobné, že získává více oblastí, včetně prefrontální kůry, středního časového kortexu a hippocampu. To dobře vyhovuje anatomickým důkazům, že dopaminergní výstupy z ventrální tegmentální oblasti silně zasahují do ventrální oblasti CA1 a entorhinální kůry.[13], [28]. Tato smyčka prefrontální-hippocampální-VTA může hrát klíčovou roli pro generování kontextuální znalosti, která zase podporuje dokončení vzoru během částečného vyvolání prostorové paměti na základě narážky pomocí usnadnění dopaminem regulované pozornosti [3], [14], [26], [28]. V budoucích studiích bude důležité dále definovat anatomické lokusy, z nichž pocházejí zjištěné deficity dokončení vzoru. Bylo by obzvláště zajímavé prozkoumat kandidátní místa, jako je přední cingulární kůra, temporální kůra a hippocampus, pomocí farmakologických, genetických a rozsáhlých in vivo technik záznamu. [11], [41]-[44]. Je také důležité posoudit, zda genetická kompenzace nebo pomalé změny v mutantním mozku přispívají k pozorovaným deficitům v paměti. Existují také náznaky, že do regulace načítání paměti mohou být kriticky zapojeny i další neurotransmiterové systémy [3], [37], [45], [46]a bylo by velmi zajímavé prozkoumat a porovnat jejich dynamické interakce mezi částečným dokončením vzorem spouštěného vzoru a úplným načtením paměti založeného na tágu. Závěrem naše studie naznačuje, že jemná rovnováha hladin dopaminu je rozhodující pro dokončení vzoru během vyvolání asociativní prostorové paměti.
Materiály a metody
Etická prohlášení
Veškerá práce na zvířatech popsaná ve studii byla provedena podle pokynů NIH a schválena institucionálním výborem IACUC na Medical College of Georgia (číslo schválení AUP: BR07-11-001).
Produkce a genotypizace mutantních myší
Myši DAT byly velkorysým darem od laboratoře Dr. XiaoXi Zhuanga z Chicagské univerzity. Šlechtění a genotypizace DAT heterozygotních knockoutovaných myší jsou stejné, jak je popsáno [6]. Pro naše experimenty byly samci i samice myší použity v poměru 1![[poměr]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif){kind=small}
1. PCR pro DAT+/− myši byly následovány protokolem, jak je popsáno [6]. Všechny myši byly chovány ve standardních podmínkách (23.1 ° C, 50.5% vlhkost) ve zvířecím zařízení Medical College of Georgia. Všechny experimenty byly provedeny ve zvukotěsné a specializované místnosti pro chování. Všichni experimentátoři byli slepí vůči genotypu jednotlivého zvířete.
Úloha rozpoznávání nových objektů
Experimentální protokol byl stejný, jako byl popsán dříve [37], [47]. Stručně, myši byly individuálně zvyknuty do otevřeného pole (20 × 20 × 10 vysoké palce) po dobu 3 dnů. Během tréninků byly na otevřené pole umístěny dva nové objekty a zvíře bylo povoleno prozkoumat 15 min. Čas strávený zkoumáním jednotlivých objektů byl zaznamenán. Během jednohodinových testů zpětného vyvolání bylo zvíře umístěno zpět do stejné krabice, ve které byl jeden ze známých předmětů během tréninku nahrazen novým objektem, a bylo umožněno volně zkoumat 15 min. K měření paměti rozpoznávání byl použit index preferencí, poměr času stráveného zkoumáním některého z těchto dvou objektů (tréninková relace) nebo nového (retenční relace) oproti celkovému času strávenému zkoumáním obou objektů.
Testy na otevřeném poli a na rotoru
Protokoly byly stejné, jak byly popsány [48]. Pro měření aktivity na otevřeném poli byly myši umístěny do otevřeného pole vyrobeného z černé skříňky 14 × 14 palce. Krabice byla označena malými čtvercovými mřížkami 2 × 2 palce (čtverce 7 od 7, celkem 49). Aktivita zvířat v otevřeném poli byla měřena počtem křížení, které myši prošly v periodě 3 minut. Pro měření Rota-tyčového testu byly myši umístěny na zrychlující se rotující dřevěnou tyč. Prut je dlouhý 12 a průměr 1 palce. Počáteční rychlost rotace byla na 4 ot / min a pak stabilně zrychlována na 40 ot / min. Výkon byl měřen podle doby (v sekundách), kterou myši dokázaly zůstat na rotační tyči během buď pětiminutových nebo jednohodinových testů vyvolání.
Zvýšené testy na bludišti
Protokoly byly stejné, jak byly popsány [49]. Vyvýšené plusové bludiště je vyrobeno z nerezové oceli, která je natřena matně černou barvou, a skládá se ze čtyř ramen (dvě otevřená bez stěn a dvě uzavřená stěnami 15.25 cm vysoké) 30 cm dlouhá a 5 cm široká. Každé rameno bludiště je připevněno k robustním kovovým nohám tak, že je vyvýšeno o 40 cm nad stůl, na kterém spočívá. Aktivita byla zaznamenána digitálním fotoaparátem (Logitech Camera, Model No. N231) umístěným 130 cm nad bludištěm. Testování probíhalo při slabém světle (jedna 40-W a jedna měkká bílá žárovka 60-W, obě úhly k vytvoření nepřímého osvětlení bludiště) během fáze světla cirkadiánního cyklu (mezi 0900 h a 1400 h). Bludiště bylo mezi testy očištěno 5% kyselinou octovou. Bílý šum (30 dB) maskuje cizí šum pozadí. V den zkoušky byla zvířata přivedena do testovací místnosti ve svých domácích klecích a každá dvojice zvířat byla poté vyjmuta ze své domácí klece a umístěna do oddělené chovné klece na 5 min před umístěním do bludiště. Zvířata byla umístěna jednotlivě do středu bludiště s polohou hlavy vyvažovanou mezi myšmi a chování bylo zaznamenáno po dobu 5 min. byla zaznamenána a analyzována doba strávená na otevřené paži a zavřené paži (když jsou všechny čtyři tlapky hlodavce na otevřené nebo uzavřené paži).
Kontextové strach
Kondicionování strachu bylo provedeno, jak bylo popsáno výše [45]. Experiment byl proveden v systému pro úpravu strachu, komoře umístěné ve zvukem utlumené krabici s domovým světlem na stropě a mřížkou z nerezové oceli (Coulbourn Instruments, Whitehall, PA). Dno mřížky bylo zapojeno do generátoru nárazů a zvukový signál pocházel z reproduktoru připevněného na stěně komory. Všechny podněty byly ovládány automaticky pomocí osobního počítače s programem Graphic State. Před klecí byla umístěna videokamera pro zaznamenávání chování. Myši byly ošetřovány po dobu 3 dnů a poté byly zvyknuty do tréninkové komory po dobu 5 min. Použitým kondicionovaným stimulem (CS) byl zvuk 85 dB při 2.8 kHz, zatímco nepodmíněným stimulem (US) byl kontinuální míchaný šok nohou při 0.8 mA pro 2. Po jediném společném ukončení CS / US paringu zůstalo zvíře v komoře dalších 30 pro měření okamžitého zmrazení. Během retenčního testu byla každá myš umístěna zpět do stejné komory a zmrazovací reakce byly zaznamenávány po dobu 5 min (kontextová zmrazovací reakce). Všechny testy byly videokazety pod červeným světlem. Celková doba zmrazení byla měřena jako index paměti strachu. Zmrazovací chování bylo definováno jako úplný nedostatek pohybu bez dýchání. Zmrazovací chování bylo hodnoceno softwarem (Coulbourn Instruments) a převedeno na odezvu na zmrazení [odezva na zmrazení 
= (celková doba zmrazení / celková doba testování) × 100%].
Testy prostorové referenční paměti
Testem prostorové referenční paměti bylo vodní bludiště na skryté platformě. Postupovali jsme podle protokolu, jak bylo popsáno dříve Nakazawou et al. [22]. Výcvik se skládal ze čtyř pokusů denně, z toho jedna hodina mezi pokusy. Pohyb myší byl sledován videokamerou a měřen pomocí softwaru (Noldul Information Technology, Nizozemsko). Byla zaznamenána a analyzována úniková latence na platformu, stejně jako obsazenost kvadrantu a křížení platformy. Bazén má průměr 118 cm a platforma má průměr 9.5 cm. Byly provedeny čtyři testy sond. První test sondy (P1) byl proveden den následující po posledním tréninku za podmínek cue (den 11). Druhý test sondy (P2) byl proveden v den 12 za podmínek částečného podnětu (odstraněním tří ze čtyř vizuálních podnětů zavěšených na stěně černé opony). Pro DAT+/− myši, provedli jsme třetí pokus sondou (P3) v den 13 za podmínek úplného cue a čtvrtý pokus sondou (P4) v den 14 za podmínek částečného podnětu. Jeden další blok (studie 4) byl doručen 1 hodinu po testech sondy P1, P2 a P3, aby se zamezilo vyhynutí, ke kterému mohlo dojít během pokusu se sondou. Kromě toho jsme vyloučili složený účinek pravděpodobného přetrénování před P4 (test sondou s částečnou narážkou a injekcí haloperidolu), podrobili jsme další skupinu DAT+/− myši, stejně jako jejich kontrolní vrhu divokého typu, ke dvěma dalším testům na sondách (testy P3 'a P4'). Test sond P3 'byl proveden jeden den po posledním tréninku za podmínek cue (10. den). Test sond P4 'byl proveden v den 11 za podmínek částečného startu. Během všech našich sondových testů byla platforma odstraněna a myši byly ponechány plavat v bazénu po stejnou dobu, jaká byla použita během tréninku (60 sekund). Byla zaznamenána doba strávená v každém kvadrantu. Obnovení hladin dopaminu [6], [20], [21], myši od DAT+/− a kontrolní skupiny byly injikovány intraperitoneálně buď haloperidolem (0.002 mg / kg tělesné hmotnosti), nebo fyziologickým roztokem 30 minut před experimenty s P4 a P4 'sondami.
Analýza dat
Aby se zohlednily korelace mezi zvířaty mezi opakovanými měřeními, byly použity lineární smíšené modely k odhadu behaviorálního výkonu v Morrisově vodním bludišti, rozpoznávání nových objektů, kondicionálního strachu kondicionování a rota-rod testů. Ke stanovení významu těchto behaviorálních měření mezi DAT byla použita Tukey-Kramerova metoda+/− myši a kontrolní spolužáci. V otevřeném poli a v testech se zvýšenými bludišti byla ke stanovení genotypových účinků použita jednosměrná ANOVA a post hoc Dunnettův test. Kontinuální proměnné jsou prezentovány jako průměr a standardní chyba průměru (SEM). Data byla analyzována pomocí SPSS verze 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Rozdíly byly považovány za významné, když P <0.05.
Poděkování
Děkujeme Dr. Xiaoximu Zhuangovi z University of Chicago za poskytnutí DAT+/− Myši KO a Brianna Klein za technickou pomoc při experimentech.
Poznámky pod čarou
Konkurenční zájmy: Autoři prohlásili, že neexistují žádné konkurenční zájmy.
Financování: Tento výzkum byl podpořen z prostředků NIMH (MH060236), NIA (AG024022, AG034663 & AG025918), USAMRA00002, Georgia Research Alliance a Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (10140900500) (vše JZT). National Science Foundation of China (81000592), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (10DZ2272200, 09DZ2200900, 10PJ1407500 and 10JC1411200), Shanghai Municipal Education Commission (11ZZ103) to FL and XMS. Financující subjekty neměly žádnou roli v designu studií, sběru a analýze dat, rozhodnutí o publikování nebo přípravě rukopisu.
;
