Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Nov 24; 106 (47): 20016 – 20020.
Publikováno online 2009 Nov 9. dva: 10.1073 / pnas.0908789106
PMCID: PMC2785284
Pietro Cottone,a,b,c,d,1,2 Valentina Sabino,a,b,c,d,1 Marisa Roberto,a,c,d Michal Bajo,e Lara Pockros,a Jennifer B. Frihauf,a,c,d,f Eva M. Fekete,a,c,d Luca Steardo,g Kenner C. Rice,h Dimitri E. Grigoriadis,i Bruno Conti,d,e George F. Koob,a,c a Eric P. Zorrillaa,c,d,2
Abstraktní
Dieta pro kontrolu tělesné hmotnosti zahrnuje cykly deprivace z chutného jídla, které může podporovat nutkavé stravování. Tato studie ukazuje, že krysy odebrané z intermitentního přístupu k chutnému jídlu vykazují přejídání chutného jídla při obnoveném přístupu a afektivní stav podobný stádiu charakterizovaný faktorem 1 uvolňujícím kortikotropin (CRF)1) reverzibilní chování antagonistů receptoru, včetně hypofagie, motivačních deficitů pro získání méně chutného jídla a chování podobné anxiogenii. Výběr byl doprovázen zvýšenou expresí CRF a CRF1 elektrofyziologická citlivost v centrálním jádru amygdaly. Navrhujeme, aby nábor anti-odměny extrahypothalamic CRF-CRF1 systémy během stahování z chutného jídla, analogické s abstinencí ze zneužívaných drog, mohou podporovat nutkavý výběr chutného jídla, nedostatek zdravějších alternativ a negativní emoční stav, pokud je zabráněno příjmu chutného jídla.
Formy obezity a poruch příjmu potravy, podobné drogové závislosti, lze pojmout jako chronické relapsující stavy se střídavými obdobími abstinence (tj. Dieta, aby se zabránilo „zakázaným“ chutným potravinám) a relapsu (tj. Nutkavé, často nekontrolovatelné, stravování vysoce chutné potraviny), které přetrvávají i přes negativní důsledky (1). Přestože pozitivní posilující vlastnosti chutných potravin jsou dobře známy (2, 3), méně pozornosti bylo věnováno jejich negativním výztužným vlastnostem (4-6), jmenovitě zvýšená pravděpodobnost reakce na chování vyvolané odstraněním averzivního podnětu (např. příjem chutného jídla pro zmírnění negativních emočních stavů). Intermitentní cykly rozšířeného užívání drog zneužívání mohou postupně vést k „afektivní závislosti“, která je pozorována jako potřeba vyšších a / nebo pravidelnějších množství drogy k udržení daného emočního nastaveného bodu a negativního emočního stavu po ukončení příjem drog (7, 8). Takové afektivní stažení může udržovat užívání a motivovat relaps prostřednictvím negativních posilujících vlastností pokračujícího a opětovného užívání drog (7, 8).
Mozkové stresové systémy s extrahypotalamickým faktorem uvolňujícím kortikotropin (CRF) se pravděpodobně podílejí na přechodu z užívání drog na závislost, během níž je příjem zneužívaných drog stále více motivován těmito negativními než pozitivními posilovacími mechanismy. CRF hraje motivačně relevantní roli v abstinenčních syndromech pro všechny hlavní drogy zneužívání, včetně alkoholu, nikotinu, kokainu, opiátů, amfetaminů a tetrahydrokanabinolu (7, 8). Analogicky se předpokládalo, že opakované cykly přerušovaného a rozšířeného přístupu k vysoce chutnému jídlu vyvolávají neuroadaptace CRF systému podobné těm, které jsou vidět u modelů závislosti na drogách (4, 5, 9).
výsledky
Přerušovaný, rozšířený přístup k chutnému jídlu postupně vede k nedostatečnému stravování méně preferovaných diet, pokud není k dispozici chutné jídlo, a k přejídání chutného jídla při obnoveném přístupu (10-12). Testovat hypotézu, že CRF1 systémy zprostředkovávají tyto adaptace na krmení, samci krys Wistar (n = 20) byla podávána chow dieta ad libitum (Chow / Chow) denně každý týden nebo byla poskytována chow ad libitum po dobu 5 dní (fáze C) následovaná vysoce chutnou sladkou stravou po dobu 2 dní (fáze P) (Chow / palatable ) (viz Obr. S1 pro dietní plán a Obr. S2 pro účinky dietního plánu na příjem potravy a tělesnou hmotnost). Po 7 týdnech dietního cyklu dostaly krysy nepeptidový CRF1 antagonista receptoru R121919 (0, 5, 10 a 20 mg / kg, sc) v latinsko-čtvercovém designu (13). Ošetření byla podána 1 h před přechodem z chutné stravy na chow nebo z chow na chutné stravování. R121919 v závislosti na dávce snížil příjemnou stravu a zvýšený příjem potravy u chow / chutných potkanů (dietní fáze × rozvrh stravy × dávka léčiva: F3,54 = 7.25, P <0.001), aniž by došlo ke změně příjmu kontrol krmení. R121919 snížil příjem vysoce chutné stravy po obnovení přístupu k chutnému jídlu (fáze P) (Obr. 1A). V nezávislých testech CRF1 antagonista receptoru zvýšený příjem méně chutné potravy u Chow / chutných potkanů odebraných z chutné stravy (fáze C) (Obr. 1B). Tím, že otupuje jak hypofágii chow, tak přejídání chutného jídla, R121919 utlumí amplitudu cyklu příjmu (rozdíl mezi příjmem během první chutné P fáze a prvním odebráním do chow C fáze: Dietní plán × Dávka léčiva: F3,54 = 7.25, P <0.001) (Obr. 1C). Podpora postupného náboru CRF-CRF1 systémy podle anamnézy stravy, spíše než účinkem akutní stravy, R121919 nesnížil chutný příjem potravy po jediné expozici dietě ani nezvýšil příjem chow během prvního stažení z chutného jídla (Obr. S3).
Odstoupení od přerušovaného, rozšířeného přístupu k chutnému jídlu může také zvýšit chování podobné úzkosti (11). Testovat hypotézu, že CRF1 receptory se podílejí na negativních emocionálních projevech chování, které následují po stažení z chutného jídla, potkanům byl podáván R121919 (0, 20 mg / kg, sc, 1-h před léčbou) a testovány v meziprostorovém designu ve zvýšené plus-bludišti (14), 5 – 9 h po přepnutí z chutné stravy na chow. Chow / Palatable krysy ošetřené vehikulem vykazovaly během odstoupení od 7 týdnů dietního cyklu méně otevřených paží než kontrolní zvířata krmená krmením, což odráží účinek podobný anxiogenii (Obr. 2A), účinek, který se dosud neprojevil pouze po dvou cyklech výběru (Obr. S4). Předběžná léčba přípravkem R121919 (20 mg / kg, dávka, která modulovala jak přejídání chutného jídla, tak podvýživu chow), blokovala pokles průzkumu otevřenou paží u potkanů Chow / Palatable v dávce, která nezměnila chování v bludišti u kontrol chow ( Rozpis stravy × Dávka: F1,43 = 7.25, P <0.02; Obr. 2Levá). Administrace R121919 nezměnila obecnou aktivitu měřenou jako záznamy se zavřenou rukou. Proto R121919 zablokoval zvýšené úzkostné chování spojené s vysazením z přerušovaného, rozšířený přístup k chutnému jídlu, aniž by došlo ke změně chování kontrol, což naznačuje nábor CRF1 systémy.
Stažení z přerušovaného, rozšířeného přístupu k chutnému jídlu také může vést k motivačním deficitům k získání méně preferovaných diet, což je potenciální index hypohedonického chování (10). Analogicky se dříve pro indexování motivačních deficitů, které se objevily během vysazení léku, použila reakce na méně preferované gustatory posilovače v rámci harmonogramů progresivního poměru posilování (15). Stanovit zapojení CRF1 receptory, testovali jsme účinky R121919 na výkonnost krys krmených dietou, abychom získali jejich méně preferovanou potravu podle schématu progresivního poměru. Potvrzení předchozích zjištění (10), Chow / Palatable potkani ošetřeni vehikulem vykazovali sníženou motivaci pracovat na získání méně chutného chow, což se projevilo snížením bodu zlomu a snížením celkových vydaných odpovědí ve srovnání s krysami Chow / Chow (10) (Obr. S5). R121919 předběžné ošetření (20 mg / kg, dávka účinná při zvyšování hypofágie u chowů, snižování chutné potravinové hyperfágie a snižování chování podobného anxiogenii) selektivně otupuje deficity výkonu s progresivním poměrem u potkanů krmených dietou v dávce, která byla u kontrolních skupin chow neúčinná (bod zlomu: Rozvrh stravy × Lék: F1,15 = 8.17, P <0.02; celkový počet odpovědí: Dieta × Droga: F1,15 = 9.14, P <0.01; Obr. 2B, vlevo, odjet). Proti alternativní interpretaci, že R121919 usnadnil výkon u Chow / chutných potkanů snížením postingestivní saturace, R121919 zablokoval deficity v reakci již v 5 min na relaci (Dietní plán × Droga: F1,15 = 2.55, P <0.05) (Obr. 2Jasný). Proto CRF1 Antagonista receptoru otupil motivační deficity v progresivním poměru, což odpovídá méně preferovaným chuťovým posilovačům, které jsou pozorovány u zvířat odebraných z přerušovaného rozšířeného přístupu k vysoce chutnému jídlu.
Aby se otestovala hypotéza, že stažení z chutného jídla by mohlo aktivovat extrahypotalamický systém CRF související se stresem, byly hladiny CRF mRNA a peptidu v centrálním jádru amygdaly měřeny pomocí kvantitativní PCR v reálném čase a RIA. Potkani byli po dobu 7 týdnů krmeni dietou nebo krmeni krmením nepřetržitě. Po anestézii a dekapitaci byly během odběru a po obnovení přístupu k chutné stravě shromážděny údery mozku z centrálního jádra amygdaly. Odebrání chutného jídla u Chow / chutných potkanů vyvolalo pětinásobné zvýšení exprese mRNA CRF v centrálním jádru amygdaly ve srovnání s potkani Chow / Chow (Obr. 3A). Naopak, mRNA CRF se vrátila na kontrolní úroveň s obnoveným přístupem k chutnému jídlu (F2,19 = 6.97, P <0.01). Exprese mRNA CRF v centrálním jádru amygdaly se nezměnila, když byly krysy Chow / Palatable cyklovány pouze jednou (Chow / Chow vs. Chow / Palatable: 5.5 ± 2.2 vs. 6.3 ± 1.7 ns), což podporuje progresivní nábor CRF- CRF1 systémy podle historie stravy, spíše než podle akutního účinku stravy. Exprese mRNA CRF se navíc nezměnila v nucleus accumbens, prefrontální kůře ani ve ostrovní kůře, což podporuje regionální specifičnost nálezů (Obr. S6). Zajímavé je, že u paraventrikulárního jádra hypotalamu ani v cirkulujícím kortikosteronu nebyly pozorovány žádné významné změny v expresi mRNA CRF ve stejném časovém bodě stažení u potkanů Chow / Palatable (Obr. S6 a S7), což naznačuje hypotézu, že změny v amygdalaru, spíše než v hypotalamu, stresové systémy CRF téměř podchytily adaptace chování. Kromě toho imunoreaktivita peptidů CRF v centrálním jádru amygdaly u zvířat odebraných z chutné stravy byla o 70% vyšší než u zvířat krmených chow, ale vrátila se na kontrolní hladiny krmené chow s přístupem k chutné stravě (F2,24 = 4.01, P <0.01) (Obr. 3B). Takže odebrání chutného jídla aktivovalo peptidový systém CRF související se stresem v centrálním jádru amygdaly, analogický s nálezy v modelech odebírání léků a ethanolu (7, 8). Protože obnovený přístup k chutnému jídlu snížil aktivaci extrahypotalamu CRF v centrálním jádru amygdaly, přičemž aktivace CRF je spojena s úzkostí (16), současné výsledky také naznačují, že chutné jídlo by mohlo získat negativní posilovací vlastnosti tím, že zmírní negativní afektivní důsledky abstinence (17).
Pro testování hypotézy, že krysy odebrané z chutného jídla, může být zvýšená citlivost na CRF1 antagonistická modulace signalizace kyseliny y-aminomáselné (GABA) v centrálním jádru amygdaly, ke které dochází během odběru ethanolu (18), zkoumali jsme účinek R121919 na GABAergický přenos centrálního jádra amygdala neuronů v preparátu plátek. Samci krys Wistar (n = 14) byly cyklizovány dietou po dobu 7 týdnů a obětovány poté, co byly přepnuty na méně chutnou potravu. Bazální GABAergický přenos v centrálním jádru amygdala synapsí se nelišil ve vztahu k historii stravy (n = Buňky 23) napříč všemi stimulačními intenzitami používanými k vyvolání GABA-inhibičních postsynaptických potenciálů (IPSP). Superfúze 20 min s R121919 (1 μM) však vyvolala větší snížení vyvolané GABAA-IPSP v centrálním jádru amygdala neuronů Chow / Palatable potkanů (M ± SEM: 30 ± 6%, n = Buňky 9) než u kontrolních vzorků krmených krmením pro žvýkání (M ± SEM: 12 ± 6%, P <0.05, n = Buňky 11) (Obr. 4). Po uplynutí 30 min. Vymývací periody se IPSP obou skupin vrátily na podobné základní úrovně. Proto je v souladu s nadměrnou aktivací amygdaly CRF-CRF1 systém a účinky pozorované během odběru etanolu (18), krysy s cyklem potravy vykazovaly zvýšenou citlivost na inhibiční účinky CRF1 antagonista receptoru na centrálním jádru amygdala GABAergického přenosu.
Diskuse
Souhrnné výsledky poskytují funkční důkaz, že historie přerušovaného, rozšířeného přístupu k chutnému jídlu vede k progresivním, motivačně relevantním neuroadaptacím u extrahypotalamického CRF-CRF souvisejícího se stresem.1 systémy. Konkrétně selektivní CRF1 receptorový antagonista R121919 odlišně a selektivně ovlivňoval krmení u potkanů s cyklem potravy, což zvyšuje pravidelný příjem potravy a snižuje příjem vysoce chutných potravin po obnovení přístupu. CRF1 Antagonista receptoru také selektivně blokoval zvýšené chování podobné úzkosti a motivační deficity v reakci na méně preferovanou potravu, která byla pozorována během stažení z chutné stravy. Zrušení přístupu k chutné stravě zvýšilo expresi genu CRF a peptidu v centrálním jádru amygdaly, účinky, které byly eliminovány obnoveným přístupem. Kromě toho vykazovali krysy s dietou cyklované zvýšenou citlivost na inhibiční účinky CRF1 antagonista receptoru na GABAergický přenos v centrálním jádru amygdaly, což dále naznačuje nadměrnou aktivaci amygdaly CRF-CRF1 Systém. Přejídání chutných potravin při opětovném přístupu může být důsledkem zvýšené aktivace systému CRF v právě dokončené ochranné lhůtě, což je vidět jako zvýšená exprese CRF a elektrofyziologická citlivost na CRF.1 blokáda receptoru v centrálním jádru amygdaly. CRF1 antagonistické předběžné ošetření těsně před chutným přístupem k potravě je tedy interpretováno tak, že je proti původně stále přítomnému CRF-CRF1 nadměrná aktivace výběru. Krátký časový průběh chutného přejídání jídla, který se jinak u neošetřených zvířat vyskytuje (10) může odrážet časový průběh, ve kterém se exprese, uvolňování a účinky CRF peptidu normalizují, jakmile se znovu získá přístup k chutnému jídlu, jak je vidět v této studii. Přerušované stravování chutných jídel tedy může vyvolat alostatický posun v systémech odměňování mozku s náborem anti-odměn CRF-CRF1 systémy v centrálním jádru amygdaly.
Tyto výsledky mají dopad nejen na nutkavé stravování, ale také na motivaci obecně. Opakovaná aktivace hedonických systémů vyvolala v mozku protivníkovské procesy (tj. Nábor CRF)1 obvody), které byly odlišné od jednoduché ztráty funkce v systémech odměnového vysílače. Takové neuroadaptace mezi systémy (19) také dochází během přechodu na závislost na všech hlavních drogách zneužívání (7, 8). Zobecnění na nedrogové podněty v této studii naznačuje, že motivační procesy mohou být narušeny u jedinců, kteří v průběhu času zažívají opakované kontrasty v intenzitě hedonických podnětů (20). Adaptivně mohou tyto procesy přesouvat chování při hledání a konzumaci potravin směrem k energeticky hustým potravinám s vysokou odměnou a zároveň devalvovat úsilí o získání méně energeticky bohatých potravin s nízkou odměnou (nebo nepotravin), což je adaptace evolučně užitečná, když existují náklady na shánění potravy (např. expozice dravců, omezený čas a energetické zdroje). V dnešním prostředí však mohou stejné procesy řídit příjem potravin, které podporují obezitu, na úkor méně chutných, ale možná výživnějších alternativ.
Tak, změny závislé na CRF1 systémy mohou pomoci řídit (i) příjem energeticky hustých chutných potravin, (ii) nedostatečná spotřeba zdravějších alternativ a (iii) související negativní emoční stav, ke kterému dochází, když je zabráněno přístupu k chutnému jídlu (4, 5, 10-12, 17). Aktivace systému CRF, převedená na lidský stav, může podporovat relapsu v obezitě a souvisejících poruchách příjmu potravy, jakož i další negativní motivační následky cyklické abstinence z chutného jídla.
Materiály a metody
Předměty.
Samci krys Wistar (n = 155, 180 – 230 g, 45 dní staré) byly získány od Charlese Rivera a jednotlivě umístěny po příjezdu do drátěných plastových klecí (19 × 10.5 × 8 palců) v 12 h: 12 h zpětného světelného cyklu (10 h) : 00 h se zhasne), vivárium s regulovanou vlhkostí (60%) a teplotou (22 ° C). Krysy měly přístup ke kuřecím hlodavcům na bázi kukuřice [Harlan Teklad LM-485 Dieta 7012: 65% (kcal) uhlohydrát, 13% tuk, 21% protein, metabolizovatelná energie 341 cal / 100 g] a voda ad libitum týdně před 1 začátek experimentů. Experimentální postupy byly dodržovány v příručce National Institutes of Health pro péči a používání laboratorních zvířat (NIH publikační číslo 85 – 23, revidované 1996) a „Zásady laboratorní péče o zvířata“ (http://www.nap.edu/readingroom) / bookslabrats) a byly schváleny Výborem pro ústavní péči o zvířata a jejich použití ve Výzkumném ústavu Scripps.
Drogy.
R121919 byl syntetizován tak, jak je popsáno v Chen et al. (21). R121919 je vysoká afinita (Ki = 3.5 nM) selektivní CRF1 antagonista s fyziochemickými vlastnostmi lepšími než mnoho jiných CRF1 antagonisté (např. snížená logP a logD, zvýšená rozpustnost ve vodě) (13). Pro testování byl R121919 nejprve solubilizován v 1 M HCI (10% konečného objemu), pak zředěn na finální vehikulum 20% (hm./obj.) 2-hydroxypropyl-P-cyklodextrin (Sigma-Aldrich), zpětně titrován pomocí NaOH na pH 4.5. Roztok R121919 byl podáván sc (sc) v objemu 2 ml / kg.
Ad Libitum Diet Alternation.
Po aklimatizaci byly krysy rozděleny do dvou skupin odpovídajících příjmu potravy, tělesné hmotnosti a účinnosti krmení z předchozích 3 – 4 dnů. Jedna skupina dostala stravovací stravu („Chow“) ad libitum 7 dní v týdnu (Chow / Chow) a druhé skupině byla poskytnuta chow ad libitum pro 5 dny každý týden, poté následovalo 2 dní ad libitum přístupu k vysoce chutným , s vysokým obsahem sacharózy s příchutí čokolády („Palatable“; Chow / Palatable). Chutná strava je nutričně kompletní, čokoládová příchuť s vysokým obsahem sacharózy (50% kcal), strava založená na AIN-76A, která je srovnatelná v poměru makronutrientů a energetické hustotě jako strava pro chow [TestDiet; čokoláda s příchutí vzorce 5TUL: 66.8% (kcal) uhlohydrát, 12.7% tuk, 20.5% protein, metabolizovatelná energie 3.48 kcal / g; formulován jako přesné potravinové pelety 45-mg pro zvýšení jeho preferencí (22, 23)]. Pro stručnost se první 5 dny (pouze chow) a poslední 2 dny (chow nebo chutné podle experimentální skupiny) každého týdne označují ve všech experimentech jako fáze C a P. Dieta nebyla nikdy k dispozici. Chow dieta byla buď Harlan Teklad LM-485 Dieta 7012 [65% (kcal) uhlohydrát, 13% tuk, 21% protein, metabolizovatelná energie 341 cal / 100 g] nebo 5TUM strava formulovaná jako extrudované pelety 4 až 5-g [65.5-g % (kcal) uhlohydrát, 10.4% tuk, 24.1% protein, metabolizovatelná energie 330 cal / 100 g; TestDiet]. Podobně jako v předchozích studiích byl chill Harlan Teklad LM-485 použit v experimentech s krmením a zvýšeným plusem bludiště (11), zatímco testDiet 5TUM chow (10) byl použit v progresivních poměrech, CRF mRNA, obsahu peptidu CRF, kortikosteronu RIA a elektrofyziologických experimentech.
Jak bylo dříve publikováno (10), relativní stravovací preference, vypočtené jako procento denního příjmu (kcal) první stravy ve vztahu k druhé stravě, byly následující: 5TUL Čokoládová strava (sladká chutná strava) vs. Harlan LM-485 chow (M ± SEM) preference 90.7 ± 3.6%) a 5TUL Čokoládová strava (sladká chutná strava) vs. 5TUM chow Diet (M ± SEM preference 91.2 ± 3.7%).
Zvýšené bludiště.
Test se zvýšeným plusem bludiště byl proveden tak, jak je popsáno v Cottone et al. (24). Chow / Palatable potkani byli cyklizováni dietou po dobu nejméně 7 týdnů a poté byli předem ošetřeni buď vehikulem nebo 20 mg / kg R121919 (-1 h, sc) a testováni 5-9 h po přechodu z chutné stravy na chow (P → fáze C). Kontrolní krysy Chow / Chow byly testovány souběžně v designu mezi subjekty (n = 47). Chow dieta byla k dispozici ad libitum až do doby testování. Další podrobnosti viz Text SI.
Plán progresivního poměru zesílení pro potraviny.
Schéma posilování potravy progresivním poměrem bylo provedeno tak, jak je popsáno v Cottone et al. (10). Zvířata dostávala ad libitum A / I chow (5 g extrudované pelety) v jejich domácích klecích v průběhu experimentu, pokud není uvedeno jinak. Potravinovými zesilovači byly pelety 45-mg pro přesné krmení pro chow, jejichž složení bylo shodné s extrudovanou stravou pro domácí klece. Relace skončily, když subjekty nedokončily poměr 14 min, s posledním dokončeným poměrem definovaným jako bod zlomu. Chow / Palatable potkani byli cyklizováni dietou po dobu alespoň 7 týdnů a poté předběžně ošetřeni R121919 (-1 h, sc) v době přechodu z chutné stravy na chow (fáze P → C). Kontrolní krysy Chow / Chow byly testovány souběžně v designu mezi subjekty (n = 17). Dávky přípravku R121919 (0, 20 mg / kg tělesné hmotnosti, sc) byly podávány v rámci jedinců v protizávažném designu ve dvou dietních cyklech. Další podrobnosti viz Text SI.
Kvantitativní PCR v reálném čase.
Potkani (n = 20) byli po dobu 7 týdnů podrobeni dietnímu cyklu, anestetizováni a dekapitováni během dvou dietních podmínek (den 5 a 7 každého týdenního cyklu). Mozky byly rychle odstraněny a nakrájeny koronálně na plátky v mozkové matrici a centrální jádro amygdaly, nucleus accumbens, ostrovní kůra a prefrontální kůra byly vyraženy na ledově studené ploše. Celková RNA byla připravena z každého mozkového razníku pomocí standardního protokolu pro extrakci RNA ze zvířecích tkání. Celková RNA (1 μg) byla poté reverzně transkribována v přítomnosti Oligo (dT) 20 podle pokynů výrobce. Kvantitativní RT-PCR reakce byly prováděny v objemu 20 ul s použitím 0.5 μM primerů a 4 mM MgCI2. Výsledky byly analyzovány metodami druhého derivátu a exprimovány v libovolných jednotkách, normalizovány na úrovně exprese referenčního genu, CypA. Všechny RT-PCR reakce pro danou sekvenci byly provedeny ve stejném cyklu. Další podrobnosti viz Text SI.
Extrakce kyselinou peptidovou a CRF RIA.
Potkani (n = 25) byly cyklizovány dietou po dobu alespoň 7 týdnů, anestetizovány a dekapitovány během dvou dietních podmínek (dny 5 a 7 každého týdenního cyklu). Mozky byly rychle odstraněny a nakrájeny koronálně na mozkovou matrici a centrální jádro údivů amygdaly bylo shromážděno na ledové scéně. Extrakce kyselinou peptidovou se řídila již zavedeným postupem (25). Tkáňová imunoreaktivita podobná CRF byla kvantifikována pomocí citlivé a specifické RIA na pevné fázi upravené z Zorrilla et al. (26). Další podrobnosti viz Text SI.
Kortikosteron RIA.
Potkani (n = 12) byli po dobu alespoň 7 týdnů podrobeni dietnímu cyklu a během dvou dietních podmínek (5. a 7. den každého týdenního cyklu) byla odebrána krev z ocasu. Plazmatické hladiny imunoreaktivity podobné kortikosteronu byly stanoveny pomocí komerčně dostupné soupravy RIA podle pokynů výrobce (MP Biomedicals, Inc.) (26). Další podrobnosti viz Text SI.
Elektrofyziologická studia
Příprava řezů.
Centrální jádro plátek amygdaly bylo připraveno jak bylo popsáno výše (27, 28) od potkanů (n = 7 / skupina), která byla cyklicky stravována po dobu nejméně 7 týdnů, anestetizována a dekapitována 2 – 3 h poté, co byla stažena z chutného jídla. Mozky byly rychle odstraněny a umístěny do ledově chlazené umělé mozkomíšní tekutiny (aCSF), plynované 95% O2 a 5% CO2. Plátky byly nařezány, inkubovány v konfiguraci rozhraní po dobu přibližně 30 min. A zcela ponořeny a nepřetržitě superfúzovány teplým plynem aCSF. K aCSF byla přidána léčiva ze zásobních roztoků, aby se získaly známé koncentrace v superfuzátu. Při použitých rychlostech superfúze 2 – 4 ml / min dosahují koncentrace léčiva 90% koncentrace zásobníku v 2 min.
Elektrofyziologie.
Zaznamenali jsme centrální jádro amygdala neuronů s ostrými mikropipetami pomocí režimu nespojitého napětí nebo proudu. Většinu neuronů jsme drželi poblíž jejich klidového membránového potenciálu. Data byla získána pomocí předzesilovače a uložena pro pozdější analýzu pomocí softwaru pClamp. Farmakologicky izolovaný GABAA receptorem zprostředkované inhibiční postsynaptické potenciály (GABAA-IPSP) byly vyvolány lokální stimulací v centrálním jádru amygdaly prostřednictvím bipolární stimulační elektrody při superfuzi blokátorů glutamátového receptoru CNQX a APV a GABAB blokátor receptoru CGP 55845A. Abychom určili parametry odezvy pro každou buňku, provedli jsme vstupní a výstupní protokol. Byl aplikován rozsah proudů, počínaje prahovým proudem požadovaným k vyvolání IPSP až po napětí potřebné k vyvolání maximální amplitudy. Normalizovali jsme tři stimulační intenzity stejných kroků (prahová hodnota, poloviční maximální a maximální) jako 1 – 3 ×. Hyperpolarizační a depolarizační proudové kroky (přírůstky 200-pA, doba 750-ms) byly také použity pro generování křivek napětí-proud (VI). Vyvinuli jsme vyvolané amplitudy IPSP a VI odpovědi pomocí softwaru Clampfit. Všechna opatření byla přijata před superfuzí se selektivním CRF1 antagonista receptoru R121919 (1 μM), během jeho superfúze (20 min.) a následující vymývání (30 min.). Další podrobnosti viz Text SI.
Statistiky.
Skupinová srovnání byla použita Studentova t- testy (porovnání dvou skupin) nebo analýza rozptylu (ANOVA) (porovnání nejméně tří skupin), druhé interpretace jednoduchou analýzou hlavních účinků nebo Newman-Keulsovým porovnáním po významných omnibusových účincích (P <0.05). Data z experimentu s krmením byla analyzována třícestnými smíšenými ANOVA s dietním plánem jako faktorem mezi subjekty a Dose a dietní fází jako faktory uvnitř subjektu. Data z experimentu se zvýšeným množstvím bludišť byla analyzována obousměrnými ANOVA s dietním plánem a dávkou jako faktory mezi subjekty. Pro plán progresivního poměru výztužného experimentu byly body zlomu a celkové odpovědi analyzovány obousměrně smíšenými ANOVA s dietním plánem jako faktorem mezi subjekty a dávkou jako faktorem v rámci subjektu. Časový průběh reakce během prvních 5 minut byl analyzován třícestnými smíšenými ANOVA s dietním plánem jako faktorem mezi subjekty a dávkou a časem jako faktory uvnitř subjektu. Údaje z elektrofyziologických studií byly analyzovány s ANOVA mezi subjekty nebo s ANOVA mezi subjekty s případnými opakovanými opatřeními. Data z kortikosteronu RIA byla analyzována obousměrně smíšenou ANOVA s dietním plánem jako faktorem mezi subjekty a dietní fází jako faktorem v rámci subjektu. Použité statistické balíčky byly Instat 3.0, Prism 4.0 (GraphPad), Systat 11.0 a SPSS 11.5 (SPSS).
Poděkování.
Děkujeme Mike Arends za redakční pomoc, Mary Gichuhi za administrativní pomoc a Bobu Lintzovi, Jeanette Helfersové, Stephanie Dela Cruz a Molly Brennanové za technickou pomoc. Tato práce byla podporována Národním institutem pro cukrovku a trávicí a nemoci ledvin DK70118, DK26741 a P30DK56336; Grant národního institutu pro zneužívání drog DA023680; Národní institut pro zneužívání alkoholu a alkoholismus Granty AA016731 a AA015566; Národní ústav pro neurologické poruchy a mrtvice Grant IT32NS061847-01A2; Národní institut pro grant Aging AG028040; Grant HL088083, Národní ústav srdce, plic a krve; Ellison Medical Foundation; a Pearsonovo centrum pro výzkum alkoholismu a závislosti. Část této práce byla podpořena intramurálními výzkumnými programy Národního institutu pro zneužívání drog a Národního institutu pro zneužívání alkoholu a alkoholismus. Toto je rukopisné číslo 19807 z The Scripps Research Institute.
Poznámky pod čarou
Autoři neuvádějí žádný střet zájmů.
Tento článek je PNAS přímé podání.
Tento článek obsahuje podpůrné informace online na adrese www.pnas.org/cgi/content/full/0908789106/DCSupplemental.
Reference
;
