Dopaminové receptory D2 v závislosti na návykové dysfunkci a kompulzivní stravě u obézních krys (2010)

Komentář: Tato studie ukazuje, že když je zvířeti poskytnut neomezený přístup, silné přírodní posílení (velmi stimulující potrava) může způsobit pokles D2 receptorů. Tento pokles byl pozorován téměř u všech potkanů ​​a došlo k němu poměrně rychle. Když bylo odstraněno „vysoce chutné“ jídlo, krysy odmítly jíst normální jídlo. Krysy pokračovaly v záchvatu (i když mohly) navzdory spárování elektrických šoků s „vysoce chutnou“ spotřebou potravy.

• Úplná studie

Nat Neurosci. 2010 May; 13(5): 635-641. Publikováno online 2010 březen 28. dva:  10.1038 / nn.2519

Abstraktní

Zjistili jsme, že vývoj obezity byl spojen se vznikem postupně se zhoršujícího deficitu v odezvách nervových odměn. Podobné změny v odměňování homeostázy vyvolané kokainem nebo heroinem se považují za zásadní při zahájení přechodu od náhodného k nutkavému užívání drog. V souladu s tím jsme detekovali kompulzivní stravovací chování u obézních, ale nikoli štíhlých potkanů, měřeno jako chutná konzumace potravy, která byla odolná vůči narušení averzivním podmíněným stimulem. Striatální dopaminové receptory D2 (D2R) byly u obézních potkanů ​​downregulovány, jak bylo popsáno u lidí závislých na drogách. Navíc potlačení striatálních D2R zprostředkovaných lentivirem rychle urychlilo vývoj deficitů odměňování závislých na návycích a nástup kompulzivního hledání potravy u potkanů ​​s rozšířeným přístupem k chutnému vysokotučnému jídlu. Tato data ukazují, že nadměrná konzumace chutného jídla vyvolává závislost podobné neuroadaptivní odezvy v obvodech odměňování mozku a řídí vývoj nutkavého stravování. Běžné hedonické mechanismy proto mohou být základem obezity a drogové závislosti.

Úvod

Krmení je ovlivněno potěšením a odměnou a získávání potravinové odměny může silně motivovat spotřebu1, 2. Hedonické mechanismy přispívající k obezitě však zůstávají špatně pochopeny. U hyperfagických lidí s vrozeným nedostatkem leptinu se aktivita v dorzálním a ventrálním striatu, které jsou základními složkami mozkových odměnových obvodů, výrazně zvyšuje v reakci na obrázky jídla3 a substituční léčba leptinem tlumí jak striatální aktivitu, tak sebeznámé „lajkování“ jídla3 . To naznačuje, že striatum je důležité v hedonických aspektech chování při krmení. Nedávno bylo prokázáno, že aktivace striata v reakci na vysoce chutné jídlo je u obézních jedinců oslabena ve srovnání s hubenými kontrolami4. Kromě toho jsou hypofunkce dorzálního striata a dlouhodobý přírůstek hmotnosti nejvýraznější u jedinců s alelou TaqIA v lokusu genu DRD2 – ANKK1, což má za následek sníženou striatální expresi D2R a bylo prokázáno, že předisponují jednotlivce k poruchám látkové závislosti4, 5 Tato a podobná pozorování vedla k návrhu, že deficity ve zpracování odměn mohou být důležitým rizikovým faktorem pro rozvoj obezity a že obézní jedinci mohou nutně konzumovat chutné jídlo, aby kompenzovali hyposenzitivitu odměny6. Zejména není jasné, zda deficity ve zpracování odměn jsou konstitutivní a předcházejí obezitě, nebo zda nadměrná konzumace chutného jídla může vést k dysfunkci odměn, a tím přispět k obezitě vyvolané stravou.

Charakteristickou vlastností obézních a obézních jedinců je to, že se nadále přejídají, a to navzdory známým negativním zdravotním a sociálním důsledkům. Mnoho jedinců s nadváhou vyjadřuje touhu omezit svou spotřebu potravin, přesto se snaží kontrolovat svůj příjem a opakovaně konzumují nad rámec svých energetických potřeb 7, 8. Vývoj stravovacího chování, které je necitlivé na negativní výsledek, je obdobou kompulzivního chování při užívání drog, které se vyskytuje u lidí závislých na drogách, což je podobně nepříznivé pro negativní důsledky9. Zde jsme zkoumali účinky rozšířeného přístupu k chutné stravě s vysokým obsahem tuku na citlivost systémů odměňování mozku u potkanů. Rovněž jsme zkoumali souvislost mezi dietou indukovanou hedonickou dysregulací a vznikem nutkavého hledání potravy. Nakonec jsme zkoumali roli striatálních D2R v těchto závislých reakcích na chování.

U obézních potkanů ​​je závislý na odměně

Abychom otestovali účinky omezeného nebo rozšířeného přístupu k chutné stravě s vysokým obsahem tuků, připravili jsme samce potkanů ​​Wistar (300–350 g) s bipolární stimulační elektrodou v laterálním hypotalamu a v diskrétní studii jsme je trénovali po dobu 10–14 dní postup odměňování mozkové stimulace (BSR) s aktuální prahovou hodnotou, dokud nebyly stanoveny stabilní prahové hodnoty odměny4. V postupu BSR krysy energicky reagují na získání odměňující se elektrické stimulace prostřednictvím zavedené stimulační elektrody, přičemž minimální stimulační intenzita, která udržuje sebeimulační chování, se nazývá prahová hodnota odměny10. Vzhledem k tomu, že prahové hodnoty odměny zůstávají stabilní a nezměněné po delší dobu za výchozích podmínek, poskytuje tento postup citlivou míru reakce systémů odměn v mozku. Po stanovení stabilních prahových hodnot BSR (definovaných jako <10% variace prahových hodnot ve třech po sobě jdoucích sezeních) jsme krysy rozdělili do tří skupin, které nevykazovaly žádné rozdíly v průměrných tělesných hmotnostech nebo prahových hodnotách odměny mezi skupinami. Těmto třem skupinám byl poskytnut rozdílný přístup ke stravě typu „cafeteria“ sestávající z chutného energeticky hustého jídla snadno dostupného pro lidskou spotřebu (viz Online metody). Krysy měly 0 h (potkani pouze s chow; n = 9), 1 h (potkan s omezeným přístupem; n = 11) nebo 18–23 h (potkan s prodlouženým přístupem; n = 11) přístup ke stravě denně po dobu 40 po sobě jdoucích dnů. Je známo, že stravování v jídelně vede u potkanů ​​k obezitě vyvolané stravou11. Všechny krysy měly také ad libitum přístup ke standardnímu laboratornímu krmivu, přičemž byly zaznamenány prahové hodnoty odměny, přírůstek hmotnosti a kalorický příjem.

Hmotnost se výrazně zvýšila u potkanů ​​s prodlouženým přístupem ke stravovací stravě ve srovnání se skupinami, které mají pouze chow nebo s omezeným přístupem (obr. 1a). Hmotnost měla také tendenci se zvyšovat u potkanů ​​s omezeným přístupem ve srovnání s potkani, kteří pouze chow, ale tento účinek nedosáhl statistické významnosti. Vývoj obezity u krys s prodlouženým přístupem byl úzce spojen se zhoršujícím se deficitem funkce odměny v mozku, což se odráželo v progresivně zvýšených prahech BSR (obr. 1b). Protože mezi těmito třemi skupinami nebyly pozorovány žádné rozdíly v latenci odezvy pro BSR (doplňkový obrázek 1), nelze toto pozorování vysvětlit deficitem v chování. Podobné deficity ve funkci odměny v mozku byly hlášeny u potkanů ​​s prodlouženým, ale neomezeným přístupem k intravenóznímu podání kokainu nebo heroinu12, 13, 14. Rozšířený přístup k chutnému vysokotučnému jídlu tedy může vyvolat závislostní deficity ve funkci odměňování mozku, které jsou považovány za důležitý zdroj motivace, který může vést k přejídání a přispívat k rozvoji obezity1, 6.

Obrázek 1: Porucha hmotnosti a odměna u potkanů ​​s prodlouženým přístupem k jídelníčku.

(a) Průměrný (± sem) přírůstek hmotnosti u potkanů ​​pouze s chow, omezeným přístupem a prodlouženým přístupem (interakce × den: F39,702 7.9 = 0.0001, P <0.05; * P <78,1092 ve srovnání s chow-only skupinou, post hoc test). (b) Průměrná (± sem) procentní změna oproti výchozím prahovým hodnotám odměny (přístup × časová interakce: F1.7 = 0.0005, P <0.05; * P <XNUMX ve srovnání s chow-only skupinou, post hoc test).

Když jsme podrobně zkoumali chování při krmení (obr. 2), zjistili jsme, že celkový denní kalorický příjem byl podobný u potkanů ​​pouze pro chow a potkanů ​​s omezeným přístupem (obr. 2a, d). Naproti tomu celkový kalorický příjem u potkanů ​​s prodlouženým přístupem byl téměř dvakrát vyšší než u potkanů ​​s omezeným přístupem a potkanů ​​(obr. 2a, d). Ačkoli krysy s omezeným přístupem a pouze pro žvýkání si udržovaly přibližně stejný denní kalorický příjem (obr. 2a, d), krysy s omezeným přístupem získaly pouze ~ 33% svých denních kalorií z chow (obr. 2b, d), což naznačuje, že během svého přístupu k jídlu 66 h ke stravovací dietě 1 (obr. 15d) si vyvinuly chování při krmení podobném binge a spotřebovali ~ 2% svého denního kalorického příjmu. Krysy s prodlouženým přístupem získaly pouze malou frakci (~ 5%) jejich celkového kalorického příjmu z potravy (Obr. 2b); konzumovali stravu téměř výhradně (obr. 2d). Posun ve stravovacích preferencích ve skupinách s omezeným a rozšířeným přístupem se také projevil ve výrazném zvýšení příjmu tuku ve srovnání s potkanymi, které pouze chow (obr. 2c a doplňkový obr. 2). V souladu s předchozími zprávami 16 došlo u potkanů ​​s prodlouženým přístupem k poklesu konzumace stravovací stravy v průběhu času. To může odrážet vývoj tolerance k chutnosti potravinových položek poskytovaných jako součást stravování v průběhu času. Nicméně preference pro stravování ve stravě oproti standardnímu krmení u těchto krys zůstala trvale vysoká (doplňkový obrázek 3). Tato data ukazují, že rozšířený, ale neomezený přístup k chutné stravě s vysokým obsahem tuků, způsobuje deficity závislé na závislostech, přejídání a ztrátu homeostatické energetické bilance. Naproti tomu omezený přístup k chutnému jídlu způsobuje spousty konzumních vzorců, ale nenarušuje rovnováhu homeostatické energie ani funkci odměňování mozku. Je však možné, že omezený přístup ke stravovací stravě po dobu delší než 40 po sobě jdoucích dnů by vyvolal významné přibírání na váze a narušení funkce odměňování mozku.

Obrázek 2: Vzorce spotřeby u potkanů ​​s prodlouženým přístupem k dietě v jídelně.

a) Průměrný (± sem) denní kalorický příjem u potkanů ​​pouze s chow, omezeným a prodlouženým přístupem (přístup: F1,324 = 100.6, P <0.0001; čas: F18,324 = 7.8, P <0.0001; přístup × časová interakce: F18,324 4.6 = 0.0001, P <0.05; * P <2,504 ve srovnání se skupinou pouze s chow, post hoc test). (b) Průměrný denní kalorický příjem (± sem) z krmiva (přístup: F349.1 = 0.0001, P <18,504; čas: F5.9 = 0.0001, P <36,504; přístup × časová interakce: F3.52 = 0.0001, P <0.05; * P <2,486 ve srovnání s chow-only skupinou, post hoc test). (c) Průměrný denní kalorický příjem (± sem) z tuku (přístup: F118.7 0.0001 = 18,486, P <8.8; čas: F0.0001 36,486 = 6.2, P <0.0001; přístup × časová interakce: F0.05 40 = 2,54, P <25.0; * P <0.0001 ve srovnání s chow-only skupinou, post hoc test). (d) Porovnání průměrného (± sem) celkového kalorického příjmu a kalorií spotřebovaných výhradně z krmiva během celého 2,54denního období přístupu (přístup: F1235.2 = 0.0001, P <2,54; zdroj kalorií: F485.7 = 0.0001, P <0.001; přístup × interakce zdroje kalorií: F0.001 = XNUMX, P <XNUMX; *** P <XNUMX ve srovnání s celkovými kaloriemi ve skupině s chow-only, ### P <XNUMX ve srovnání s celkovými kalorií v stejná skupina potkanů, post hoc test).

Po 40 dnech potkanům již nebyl povolen přístup k chutné stravě, ale nadále měli přístup podle libosti ke standardnímu laboratornímu krmivu. Během tohoto vynuceného období „abstinence“ jsme denně hodnotili prahové hodnoty odměny a spotřebu krmiva. Zvýšení prahových hodnot odměny přetrvávalo po dobu nejméně 2 týdnů u potkanů ​​s prodlouženým přístupem, když již neměli přístup k chutné stravě (obr. 3a). To kontrastuje s relativně přechodnými (~ 48 h) deficity funkce odměny hlášené u potkanů ​​podstupujících abstinenci od kokainu, který si podávali sami13. Rovněž došlo k výraznému poklesu kalorického příjmu (obr. 3b) a postupnému snižování tělesné hmotnosti (obr. 3c) u potkanů ​​s prodlouženým přístupem a v menší míře u potkanů ​​s omezeným přístupem během této doby abstinence, v souladu s předchozí zprávy 11, 15. Po 14 dnech abstinence byly krysy usmrceny a umístění elektrod bylo stanoveno barvením kresyl fialovou barvou (obr. 3d).

Obrázek 3: Přetrvávající dysfunkce odměňování a hypofágie během abstinence u potkanů ​​s prodlouženým přístupem k dietě v jídelně.

(a) Průměrná procentuální změna oproti výchozím prahovým hodnotám odměny (± sem) během abstinence od chutné stravy s vysokým obsahem tuku (přístup: F2,112 3.7 = 0.05, P <4,112; čas: F2.3 0.05 = 0.05, P> 14; * P <2,168 ve srovnání s chow-only skupinou, post hoc test). (b) Průměrný kalorický příjem (± sem) v poslední den přístupu k dietě s vysokým obsahem tuků (výchozí hodnota) a během 41.7 dnů abstinence, kdy byl k dispozici pouze standardní krmivo (přístup: F0.0001 6,168 = 65.6, P <0.0001 ; čas: F12,168 = 38.3, P <0.0001; přístup × časová interakce: F0.05 = 14, P <1,126; * P <37.2 ve srovnání s chow-only skupinou, post hoc test). (c) Změna průměrné tělesné hmotnosti (± sem) ve srovnání s tělesnou hmotností v poslední den přístupu k dietě s vysokým obsahem tuků (výchozí hodnota) a během 0.0001 dnů abstinence, kdy byl k dispozici pouze standardní krmivo (přístup: F7,126 3.1) = 0.01, P <7,126; čas: F40.9 = 0.0001, P <0.05; interakce × časová interakce: FXNUMX = XNUMX, P <XNUMX; * P <XNUMX ve srovnání s chow-only skupinou, post hoc test). (d) Histologická rekonstrukce umístění elektrod stimulujících BSR v laterálním hypotalamu potkanů ​​pouze s chow (trojúhelníky), s omezeným přístupem (čtverce) a s rozšířeným přístupem (kruhy).

Striatální D2R u obézních potkanů: role v deficitu odměny

Dále jsme testovali hypotézu, že nadměrná konzumace chutné stravy může snížit striatální hustotu D2R a přispět k rozvoji hyposenzitivity odměny podobné závislosti. Nové kohortě potkanů ​​pouze s chow, omezeným přístupem a prodlouženým přístupem byl povolen přístup do jídelníčku, dokud nedošlo ke statisticky významnému nárůstu tělesné hmotnosti u potkanů ​​s rozšířeným přístupem ve srovnání se skupinou s chow-only (P <0.05 ; Obr. 4a). Striatální exprese údajně silně glykosylované (~ 70 kDa) formy D2R vázané na membránu byla nižší u potkanů ​​s prodlouženým přístupem než u potkanů ​​s omezeným přístupem nebo pouze s chow (obr. 4b; viz online metody). Když jsme krysy v každé přístupové skupině rozdělili do dvou podskupin na základě středního rozdělení tělesných hmotností (lehkých nebo těžkých), našli jsme jasný inverzní vztah mezi tělesnou hmotností a striatální expresí D2R (obr. 4a, c). Nezjistili jsme žádné statisticky významné snížení exprese neglykosylovaných nezralých (~ 39 kDa) a středně glykosylovaných cytoplazmatických (~ 51 kDa) forem D2R (doplňkový obrázek 4) 17, což naznačuje, že striatální D2R exprese u potkanů ​​s rozšířeným přístupem je pravděpodobně regulováno post-transkripčními mechanismy.

Obrázek 4: Hmotnostní přírůstek je nepřímo úměrný striatálním hladinám D2R.

(a) Krysy pouze s chowem, omezeným přístupem a rozšířeným přístupem byly rozděleny do dvou skupin podle podmínek přístupu na základě středního rozdělení tělesných hmotností: lehké (L) nebo těžké (H). (b) Celý striatální komplex byl odebrán ze všech potkanů ​​a hladiny D2R v každé skupině měřeny westernovým přenosem. Pás spojený s membránou D2R byl vyřešen při 70 kDa a níže je zobrazena kontrola navádění proteinu (p-aktin, 43 kDa). Plné délky imunoblotů jsou uvedeny na doplňkovém obrázku 12. (c) Relativní množství D2R ve striatu potkanů ​​pouze s chow, omezeným přístupem a prodlouženým přístupem byla kvantifikována denzitometrií (F2,6 = 5.2, P <0.05, hlavní účinek přístupu; * P <0.05 a ** P <0.01 ve srovnání se skupinou chow-only-L).

Dále, abychom otestovali funkční význam dietou indukovaného snížení striatálního D2R na funkci odměňování mozku, jsme navrhli a validovali lentivirový vektor pro dodání krátké vlásenkové interferující RNA (shRNA), aby se srazil D2R (Lenti-D2Rsh); 5 a doplňkový obrázek 5). Hranice odměn se začaly zvyšovat u potkanů ​​léčených Lenti-D2Rsh téměř okamžitě poté, co byl povolen prodloužený přístup ke stravovací jídelně, zatímco prahové hodnoty odměny zůstaly nezměněny u potkanů ​​s prodlouženým přístupem léčených prázdným lentivirovým vektorem (kontrola Lenti) v relativně krátkém období. přístupu ke stravovací jídelně (14 d; Obr. 6a). Latence odezvy se u obou skupin potkanů ​​nezměnily, což ukazuje, že tento účinek nebyl sekundární vzhledem k deficitům ve výkonu úkolu (doplňkový obrázek 6). Hranice odměny byly také nezměněny u potkanů ​​ošetřených Lenti-D2Rsh nebo Lenti-kontrolou, kteří měli přístup ke krmení pouze ve stejném období (obr. 6b).

Prahové hodnoty zůstaly trvale zvýšeny během další 15 d abstinence, když všechny krysy měly přístup pouze ke standardnímu krmení (doplňkový obrázek 7). Knockdown striatálního D2R proto zvyšuje zranitelnost vůči hypofunkci odměňování vyvolané dietou, ale nezměnilo základní aktivitu systémů odměňování mozku.

Obrázek 5: Lentivirem zprostředkované potlačení striatální D2R exprese.

(a) Grafické znázornění striatálních oblastí, ve kterých byl nadměrně exprimován Lenti-D2Rsh. Zelené kruhy na levé striatální hemisféře představují místa, na která byly namířeny virové infuze. Zelené barvení na pravé striatální hemisféře je reprezentativní imunochemické barvení na zelený fluorescenční protein (GFP) z mozku krysy Lenti-D2Rsh. (b) Reprezentativní imunoblot snížené exprese D2R ve striatu krys Lenti-D2Rsh. Imunobloty plné délky jsou uvedeny na doplňkovém obrázku 13. (c) Relativní množství D2R ve striatu potkanů ​​Lenti-control a Lenti-D2Rsh, kvantifikované denzitometrií (* P <0.05 ve srovnání s Lenti-kontrolní skupinou, post hoc test ). (d) Infekce gliových buněk ve striatu vektorem Lenti-D2Rsh nebyla detekována. Zelené barvení je GFP z viru; červená je marker astrocytů gliální fibrilární kyselý protein (GFAP); buněčná jádra jsou zvýrazněna DAPI barvením modře. Bílé šipky označují lokalizovanou oblast gliózy, která se nachází pouze v místě injekce viru ve striatu a ne v okolních tkáních, do kterých virus difundoval. Ani v této oblasti není žádný z astrocytů pozitivní na GFP. Žluté šipky ve zvětšeném obrazu zvýrazňují typické GFP-negativní astrocyty, které byly detekovány. (e) Vysoká hladina neuronální infekce ve striatu vektorem Lenti-D2Rsh. Zelené barvení je GFP z viru; červená je neuronový nukleární marker NeuN; buněčná jádra jsou zvýrazněna DAPI barvením modře. Žluté šipky ve zvětšeném obrazu zvýrazňují GFP-pozitivní a NeuN-pozitivní neurony ve striatu. (f) Vyšší zvětšení virově infikovaného (GFP-pozitivního) neuronu ve striatu potkanů ​​Lenti-D2Rsh, který ukazuje typické morfologické rysy středně ostnatých neuronů.

Obrázek 6: Znalost striatálního D2R zvyšuje zranitelnost při odměňování dysfunkce u potkanů ​​s rozšířeným přístupem k dietě v jídelně.

(a) Průměrná (± sem) procentní změna oproti výchozím prahovým hodnotám odměny u potkanů ​​Lenti-control a Lenti-D2Rsh, kteří prodloužili přístup k dietě v bufetu po dobu 14 po sobě jdoucích dnů (virus: F1,156 5.9 = 0.05, P <13,156; čas: F2.2 = 0.05, P <13,156; interakce virus × čas: F2.2 = 0.05, P <0.05; #P <2, účinek interakce). (b) Průměrná (± sem) procentní změna oproti výchozím prahovým hodnotám odměny u potkanů ​​Lenti-control a Lenti-D14Rsh, kteří měli přístup pouze k chow. (c) Průměrný (± sem) kalorický příjem potkanů ​​pouze během 2,28 dnů krmení nebo prodloužený přístup (přístup: F135.6 = 0.0001, *** P <14). (d) Průměrný (± sem) přírůstek hmotnosti pouze během 2,28 dnů krmení nebo prodloužený přístup (přístup: F96.4 = 0.0001, P <0.001; *** P <XNUMX, hlavní účinek přístupu).

Zjistili jsme, že kalorický příjem (Obr. 6c) a přírůstek na váze (Obr. 6d) byly podobné v Lenti-D2Rsh a odpovídajících Lenti-kontrolních skupinách za podmínek pouze pro chow nebo s prodlouženým přístupem (doplňkové obrázky 8 a 9). Takže striatální knockdown D2R nezměnil ani preferenci pro stravování v jídelně, ani celkový kalorický příjem, když bylo chutné jídlo volně dostupné pro spotřebu.

Kompulzivní stravování u obézních potkanů: role pro striatální D2R

Dále jsme testovali hypotézu, že u potkanů ​​se může objevit kompulzivní stravování s rozšířeným přístupem ke stravě v bufetu a že k tomuto účinku mohou přispět deficity striatální signalizace D2R. Nové kohortě potkanů ​​pouze s chow, omezeným přístupem a prodlouženým přístupem byl povolen přístup k dietě v bufetu po dobu> 40 d, dokud u prodloužených potkanů ​​nedošlo k statisticky významnému nárůstu hmotnosti (P ​​<0.05 ve srovnání s potkani pouze s chow; data nejsou zobrazeno). Všechny tři skupiny potkanů ​​pak měly povolen pouze 30minutový přístup do jídelníčku po dobu 5–7 dní v operativní komoře, dokud nebylo dosaženo stabilního příjmu (definováno jako <10% variace v denním příjmu). Polovina potkanů ​​v každé podmínce přístupu byla poté vystavena světlu (podmíněný stimul) spárovanému s aplikací šoků nohou (potrestaná skupina), zatímco zbývající krysy v každé skupině byly vystaveny nárazovému světlu v nepřítomnosti otřesu nohou (nepotrestaná skupina ). V testovací den jsme zkoumali účinky samotné expozice cue světla na chutnou spotřebu jídla (obr. 7; viz online metody). Zjistili jsme, že průměrný kalorický příjem během 30minutových výchozích relací byl vyšší u potkanů ​​pouze s chow a omezeným přístupem než u potkanů ​​s prodlouženým přístupem (obr. 7a, b). To naznačuje, že potkani pouze s chow a omezeným přístupem bičovali na chutném jídle během přerušovaných 30minutových přístupů, což se odráží ve skutečnosti, že tyto krysy konzumovaly ~ 40–50% jejich denního kalorického příjmu, obvykle ~ 100 kCal, během těchto relací (obr. 7a, b). Naproti tomu se krysy s rozšířeným přístupem zdají rezistentní vůči rozvoji tohoto chování jako při přejídání, možná proto, že jejich historie téměř neomezeného přístupu k chutnému jídlu po více než 40 po sobě jdoucích dnů stanovila vzorce stravování, které bylo relativně nepružné změnit. V den testu jsme nezjistili žádné statisticky významné účinky opakování světelného signálu na spotřebu potravy u nepotrestaných potkanů ​​ze skupin s chow-only, omezeným přístupem nebo rozšířeným přístupem ve srovnání s příjmem během základního období (obr. 7a). Samotné signální světlo proto nemělo žádný motivační nápad. U potrestaných potkanů ​​nárazové párové světlo signifikantně snížilo chutný příjem potravy u potkanů ​​pouze s chow a omezeným přístupem. Kontrolní světlo však nemělo žádný vliv na příjemný příjem potravy u potkanů ​​s rozšířeným přístupem, což ukazuje, že jejich konzumace byla necitlivá na averzivní narážky na životní prostředí předpovídající nepříznivé účinky. Základní příjem energie u potkanů ​​s rozšířeným přístupem byl nižší než u ostatních skupin. Protože však příjem potravy během podobných časových období byl mnohem nižší (obr. 7d), je nepravděpodobné, že by to představovalo „podlahový efekt“, který by zmařil naše zjištění. Naše data společně podporují myšlenku, že u potkanů ​​s rozšířeným přístupem se může objevit nutkavé stravovací chování analogickým způsobem jako u nutkavého užívání kokainu pozorovaného u potkanů ​​s anamnézou rozšířeného přístupu k droze18.

Obrázek 7: Kompulzivní reakce na chutné jídlo.

(a) Průměrná (± sem) chutná konzumace stravy u nepotrestaných potkanů ​​během 30minutových výchozích relací a v testovací den, kdy byly krysy vystaveny neutrálnímu podmíněnému stimulu, který nebyl dříve spárován se škodlivým šokem nohy (přístup: F2,20 = 5.2, P <0.05; # P <0.05 ve srovnání s potkany pouze pro krmení). (b) Průměrná (± sem) chutná konzumace stravy u potrestaných potkanů ​​během 30minutových výchozích relací a v den testu, kdy byly krysy vystaveny podmíněnému stimulu, který byl dříve spárován se škodlivým šokem nohy (přístup: F2,21 = 3.9 , P <0.05; narážka: F1,21 = 8.6, P <0.01; interakce × narážka: F2,21 = 4.7, P <0.05; * P <0.05 ve srovnání s příjmem během základní relace, # P <0.05 ve srovnání s pouze potkani) (c) Průměrná (± sem) chutná konzumace stravy během 30minutových výchozích relací a v testovací den u potkanů ​​Lenti-control a Lenti-D2Rsh, kteří dříve měli pouze stravu nebo prodloužený přístup k stravě v jídelně (narážka: F1,26, 29.7 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <30 ve srovnání s příjmem během základních relací, post hoc test). (d) Průměrná (± sem) spotřeba krmiva během 2minutových výchozích relací a v den testu u potkanů ​​Lenti-control a Lenti-D1,26Rsh, kteří dříve měli pouze krmení nebo prodloužený přístup k dietě v jídelně (narážka: F44.9 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <XNUMX ve srovnání s příjmem během základních relací, post hoc test).

Nakonec jsme zkoumali účinky podmíněného stimulu spárovaného s trestem na příjem potravy u potkanů ​​Lenti-control a Lenti-D2Rsh, které dříve měly přístup pouze k krmení nebo prodloužený přístup k stravě v jídelně (krysy z obr. 6). Zjistili jsme, že základní příjemný příjem potravy během 30minutových výchozích relací byl ve všech čtyřech skupinách podobně vysoký (~ 40 kCal) (obr. 7c). Kromě toho byla celková denní spotřeba krmiva (v domácí kleci) podobná mezi všemi čtyřmi skupinami potkanů ​​během kondičních sezení a v testovací den (doplňkový obr. 10). Čtrnáctidenní předchozí přístup k jídelní stravě proto nebyl dostatečný k tomu, aby blokoval přejídání jako podobné chování, jaké bylo pozorováno u potkanů, kteří měli> 14 d prodloužený přístup k jídelní stravě (obr. 40a, b). Averzivní stimulační světelný stimul narušil chutný příjem potravy u potkanů ​​Lenti-control a Lenti-D7Rsh, které dříve měly přístup pouze k čau (obr. 2c). Podobně averzivní podmíněný stimul narušil chutný příjem potravy u Lenti-kontrolních potkanů, kteří měli dříve rozšířený přístup ke stravě v jídelně o 7 dní. Naproti tomu averzivní podmíněný stimul neměl žádný dopad na chutnou spotřebu potravy u potkanů ​​Lenti-D14Rsh, které dříve měly o 2 dní prodloužený přístup ke stravě v jídelně (obr. 14c). Prahové hodnoty BSR zůstaly u těchto potkanů ​​významně zvýšené, když byly zaznamenány 7 hodin po testovací relaci, zatímco prahové hodnoty zůstaly stabilní a nezměněné u ostatních tří skupin potkanů

(Doplňkový obrázek 11). Abychom ověřili, že rezistence na podmíněně stimulované potlačení chutného příjmu potravy u potkanů ​​s prodlouženým přístupem Lenti-D2Rsh nebyla sekundární k poškození klasických kondicionačních procesů, testovali jsme účinky averzivního podmíněného stimulu na spotřebu méně chutného standardního krmiva u všechny čtyři skupiny potkanů. Na rozdíl od konzumace chutného jídla podobného nárazu jsme zjistili, že všechny čtyři skupiny potkanů ​​konzumovaly během období 2 min. Základní linie (Obr. 30d) malý chow (~ 7 kCal) a že příjem chow byl přerušen ve všech čtyřech skupinách podobná velikost po vystavení averzivnímu podmíněnému stimulu (obr. 7d). Tato data ukazují, že knockdown striatálních D2R výrazně urychlil vznik kompulzivního stravování chutného jídla, ale pouze u potkanů ​​s anamnézou rozšířeného přístupu. Navíc vzhledem k tomu, že kompulzivní stravování bylo detekováno pouze u potkanů ​​Lenti-D2Rsh, které měly zvýšené prahové hodnoty BSR, může být hypofunkce odměňování vyvolaná stravou nezbytným předchůdcem vzniku kompulzivního hledání potravy.

Diskuse

Snadný přístup k chutným potravinám s vysokým obsahem tuků je považován za důležitý environmentální rizikový faktor pro obezitu19. Zjistili jsme, že rozšířený přístup k vysoce chutné stravovací stravě vedl k přejídání a přibývání na váze spolu s postupným zvyšováním prahů BSR u potkanů. Tento účinek na prahové hodnoty BSR lze vysvětlit postupným snižováním citlivosti obvodů odměňování mozku, což je interpretace v souladu se skutečností, že omezení potravy a ztráta hmotnosti může zvýšit20, zatímco akutní překrmování může přechodně snížit21, což odpovídá BSR u potkanů. Toto zjištění představuje rozšíření práce, které ukazuje, že akutní nadměrné krmení potkanů ​​pomocí intragastrické krmné zkumavky21 a žaludeční distenze nebo intravenózní infuze glukagonu, které napodobují postprandiální saturaci22, 23, 24, snižují reakci na odměňování laterálních hypothalamických BSR a zvyšují averzi podobné reakce na stimulace25. Předchozí práce také ukázala, že opakovaně silové krmení potkanů ​​pomocí intragastrických zkumavek, dokud se jejich hmotnost nezvýší o ~ 200 g, podobně snižuje rychlost reakce na BSR, což je účinek, který přetrvává, dokud se tělesná hmotnost normalizuje23. Stejně jako v těchto nálezech u potkanů ​​byla reakce koček na laterální hypothalamickou BSR inhibována předchozím krmením satiace26, což ukazuje, že interakce mezi funkcí odměňování mozku a metabolickým stavem jsou zachovány, a proto se pravděpodobně vyskytují také u lidí. Snadný přístup a následné přejídání stravovacích stylů u lidí je považováno za důležitý environmentální přispěvatel k současné epidemii obezity v západních společnostech 19. Naše data ukazují, že hypofunkce odměny vzniká u potkanů, kteří dobrovolně přejídají chutnou stravovací stravu podobnou stravě konzumované lidmi, a že tento účinek se postupně zhoršuje, když přibývají na váze. Zejména všechny krysy se zvýšením prahu odměny ≥ 20% měly BSR elektrody umístěné v ~ 500 μm fornixu dorsolaterálně. Citlivost neuronů souvisejících s odměnou v této oblasti je zvýšena omezením potravy způsobem, který je citlivý na hormon leptin odvozený od tuku, a tato oblast mozku je považována za důležitý substrát pro odměnu za jídlo27. Mozkové obvody, které regulují potravinové hedoniky, jsou proto inhibovány postingestivními signály, které předpovídají saturaci, v souladu s nedávnými lidskými zobrazovacími studiemi, které ukazují, že žaludeční distenze28 a střevní postprandiální faktorový peptid YY3-36 (PYY) 29 modulují aktivitu regionů mozku podílející se na zpracování odměn. Kromě toho jsou systémy odměn inhibovány také nadměrným přírůstkem na váze. Poslední zprávy naznačují, že cirkulující leptin, klíčový regulátor energetické rovnováhy, může pronikat do mozkových tkání a inhibovat aktivitu odměňovacích obvodů 3, 27, 30, 31.

Deficity odměn u potkanů ​​s nadváhou mohou odrážet kontraradaptivní snížení základní citlivosti obvodů odměňování mozku, aby se postavily proti jejich nadměrné stimulaci chutným jídlem. Taková hypofunkce odměny způsobená dietou může přispět k rozvoji obezity zvýšením motivace konzumovat „obezitní“ stravu s vysokou odměnou, aby se zabránilo nebo zmírnilo tento stav negativní odměny6, 32. To by mohlo odpovídat za hypofágii, kterou jsme pozorovali v rozšířeném přístupu u potkanů ​​a v menší míře u potkanů ​​s omezeným přístupem, když byla odebrána chutná strava a byla k dispozici pouze méně chutná potrava. Takový scénář je také v souladu s údaji ze studií zobrazování lidského mozku, ve kterých je otupená aktivace striata v reakci na vysoce chutné jídlo, zejména u jedinců s genetickými polymorfismy, o nichž se předpokládá, že snižují expresi striatální D2R, spojena s dlouhodobým přírůstkem hmotnosti4. Není jasné, zda se taková hyposenzitivita odměny u obézních jedinců projevuje před rozvojem obezity a souvisí pouze s genetickými faktory („syndrom nedostatku odměny“), nebo zda přejídání může způsobit narušení zpracování odměn. Naše data ukazují, že rozšířený přístup k chutnému vysokoenergetickému jídlu a následné přejídání otupí citlivost, a proto mohou představovat důležitý hedonický mechanismus, který podporuje rozvoj obezity. Podobná dysfunkce odměn, jaká je zde uvedena u obézních potkanů, je také zjištěna u potkanů ​​s anamnézou prodlouženého přístupu k intravenóznímu podávání kokainu nebo heroinu, ale ne u těch s anamnézou omezeného přístupu12, 13, 14. Navíc přechod od Bylo navrženo příležitostné až nutkavé hledání drog, které je výsledkem pokusu zmírnit přetrvávající stav snížené odměny vyvolané touto dysfunkcí odměny vyvolané drogami12, 32, 33. Naše data tedy naznačují, že obezita a drogová závislost mohou sdílet základní hedonické mechanismy.

Downregulace striatální exprese D2R je pozoruhodná neuroadaptivní reakce na nadměrnou spotřebu chutného jídla. Opravdu, snížení striatální hustoty D2R je vidět u jedinců s nadváhou4, 34 a hlodavců35, 36. Naopak, jedinci s anorexií nervózou mají zvýšený striatální D2R37 a úbytek hmotnosti u obézních jedinců po bariatrické (žaludeční bypass) chirurgii je spojen se zvýšenou striatální hustotou D2R28. Genový polymorfismus označovaný jako alela TaqIA A1 vede ke snížené striatální hustotě D2R a jedinci nesoucí tuto alelu jsou nadměrně zastoupeni v obézních populacích4. Alela TaqIA také zvyšuje zranitelnost vůči závislosti na alkoholu, opioidech a psychomotorických stimulantech38. Snížení striatální hustoty D2R, ke kterému dochází buď prostřednictvím konstitutivních genetických faktorů, nebo v důsledku přejídání, může proto přispět k neurobiologickým mechanismům obezity. Zjistili jsme, že striatální hladiny izoformy 70 kDa D2R, o nichž se předpokládá, že odrážejí D2R asociovanou s membránou, byly nepřímo úměrné tělesné hmotnosti u potkanů ​​ze skupin pouze pro chow, s omezeným a rozšířeným přístupem (Obr. 4). Knockdown striatální exprese D2R, nejvíce prominentně v dorsolaterálním striatu (obr. 5), způsobil, že prahové hodnoty BSR se zvýšily téměř okamžitě po vystavení dietě v jídelně. Snížení striatální exprese D2R proto rychle zrychlilo vznik hypofunkce odměny u potkanů ​​s prodlouženým přístupem k vysoce chutnému jídlu, což je nález odpovídající údajům o zobrazování lidského mozku, které ukazují, že deficity striatální hustoty D2R přispívají k odměňování hypofunkcí u obézních jedinců4.

Pozoruhodné jsou také tři rysy potkanů ​​Lenti-D2Rsh. Za prvé, ačkoli striatální knockdown D2R v kombinaci s rozšířeným přístupem k chutné stravě vedl ke zvýšení prahových hodnot BSR, nebyly u těchto krys ve srovnání s kontrolními krysy žádné rozdíly v kalorickém příjmu nebo přírůstku hmotnosti. To by mohlo odrážet skutečnost, že krysy měly pouze 14 d přístup ke stravovací dietě; delší období přístupu mohla mít za následek vyšší hmotnostní přírůstek v čase, podobně jako vyšší náchylnost k hmotnostnímu přírůstku pozorovanému u lidí s deficity ve striatální D2R signalizaci4. Výhodou omezení přístupu ke stravovací jídelně na pouze 14 d je však to, že knockdown krysy s rozšířeným přístupem byly jedinou skupinou, která vykazovala zvýšené prahové hodnoty BSR, což nám umožnilo posoudit potenciální roli hypofunkce odměny ve vývoji kompulzivního jíst (viz níže). Za druhé, prahové hodnoty BSR zůstaly stabilní a nezměněné u knockdown krys, které měly přístup pouze k chow. To ukazuje, že snížená striatální exprese D2R sama o sobě nestačí k navození hyposenzitivity odměny; místo toho se zdálo, že interaguje s nadměrnou spotřebou chutného jídla, aby se urychlil vznik tohoto stavu se sníženou citlivostí na odměny. Jiné adaptivní odezvy v obvodech odměňování mozku by proto mohly vyvolat hyposenzitivitu odměny u potkanů ​​s prodlouženým přístupem ke stravovací stravě. S ohledem na to si uvědomujeme, že agonista D2R bromokriptin snižuje cirkulační hladiny leptinu39 a leptin inhibuje krmení alespoň částečně inhibicí striatálních oblastí, které kontrolují hedonické reakce na potravu 3, 30, 31. Je tedy možné, že downregulace striatálního D2R v reakci na zvyšování tělesné hmotnosti zvyšuje signalizaci leptinu a tím zvyšuje inhibiční účinky tohoto adipokinu na systémy odměňování mozku. Nakonec jsme si všimli, že jsme zaměřili naše lentivirové vektory na dorsolaterální striatum. Bylo to především z technických důvodů, protože laterální umístění kanyl pro dodávání virů do striata nám umožnilo také umístit elektrodu stimulující hypotalamickou stimulaci pro stanovení prahu BSR. Je tedy možné, že cílení D2R na knockdown v jiných oblastech striata, zejména v dorzomediálních a ventrálních oblastech (jádro accumbens jádro a skořápka), by mohlo mít zvýšené prahové hodnoty BSR dokonce i v nepřítomnosti chutné stravy.

Dorsolaterální striatum bylo silně zapojeno do učení typu zvyku stimul-odezva, což se odráží ve vývoji konzumního chování, které je necitlivé na devalvaci předchozím krmením k nasycení nebo párováním se škodlivými podněty40. Zaměřením převážně na dorsolaterální striatum bychom mohli zničit populace D2R, které regulují náchylnost krysy k rozvoji nutkavého stravování. V souladu s rolí striatálních D2R v nutkavém chování je alela TaqIA lidského lokusu genu DRD2 – ANKK1 - což má za následek nízkou striatální hustotu D2R5, otupuje striatální aktivaci v reakci na chutné jídlo4 a zvyšuje náchylnost k obezitě4 - je také spojena s deficity v učení vyhýbat se činům s negativními důsledky41. Ztráta inhibiční kontroly nad chováním, která může mít negativní výsledek, je charakteristickým rysem obezity i drogové závislosti, u nichž konzumní chování přetrvává navzdory negativním sociálním, zdravotním nebo finančním důsledkům. Chování při užívání kokainu u potkanů ​​s anamnézou rozsáhlého užívání drog se může stát nepružným a odolným proti narušení averzním podmíněným stimulem, který předpovídá negativní výsledek (šok nohou) 18. Podobně myši, které dříve měly přístup k chutné stravě s vysokým obsahem tuku, stráví více času v averzním prostředí (jasně osvětleném), aby získaly chutné jídlo, než myši, které s dietou neměly žádné zkušenosti42. Zjistili jsme, že chutná konzumace potravy u potkanů ​​s rozšířeným přístupem k stravě v jídelně byla podobně necitlivá na averzivní podmíněný stimul. V souladu s rolí striatálních D2R v tomto efektu bylo zjištěno nutkavé stravování u striatálních D2R knockdown krys, které dříve měly 14 d prodloužený přístup k dietě v jídelně, ale ne v kontrolních skupinách. Z hlediska neurocirkulace může rozšířený přístup k chutnému jídlu vyvolat plasticitu kortikostriatálních cest, čímž se zvířata stanou náchylnějšími k vývoji nutkavého chování, přičemž deficity v striatální signalizaci D2R tento proces podporují. Snížená striatální hustota D2R u obézních jedinců skutečně souvisí se sníženým metabolizmem v prefrontálních a orbitofrontálních kortikálních oblastech43, které mají inhibiční kontrolu chování44.

Zejména kompulzivní konzumace chutného jídla byla detekována pouze u knockdown potkanů, kteří dříve měli rozšířený přístup ke stravovací jídelně, ne u kontrolních potkanů, kteří měli rozšířený přístup ke stravovací stravě po stejné časové období, ani u knockdown potkanů, kteří měli přístup pouze pro chow. Hlavním rozdílem mezi knockdown krysy s předchozím rozšířeným přístupem a do ostatních skupin byly jejich trvale zvýšené prahové hodnoty BSR. To by mohlo odrážet běžné neurobiologické původy hypofunkce odměny a vznik kompulzivního stravování, které jsou časově shodné, ale nezávislé jevy. Alternativně by hypofunkce s odměnou indukovanou stravou mohla sloužit jako substrát pro negativní posílení, které usnadňuje vývoj kompulzivního stravování14, 32, 33. Ať už jsou základní mechanismy jakékoli, naše zjištění ukazují, že u obézních potkanů ​​se u obézních potkanů ​​může objevit závislost, nutkavá reakce na chutné jídlo, a naznačují, že deficity ve striatální signalizaci D2R zvyšují zranitelnost vůči vývoji tohoto chování.

Souhrnně jsme zjistili, že nadměrná stimulace systémů odměňování mozku prostřednictvím nadměrné konzumace chutného, ​​energeticky hustého jídla indukuje hluboký stav hyposenzitivity odměny a rozvoj kompulzivního stravování. Tyto maladaptivní behaviorální reakce u obézních potkanů ​​pravděpodobně vyplývají ze stravou vyvolaných deficitů v striatální D2R signalizaci. Nadměrná konzumace drog zneužívání podobně snižuje striatální hustotu D2R, vyvolává hluboký stav hypofunkce odměny a vyvolává nutkavé chování při užívání drog. Naše zjištění proto podporují předchozí práci 4, 19, 42, 45, 46, 47 v indikaci, že obezita a drogová závislost mohou vznikat z podobných neuroadaptivních reakcí v mozkových odměnových obvodech.

Metody

Krysy.

Samci potkanů ​​Wistar vážící 300 – 350 g na začátku experimentů byli získáni z Charles River. Po příjezdu byly krysy umístěny jednotlivě při konstantní teplotě v cyklu 12-h světlo-tma (světla svítila v 2200 h). Potkanům byl po dobu trvání experimentu povolen přístup ke standardnímu laboratornímu krmivu a vodě ad libitum. Všechny postupy byly schváleny Výborem pro ústavní péči o zvířata a jejich použití ve Scripps Florida a krysy byly ošetřeny v souladu s pokyny stanovenými Národními zdravotními instituty týkajícími se zásad péče o zvířata.

Chirurgické postupy.

Krysy připravené s elektrodami stimulujícími BSR byly nejprve anestetizovány inhalací 1 – 3% isofluranu v kyslíku a umístěny do stereotaxického rámce (Kopf). Bipolární elektrody BSR (11 mm dlouhé) byly implantovány do zadní laterální hypotalamu (anteroposteriorní, -0.5 mm od bregmy; střední, ± 1.7 mm od středové čáry; dorsoventrální, 8.3 mm od dura; řezná tyč byla upravena na 5 mm nad interaurální linií ) 47. Krysy, které dostaly injekci viru, byly také připraveny s oboustrannými vodicími kanyly (rozměr 23, délka 14 mm) umístěnými nad striatem (anteroposterior, 2.8 mm od bregmy; střední, ± 3.1 mm od střední linie; dorsoventrální, -2.4 mm od dura) 48 a naplněné s 14-mm stylety. Elektroda a kanyly držely na místě čtyři šrouby z lebky z nerezové oceli a dentální akrylát. Po chirurgickém zákroku byla chirurgická rána ošetřena topickým antibiotikem jednou za 12 h pro 5 d. Potkanům bylo umožněno, aby se 7 – 10 d zotavili z chirurgického zákroku, a poté byli vyškoleni v proceduře prahové hodnoty BSR.

Postup BSR.

Krysy byly vyškoleny, aby reagovaly na stimulaci BSR podle diskrétní zkušební procedury prahového proudu podobné postupu popsanému jinde 10, 14. Stručně, hladiny BSR proudu se měnily v střídavých sestupných a vzestupných řadách v krocích 5-μA. V každé testovací relaci byly prezentovány čtyři střídavé sestupné / vzestupné řady. Prahová hodnota pro každou sérii byla definována jako střed mezi dvěma po sobě jdoucími intenzitami proudu, na které krysy reagovaly v nejméně třech z pěti pokusů, a dvěma po sobě jdoucími intenzitami proudu, na které krysy nereagovaly ve třech nebo více z pěti pokusů. Celkový práh relace byl definován jako průměr prahů pro čtyři jednotlivé řady. Každá testovací relace trvala přibližně 30 min. Stabilní prahové hodnoty BSR byly definovány jako ≤10% variace prahů během 5 po sobě jdoucích dnů, obvykle stanovené po 10 – 14 d tréninku. Latence odpovědi pro každou testovací relaci byla definována jako průměrná latence odpovědi ve všech studiích, během nichž došlo k pozitivní odpovědi.

Virové balení a dodávka.

Krátká vlásenka RNA byla dodána a konstitutivně exprimována pomocí vektorového systému pRNAT-U6.2 / Lenti (GenScript). Virové částice byly připraveny podle protokolu výrobce. Stručně řečeno, buňky HEK 293FT byly transfekovány vektorem obsahujícím shRNA inzert (5'-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTCTCACACTCGAG-3 ') nebo prázdný vektor plus médium ViraPower Packaging Mix (Invitrogen) po dobu 72 hodin. Supernatant byl poté sebrán a zahuštěn ultracentrifugací (24 76,755 g, Beckman Coulter SW 32 TI rotor., 90 minut, 4 ° C) a titr viru byl stanoven pomocí fluorescenčně aktivovaného třídění buněk podle pokynů výrobce. Virus byl rozdělen na alikvoty a do použití skladován v krabičkách chráněných před světlem při -80 ° C.

Krysy se stabilními prahovými hodnotami BSR obdržely bilaterální virové injekce na třech místech ve striatu každé mozkové hemisféry (2 μl na injekci, 1 μl min-1, 1 min mezi injekcemi, celkem šest injekcí na krysu). Potkanům bylo umožněno alespoň zotavení z 2 – 3 d z intrastriatálních injekcí, než bylo obnoveno stanovení prahu BSR. Denní stanovení prahové hodnoty BSR pokračovalo pro 33 d po injekcích viru, aby bylo zajištěno maximální striatální D2R knockdown bylo dosaženo před povolením potkanům přístup ke stravě v jídelně. Během těchto 2 d nebyly zjištěny žádné rozdíly v prahech BSR mezi krysy Lenti-control a Lenti-D33Rsh (data nejsou uvedena).

Imunoblotting.

Krysy byly usmrceny přibližně 1 h po jejich pravidelném naplánovaném přístupu do jídelny a mozky byly rychle odstraněny. Řezy mozku o tloušťce ~ 1 – 2 mm byly připraveny pomocí koronální mozkové matrice (interval řezu 1-mm; Plastics One) na ledovém bloku a byly odebrány tkáňové údery dorzálního striata (bregma: ~ 2.2 až -0.26 mm). Děrovačky striatální tkáně byly rychle shromážděny, rychle zmrazeny a uloženy při -80 ° C až do použití. Jednotlivé vzorky byly rozmrazeny na ledu a stejná množství striatální tkáně byla spojena na základě hmotnostně závislého mediálního rozdělení přístupových skupin (krysy 7 – 10 na skupinu). Tkáň byla před homogenizací resuspendována v 500 μl ledově chladném RIPA pufru (Thermo Scientific) obsahujícím orthovanadát sodný, inhibitory koktejlu fosfatázy 1 a 2 (Sigma-Aldrich), leupeptin a pepstatin. Tkáňové lyzáty byly vařeny po dobu 10 min ve vzorkovém pufru a naneseny na 4% –20% nebo 10% Tris-glycin SDS gely (Invitrogen). Protein byl přenesen na nitrocelulózové membrány, blokován po dobu 1 h při ~ 23 – 25 ° C (5% beztučné sušené mléko a 0.2% Tween-20 v PBS, pH 7.4) a inkubován v primární protilátce přes noc při 4 ° C. Následující primární protilátky byly zředěny v blokovém roztoku: D2R myší monoklonální (Santa Cruz, 1: 100) nebo p-aktinový myší monoklonální (Santa Cruz, 1: 200). Po inkubaci s křenovou peroxidázou konjugovanou sekundární protilátkou (Amersham, 1: 2,000) bylo přidáno chemiluminiscenční ECL činidlo. Zralá membránově spojená forma D2DR (~ 70 kDa) 17, 49 byla normalizována na kontrolu nanášení proteinu (p-aktin; 43 kDa) a kvantifikována denzitometrií za použití softwaru NIH Image J.

Imunochemická analýza.

Krysy byly anestetizovány a transkardiálně perfundovány 4% paraformaldehydem v PBS (pH 7.6). Mozky byly odstraněny, postfixovány přes noc a uloženy v sacharóze (30% roztok v PBS, pH 7.4) po dobu alespoň 72 h. Zmrazené tkáňové řezy (tloušťka 30 μm) byly odebrány z mikrotomu a blokovány (3% BSA, 5% normální kozí sérum a 0.3% Triton X-100 v PBS) po dobu 1 h při ~ 23 – 25 ° C. Následující primární protilátky byly přidány do blokového roztoku a inkubovány přes noc při 4 ° C: kuřecí polyklonální k GFP (Abcam, 1: 1,000); králičí monoklonální k GFAP (Millipore, 1: 1,000); myší monoklonální k NeuN (Millipore, 1: 1,000). Řezy byly inkubovány s fluorescenčně barvivem-konjugovanými sekundárními protilátkami při ~ 23 – 25 ° C: anti-kuřecí – 488-nm barvivo (Jackson ImmunoResearch, 1: 1,000), anti-králičí-594-nm barvivo (Invitrogen, 1: 1,000 ) a barvivo proti myši-594-nm (Invitrogen, 1: 1000). Řezy byly připevněny montážním médiem Vectashield obsahujícím DAPI (Vector Labs) a kryty sklouznuty. Snímky byly pořízeny za použití fluorescenčního mikroskopu Olympus BX61 (objektiv 2) nebo konfokálního mikroskopu Olympus (objektivy 10 a × 100).

Postup podávání.

Krysy byly umístěny jednotlivě na papírové podestýlky (alfa polštářky; Shepherd Special Papers), aby se zabránilo znečištění potravinářských produktů volnými materiály podestýlky. Stravování v jídelně sestávalo ze slaniny, klobásy, tvarohového koláče, libového dortu, polevy a čokolády, které byly jednotlivě zváženy před tím, než byly potkanům k dispozici. Dietní jídla v jídelně byla dodávána v malých kovových nádobách. Po dokončení krmení byly všechny potraviny, včetně standardního laboratorního krmiva, znovu zváženy. Kalorický příjem z různých makronutrientů byl vypočítán pomocí nutričních informací poskytnutých výrobcem.

Cue-indukované potlačení chování při krmení.

Krmení probíhalo ve zvukově tlumených provozních komorách, jejichž rozměry byly stejné jako v experimentech BSR. Krysy byly umístěny do komory operanta a po dobu 30 minut měly přístup do jídelny nebo jídla do jídelny. Potraviny byly dodávány v malých kovových nádobách. Všechny potraviny byly zváženy před a po krmení, které bylo prováděno během normálního krmení potkanů. Spotřeba krmiva byla hodnocena podle spotřeby 45mg krmných pelet stejného složení jako krmivo poskytované v domácích klecích krys. Potkanům byl poté povolen 30minutový přístup do jídelníčku denně, dokud nebylo dosaženo stabilního příjmu (definováno jako <10% variace v denním příjmu), což vyžadovalo 5-7 dní. Po stabilizaci chutného příjmu potravy během tohoto základního období byly krysy v každé podmínce přístupu rozděleny do dvou skupin: potrestáni (ti, kteří dostávali šok z nohy) a nepotrestáni (nedostávali šok z nohy). Krysy pak byly podrobeny čtyřem kondičním sezením po sobě jdoucích dní ve stejné komoře operátora, ve které měli dříve přístup k chutnému jídlu. Během 30minutových kondičních relací bylo na 10 minut aktivováno startovací světlo (kondicionovaný stimul), na 10 minut vypnuto a poté na 10 minut znovu zapnuto. Potrestané krysy dostaly šok z chodidla pouze během prezentace kontrolního světla (0.5 mA po dobu 1.0 s; 10 stimulací s ~ 1minutovými intervaly). Nepotrestaným krysám bylo signalizační světlo prezentováno stejným způsobem, ale bez úrazu nohou. V testovací den, den po závěrečné kondiční relaci, dostaly krysy v potrestaných skupinách občasný šok nohou (celkem pět stimulací) spárovaný s aktivací startovacího světla po dobu 5 minut. Nepotrestané krysy byly znovu vystaveny světelnému podnětu bez šoku nohou. Po 5minutové době trestu byl všem potkanům umožněn přístup k chutnému jídlu na 30minutovou relaci s přerušovaným aktivováním podmíněného stimulu (10minutové světlo zapnuto, 10minutové světlo vypnuto, 10minutové světlo zapnuto).

Statistické analýzy.

Výchozí prahové hodnoty odměn byly definovány jako průměrná prahová hodnota pro 5 d před přístupem ke stravovací dietě pro každý subjekt. Mezní hodnoty odměn byly vyjádřeny jako procentuální změna oproti základní prahové hodnotě. Údaje o procentech základních prahových hodnot odměny, přírůstku hmotnosti, kalorické spotřebě a kalorické spotřebě tuků byly analyzovány pomocí dvoufaktorové analýzy opakovaných měření rozptylu, s přístupem (pouze chow, omezený přístup nebo rozšířený přístup), zdrojem kalorií ( standardní strava pro žraloky nebo bufety), viry (Lenti-control nebo Lenti-D2Rsh) a tága (párované nebo nespárované s trestem) jako faktory mezi subjekty a čas jako faktor mezi subjekty. Pokud je to vhodné, hlavní účinky v analýzách rozptylu byly dále analyzovány Bonferroniho post hoc testy. Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru GraphPad Prism.

Reference

Reference

Korespondence s:

· Paul J Kenny ([chráněno e-mailem])